"Año de la recuperación y consolidación de la economía peruana"
Universidad Nacional de Piura
Facultad de Ciencias
Escuela Profesional de Ciencias Biológicas
INFORME DE PRACTICA N° 04
PCR y Electroforesis
ALUMNOS:
Arenas Rojas, Thais Belen
Chumacero Correa, Ricky Alonso
Jimenez Ramirez, Diego
LaTorre Adrianzen, Luis Eduardo
Izquierdo Ramos, Raul David
Sanchez Lopez, Renso Omar
CURSO:
Genética
DOCENTE:
Blgo. Dioses Iman, David Steven. MSc
Ciclo (2025 - I)
INTRODUCCIÓN
La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una técnica fundamental en biología
molecular que permite la amplificación in vitro de fragmentos específicos de ADN. Esta metodología,
desarrollada por Kary Mullis en 1983, ha revolucionado el estudio de los ácidos nucleicos al
posibilitar la obtención de millones de copias de una secuencia de ADN a partir de cantidades
mínimas de muestra. Se basa en la replicación del ADN mediante ciclos térmicos que incluyen
desnaturalización, alineamiento de cebadores y extensión, utilizando una ADN polimerasa
termoestable como la Taq polimerasa (Serrato et al., 2014).
La PCR se ha convertido en una herramienta indispensable en diversas áreas de la biología
molecular, incluyendo la investigación genética, el diagnóstico clínico y la identificación forense. Su
capacidad para detectar y amplificar secuencias específicas de ADN la hace especialmente útil en la
identificación de patógenos, la detección de mutaciones genéticas y la realización de pruebas de
paternidad (Ledesma, 2019). Existen diversas variantes de la PCR que han sido desarrolladas para
mejorar su sensibilidad, especificidad y aplicabilidad. Entre ellas se encuentra la PCR en tiempo real
(qPCR), que permite la cuantificación de ADN en tiempo real durante el proceso de amplificación, y
la PCR multiplex, que permite la amplificación simultánea de múltiples secuencias objetivo en una
sola reacción (Ledesma, 2019).
La electroforesis es una técnica analítica utilizada para separar moléculas cargadas, como
ácidos nucleicos y proteínas, según su tamaño y carga eléctrica. En el caso del ADN, que posee una
carga negativa debido a sus grupos fosfato, la electroforesis en gel de agarosa permite su migración
hacia el ánodo bajo un campo eléctrico. La velocidad de migración está influenciada por el tamaño de
las moléculas y la concentración del gel, permitiendo así la separación y análisis de fragmentos de
ADN amplificados por PCR (Useche & Cano, 2022).
La electroforesis en gel de agarosa es ampliamente utilizada para la separación de fragmentos
de ADN de diferentes tamaños. La concentración del gel de agarosa puede ajustarse para optimizar la
resolución de fragmentos de diferentes longitudes, y la visualización de las bandas de ADN se realiza
mediante tinción con agentes intercalantes como el bromuro de etidio, seguido de exposición a luz
ultravioleta (Laguna Miranda, 2017).
La electroforesis no solo es útil para la separación de moléculas, sino también para la
cuantificación y análisis de la pureza de las muestras. Por ejemplo, la intensidad de las bandas
observadas en el gel puede correlacionarse con la concentración de ADN presente en la muestra,
proporcionando una estimación semicuantitativa de su contenido (Yábar Varas, 2003).
El objetivo de la práctica fue aplicar la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
para amplificar un fragmento específico de ADN y evaluar la eficiencia de dicha amplificación
mediante electroforesis en gel de agarosa.
II. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Se preparó una mezcla maestra para la PCR utilizando los siguientes volúmenes por muestra:
10 μl de Premix 2X de la marca GeneOn, 8.6 μl de agua ultrapura, 0.2 μl del primer LCO, 0.2 μl del
primer HCO y 1 μl de ADN, obteniendo un volumen final de 20 μl por muestra. El Premix contenía
Taq DNA polimerasa (0.1 U/μl), dNTPs (0.4 mM cada uno), MgSO₄ (4 mM), KCl (20 mM),
(NH₄)₂SO₄ (16 mM) y Tris-HCl (20 mM, pH 8.8).
Las muestras fueron colocadas en el termociclador y se utilizó el siguiente programa de
amplificación: una desnaturalización inicial a 94 °C durante 5 minutos, seguida de 30 a 35 ciclos de
94 °C por 30 segundos, 50 °C por 30 segundos y 72 °C por 45 segundos. Finalmente, se realizó una
extensión final a 72 °C durante 5 minutos.
2.2 Electroforesis en Gel de Agarosa
2.2.1 Preparación del gel Agarosa
Se preparó un gel de agarosa al 1.5% pesando 1.2 g de agarosa, los cuales fueron disueltos en
80 ml de tampón TAE 1X. La mezcla fue calentada hasta que se volvió completamente transparente.
Luego, se dejó enfriar durante 15 minutos y se añadieron 2.5 μl del intercalante Bromuro de etidio
(altamente tóxico, por eso se utilizaron guantes de nitrilo para su manipulación), mezclando con
cuidado para evitar la formación de burbujas. Posteriormente, la solución se vertió en el molde del gel
y se dejó solidificar durante 30 minutos a temperatura ambiente.
2.2.2 Carga de las muestras en el gel
Una vez solidificado el gel, se colocó en la cámara de electroforesis y se cubrió
completamente con tampón TAE 1X. Cada muestra fue preparada mezclando 5 μl del producto
amplificado por PCR con 1 μl de colorante de carga (loading dye, azul de metileno). Estas mezclas
fueron cargadas en los pocillos del gel, junto con el control negativo, el control positivo y un
marcador de peso molecular de 100 pb. La corrida electroforética se llevó a cabo a 90 voltios durante
30 minutos.
2.3 Lectura de resultados
Finalizada la corrida electroforética, el gel fue retirado de la cámara y colocado en el
transiluminador con luz azul. En esta etapa, se procederá a observar las bandas correspondientes a los
productos amplificados por PCR. Se espera visualizar bandas en las muestras positivas, las cuales
deberían corresponder al tamaño esperado del fragmento amplificado. En las muestras negativas y en
el control negativo no deberían observarse bandas, lo que indicaría ausencia de amplificación o
contaminación. El control positivo deberá presentar una banda del tamaño esperado, lo que
confirmaría que la reacción de PCR y la electroforesis se llevaron a cabo correctamente.
III. RESULTADOS
3.1 Preparación exacta del medio para la PCR
REACTIVOS VOLUMEN (1 MUESTRA) VOLUMEN ( MUESTRA)
Premix 2x 10 um
Agua ultrapura 8.6 um
Primer LCO 0.2 um
Primer HCO 0.2 um
ADN 1 um
Volumen final 20 um
3.2 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Fig 01: Termociclador usado en la Prueba reaccion Cadena de la Polimerasa (PCR)
Fig 02: Inóculo del primer LCO a la muestra
Fig 03: Inóculo del primer HCO a la muestra
IV. DISCUSIÓN
La técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una herramienta fundamental en
biología molecular por su alta sensibilidad y especificidad en la amplificación de fragmentos de ADN
(Mullis & Faloona, 1987). En esta práctica, se emplearon primers LCO y HCO, comúnmente
utilizados para la amplificación de genes mitocondriales como el COI (Cytochrome Oxidase I), un
marcador ampliamente aplicado en estudios de genética molecular, identificación de especies y
códigos de barras genéticos (Hebert et al., 2003).
El uso del Premix 2x marca GeneOn representa una alternativa eficiente y práctica; esta
mezcla comercial ya contiene todos los reactivos esenciales para la reacción, lo cual minimiza errores
de preparación y asegura condiciones óptimas para la amplificación, tal como se ha señalado en
protocolos estándar como los de (Innis y Gelfand 1990). Uno de los elementos clave del Premix es la
Taq DNA polimerasa (0.1 U/μL), una enzima termoestable aislada de Thermus aquaticus, capaz de
soportar las altas temperaturas de la desnaturalización del ADN. (Saiki et al. 1988) demostraron que el
uso de esta enzima fue un avance determinante en la estandarización de la PCR, ya que permite
múltiples ciclos térmicos sin necesidad de agregar nueva enzima, debido a que anteriormente estas se
desnaturalizan producto de la temperatura. La inclusión de esta polimerasa en el Premix asegura la
síntesis eficiente de las nuevas cadenas de ADN durante la etapa de elongación.
Además, el Premix incluye una concentración balanceada de dNTPs (dATP, dCTP, dGTP y
dTTP, todos a 0.4 mM), los cuales son los bloques de construcción para las nuevas cadenas de ADN.
Tal como se describe en el trabajo de (Mullis y Faloona 1987), los autores también enfatizan que una
proporción equilibrada de nucleótidos es fundamental para evitar errores de incorporación y
maximizar la fidelidad de la amplificación. En este sentido, el Premix proporciona las concentraciones
adecuadas para garantizar que la Taq polimerasa funcione de manera efectiva sin limitaciones de
sustratos.
(Innis y Gelfand, 1990) señalan que el buffer MgSO₄ (4 mM), participa aportando los iones de
Mg que actúan como cofactores de la polimerasa, los autores destacan que tanto la concentración
como el tipo de sal de magnesio pueden afectar la especificidad y rendimiento de la PCR, pues
influyen en la estabilidad del ADN molde, los primers y la enzima. La concentración provista por
GeneOn está dentro del rango recomendado en literatura, lo cual favorece una amplificación eficiente.
Por otro lado, las sales como KCl (20 mM) y (NH₄)₂SO₄ (16 mM) tienen un papel crucial en la
estabilidad de los híbridos ADN-primer y en la especificidad de la reacción. El cloruro de potasio
contribuye a estabilizar la unión entre el molde y los primers, mientras que el sulfato de amonio ayuda
a prevenir la formación de dímeros de primers y productos inespecíficos, como también lo mencionan
Innis y Gelfand (1990) en sus recomendaciones sobre buffers para PCR.
Finalmente, el tampón Tris-HCl (20 mM, pH 8.8) estabiliza el pH del sistema durante los
cambios térmicos de los ciclos de la PCR. Mantener un pH alcalino es crucial para preservar la
actividad enzimática, tal como se ha reportado en protocolos estandarizados (Saiki et al., 1988). En
conjunto, el uso del Premix 2x de GeneOn (Mezcla comercial), facilita la reproducibilidad de los
experimentos de PCR, asegurando condiciones óptimas sin necesidad de realizar ajustes individuales
de cada reactivo.
El programa de termociclado es una parte fundamental de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR), ya que regula las condiciones térmicas que permiten la desnaturalización del ADN
molde, la alineación de los primers y la síntesis de las nuevas cadenas de ADN. El esquema
presentado sigue una estructura típica de PCR estándar, y su diseño responde a principios establecidos
en trabajos fundacionales como los de (Saiki et al. 1988) y (Mullis y Faloona 1987). El programa
standar inicia con una fase de desnaturalización inicial a 94°C durante 5 minutos, cuyo propósito es
asegurar que las hebras de ADN molde se separen completamente, rompiendo los enlaces de
hidrógeno entre las bases complementarias. (Innis y Gelfand 1990). (Teijon, 2006) señala que esto es
esencial cuando se trabaja con ADN genómico o con estructuras secundarias complejas. sugieren que
una desnaturalización prolongada al comienzo del protocolo mejora la eficiencia en las primeras
rondas de amplificación, permitiendo una mejor exposición de los sitios blanco para los primers.
Luego, cada ciclo incluye una desnaturalización rápida a 94°C durante 30 segundos, que
mantiene las hebras separadas antes de la hibridación. Esta temperatura es adecuada para la mayoría
de los moldes de ADN y coincide con los protocolos standar propuestos por (Saiki et al. 1988),
quienes estandarizaron estos pasos al introducir la Taq polimerasa. La siguiente etapa corresponde a la
alineación de los primers a 50°C durante 30 segundos, lo cual permite su unión específica a las
secuencias complementarias del ADN molde. Esta temperatura puede considerarse relativamente baja,
por lo que sugiere que los primers usados en este experimento tienen una temperatura de fusión (Tm)
también baja, o que se busca maximizar la sensibilidad del ensayo. Según (Teijon, 2006), la
temperatura de alineamiento debe ajustarse cuidadosamente para evitar productos inespecíficos, ya
que temperaturas menores favorecen uniones no específicas. Sin embargo, cuando se prioriza la
amplificación de fragmentos presentes en baja concentración, una temperatura como esta puede ser
funcional. Posteriormente, la elongación se realiza a 72°C durante 45 segundos, que es la temperatura
óptima para la actividad de la Taq DNA polimerasa. Durante esta etapa, la enzima incorpora los
nucleótidos (dNTPs) en la cadena de ADN complementaria. La duración de esta fase depende del
tamaño del fragmento que se desea amplificar; en general, la Taq polimerasa puede sintetizar
alrededor de 1000 bases por minuto, por lo que 45 segundos es adecuado para fragmentos menores a 1
kb, como recomiendan (Mullis y Faloona 1987).
Después de completar los 30 a 35 ciclos de amplificación, se realiza una elongación final a
72°C durante 5 minutos. Esta etapa tiene como propósito asegurar que cualquier cadena de ADN
parcialmente extendida se complete antes de finalizar el programa. Según (Innis y Gelfand 1990), esta
fase final mejora el rendimiento y la calidad de los productos amplificados, especialmente cuando se
utilizan en aplicaciones posteriores como clonación o secuenciación. En conjunto, este programa de
termociclado está basado en parámetros standar que se siguen cuando se realiza esta práctica para un
resultado exitoso en la siguiente fase; la electroforesis.
En cuanto a la electroforesis en gel de agarosa, se utilizó una concentración de agarosa al
1.5%, la cual es apropiada para separar fragmentos de ADN entre 100 y 1000 pb (Sambrook &
Russell, 2001). Esta concentración permite una buena resolución de los productos esperados. Además,
el uso de bromuro de etidio, (compuesto toxico). Históricamente, el bromuro de etidio (EtBr) ha sido
el reactivo de elección debido a su alta sensibilidad, bajo costo y facilidad de uso, sin embargo, su
amplio empleo ha generado una preocupación significativa en la comunidad científica debido a sus
inherentes propiedades mutagénicas y carcinogénicas.
(Solari, 2004) señala que el EtBr es un compuesto intercalante que se inserta entre las bases del
ADN, lo que le permite fluorescer intensamente bajo luz ultravioleta. Esta intercalación es la base de
su capacidad para visualizar el ADN, pero también es el mecanismo por el cual ejerce su toxicidad; al
alterar la estructura del ADN, el EtBr puede interferir con procesos celulares cruciales como la
replicación y la transcripción, lo que lleva a mutaciones genéticas y, potencialmente, al desarrollo de
cáncer. Numerosos estudios han documentado la genotoxicidad del EtBr tanto in vitro como in vivo,
lo que ha impulsado la búsqueda de alternativas más seguras (Marmur & Doty, 1962; Singer et al.,
1999) resaltan que la exposición a este reactivo, incluso en cantidades mínimas, requiere precauciones
estrictas como el uso de guantes, gafas de seguridad y trabajo en campanas de extracción, así como
procedimientos especializados para su eliminación, lo que añade complejidad y costo a los
experimentos de laboratorio, debido a que se manipulo mínimamente, solo se utilizo guantes de nitrilo
para su manejo durante la práctica, aunque se recomienda usar los protocolos señalados por los
autores.
En esta práctica se utilizó tampón TAE (Tris-Acetato-EDTA) para la preparación del gel de
agarosa y para la electroforesis, una elección común en muchos protocolos por su alta resolución en
fragmentos grandes de ADN y buena capacidad de migración (Sambrook & Russell, 2001). No
obstante, algunos autores prefieren el uso de tampón TBE (Tris-Borato-EDTA), especialmente cuando
se busca una mayor capacidad de amortiguación y mejor definición en fragmentos pequeños, aunque
este presenta una menor tasa de migración del ADN (Maniatis et al., 1982). Además, estudios como
los de Brody & Kern (2004) han señalado que el TBE es más estable durante corridas prolongadas, ya
que mantiene el pH de forma más constante, lo que reduce el riesgo de difuminación de las bandas.
Sin embargo, el TAE es más adecuado cuando se planea extraer ADN del gel para aplicaciones
posteriores, debido a que su bajo contenido en sal interfiere menos en reacciones enzimáticas
posteriores, como digestiones o ligaciones.
El tampón TAE (Tris-Acetato-EDTA) es una de las soluciones más comúnmente empleadas
en las prácticas de electroforesis en gel de agarosa, esta solución ofrece un entorno químico que
permite el paso de la corriente eléctrica y mantiene la estabilidad estructural del material genético
durante el proceso de migración en el gel. Uno de los componentes es el Tris
(trishidroximetil-aminometano), el cual actúa como un buffer que mantiene el pH del sistema cerca de
8.0. permitiendo que las moléculas de ADN mantengan su carga negativa y, por lo tanto, migren
adecuadamente hacia el polo positivo durante la electroforesis. (Sambrook & Russell, 2001) señala
que un pH fuera de este rango podría alterar la carga de las moléculas de ADN o ARN, afectando su
movilidad e incluso su integridad . (Green & Sambrook, 2012) señalan que el segundo componente, el
ácido acético glacial, proporciona el ion acetato, que junto con Tris forma el sistema buffer
Tris-acetato, contribuyendo al control del pH, a la conductividad iónica del medio, permitiendo que
fluya la corriente eléctrica a través del gel de agarosa. La elección del ion acetato frente a otros como
el borato (usado en el TBE) es importante cuando se desea recuperar ADN del gel posteriormente, ya
que el TAE tiene menor capacidad de interacción con el ADN y, por ende, facilita su extracción.
Por su parte, el EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) en su forma sal disódica dihidratada
actúa como un agente quelante de iones divalentes, principalmente Mg²⁺ y Ca²⁺, los cuales son
cofactores esenciales para las nucleasas, enzimas capaces de degradar ácidos nucleicos, al secuestrar
estos iones, el EDTA inhibe la actividad de estas enzimas y protege el ADN o ARN de la degradación
durante la preparación y ejecución del experimento (Ausubel et al., 2003), señala que aunque el
tampón TAE presenta ciertas ventajas como una mejor recuperación del ADN y una migración más
rápida de fragmentos pequeños, también tiene limitaciones. El autor señala que su capacidad
tamponadora es menor que la de otros tampones como el TBE, por lo que no es ideal para corridas
largas o de alto voltaje, ya que puede agotarse rápidamente y provocar un descenso del pH, alterando
la movilidad electroforética y la resolución de las bandas, información que es destacada por (Maniatis
et al., 1982).
La iridiscencia en los geles de agarosa utilizados en electroforesis ocurre principalmente debido
a interferencia constructiva y destructiva de la luz en la estructura semisólida del gel. Esta propiedad
óptica es similar a la que se observa en burbujas de jabón, alas de insectos o en una película de aceite
sobre agua. (Voet y Pratt, 2007) señalan que el gel de agarosa está compuesto por una matriz
tridimensional de polisacáridos que forman poros microscópicos. Cuando el gel se somete a una
corriente eléctrica, se pueden generar gradientes térmicos y estructurales dentro del gel, que provocan
variaciones en el índice de refracción del medio. Estas variaciones, combinadas con la iluminación
ambiental (por ejemplo, la luz blanca del laboratorio), causan que ciertas longitudes de onda se
refuercen o cancelen mutuamente, dando lugar al efecto iridiscente que se observa como destellos o
colores tornasolados en la superficie del gel, tal y como se observó en el momento de ver el gel bajo la
luz UV. (Sanger, Nicklen, & Coulson, 1977).
Por otro lado, la tinción con bromuro de etidio se intercalan con el ADN y fluorescen bajo luz
UV o azul, pueden amplificarse efectos ópticos adicionales. Estas sustancias también tienen índices de
refracción propios que pueden alterar la forma en que la luz se refleja en el gel. (Voet y Pratt, 2007)
señalan que la iridiscencia puede ser más notoria si el gel está parcialmente deshidratado o si ha sido
manipulado o secado. Esto cambia la estructura superficial del gel, haciéndola más lisa y permitiendo
una reflexión más uniforme de la luz incidente. También influye la densidad del gel de agarosa, ya que
como señala (Huang et al., 2002) en concentraciones más altas tienden a producir una matriz más
densa, con mayor posibilidad de refracción e interferencia de la luz.
El principio básico que explica la migración del ADN a través del gel se basa en la interacción
entre la carga eléctrica de las moléculas y el campo eléctrico aplicado. (Sambrook & Russell, 2001;
Green & Sambrook, 2012) señalan que al ser el ADN una macromolécula cargada negativamente
debido a la presencia de grupos fosfato en su esqueleto, al aplicar un campo eléctrico en el gel de
agarosa, el ADN es atraído hacia el polo positivo (ánodo), migrando a través de la matriz porosa del
gel. Los autores destacan que la velocidad de migración está influenciada por el tamaño de los
fragmentos; asi los fragmentos más pequeños se desplazan con mayor facilidad y rapidez a través de
los poros del gel, mientras que los fragmentos más grandes encuentran mayor resistencia, migrando
más lentamente.
Por otro lado, la matriz de agarosa actúa como un tamiz molecular que restringe el movimiento
de las moléculas de ADN en función de su longitud, (Brody & Kern, 2004) señalan que al estar
compuesta por una red tridimensional de polisacáridos que forma poros de tamaño variable, los cuales
dependen de la concentración de agarosa utilizada. Además, la migración del ADN no depende de su
forma ni secuencia, sino principalmente de su masa molecular lineal, esto permite que la técnica sea
reproducible y útil para la estimación del tamaño de los fragmentos al compararlos con un marcador
de peso molecular o "ladder". (Maniatis et al., 1982) señala que el tampón TAE proporciona un pH
constante y una conductividad iónica adecuada para facilitar el flujo de corriente eléctrica. Además, el
EDTA del tampón protege el ADN de posibles degradaciones al quelar iones metálicos divalentes que
actúan como cofactores de nucleasas.
V. CONCLUSIONES
La PCR es una técnica de amplificación específica y sensible del ADN, que durante la
práctica, se evidencia cómo, a partir de una cantidad ínfima de material genético inicial, se pueden
generar muchas copias de una secuencia de interés, determinada por el diseño de los cebadores
(primers) y los reactivos que se utilizan.
La Electroforesis en gel de agarosa es el método estándar para visualizar y analizar los
productos de PCR que permite la separación de los fragmentos de ADN amplificados según su
tamaño, lo que es esencial para confirmar la amplificación de la muestra.
Se observó que la presencia de una banda clara y nítida bajo la luz UV, nos mostró que la
PCR fue exitosa.
La combinación de PCR y electroforesis no solo permite la amplificación y visualización,
sino que también sirve como una forma de control de calidad para ambas técnicas
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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