INGENIERÍA GENÉTICA
Clase 6/3
Operador: sitio dentro del promotor que permite la unión de reguladores. En
general represores. Ej. Represor lac. Es distinto operador de operón.
Componentes de un vector plasmídico:
- Ori
- Marcador de resistencia
- Marcador de selección
- Promotor
- Operador
- MCS
- Terminador
Imagen de pizarrón plásmido
La mayor diferencia entre los orígenes de replicación es si produce un alto o
bajo número de copias. Hay plásmidos que ya tienen codificados su origen
de replicación, y otros que dependen de la maquinaria de replicación del
hospedero. Si quiero hacer una coexpresión y transformar dos vectores
distintos en un hospedero, tengo que asegurarme que los grupos de
incompatibilidad sean diferentes, sino no los voy a poder mantener en el
hospedero. A esto se le llama control estringente o relajado de la
replicación.
MÉTODOS DE CLONADO: clásico y moderno
1) Basados en enzimas de restricción
2) Independientes de ligación (lic)
3) Basados en PCR, independientes de ER
4) Recombinación sitio-dirigida
Hacia el 5’ de los primers que diseñamos para la amplificación de nuestro
gen, le incluimos el sitio de restricción (siempre y cuando esté en MCS y no
corte el plásmido en ningún otro lado).
Siempre conviene más elegir enzimas que produzcan extremos cohesivos, el
clonado es más eficiente. Y si elegimos dos enzimas distintas siempre va a
ser bidireccional el clonado, lo cual es positivo.
Nunca va a pasar que vamos a encontrar justo los sitios de restricción que
necesitamos para clonar el gen flanqueando el gen, por eso debemos
agregarlos en el diseño de primers.
1.0.0 explica armado de primers.
Es importante tener en cuenta el contenido de GC porque los GC forman 3
puentes de hidrógeno, si tiene poco conteniod de gc el primer, necesitas
poca temp de annealing para hibridarlo al ADN. En cambio, si tiene mucho
contenido de gc se necesitan temperatras mas altas de temp de melting
para la hibdridacación.
EJERCICIO: 1) BASADOS EN ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Hay inespecificidades en la amplificación, pero sí es posible continuar con
los pasos de clonado, porque se puede cortar esa banda, ponerla en un tubo
y usar un kit de purificación, te olvidas de todas las inespecificidades. De
todos modos, se puede mejorar la amplificación. El clonado puede que no
funcione tan bien si decido hacer una purificación en el tubo.
Paso 5: ligación.
Por qué se usa la T4 ligasa proveniente del bacteriófago T4? Por que se
suelen usar polimerasas de fagos, ligasas de fagos? La T4 es más eficiente
xq el fago necesita codificar una ligasa que compita con la ligasa de la
bacteria. También se usa la t7 arn polimerasa en expresión de proteínas
recombinantes que también es de un fago, o la t5 arn polimerasa.
Transformación
Cada cepa de e. coli tiene su genoma característico. Por ejemplo la DH5alfa
es la mas usada para transofmar y mantener vectores que queremos usar
ya sea clonados o sin clonar debido a que tiene algunas mutaciones de
endonucleasas y recombinasas que aumentan la estabilidad del ADN
exógeno. Si voy a purificar ese plásmido de la bacteria voy a tener mayor
rendimiento de ese ADN.
Paso 6: confirmación del clonado
El patron de bandas de un gel no es el mismo para el vector original sin
clonar que para el que tiene el inserto. El perfil de enzimas de restricción
(que no tienen nada que ver con las eligidas para hacer el clonado, estas
son para confirmar el clonado). Ej si elijo 3 enzimas de restricción, si la ER2
está presente en el vector parental y esta enzima se vio eliminada por el
proceso de clonado en la inserción de mi inserto, puedo usar esta enzima
como un proxy, para ver si mi clonado funcionó o no (si no se observan 3
cortes es porque al introducir mi inserto sacamos su sitio de restricción por
lo que no va a poder cortar), se observarían solo dos bandas si funciono mi
clonado.
Corro mi vector parental que es mi control negativo y el experimental que
es el de mi clonado voy a tener (C= control y E=experimento de clonación):
Hay que elegir las enzimas que nos permitan ver un perfil de bandas claro,
que la diferencia sea clara. Si se ven dos bandas significa que el clonado
funcionó. Luego puego hacer PCR si quiero agregar un paso más de
confirmación y siempre debo secuenciar el inserto para observar que no
haya habido una mutación porque un nucleótido menos es un cambio de
fase de todo el marco abierto de lectura. Te cambia el gen.
Método Flexi
Te ahorra elegir vector xq viene con un vector comercial y te ahorra elegir
los sitio de restricción
Golden gate assembly: para el clonado de muchos genes. Es un método
seamless.
2) independientes de ligación (lic):
No usan ER para el clonado, no se usa una ligasa in vitro. La ligación ocurre
en la bacteria
Si quiero hacer un clonado mediante esta estrategia dependo de la
actividad T4 de mi dna polimerasa. Esta t4 es una dna polimerasa que tiene
actividad 5’-3’, pero como es una enzima, va a agregar nucleótidos solo si
tiene sustrato. El sustrato son los desoxirribonucleótidos. Si la polimerasa no
tiene ese sustrato, van a empezar a primordiar otras actividades de esta
enzima, entre ellas la 3’-5’ exonucleasa. Etnocnes en la reacción en vez de
agregar dNTPs que no me interesan porque no quiero sintetizar nada, solo
agrego un dntp. Como la t4 tiene actividad 3’5’ exonucleasa, agarra los 3’
que quedaron libres (por eso hay que linealizar, para que queden extremos
libres).
Entonces la t4 va a comer la hebra hasta cierto punto. Esto genera
“overhangs”, una especie de extremos cohesivos que son bastante mas
largos que los generados por ER, y en este caso son 5’. La t4 polimerasa va
a actuar sobre los extremos 3’, dejando unos extremos que sobresalen, que
eso vamos a usarlo para el clonado.
Pcr inversa ni la explicó
CLASE 13/3 EJERCICIOS CLONADO MOLECULAR
1) Elegir el vector adecuado: depende si yo lo quiero expresar o guardar
como una biblioteca. Capacidad de almacenamiento.
A tener en cuenta:
- Tamaño del inserto
- Clonado o expresión (el de expresión tiene un promotor y el de
clonado no lo necesita)
- Ori: secuencia que le permite al vector replicarse ya sea con la
maquinaria bacteriana o con la del vector. Es una secuencia que
recluta la maquinaria necesaria para que se replique el hospedador.
Puedo tener ori de altos o bajos números de copias, esto va a
depender de lo que quiera hacer, ej si mi proteína es tóxica, bajo
número de copias.
- Marcador de resistencia: gen que le confiere resistencia a
determinado antibiótico. Ej si el cassette de resistencia es de
ampicilina, debo usar una bacteria que normalmente sea sensible a
ampicilina (para esto también debo elegir el hospedador bien), y
segundo debo cultivarla en un medio que tenga ampicilina. Por lo que
solo las que tengan el vector van a vivir. El resto que no se
transformaron, mueren.
- El MCS debe estar río abajo del promotor.
2) Obtener el fragmento a insertar (por ej. Por PCR, amplifico a partir de
ADNg si fuera una bacteria o de cDNA si fuera una célula eucariota, )
para diseñar los primers de la PCR debo tener en cuenta qué enzimas
de restricción me sirven para que esos primers tengan en sus
extremos los sitios de corte para esa enzima
b) Fw: ATGAAACAAGGACAG
