UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DEL VALLE DE TOLUCA ASIGNATUIRA: INGENIERÍA GENÉTICA
INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA FACILITADOR: M. en C. DIANA ROCÍO RUÍZ SAÉNZ
PCR
INVERSA
INTEGRANTES:
CORRAL OROZCO CÉSAR ENRIQUE
HERNÁNDEZ SALGADO ITZEL LUCERO
OROZCO GÓNZALEZ JONATHAN JOEL
RAMÍREZ BUSTAMANTE OSIEL NAID
¿QUÉ ES LA PCR INVERSA?
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) estándar se utiliza para amplificar un
segmento de ADN que se encuentra entre dos cebadores que apuntan hacia adentro.
Por el contrario, la PCR inversa (también conocida como PCR invertida o de adentro
hacia afuera) se utiliza para amplificar secuencias de ADN que flanquean un extremo
de una secuencia de ADN conocida y para la cual no hay cebadores disponibles.
Implica la digestión por una RT-PCR Los fragmentos de
restricción individuales se
enzima de restricción de
una preparación de ADN convierten en círculos por
que contiene la secuencia ligación intramolecular, y el
conocida y su región ADN circularizado se utiliza
flanqueante. entonces como molde en la
PCR.
El producto de la reacción La secuencia desconocida
de amplificación es un se amplifica por dos
fragmento de ADN lineal cebadores que se unen
que contiene un solo sitio específicamente a la
para la enzima de secuencia conocida y
restricción utilizada apuntan en direcciones
originalmente para digerir el opuestas.
ADN.
El tamaño del fragmento amplificado depende de la
distribución de los sitios de restricción dentro de las
secuencias de ADN conocidas y flanqueantes.
LA RT-PCR SE COMPONE DE LOS
SIGUIENTES PASOS:
Conversión del ARN
1 en ADNc usando
transcriptasa inversa
2 Amplificación del ADNc
usando PCR
Pasos para crear ADNc a partir de una plantilla de ARNm. Usando un cebador oligo(dT), el
ARNm se transcribe inversamente en ADNc y se hidroliza la hebra de ARN.
REACCIÓN RT-PCR
El ADNc es ADN
La síntesis de ADNc la cataliza una enzima llamada transcriptasa sintetizado a partir de
inversa, que utiliza al ARN como plantilla para la síntesis del ADN. moléculas de ARN
mensajero.
La reacción RT-PCR se compone de los siguientes pasos:
Se utiliza un La transcriptasa El híbrido resultante
fragmento de oligo(T) inversa utiliza el ARN-ADNc se separa
como cebador para ARNm como plantilla al aumentar la
unirlo a la cola de para sintetizar las temperatura.
poli(A) del extremo 3' hebras de ADNc.
de cada ARNm.
Las hebras se La ADN polimerasa Un cebador
separan aumentando produce la hebra de ADN específico se hibrida
la temperatura y el complementaria, con su secuencia
ciclo PCR se repite. comenzando por el complementaria.
primer sitio de unión.
A. RT-PCR de un paso
TIPOS DE RT-PCR B. RT-PCR de dos pasos
La RT-PCR de un solo paso combina la transcripción inversa y la amplificación por PCR en una sola
reacción, mientras que la RT-PCR de dos pasos separa estas etapas, lo que ofrece flexibilidad en la
selección de cebadores y el potencial de realizar múltiples análisis a partir de una síntesis de ADNc.
RT-PCR DE UN PASO
En la RT-PCR de un solo paso tanto la transcripción inversa
como la PCR en tiempo real se realizan en el mismo tubo,
precediendo la transcripción inversa a la PCR. Esto es
posible gracias a la química de reacción especializada y a
los protocolos de ciclado. Este procedimiento permite el
procesamiento rápido de múltiples muestras y es fácil de
automatizar. La reducción del número de pasos de
manipulación resulta en una alta reproducibilidad entre
muestras y minimiza el riesgo de contaminación, ya que
requiere menos manipulación.
RT-PCR DE DOS PASOS
El ARN se transcribe primero de forma inversa a ADNc
utilizando cebadores oligo-dT, oligómeros aleatorios o
cebadores específicos del gen. A continuación, se añade
una alícuota de la reacción de transcripción inversa a la PCR
en tiempo real. El uso de cebadores oligo-dT u oligómeros
aleatorios para la transcripción inversa significa que se
pueden analizar varios transcritos diferentes por PCR a partir
de una única reacción de RT. Además, las muestras de ARN
se pueden transcribir inmediatamente a ADNc más estable.
CEBADORES
RT-PCR de un RT-PCR de dos
paso pasos
El cebador de PCR corriente abajo también es el Se pueden utilizar 3 tipos de cebadores y mezclas de los
cebador para la transcripción inversa. Por lo mismos para la transcripción inversa:
tanto, la RT-PCR de un solo paso siempre se Cebadores oligo-dT (normalmente de 13 a 18 meros). Solo
realiza con cebadores específicos del gen. se transcribirán de forma inversa los ARNm comenzando
por la cola de poli-A en el extremo 3'.
Oligómeros aleatorios (como hexámeros, octámeros o
nonámeros). Permitirán la transcripción inversa de toda la
población de ARN, incluyendo el ARN ribosómico, el ARN de
transferencia y los ARN nucleares pequeños.
Cebadores específicos del gen. Permiten la transcripción
inversa de un transcrito específico.
VENTAJAS DE LA RT-PCR
DESVENTAJAS DE LA RT-PCR
APLICACIONES DE LA RT-PCR
CONCLUSIONES
La RT-PCR es una herramienta poderosa y versátil para el
análisis de ARN.
Sus aplicaciones son vastas y continúan expandiéndose en
investigación y diagnóstico.
Requiere atención meticulosa a los detalles para obtener
resultados precisos y confiables
