Unidad Profesional Interdisciplinaria de Ingeniería Campus Guanajuato.
Instituto Politécnico Nacional.
Equipo Número: 6
Andrea Lizet Hernández González
Irma Alondra López Guerrero
Flor Alejandra Piña Rodríguez
Integrantes: Luz Alejandra Ramírez Martínez
Marco Antonio Sánchez López
Jared Alejandro Torres Amaya
Departamento: Formación Integral e Institucional.
Academia: Biología.
Laboratorio de Biotecnología Molecular.
Unidad de aprendizaje:
Dr. César Aza González
Docente: Dr. Guillermo Pastor Palacios
Juan Francisco Sánchez Lopez
Grupo: 5BM1.
Periodo escolar: 2025/2.
• Práctica 1. Extracción de DNA genómico de
bacterias.
• Práctica 2. Cuantificación de DNA y
visualización en gel de agarosa
• Práctica 3. Extracción y Purificación de RNA
de Plantas
Bitácora: • Práctica 4. Cuantificación de RNA y
visualización en gel agarosa
• Practica 5. Reacción en cadena de la
polimerasa (PCR).
• Practica 6. Clonación de un fragmento de
DNA
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INDICE
PRÁCTICA 1. EXTRACCIÓN DE DNA GENÓMICO DE BACTERIAS. ............................. 3
PRÁCTICA 2. CUANTIFICACIÓN DE DNA Y VISUALIZACIÓN EN GEL DE AGAROSA. 5
PRÁCTICA 3. EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE RNA DE PLANTAS ........................ 6
PRÁCTICA 4. CUANTIFICACIÓN DE RNA Y VISUALIZACIÓN EN GEL DE AGAROSA. 9
PRÁCTICA 5. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) ........................... 13
PRÁCTICA 6. CLONACIÓN DE UN FRAGMENTO DE DNA ......................................... 17
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PRÁCTICA 1. EXTRACCIÓN DE DNA GENÓMICO DE
BACTERIAS.
Fecha de Realización: martes 18 febrero 2025
SESION 1
• RESULTADOS Y OBSERVACIONES
NOTAS /OBSERVACIONES:
• Conversión:
1 μL =0.001 mL
1 mL= 1,000 μL
• Del primer paso, se peso y se obtuvo 23.8894 g
• Sobre la pastilla bacteriana es de 600 μL
• Se considero un tiempo de 40 minutos
• Se agregaron 100 μL de solución del detergente
• La cepa que se utilizo es Klebsiella Pneumoniae
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Pastill
Figura 1. Presentación de la pastilla
dentro del tubo falcon.
Figura 2. Diferentes fases de la extracción del DNA
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PRÁCTICA 2. CUANTIFICACIÓN DE DNA Y
VISUALIZACIÓN EN GEL DE AGAROSA.
Fecha de Realización: 25 de febrero de 2025
SESION 2
• RESULTADOS Y OBSERVACIONES.
Cuantificación de DNA
Muestra Dilución Abs 260 Abs 280 Abs 230 260/280 230/260 RNA (𝜇𝑔/𝑚𝑙)
nm nm nm
DNA total ----------- 9.775 5.217 ----------- 1.87 1.69 488.7
de bacterias
ELECTROFORESIS
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PRÁCTICA 3. EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE RNA DE
PLANTAS.
Fecha de Realización: jueves 27 febrero 2025
SESION 1
• OBJETIVO
Objetivo General:
Realizar la extracción de RNA por técnicas convencionales.
• METODOLOGIA
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• RESULTADOS Y OBSERVACIONES
En la ruptura y homogenización del tejido vegetal, se utilizó un mortero en el cual se vació
Nitrógeno líquido junto con un pedazo de fruto de chile, el cual fue chile serrano Capsicum
annuum, para extraer el ARN del pericardio. Al pasar cierto tiempo de congelación con el objetivo
de detener la degradación enzimática, se molió lo más fino posible hasta formar un polvo. [Figura
1]
A) B) C)
Figura 1. A) Nitrógeno líquido vaciado en un recipiente. B) Agregando un parte del chile serrano Capsicum
annuum. C) El pericardio del Capsicum annuum triturado.
Este ARN triturado fue adicionado al reactivo TRIzol Reagent, 2 cucharadas a cada microtubo con
volumen de 1.5 de la marca Eppendorf [Figura 2], con el objetivo de tener duplicado. Estas
muestras fueron incubadas, adicionando cloroformo, incubadas y centrifugadas para finalmente
tomar la fase superior acuosa a un nuevo microtubo de la marca Eppendorf.
Figura 2. Tubos Eppendorf con muestra de ARN con el reactivo TRIzol Reagent homogenizado.
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Continuamos a la Precipitación del RNA, y tomamos del Tubo 1 620𝜇𝑙 y el Tubo 2 600 𝜇𝑙 de fase
acuosa, para la precipitación utilizamos el alcohol isopropílico ya que este reactivo precipita los
ácidos nucleicos del ADN como el ARN como es ente caso de soluciones acuosas.
Sin embargo, el reactivo se adiciono a la fase incorrecta, a la fase orgánica [Figura 3]. Y se desechó
por accidente la fase acuosa.
Figura 3. Fase orgánica adicionada con alcohol isopropílico.
Finalmente realizamos un lavado de DNA con etanol al 75%, centrifugamos y descartar el
sobrenadante. Para llegar a la Re-suspensión del RNA, secamos la pastilla y la suspendemos en
agua miliQ esteril., que es un agua purificada e incubar, adicionar RNaseOUT como activador de
RNAsas, a los Tubos Eppendorf, con un marcador localizar y marcar con un círculo la pastilla.
Para proseguir con la Practica de RNA, el Equipo 3 de Laboratorio, regaló 20 𝜇𝑙 de la muestra de
uno de los 2 Tupos Eppendorf. Y todas las muestras fueron almacenadas a -80°C.
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PRÁCTICA 4. CUANTIFICACIÓN DE RNA Y
VISUALIZACIÓN EN GEL DE AGAROSA.
Fecha de Realización: martes 4 marzo 2025
SESION 2
• OBJETIVO
Cuantificar RNA por métodos espectrofotométricos
Visualización de RNA en gel de agarosa
• INTRODUCCION
Al igual que el DNA, la concentración de RNA puede estimarse a través de un espectrofotómetro
de luz ultravioleta (UV) a una longitud de onda de 260 nm. Una unidad de densidad óptica (DO)
a 260 nm equivale a 40 μg/ml de RNA. De modo que para obtener la concentración de RNA se
utiliza la siguiente fórmula:
Concentración de RNA (μg/ml) = 40/(1/OD 260)
• METODOLOGIA
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• RESULTADOS Y OBSERVACIONES
Para la segunda parte del ARN del pericardio, chile serrano Capsicum annuum, comenzamos con
la cuantificación de nuestra muestra. Tomando 2 𝜇𝐿 de muestra y colocándola en el Equipo
NANODROP, se mostrará una gráfica Longitud de onda VS Absorbancia [Figura 6] y las
Concentraciones del ARN.
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CUANTIFICACIÓN DEL RNA POR EL EQUIPO NANODROP
Figura 6. Grafica Longitud de onda (nm) Vs Absorbancia (10 nm)
Tabla 1. Resultados de los parámetros de la cuantificación del ARN y las relaciones de
absorbancia
Muestra Dilución Abs 260 Abs 280 Abs 230 260/280 230/260 RNA (𝜇𝑔/𝑚𝑙)
nm nm nm
RNA de N/A 24.031 14.628 N/A 1.64 0.50 961.2
plantas
ELECTROFORESIS DEL RNA DE PLANTAS DE CHILE SERRANO EN GEL AGAROSA.
1% EN BUFFER TAE 1X
Para la visualización del RNA en gel agarosa con buffer TAE 1X al 1%, este reactivo tiene que
ser nuevo, ya que la muestra como es el ARN es sensible.
Colocamos el gel en la cámara de electroforesis y cubrirlo con buffer de corrida. En la zona de
Bromuro del Laboratorio, se colocan 2 𝜇𝐿 de buffer de carga para DNA, y de nuestra muestra 5 𝜇𝑙
[Figura 7]. En este caso, se utilizaron 2 pozos, siendo el equipo 6 fueron utilizados los 2 últimos
y luego el indicador; marcador del peso molecular [Figura 8].
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12 13
Figura 7. Electroforesis iniciada a 100 V con 14 pozos, 12 de muestras y 2 del marcador mp.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Figura 8. Se corrió tres muestras de ARN la electroforesis en gel de agarosa al 1% en buffer TAE 1X, se utilizó el
marcador GeneRuler 1 kb DNA Ladder . La correspondencia a las muestras del equipo No.6, son los carriles 12-
13 con 5 μL de muestra de ARN, con una mezcla de 2 μL de buffer de carga, a una corrida de 100 V, y una
visualización en el transiluminador.
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PRÁCTICA 5. REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR)
FECHA: Primer sesión 25/03/25
RESULTADOS Y OBSERVACIONES:
Hubo un cambio en la mezcla de reacción de PCR, se puede ver desglosado en la siguiente parte:
• Agua destilada estéril 13.5 𝜇𝐿
• 𝑀𝑔𝐶𝑙2 (50 𝜇𝑀) 2 𝜇𝐿
• 𝑑𝑁𝑇𝑃𝑠 (𝜇𝑀) 0.5𝜇𝐿
• Oligonucleótido directo (10𝜇𝑀) 3 𝜇𝐿 →𝑀𝑇𝑆 𝐷
• Oligonucleótido reverso (10 𝜇𝑀) 1 𝜇𝐿 →𝑀𝑇𝑆 𝑅
𝑛𝑔
• DNA genómico (o plasmidico?) (100 ) 2𝜇𝐿 →
𝜇𝐿
𝑁𝑜 𝑠𝑒𝑟á 𝑝𝑙á𝑠𝑚𝑖𝑑𝑖𝑐𝑜, 𝑠𝑒𝑟á 𝑔𝑒𝑛ó𝑚𝑖𝑐𝑜 𝑑𝑒 𝑆𝑡𝑟𝑒𝑝𝑡𝑜𝑚𝑦𝑐𝑒𝑠
• Regulador PCR 10X 2.5 𝜇𝐿
• Taq. DNA polimerasa 50 𝜇𝐿 0.5 𝜇𝐿
Secuencia de los oligonucleótidos utilizados para la amplificación:
(18 bases)
• MTSD: 5´ GAGTTCACCGACGGCAAG 3´
(20 bases)
• MTSR: 5´ CCCGACTCAGCAGTCGCATCC 3´
PCR
Para la Desnaturalización: ~95°C, Templar los cebadores (anillamiento) ~55-65 °C, Extender
cebadores (elongación) 72°C.
Para el KIT GRUPAL:
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1 RXN 6 RXN
10 X Standar Taq. Reaction 2.5 𝜇𝐿 15 𝜇𝐿
Buffer
10 𝜇𝑀 dNPs 0.5 𝜇𝐿 3𝜇𝐿
10𝜇𝐿 Forward primer 3 𝜇𝐿 18 𝜇𝐿
10 𝜇𝐿 Reverse primer 1 𝜇𝐿 3 𝜇𝐿
Template DNA 2 𝜇𝐿 12 𝜇𝐿
Taq DNA polymerase 0.125 𝜇𝐿 0.75𝜇𝐿
Nuclease Free Water 15.875 𝜇𝐿 59.75 +
Los tubos de los equipos fueron nombrados de la siguiente manera:
123456
ABCDEF
Programando al Termociclador:
95 °𝐶
5 𝑚𝑖𝑛
30 ciclos
95 °𝐶 50 − 60 °𝐶 72°𝐶
30 𝑠𝑒𝑔 45 𝑠𝑒𝑔 1 𝑚𝑖𝑛
72 °𝐶
10 𝑚𝑖
4 °𝐶
∞
FECHA: Primer sesión 27/03/25
Nueva reacción para PCR, ya que la anterior no iba a ser percibida en el gel de agarosa.
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Kit Individual:
1. Agua desionizada estéril 16 𝜇𝐿
2. 𝑀𝑔𝐶𝑙2 (50 𝑚𝑀) 2 𝜇𝐿
3. dNTPs 10mM 0.5 𝜇𝐿
4. Oligonucleotido directo (10m M) ITS1 1 𝜇𝐿
5. Oligonucleotido reverso /10 mM) ITS4 1 𝜇𝐿
6. DNA genomico (100mg/mL) 1 𝜇𝐿
7. Regulador PCR 10 x 2.5 𝜇𝐿
8. Taq. DNA polimerasa 0.5 𝜇𝐿
Volumen total 25 𝜇𝐿
Un nuevo kit global sin MAGNESIO, tomando en cuenta 7 reacciones.
1 rxn 7 rxn
1. Agua desionizada estéril 19.85 𝜇𝐿 139 𝜇𝐿
2. 𝑀𝑔𝐶𝑙2 (50 𝑚𝑀) ------------- ---------------
3. dNTPs 10mM 0.5 𝜇𝐿 3.5 𝜇𝐿
4. Oligonucleotido directo (10m M) ITS1 0.5 𝜇𝐿 3.5 𝜇𝐿
5. Oligonucleotido reverso /10 mM) ITS4 0.5 𝜇𝐿 3.5 𝜇𝐿
6. DNA genomico (100mg/mL) 1 𝜇𝐿 7 𝜇𝐿
7. Regulador PCR 10 x 2.5 𝜇𝐿 17.5 𝜇𝐿
8. Taq. DNA polimerasa 0.15 𝜇𝐿 1 𝜇𝐿
Volumen total 25 𝜇𝐿 175 𝜇𝐿
También serán tomadas en cuentas las siguientes muestras:
Equipo 1 Equipo 2 Equipo 3 Equipo 4 Equipo 5 Equipo 6 Equipo 1
DNA A1 E3 E5 2 Eq1 A1 E3
Tubo Nuew En N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7
Invitrogen I1 I2 I3 I4 I5 I6 I7
A continuación, se realizará la visualización en gel de agarosa. (1/Abril/2025)
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Eq. 1 Eq. 2
I G I G
MP N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 I1 I2 I3 I4 I5 I6 I7 MP
Eq. 3 Eq. 4 Eq. 5 Eq. 6
MP Eq. 3 Eq. 4 Eq. 5 Eq. 6
I G I G I G I G
Figura 1. Electroforesis del PCR.
10 𝜇𝐿 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 + 4 𝜇𝐿 𝐵𝑢𝑓𝑓𝑒𝑟
I: Individual
G: Grupal
Solo algunos fragmento fueron visibles como son: N2,N3,N5,N6,I1,I2,I4,I5,I6,I7
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PRÁCTICA 6. CLONACIÓN DE UN FRAGMENTO DE DNA
FECHA: 3/04/2025
RESULTADOS Y OBSERVACIONES.
Utilizar el producto de PCR para su ligación a un vector. Se usará el siguiente kit del Manual
Topo8GWInvitrogen. Se tomará la mitad del volumen de los reactivos del kit.
Reactivos (E. coli) 1 rxn ½ rnx
1. Producto de PCR 0.5 − 4 𝜇𝐿 2 𝜇𝐿
fresco
2. Solución salina 1 𝜇𝐿 0.5 𝜇𝐿
3. Agua 5 𝜇𝐿 ---------------
4. Vector TOPO ® 1 𝜇𝐿 0.5 𝜇𝐿
• DNA genómico, para extraer este gen del organismo. Seleccionar -> aislar un fragmento
para posteriormente uso del PCR.
• Intento de ligar (PCR -> ligar) con las eligasas o TOPO
• Choque térmico (42 °C, 40-60 seg). En este proceso el plásmido entra a la bacteria, en
unas entran el vector sin nada y otras el vector con resistencia antibiótica.
4/04/2025
Se hicieron cajas Petri con diversas características. Equipo 6; 150 sp (+) antibiótico
Figura 2. Caja Petri 150 sp (+) antibiótico del equipo 6.
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Tubos Falcon de 50 mL (conteniendo 10 mL de medio LB con el antibiotico) inocular con el
asa bacteriologica una colonia que haya crecido del medio solido con el antibiotico. Incubar
a 37°C.
Figura 3. Tubo Falcon inoculado con una colonia del medio sólido.
Recordando las cajas Petri como CONTROL.
Eq. 1. Control Celulas transformadas sin antibiotico 100 𝜇𝐿 -sp
Eq. 2 Conrol Celulas no transformadas con antibiotico 100 𝜇𝐿 +sp
A) B)
I I
m
m controles. A) Celulas transformadas sinantibiotico. B) Celulas no transformadas con
Figura 4. Cajas Petri
ag antibiotico. ag
en en
. .
El El
ec ec
tr tr
of of
18
or or
es es
is is
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Del cultivo obtenido en el Tubo Falcon, tomar 1.5mL a un tubo Eppendorf y centrifugar a 10,000
rpm por 10 minutos a 4 °C. Adicionando las Soluciones I, II, III y centrifugarlas. Para finalmente
obtener la pastilla del DNA Re suspendida en 50𝜇𝐿 de agua estéril.
10/04/205
Electroforesis en Gel agarosa.
Eq. Eq. Eq.6
Eq. Eq. Eq.
MP 1 2 3 4 5 F1 F2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Figura 5. Electroforesis del DNA plasmídico
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Cuantificación Nanodrop.
Muestra Abs 260 nm Abs 280 nm 260/280 260/230 230/260 DNA (𝜇𝑔/𝑚𝐿)
F1 38.292 19.319 1.98 1.98 0.429 1914.6
F2 43.457 21.194 2.05 2.05 0.444 2172.8
15/abril/2025
Sesión de PCR y Digestión con enzimas.
A) Confirmación por digestión del vector.
AGUA BUFFER 10X Eco DNA ENZIMA Eco R1
R1
Llevar 20 𝜇𝐿 2 𝜇𝐿 3 𝜇𝐿 (200 ng/ 𝜇𝐿) 1 𝜇𝐿
Concentraciones:
𝐹1: 1914.0 | 1 𝜇𝐿
𝐹2: 2172.8 | 1 𝜇𝐿
29/04/2025
PCR-> Amplificación
Corte/EcoR1 -> Se observa el fragmento que se cortó.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
PCR
PM E1 E2 E3 E4 E5 E6 PCR PM
PCR: 𝐼5 3𝜇𝑙 + 𝐼2 3 𝜇𝐿 = 6𝜇𝐿 + 2𝜇𝐿 𝐵𝑢𝑓𝑓𝑒𝑟
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Corte
PM E1 E2 E3 E4 E5 E6 Plasmido PM
s/corte
Observación: La visualización de la electroforesis fue casi nula, por lo que quizás se vuelve a
realizar la clonación.
6/Mayo/2025
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Se realiza nuevamente la sesión de PCR y Digestión con enzimas, con cambios a la mezcla de
digestión.
A) Confirmación por digestión del vector.
1. Mezcla de digestión.
AGUA BUFFER 10X Eco DNA ENZIMA Eco R1
R1
9 𝜇𝐿 2 𝜇𝐿 8 𝜇𝐿 1 𝜇𝐿
B) Confirmación por PCR
Se utilizaron
𝐼1 → 𝐼7 → 𝑖𝑛𝑣𝑖𝑡𝑟𝑜
𝑁1 → 𝑁7 → 𝑁𝑒𝑤 𝑒𝑛𝑔𝑙𝑎𝑛𝑑
Para el equipo 6, los tubos de Digestión fueron nombrados F1 y F2
Nota: En la preparación del PCR, fue realizador por un profesor
2. Mezcla de PCR
REACTIVO Invitrogen Rxn x7 New england Rxn x7
Agua 17.8 124.6 18.875 132.125
Buffer 2.5 17.5 2.5 17.5
𝑀𝑔𝐶𝑙2 1 7 ------------ ------------------
𝑑𝑁𝑇𝑃𝑠 0.5 3.5 0.5 3.5
Oligos directos 1 7 1 7
Oligos reverso 1 7 1 7
DNA 1 7 1 7
Taq DNA 0.2 1.4 0.125 0.9
25 175 25 175.025
EQUIPOS 1 2 3 4 5 6 7 ENZIMA
I1 I2 I3 I4I I5 I6 I7 Invitrogen
N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 New
england
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Para la electroforesis, se indicó el siguiente orden para las celdas.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
[DIG]
PM Eq. 1 Eq. 2 Eq. 3 Eq. 4 Eq. 5 Eq. 6 Control Dig
Dig: 20𝜇𝐿 𝐷𝑖𝑔 + 6 𝜇𝐿 𝐵𝑢𝑓𝑓𝑒𝑟
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
[PCR] PM Control
Eq. 1 Eq. 2 Eq. 3 Eq. 4 Eq. 5 Eq. 6
PCR
PCR: 6 𝜇𝑙 𝐷𝑁𝐴 + 2 𝜇𝐿 𝐵𝑢𝑓𝑓𝑒𝑟
Observación: Hubo modificaciones del orden al cargar las muestras en algunos equipos.
MP Eq. 1 Eq. 2 Eq. 3 Eq. 4 Eq. 6 Cont. Dig
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
MP Eq. 1 Eq. 2 Eq. 3 Eq. 5 Eq. 6 Cont. PCR
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Figura 6. Electroforesis de 28 celdas en total. Para 14 celdas para Digestión y 14 celdas para PCR.
El equipo 4 coloco sus 4 muestras juntas (celdas 8,9,10,11)), por lo tanto, el equipo 5 tuvo que hacer lo mismo, pero
en la fila de abajo.
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