MEDIOS DE CULTIVO PREPARACION MEDIO DE CULTIVO:

• Polvo deshidratado + agua destilada

• Lo caliento agitando lentamente hasta que se disuelva.
Es un conjunto equilibrado de nutrientes en una sustancia liquida o solida que reúnen las • Ajustamos el pH si es necesario con NaOH o HCl.
condiciones necesarias para permitir el desarrollo de los microorganismos. • Fraccionamos o cerramos con tapa plástica o de algodón.
Condiciones generales: CONCISTENCIA, NUTRIENTRES Y ESTERILIDAD. Les debo aportar: pH, • Esterilizar en autoclave (en caso que se pueda).
temperatura, oxígeno, humedad, composición química. • Se distribuyen en placas

Se clasifican según utilidad:

Se clasifican según su consistencia en:
• Selectivos: Favorecen el crecimiento de un determinado Liquido: se disponen em matraces, frascos,
grupo de bacterias mientras inhiben el desarrollo de otras. tubos. Los microorganismos crecen en todo el
Ejemplo: Cetrimida (CET) para las pseudomonas y Löwenstein- medio, no se distinguen colonias.
Jensen (L-J)
Solido: tienen una proporción de agar, puede
• Diferenciales: permite distinguir microorganismos según su ser en placas de Petri o tubos. Le permite a la
crecimiento (fermenta o no azúcar) (indicador de pH de célula formar colonias aisladas.
acuerdo a su metabolismo y nutrientes utilizados). Ejemplo:
Agar sangre (AG), SIM, Citrato de Simmons, TSIA. Semi solido: poca proporción de agar, suele
fraccionarse en tubos y se utilizan
• Ejemplos de selectivo-diferencial: MacConkey (MCC) es generalmente para pruebas bioquímicas y de
para enterobactérias, Manitol Sal Agar (MAS) es para motilidad o como medio de transporte. No se
estafilococos y Agar XLD, Agar SS. visualizan colonias
• Nutritivos: medios líquidos o solidos que tienen los nutrientes mínimos,
permite el crecimiento de cualquier microorganismos no exigentes.
Ejemplo: Agar tripticasa soja ( TSA), Agar nutritivo (AN) que se utiliza para
cualquier tipo de bacteria si no conozco procedencia de la muestra,
y Caldo nutriente (CN)

• De enriquecimiento: medios líquidos que permiten el crecimiento

preferencial de ciertas bacterias. Ejemplos: Caldo tetrationato, Caldo
Cooked Meat.
 Agar Mac Conkey (MCC): medio de cultivo sólido en placa selectivo y diferencial.
Agar nutritivo (AN): medio sólido nutritivo en placa con Para aislamiento de bacilos Gram – (enterobacterias), fermentadores y no
extracto de carne o de levadura, peptona, cloruro de sodio fermentadores de la lactosa. Contiene peptonas como nutriente y lactosa (hidrato de
y 1,5 % de agar. carbono fermentable)
• Escherichia coli lactosa + , generando una acidificación del medio (rosado)
Agar tripicasa soja (TSA): Es un medio multiuso sólido • Salmonella y Proteus, lactosa - , y alcalinizan el medio (amarillo)
nutritivo en placa. Posee triptona, peptona de soya
(fuente de hidratos de carbono), cloruro de sodio y agar. Manitol Sal Agar (MSA): medio de cultivo sólido en placa selectivo y diferencial
para el aislamiento de Staphylococcus spp. Contiene extracto y peptona de carne
Agar sangre (AS): Es un medio de cultivo sólido diferencial. como nutrientes, manitol como hidrato de carbono fermentable y rojo fenol como
Al ser suplementado con sangre permite la visualización de indicador de pH.
las reacciones de hemólisis (alfa, beta y gamma) • Staphylococcus aureus produce colonias de color amarillo (Manitol +)
• betahemólisis consiste en la lisis total o completa de los • Staphylococcus epidermidis produce colonias de color fucsia (Manitol -)
glóbulos rojo
• La alfahemólisis es la lisis parcial o incompleta de los Agar Cetrimida (CET):Selectivo: La cetrimida es un detergente que actúa inhibiendo
glóbulos rojos el crecimiento de otras bacterias diferentes a Pseudomonas. aeruginosa. Contiene
• La gammahemólisis es la ausencia de hemólisis cloruro de magnesio y sulfato de potasio que estimulan la producción de
pigmentos (verde).
 TÉCNICAS DE SIEMBRA EN MEDIOS DE CULTIVO
Sembramos en medios de cultivo para hacer que las bacterias se reproduzcan con el
objetivo de aumentar el número de individuos de una población y realizar un diagnóstico

SIEMBRA EN MEDIO SOLIDO: en placa por estría. SIEMBRA EN MEDIO SOLIDO: en tubo. Para realizar pruebas
Objetivo: obtener colonias aisladas para poder identificar bioquímicas o para el cultivo de Mycobacterium.
el microorganismo. Dos tipos:
Se inocula la muestra sobre un extremo de la placa y se 1. En profundidad y superficie (ej. TSIA). Se siembra con hilo.
extiende con el asa formando estrías. La siembra en profundidad se realiza para favorecer el
crecimiento en anaerobiosis y la siembra en superficie para el
crecimiento de aerobiosis. Se utiliza para identificar
enterobacterias (anaerobias facultativas)
2. Sobre superficie inclinada (ej. Citrato de Simmons). Se
siembra por estría en la superficie por asa o por hilo. Si la
muestra es solida se usa asa o hilo, si la muestra es liquida
solo asa.

SIEMBRA EN MEDIO LIQUIDO: se realiza con asa. El

crecimiento bacteriano se evidencia con la turbidez del medio.

SIEMBRA EN MEDIO SEMISOLIDO: en tubo.

Se utiliza para estudiar la movilidad de las
bacterias y la producción de gas sulfhídrico. Se
realiza con hilo.
 PREPARACIÓN PARA LA OBSERVACIÓN
FORTIS: Extensión de una muestra o cultivo que se realiza sobre un portaobjetos con objetivo de separar lo más posible Los pasos a seguir para una perfecta identificación
los microorganismos. bacteriana son:
Tipos de frotis: 1. Obtención un cultivo puro
1. Frotis en fresco o húmedo: para poder visualizar los microorganismos vivos, se aprecia movimiento, tamaño y forma 2. Examen microscópico de células vivas y de frotis
natural. teñido por coloración Gram. Se determina así
2. Frotis secado, fijado y coloreado: la mayoría de las veces es necesario que las bacterias presentes en nuestro frotis sean la forma y las características tintoriales del
coloreadas ya sea para poder observar mejor su forma, agrupación, tamaño o para evidenciar alguna característica microorganismo en estudio.
en particular. Tinción de gram. 3. Determinar las características nutricionales (en
3. Frotis por impresión o aposición: para realizar la tinción de cápsula bacteriana. general se desprenden de los métodos
empleados en el aislamiento y cultivos
PROCEDIMIENTO FROTIS SECADO Y FIJADO: anteriores)
1. Preparación de la lamina: el porta objeto se sumerge en alcohol-acetona, se seca con un paño y se pasa por un 4. Realización de pruebas primarias (Gram,
mechero. morfología, catalasa, oxidasa, fermentación de
2. Extensión del material: para liquido se coloca una gota de cultivo en el porta objeto y con el asa se extiende. glucosa, esporas, crecimiento en aerobiosis y
Para sólido se coloca una gota de agua destilada estéril y con el asa saco una colonia de la placa y la pongo anaerobiosis y movilidad).
sobre la gota con movimientos circulares. 5. Realización de pruebas secundarias y terciarias a
3. Secado: poner el porta objeto sobre el mechero para que las células se deshidraten. efectos de llegar a especie. Estas dependerán del
4. Fijado: pasar tres veces el porta objeto por el fuego, se matan las bacterias (la forma se mantiene por la género o familia determinado. (ej: producción de
deshidratación) y fijo la muestra al vidrio. pigmentos, producción de indol a partir de triptófano,
producción de coagulasa, ureasa, TSIA, etc.
PROCEDIMIENTO TINCIÓN DE GRAM: Tinción diferencial: los m.o difieren en la composición de la pared
1. Obtención de un frotis secado y fijado
2. Cubrir con solución de cristal violeta (colorante primario) y dejar 1 min.
3. Lavar suavemente con agua.
4. Cubrir con lugol (mordiente) y dejar 1 min.
5. Lavar con agua.
6. Cubrir con alcohol- acetona (diferenciador) y dejar 15- 30 seg. moviendo suavemente la lámina. Continuar lavando
con alcohol- acetona hasta que no se arrastre más colorante.
7. Lavar con agua.
8. Cubrir con solución de safranina (colorante secundario o de contraste) y dejar 1 min.
9. Lavar y secar.
10. Observar al microscopio óptico con el objetivo 100X con aceite de inmersión. Las bacterias Gram positivo se verán de
color violeta y las Gram negativo rosadas
TINCION DE ESPORAS: En Bacillus y Colstridium. ¿Qué TINCION DE CÁPSULA: TÉCNICA DE AZUL DE METILENO DE
información nos brinda la tinción de esporas? Presencia o ausencia LOEFFLER. En Bacillus Anthrasis, Escherichia Coli y
de esporas y posición dentro del cuerpo celular (Terminales, Staphylococcus aureus
Centrales y Subterminales (posición intermedia)) • Preparación del fortis: Impronta (órgano) Secado del frotis
• Poner sobre un portaobjetos una gota de agua y una pequeña • Fijación química: alcohol metílico (NO calor)
porción de un cultivo bacteriano • Teñir con azul de metileno de Loeffler por 2 o 3 minutos
• Hacer el frotis. • Lavar y secar
• Dejar secar. • Observar al microscopio óptico con objetivo de 100 X con aceite
• Fijar la preparación. de inmersión.
• Cubrir con unas gotas de verde malaquita y aplicar calor con un
hisopo de lana de vidrio, mantener 5 minutos desde el comienzo
de la emisión de vapores
• Lavar el exceso de colorante con agua.
• Cubrir con el colorante de contraste, safranina durante 1 minuto
• Lavar el exceso de colorante con agua.
• Dejar secar al aire.
• Añadir una gota de aceite de inmersión y observar al microscopio
100X
 PRUEBAS PRIMARIAS Y SECUNDARIAS DE IDENTIFICACIÓN
PRIMARIAS: MOVILIDAD: prueba para saber si la bacteria se mueve o no. Para genero Bacillus
CATALASA: descompone el H2O2 (desecho) en Oxígeno y agua. Si en una gota nos permite diferenciar entre [Link] (inmóvil) de otras especies móviles.
de H2O2 colocamos nuestro medio (con asa).
• Reacción positiva: burbujas. Staphylo y Bacilos
• Reacción negativa: no burbujas. Strepto y Clostridium

OXIDASA: deteca la Citocromo C oxidasa (enzima de la cadena respiratoria de las SIM: Sulfhídrico, Indol, Movilidad.
bacterias aerobias estrictas; ejemplo: pseudomonas, B. Anthrasis). En un papel de
filtro se pone una gota de reactivo de oxidasa y con un tip de plástico tomamos Además de la movilidad de la bacteria también nos permite determinar la producción de
cultivo y ponemos en el reactivo. indol y la producción de sulfhídrico.
• Si hay un cambio de color (rosado) la reacción es positiva: Pseudomona. Procedimiento: Tomar la muestra de una colonia con el hilo y sembrar en el medio SIM por
• Si no cambia de color la reacción es negativa: Enterobacteria. punción. Incubar a 37°C durante 24 hs. Luego de retirar de la estufa colocar 3- 5 gotas
del reactivo de Kovaks.
• La producción de un anillo rosado en la superficie indica Indol +
• La formación de un precipitado negro indica la producción de Sulfhídrico
• La movilidad se lee por enturbiamiento homogéneo.

POTASA: Expongo a mi bacteria a un reactivo (KOH 3%) quien mata a las gram -.
Mezclamos el reactivo con nuestro cultivo.
• Reacción positiva: moco. Bacteria gram -
• Reacción negativa: no moco. Bacteria gram +

PRUEBA OXIDO FERMENTACIÓN

CALDO TIOGLICOLATO

COAGULASA:
Tocar la colonia con el ansa. Sembrar en el tubo con el plasma raspando contra el
vidrio asegurándose que el inóculo quede en el tubo. No agitar. Incubar en baño de
agua a 37°C . Mirar el tubo periódicamente y hasta 24 hs.
Si la prueba da coagulasa positiva al dar vuelta el tubo se observará un coagulo en el
fondo del tubo. Se considera que la prueba es positiva si el plasma es coagulado en 3 a
4 horas, aunque algunas cepas con escasa producción de coagulasa sólo coagulan el
plasma después de 24 horas de incubación.
 PRUEBAS SECUNDARIAS DE IDENTIFICACIÓN
El IMVIC es una serie de pruebas utilizadas para la
identificación de bacterias. Principalmente para la TSIA: Triple azúcar (glucosa, sacarosa, lactosa) y Fe (si queda negro se
diferenciación de enterobacterias. Se compone de cuatro produce H2S). Puedo ver además si la bacteria produce gas.
pruebas: Indol, Rojo-metilo, Vouges-Proskauer y Citrato • Pico rojo: fermento solo la glucosa
• Amarillo entero: fermentan los tres azucares.
INDOL: Se determina si la bacteria posee la enzima • Negro: produjo H2S
triptofanasa que convierte al triptófano en indol y
alanina. Se siembra parte de la colonia en el caldo y se
incuba a 37°C por 48hs y se agrega 3-5 gotas de
reactivo de Kovaks.
• Positivo: anillo rosado arriba
• Negativo: anillo amarillo propio del reactivo.
ROJO METILO Y VOUGUES PROSKAUER: para
determinar si una bacteria es capaz de fermentar la glucosa
por medio de la vía ácido-mixta (RM) o por la vía
butanodiolica (VP). Se siembra el cultivo en caldo R M V P y
luego lo divido en dos tubos, en uno revelo el RM con 5
gotas de reactivo R M (positivo: rojo, negativo: amarillo) y
en otro revelo el VP con 12 gotas de α naftol y 4 de KOH
40% (positivo: cambio de color en superficie, negativo:
ningun cambio)
CITRATO: para determinar si un microorganismo es
capaz de crecer utilizando citrato como única fuente de
carbono y sales amoniacales como única fuente de
nitrógeno.
Se toca una colonia del cultivo en placa y se siembra
con ansa o hilo en el pico de flauta ( con indicador UREASA: determina si la bacteria es capaz de
de pH azul de bromotimol) realizando estrías. hidrolizar la urea y utilizarla como fuente de nitrógeno.
Si el microorganismo es capaz de crecer con citrato Se hace en un medio de urea Christensen en pico de
también será capaz de utilizar las sales de amonio esto flauta.
lleva a la liberación del amoniaco aumentando el pH y el • Positivo: Rosado
indicador dará un viraje a azul (positivo). Si es negativo • Negativo: amarillo
el medio permanecerá verde.
 RESISTENCIA O SENSIBILIDAD BACTERIANA
ANTIBIOGRAMA: Nos permite clasificar directamente a un microorganismo como sensible o resistente a un
antibiótico (cualitativo)

METODO DE KIRBY-BAUER:
1. Preparación del inoculo: dos maneras:
• Método del medio de cultivo liquido o de Kirby-Bauer: se toma un asa de cultivo puro (3-5 colonias)
y se suspende en 5ml de caldo Mueller Hinton en tubo (nutritivo con mínimas sustancias
inhibitorias, no afecta la función del antibiótico). Se comprueba la turbidez con la escala de Mc.
Farland 0,5 y se incuba de 2 a 5 horas a 37°C.
• Método de suspensión directa de colonias o de Kirby-Bauer modificado: se toma un asa de cultivo
puro (3-5 colonias) y se supende en 5ml de suero fisiológico estéril y se ajusta la concentración
con la escala de Mc. Farland 0,5.
2. Siembra: meto un hisopo en la muestra liquida, y lo siembro en una placa con medio MH.
3. Colocación de los discos: entre 6 y 9. Para la selección de los antibióticos se deberá tener en
cuenta en primer lugar la acción y espectro de estos, así como el tipo de bacterias en la muestra:
Gram positivas o negativas.
4. Predifusion: dejar la placa con los discos de 15 a 30 min para que el antibiótico se difunda en el
medio.
5. Incubación: se invierte la placa y la incubamos en estufa a 37°C por 18-24hs.
6. Lectura e interpretación: la realizamos midiendo el diámetro del halo de inhibición alrededor de cada
antibiótico. La lectura la debemos realizar con regla o calibre y comparamos el diámetro con las
tablas proporcionadas por NCCLS que, según el diámetro del halo de inhibición de crecimiento
bacteriano, se determina si el microorganismo es resistente, sensible o intermedio.

• Si es sensible: el antibiótico tiene altas posibilidades de respuesta al tratamiento

• Si es intermedio: se debe usar altas dosis para que el tratamiento sea eficaz
• Si es resistente: no se debe usar porque no tendremos resultados terapéuticos.

UFC: unidades formadoras de colonias

 MICOLOGIA - HONGOS
Para identificar los hongos se estudian las diferentes caracteres de estructuras como son morfología
macroscópica y microscópica del micelio ( micelio aéreo y vegetativo ), tipo de hifas ( presencia o ausencia
de septo) y de esporas. Se evalúa la forma, el tamaño , la disposición y aspecto externo, de los mismos.

Los dermatofitos en particular son hongos filamentosos patógenos de humanos y animales que
afectan la piel y tejidos queratinizados .
En medicina veterinaria existen dos géneros de importancia que son : Trichophyton y Microsporum y
presentan macroconidios con ciertas particularidades que nos permiten distinguir un género de otro

Toma de muestras para diagnóstico de Dermatofitosis ( micosis superficial): Es

fundamental realizar adecuadamente la toma de muestra a partir de la lesión patológica.
• Piel y pelos: La muestra se toma con bisturí, pinza o cepillo especialmente de los
bordes de la lesión, los pelos rotos y uñas
• Mucosas y conducto auditivo: Estas muestras se toman con hisopos estériles
Siembra en medios de cultivo: suplementarlo con antibiotico, para que no proliferen
bacterias.
• Sabouraud Dextrosa Agar (SDA) es un medio selectivo para dermatofitos. La
peptona y la glucosa son los nutrientes para el desarrollo del hongo
• Papa Dextrosa Agar (PDA): Contiene una infusión de papa como fuente de
almidones y dextrosa como base para el crecimiento de mohos y levaduras.
Examen macroscópico de los cultivos:
Microsporum canis: Anverso de placa con color blanco con un halo periférico de color
naranja brillante; reverso, anaranjado-amarillento o marrón –amarillento
Trichophyton mentagrophytes: Anverso de placa color crema a tostado y pulverulento;
reverso tostado a marrón oscuro., rojo vino
Examen microscópico directo de preparaciones en fresco: las esporas (conidios) de
los hongos, que rodean los pelos infectados o las hifas en los tejidos infectados, pueden
ponerse de manifiesto tras el tratamiento de las muestras recogidas agregándoles unas
gotas de KOH al 10% sobre un portaobjeto, durante algunas horas. Esto permite
clarificar todo tipo de muestras clínicas con abundantes células, restos celulares y
observar la morfología y la pigmentación fúngica. La disposición de las esporas en el
pelo puede ser del tipo ectotrix (infección externa del pelo) o endotrix (infección interna
del pelo)
Examen microscópico de las colonias: Para la observación microscópica partiendo de las colonias se emplean frotis y tinciones especiales para
preservar la integridad de las estructuras (hifas y conidios ) de estos microorganismos.
Existen 2 formas de realizar el frotis fresco:
• Sin cinta adhesiva: Se prepara la lámina portaobjeto. Se coloca una o dos gotas de azul de lactofenol sobre el portaobjeto. Se deposita un
trozo del cultivo sobre la gota. Se deja caer el cubreobjeto encima y se calienta suavemente en la llama del mechero. Observar al microscopio
con los objetivos en seco ( 10 X y 40 X ).
• Con cinta adhesiva: Se prepara la lamina portaobjeto. Se corta 4 -5 cm de cinta adhesiva y tomarla por los extremos. Cerca del mechero abro la
placa y presiono ligeramente la cinta sobre la periferia de la colonia. Se coloca la muestra adherida sobre una gota de azul de lactofenol
(previamente colocada en la placa) Dejar reposar 3-5 minutos. Observación al microscopio con los objetivos 10 X y 40 X.
El azul de lactofenol es un colorante que permite identificar al microscopio las estructuras típicas de los hongos (hifas , conidios )

Microsporum canis: Macroconidios abundantes en forma de huso ( fusiformes ) de

pared gruesa con varios septos ( 7 a 15 ) microconidios escasos.
T. mentagrophytes Presenta hifas tabicadas en raqueta, . Espirales- Microconidios
abundantes.y macroconidios escasos en forma de cigarro de pared delgada y hasta 7
septos.
 LEVADURAS
EXAMEN DIRECTO MICROSCÓPICO.
a) Toma de muestras de oído o raspaje de piel
b) b) Preparación de un frotis y tincion de Gram

SIEMBRA EN MEDIOS DE CULTIVO: Agar Sabouraud dextrosa en aerobiosis.

EXÁMEN MACROSCÓPICO DE LOS CULTIVOS: El aspecto de las colonias es de color crema y son opacas con una superficie lisa. Incubación en
estufa por varios días en agar Sabouraud dextrosa.

EXAMEN MICROSCOPICO DE LOS CULTIVOS:

Cándida albicans es la especie implicada con más frecuencia en enfermedades animales.
Sus células son de forma ovoide y puede desarrollar hifas septadas. Crece en aerobiosis a 37ºC en una gran variedad de medios, incluido agar
Sabouraud dextrosa. Sus colonias en los cultivos son de colores blanquecinos, brillantes y convexos.