TEMA 6.

Principios de Ingeniería Genética Molecular

Modificación y restricción del DNA

Enzimas de restricción
- Herramientas esenciales en Ingeniería Genética
- Reconocen y cortan secuencias de DNA específicas denominadas
dianas de restricción o secuencias diana
L es reconocida por la
sec que
enzima de restricción

↓
E

DNA
 Enzimas de restricción

cuando no había
Sin cortar ER Endonucleasa
DNA enz de restricción
& Endonucleasa ↓
Enzima de restricción inespecífica se solaba
hay
muchas

backen

- Presentes en bacterias y arqueas - generalmente -

- Papel defensivo (sistema de restricción – modificación)

Restricción y modificación del DNA

est
halo: infección

node dicin por un gago

“halos” de lisis (“calvas”)

&
generados por los fagos
auc no
100% infección Zonas

restringida hay bacterich

Cepa A 0,002% bacterial

se

non lisado
no las
infecta - La cepa A restringe la capacidad de
prácti infección de los fagos que proceden
E .
coli Carrente de la cepa B
-

& - El paso por A modifica de alguna

Cepa B manera a los pocos fagos que se
reproducen, haciéndolos resistentes
100 % a la restricción

100% - Un nuevo paso por la cepa B elimina

la modificación de los fagos y los
vuelve de nuevo sensibles a la
restricción de la cepa A
 Base molecular del fenómeno de modificación-restricción

m
5´ - G- T- Py -Pu- A- C- 3´
3´ - C- A- Pu -Py- T- G- 5´

modisiche
m
e

Secuencia diana metilada Restrictasa ~

HincII por
Dua o
su

m Dus
cortar
5´ - G- T- Py -Pu- A- C- 3´ solo al
3´ - C- A- Pu -Py- T- G- 5´ cosas
m
fuera

5´ - G- T- Py -Pu- A- C- 3´
3´ - C- A- Pu -Py- T- G- 5´

Secuencia diana no modi-

Restrictasa
ficada por metilación HincII

5´ - G- T- Py-OH 3´ 5´ P-Pu- A- C- 3´
3´ - C- A- Pu-P 5´ 3´ OH -Py- T- G- 5´

Base molecular del fenómeno de modificación-restricción

DNA del hospedador metilado en CH3 CH3CH3
ciertas secuencias CH3 CH
CH3 3 CH
CH3
CH3
CH
CH3CH33 CH3CH3 3

DNA del fago Infección por un fago crecido en un

(no metilado) hospedador diferente

nortaexia
de
CH3 CH3 CH3

auser
CH3 CH CH3
La “metilasa” del huesped actúa CH3
3 CH
3
CH3
CH3
antes que la “restrictasa” CH3 CH 3 CH3CH3

= CH
CH3 3 CH CH3CH3 La “restrictasa” corta

enelizac
CH3 CH 3 CH3
3 CH
0,002 % elo el DNA no metilado
su
CH3 CH3 3 CH CH3
> 99 %
3
CH3
CH3 CH3 CH3CH3
todo
La “restrictasa” no
corta el DNA del fago
&
100%
sieneen Otras nucleasas no
específicas degradan
-
CH3
A 0,002%
restriction
a los fragmentos
CH3 CH CH3 CH3 CH3
3 CH3 CH CH3
CH3 CH3
3 CH
3
CH3
CH3 CH3 CH3CH3
CH3 CH3 CH3CH3 B CH3 CH CH3
CH3
3 CH
3
CH3
100 % CH3
100% CH3CH3 CH3CH3
Fagos ya no

“modificados” estan
metilados
 Tipos de enzimas de restricción
e
no son muy útiles
Tipos I y III: Grandes, multiméricas. Cortan a distancias variables del sitio “diana”
corte
metilación

y reconocimiento

hasta 1000 pb (tipo I)

auc
interesa la Capacidad restricción sabemos un
o

e
nos de
no corta
Tipo II : Frecuentemente un sólo polipéptido. Cortan siempre en el mismo sitio (en la diana o cerca)

Secuencias reconocidas por las restrictasas de tipo II

interaa e
Suelen ser de casi siempre palindrómicas pueden ser continuas
(más común) o
4pb, 6pb u 8 pb
encia discontinuas
· las el wira EcoRI 5’ GAATTC 3’
3’ CTTAAG 5’ 5’ AGATCT
~

M 5’ GGCC BglII
HaeIII 3’ TCTAGA
3’ CCGG

E coli estirpe le da igual

.

-d
EcoRI
5’ GAATTC
FokI
5’ GGATG 3’ Amp
5’ GCCnnnnnGGC
BglI 3’ CGGnnnnnCCG
3’ CTTAAG 3’ CCTAC 5’
excepción (no palindrómica)
5’ AAGCTT
HindIII
3’ TTCGAA Pueden ser cortadas dentro (más frecuente) o fuera
9 nt
5’ GAATTC 5’ GGATGnnnnnnnnnnnnnnn
5’ GCGGCCGC 3’ CCTACnnnnnnnnnnnnnnn
NotI 3’ CGCCGGCG 3’ CTTAAG
13 nt
EcoRI FokI

a co
hale
Extremos generados por el corte de las restrictasas
la
una peq porte en cadena sencilla que
queca

G ensor
en

Extremos protuberantes 5’
Sencilla
(extremos cohesivos)
-
5’ en el
visto
Lambola
gago

Extremos protuberantesO
3’
(extremos cohesivos)
-

se suelen evitar
↓
Extremos romos

2 cadena se cortan

en el =
punto

Otras enzimas importantes en ingeniería genética

#
Otras nucleasas (inespecíficas)
- -

elimina
aux
&Endonucleasas Exonucleasas
(ExoIII, BAL31)
(S1, DNasaI, RNasaH)
ibir

Cortes internos Eliminación de nucleótidos

desde los extremos
 Dus pol
llétodo de Sanger e

eDNA pol (termorresistente

PCR

-
Otras enzimas importantes en ingeniería genética
= de las nucleasar
DNA Polimerasas:
huecos
rellena
DNA polimerasa I (E. coli ) cebadoras y
e
quita
& Polimerasa Klenow, sin actividad exonucleasa
-
5´ 3´
elimina
extremoscomos abadores
5’ 3’ 5’ 3’
P OH P OH
dNTPs
OH P OH P
3’ 5’ 3’ 5’

DNA Polimerasa termoresistente:Taq, Pfu, KOD, etc…

Gen

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Otras enzimas importantes en ingeniería genética

Transcriptasa inversa,
RUA a DNA

cDNA
Copias de DNA
(DNA copial

Polimerasa de RNA
colas de nucleóticos iguales
generar

Transferasa terminal↑ 5’ O
3’ 5’ 3’
tanto

I
P OH dNTP P OH
con
(polinucleótido fosforilasa)
ac
coloca
polimerasa e
5’
P
O
3’
OH P
5’ 3’
OH
Sencill
nucleóticos dNTP
OH P OH 3’ P y dobte
3’ 5’ 5’
 Otras enzimas importantes en ingeniería genética
5’ 3’ 5’ 3’
Fosfatasa alcalina P OH OH OH
m quita josgato OH P OH OH

posición
nos
3’ 5’ 3’ 5’

Kinasa de polinucleótidos
5’ 3’ 5’ 3’
OH OH P OH
OH OH OH P
3’ 5’ 3’ 5’
Kinasa nos añade
in vivo - gragmentos
unir
~ OVaZaki ↑ mercado e me marca los
Ligasa de DNA extremos

②
Una molécula de DNA O
Dos moléculas de DNA

Otras herramientas importantes en ingeniería genética

Nucleasas de dedos de zinc down de unión a PNA
For I
· urena
e
proteínas y reconoce
genero
con declos de finc

Nucleasas TALE (TALEN) >

- se una a det secs de Dul
Otras herramientas importantes en ingeniería genética

Sistema CRISPR-Cas9 ·
RNA
w
nucleasa Complementario
de la reg que
&leo reconcer

para corter
dRNA ·
RNA- Otra

parte que no

E complementaria
es

L
hibricacion
intramolecula

Algunas aplicaciones de las

enzimas de restricción

 Cartografía física

 Clonación de DNA
 Mapa físico
Mapa en el que se indican de forma ordenada los genes en un
cromosoma, mostrando las distancias físicas relativas (expresadas
entre 1 Otro
gen y
en pares de bases).
Se construye utilizando métodos físicos: mapas de restricción de
clones solapantes, hibridación in situ, estudios de deleciones,
secuenciación, etc.

Mapa de restricción
cloude
Mapa en el que se indican las posiciones corta

relativas de los sitios reconocidos por enzimas enz o

Varial
de restricción a lo largo de un fragmento de DNA

Digestión con HindIII

DNA lineal

Con una molécula de DNA lineal,

el número de fragmentos
4 puntos de corte producidos por una restrictasa es
para HindIII
uno más que el de puntos de corte
de la enzima

DNA circular
Con una molécula de DNA
circular, el número de fragmentos
4 puntos de corte producidos por una restrictasa es
para HindIII
igual que el de puntos de corte de
la enzima

no
grag : copto
corke
 eléctrica
electrotores in e someto corriente

Los patrones de restricción son específicos

~ es lineal su DNA
DNA del fago λ cortado con dos enzimas de restricción distintas:
BstEII Ilgragmentos HindIII

DNA lineal bicatenario

14140
7242
6369
4822 10 sitios BstEII
4234 El DNA tiene
3675
7 sitios HindIII
2323
1929

1371
1264
¿ORDEN?
702

5’ GGTNACC 3’ 5’ AAGCTT 3’
3’ CCANTGG 5’ 3’ TTCGAA 5’

Elaboración de mapas de restricción

DNA lineal 18 sumo todos para ver si me

da 10 mismo

en de examen
Corte con
d hacer todun to
Enzima 1 y
M Enzima 1 Enzima 2 Enzima 2 Mapa de
restricción
E1 E2 E1
10
8 compruebo
6
4 Enzima 1
3

Enzima 2
1
Enzima 1
0,5 +
Enzima 2
0,25
E1 E2 E1

M= marcador de tamaño

puede
dos
haber
fragmentos
de 34b prei
 21-2p)4
el de 3
fragmenta desaparece
E2 1p -

Er Es
BNA Circular Il

/Seragmentos
E1-3 7
-En
E2 2
-

-
Ez
10 A

5-
 Elaboración de mapas de restricción

hacerlo - circula
sin HindIII
M cortar HindIII SalI SalI creal

Conocida la secuencia de una molécula de DNA, programas informáticos

identifican en ella todos los puntos de corte de distintas restrictasas

[Link]
 2 pto) 3
Corte 2
de restricción d
mapa
↑
↑

·
plasmido

plásmido : 7 Kb
Tan

E *

.
Sals
C ~ Hos

oche de soen -

y
espero
E
fragmentos
> tengo 3
0'8 1 Hind 555

⑫
↓
S8e La suma
da 7

d
disa
It > sal que

Aquí no Hind está en el :

Corta
Lugar

lineal no gragmentos -1 =
puntos de corte

- 58--
.. 88 ,

HS
 [Link]

Clonación de DNA

Amplificación de DNA
“in vivo”
tener muchas
podemos sec

in vivo
 v
·

Enimcióna
Ligasa de DNA: herramienta fundamental en la clonación de DNA
ambas

suriores
en
Papel de la ligasa de DNA in vivo
Enlace fosfodiester ausente Ligación in vitro de extremos caclenas
cohesivos

Nuevo enlace fosfodiester

Ligación in vitro de extremos

romos (menos eficiente) Apareamiento transitorio de
los extremos cohesivos

DNA
unido en

Dos enlaces realizados las 2

por la ligasa de DNA
Dos enlaces realizados cadeas
por la ligasa de DNA

6 ·

egicaz
Gligasa Th

Un experimento de clonación de DNA

DNA
foráneo
Digestión

vector + inserto
Ligación
Vector ↓
Construcción del Inserto vector

DNA recombinante recombinante/

in vitro Dus recombinante

Gen de interés
inserto insertado en un
vector
conación :
Pub
Introduzco
del vector
Centro
 Un experimento de clonación de DNA

térmico
Transformación
pej choque
eléctrico

Clonación o Replicación Cromosoma de la

célula hospedadora
Amplificación en
células hospedadoras muchas copias

in vivo
División celular

muchen

bacterian

O
Clonación = Amplificación
de la secuencia

Etapas de un experimento de clonación

pej↑abrae
p
Seleccion
• Obtención de los fragmentos de DNA que Lector

se quieren clonar
• Elección del vector -elt
comun
• Construcción del DNA quimérico (vector-
fragmento) enzinc
restricción
• Introducción del DNA quimérico en la
célula hospedadora sutroducir Dua quimérico
dentro al
• Propagación celular y selección
hospedadora -

* • Identificación del clon con el fragmento

deseado e Hibricación etc .

• Aislamiento y caracterización del

fragmento clonado o expresión del gen Seleccione

clonado
Las que
tieren

Según el caso no todas las etapas no son necesarias el vector

recombinante
 Elección del vector de clonación
L transporta no

Sec interés al interior

Vector de clonación: de la cel

- Molécula de DNA que permite la incorporación, replicación y

purificación de fragmentos de DNA individuales. Tautonomc
-

O Requisitos de un vector de clonación

seat fácil que entre
e pra que
- Generalmente, molécula relativamente pequeña, fácil de manipular. la
en

ccula
O
- Fácil introducción en una célula hospedadora y replicación autónoma.
O 4 se
replica
- Puntos de corte únicos para una o varias enzimas de restricción.
para que podamos introducir indep al
se interes cromosomas
- Fácilmente seleccionable.
seleccionar es que han introducido
- Si es posible, fácil distinción entre vector no modificado y vector
quimérico (opcional). -
> distinguir vector recamb del no recomb

Rojo
-
obligatorio
-
vector circula e Reficacia

Tipos de vectores

Vector Tamaño del Aplicaciones

inserto (kb)
Plásmido 0 - 10 . Subclonación
cómodos O. Mapas de restricción
Los +
relat peq D. Secuenciación
. Mutagénesis dirigida
inconveniente me cona grag
peq . Etc.
Fago  >
-
para frag + grandes ~ 25 O
. Genotecas genómicas y de
-

cDNA
Cósmidos 30 - 44 . Genotecas genómicas y de
-

características fagomida cDNA

Cromosoma artificial hasta 300 . Genotecas genómicas
-

bacteriano (BAC)
Cromosoma artificial de hasta 2000 . Genotecas genómicas
- -

levaduras (YAC)

Genoteca : cona todo el DNA de un

organismo
en un tipo de vector
 Esquema general de un vector de clonación plasmídico

Sitios únicos de corte

de enzimas de “Polylinker o MCS”:
restricción sitio de clonación
múltiple

Sitio de Corte región en la

que corten
unchas enzimas

Origen de
replicación

Marcador
seleccionable
(AmpR, KanR, TetR , …)

Seleccione all

que hayan incorporado

Vector de clonación plasmídico

polilinker -
sitios de clonación únicas
y no únicos

↓
poli conector
d

interrumpe
alacz

Segalactosidate
cetermin
e
rompe lactos a
 Proceso de clonación
Generación de una molécula de DNA “quimérica” o recombinante

Las enzimas de restricción

facilitan la unión de
fragmentos de DNA de Cortanos
con enzimas
distinta procedencia, si
de
ambos DNAs se cortan restriccion
con la misma enzima Corte con Corte con
EcoRI EcoRI
(extremos cohesivos)

rector

lo uno
Hibridación
+ ligasa
-

2 ptos carte
E
En este caso ↓
permanecen ambos & Molécula de También los extremos
DNA romos pueden ligarse
puntos de corte
-
recombinante
-
(menos eficientemente)

Los plásmidos como vectores de clonación

dianas BamH1

DNA genómico

Gen de interés

Ligar
(ligasa de DNA)

Gen de interés
insertado en
un plásmido

Puede que el Gen de 40 esta

interés no esté insertado y Centro de l
en un plásmido
el plamido se plasmielo
na
autoligado
 Vector autoligado y plásmido recombinante
traup
G muy grade
M
CT A A T TC G G
T
A
A EcoRI
EcoRI GC CT T AA
A
A &
G T
T Orientacion
C al
Se introduc revés
Ligación
se auto
liga GA
GA
A A
GAAT TC T T
CT T CT T
TA C TA C
A A
TAAG
CT G
C
G G
C
Quimera Quimera G
Vector C C
T T C
autoligado
AT G AAT G
GA A G A
A A
T T
CT CT
Dos posibilidades
(según orientación de inserto)
tengo que hacer
mapa de restricción

Los plásmidos como vectores de clonación

Introduzco en cl
Plásmido con gen
de resistencia a Tet nospechalok
dianas BamH1
Gen de interés
insertado (o no) en
DNA genómico un plásmido

Mezcla (transformación)

Gen de interés

Bacteria Plásmido recombinante (o

Ligar no) dentro de la bacteria
E. coli
(ligasa de DNA)

Gen de interés
insertado en
un plásmido

Puede que el Gen de

interés no esté insertado
en un plásmido
no se
integra
 Los plásmidos como vectores de clonación
Plásmido recombinante
Cromosoma en el interior de la
bacteriano bacteria

medio de

S ultico

pueceestaga
inserto
el
Replicación del tetraciclina
no
plásmido dentro de
la bacteria

Colonia = cáculas
Medio de cultivo con tetraciclina: sólo Identicas que proce
las bacterias “transformadas” pueden
multiplicarse y formar colonias den de 1
Muchas copias del
mismo plásmido transformac
recombinante (o no)

extraigo
I medio
plasmido + TC

Cómo distinguir entre vector “autoligado” y

Utilice plásmido recombinante
la

↑ parce
introducir
PstI el inserto PstI
Inserto
Electroforesis en gel
rest
PstI
gen
&
AmpR
a ampicilina AmpR
6 Plásmido
Plásmido sin Plásmido Plásmido
inserto recombinante M recomb. autolig.

Cultivos de colonias individuales

obtenidas en medio con Amp

Aislamiento de plásmidos
¿Cuales tienen el inserto ?
Digestión del vector con la misma
enzima que realizamos la clonación
PstI (por ejemplo)

j M= marcador de tamaño
1 +an

inso to
 Cómo distinguir entre vector “autoligado” y
plásmido recombinante

Plásmido Inactivación insercional

pBR322 juactivo 1 gen introduciendoe
el inserto

se Corta

gen rest a AMP

es como sino
R
>
-
genacto tuviera ge
res a AMP
Digestión de DNA foráneo y
vector con SalI + ligación
inserto
↓
Ya que lo

Transformación de bacterias estoy cortado

para introduci
Siembra en medio con ampicilina mi
inserto
Plásmido sin inserto Plásmido recombinante
Vector autoligado
(autoligación) Plásmido recombinante

Cómo distinguir entre vector “autoligado” y

plásmido recombinante

R
R

terciopelo
Inserto

so
pegan Plásmido sin Plásmido
inserto recombinante
(autoligación)

Original Réplica
crecen
mecho
en otro

plásmido con inserto  AmpR TetS AmpR TetR  autoligación

Original (ampicilina) Réplica (tetraciclina)

compredo e
extraigo plámido e
electro foresin
 Cómo distinguir entre vector “autoligado” y
plásmido recombinante
no sec
gen lacZ gen lacZ que
inserto e muy grance
interrumpido
E Plásmido para que
Vector
quimérico 10
- EcoRI EcoRI EcoRI gecte
origen
la funcion
replicación a

AmpR -pra seleccione AmpR

de lac7
marcador

La actividad β-galactosidasa Al estar interrumpido lacZ, no

rompe el X-Gal produciendo se produce β-galactosidasa
indol, compuesto azul y que (colonias blancas)
precipita (colonias azules)

ampicicina

mercador

Medio con ampicilina y X-GAL

~

sustrato

B-galatosidasa

D
we
- son las
sexo

gene
interesa
ami

Digestión de DNA foráneo y

vector con PstI (por ej.)

Ligación

Transformación de bacterias en
ampicilina y X-Gal (selección de Detección visual de
E AmpR) β-galactosidasa (X-Gal)
res

ampiciunc
 La defosforilación previa del vector reduce al mínimo
las copias “autoligadas” del vector
autoligación (pra 1 enzima restricial
por d la
de

Plásmido Enzima de
restricción

Celimina
Poel 5'l S
uo

puede unir
si puede unir

↑ + hay huecos
6 los

O rellenan
las c cula

saltoconto
de Reducción de las copias “autoligadas” del vector
utilizando dos enzimas de restricción lotra forma de d

Corter HindIII
DNA del plásmido
XhoI DNA con el gen de interés autoligacion
con

2enimal

#
1p to corte
Corte con las enzimas de restricción HindIII y XhoI
para HindlII

y Xhol

↓
no
encivoo
eoriga

solo puede
si alguna
no ha Ligación introducirse
enzima
be as i
cortado

so puede autoligar
 El bacteriófago lambda (λ) como vector de clonación
procesosima
s
proceso similar con fago y a

Puede empaquetar
elimino ~ 25 Kb de DNA
sec innecesarias elimino

de
Digestión con sec no imprescindible

Introduzco
perte BamHI

sende interes E DNA foráneo

eliminar
(no necesario para
replicación del fago) insertar

Empaquetamiento “in vitro”

en cápsidas del fago λ

El bacteriófago lambda (λ) como vector de clonación

Empaqueto

Infección de [Link]

“Calvas” o halos de lisis

- -

generados por los fagos

Se lsan

clon de
Jugectado
fagos
“cesped” de bacterias son =

sensibles al fago
los
gagos
do Cada

calva de lisis
 Cromosomaartificial genoteca
BACs (Bacterial Artificial Chromosomes)
wie
-
Pueen
↑ transcripcion
Insertos (hasta 300 kb)
permiten introducir
Cant -

transcipan
plasmidos
↓ 4

F
↑ precidoconc
↑ fago X

polilinker

a
-

replicacion -

O
CMR: marcador seleccionable

oriS, repE, parA y parB: para la -

replicación y regulación del número

de copias -

el no
para que copian se a

precido
cromosara
&
a un
origen replicación
bactericht
↑ &elóveros
-
romas
pro que a a
sciueales cromoscas estructurales controvera a obics

Cromosoma artificial de levadura (YAC: Yeast Artificial Chromosome)

CLAVE
circular
CEN4 Centrómero del cromosoma 4 de levadura
TEL Telómero
ori Origen de replicación de levadura

├
TRP1

ed
SUP4 Marcadores seleccionables de levadura
URA3
elemental
como con Ban circad recescio conse
↓ eucarióticos
pramantenerto
Corte con
en
E coli
. Brazos
BamHI y SnaBI Derecho
Izquierdo
Mezcla con fragmentos de DNA
foráneo y ligación

DNA foráneo (hasta 1.000 kb)

 elomento para selecciona cils han introducido
que lo

levaduras e marcadores: bacteria morcadores

genes +

Trp
geven
-Trp
con

- res a

antibióticol

>
-
xx - URS

prozeival
URA3igen(
-
I Corto con Baut

corto con snabl pro introduar inserto

Interrumpico gen Supa

-

brazo para
-
Silose introduce inserto
& brazo gen
para URD3

-
Introduzco URD-URD 3%
guncional
igen
no

TRP (Trp 1)
-

solo se introduce derecho e no cece Ade

-

TRP-
izq
d
-
Solo + no rec
URA-
autoligado
Si introduce lo de abajo
-

crece

Si
stiere los ( gene)

n
⑧ Ade

Sup intacto
e
suprime mutación e blancas e Acet e
Seautoliga
4

Sup interrumpidoe color rojo e no se

suprime mutación e Ade e

E
 Genotecas de DNA genómico y genotecas de cDNA

6
Colecciones representativas de
fragmentos de DNA (genómico o
cDNA, según el tipo de genoteca)
clonados en el vector apropiado
Cacla sec
Al menos 1
copia de ese
DrA genó co

todos los fragmenta

DNS
--
Construcción de una genoteca genómica

Cortar an quito porte

anzima no imprescindible
restricción Cortar
Ligar
4000

DNA recombinante
400 y fragmentos

Empaquetamiento in vitro & e

para asegurarne
Fagos híbridos que tengo toclo
11

2000 el DNA
 Construcción de una genoteca genómica

Cesped de
bacterias

Clon de fagos
Cada clon contiene muchas
Genoteca de DNA genómico copias de una molécula concreta
de DNA recombinante
(GENOTECA)

Construcción de una genoteca genómica

-
e
3'2 mb

vectores
artificiales

fagos
 copia a DNA del
copia

8
de RNJ
CDUA RNA
(sin intiones)
=
a DNA
-
Construcción de una genoteca de cDNA

Tipo celular de interés

Aislamiento de sus mRNA

Genoteca de cDNA

Síntesis de los cDNA correspondientes Clon 1 Clon

Clon 22 Clon
Clon 33 Clon “n”

cada clon con el cDNA correspondiente a

genes expresados en ese tipo celular
Clonación de los cDNA en un vector

Genoteca de cDNA

cDNA: DNA2C obtenido a partir de mRNA

mRNA Cola de poli(A)

DNA genómico (2c)

cebador oligo (dT) transcrip

tala

↑
invers
&

Transcrito primario (1c) Retrotranscriptasa viral

-

elimine
RUA
e
La actividad RNasaH degrada la
-

intores mayor parte del RNAm

cebadores -

texones
RNAm (1c) Síntesis de la segunda
elimine cadena de DNA
nucleóticlos
Y relevar
Xazu
Retrotranscriptasa van

Terminación de la síntesis de uniendose

la segunda cadena =
sec
a
tipos
pego
cDNA (2c) Dua que
incluya pro corte que me interna
cDNA (versión no interrumpida del gen, sin promotor
 #
-
A + +
ACG

RNA sin cola de polid

Genoteca prozariotas - secuencia

randam
 Producción de proteínas de interés en bacterias
mucho RNAm

vector & promotor sec

fuerte

Gen de interés
consenso

2
P
mucha
transcriptin
Fusión ↓
transcripcional
E. coli
+ proteina
P

“Factoría celular” Proteína

de interés P = promotor
bacteriano

enau
~
su
propio
procorioticmeen e
Vectores de expresión – Expresión heteróloga

porigen para E coli-

.
origen
·
marcador soleccionable

promotor
-

-
Promotor -
Terminador
Gen DNA siel gen encoriótico
6 en el vector sitio u

al ribosone
Promotul
mRNA & sea reconoc
I Un buen vector de expresión debe tener:
Sitio de unión al
ribosoma bacteriano
 un promotor (fuerte y regulable)
 un sitio de unión al ribosoma
menen
 un terminador de la transcripción
Proteínas o mocador seleccionable
·
origen replicacin

E
introduce
nigen
M
184 ,
politinve
:
enzimaque
o
a
 O
I
#

donar esto del

quiro e sec

ORF
31 bado

m
31
↓
07) + +

i Sama
** T complementaria
PRSB T
S131
abador
o 1 enzima que NO corte en
migen e E1 y E2

·
¿como introduzco esos puntos de corte ?

Qué abadores necesito

per ciclo replicación

fotos
con e otro cebador
TAC

10 =
abade
↓

hago
%
hasta el 3 ciclo no
tengo los 2 pros corte que quier
virar diapo PCR

mi terror pro de carke en los 2 lado

objetivo en

douLaenido
- -

puedo como
O
co se
en

z I para
ver si es un

Promotor
↓ -

amplifico sec (PCR)

p
-

-
 => específico de lectures de expresión
el
vectores de expresión : para que se exprese -
gen
terminado -

geu e soloparte exone

solecc
promotor maquinaria bacteria
S
marcados
-

rector -

no puede elimina
de clanación origen replicación sec de reconocimiento
-

intrones
-

atc (para que sea sec ribosoma

Expresión de proteínas eucarióticas en bacterias

Proteína X

El origen de la proteína
pailinver de interés condiciona
mRNA re su posible expresión
e
o
heteróloga
↓
gare intrones

visito cDNA del gen X

CDUA
6 Promotor&
bacteriano
regulable
Producción de grandes cantidades de una
proteína eucariótica en bacterias mediante
clonación del cDNA del gen
origen de correspondiente en un vector de expresión
replicación
Marcador
seleccionable

Introducción de DNA en células eucarióticas

Wius -> capacidad de

sidisparan infectar c
a ls

Partícula de especif
oro o
↑ tungsteno
recubierta de so inyecta
Microproyectiles DNA
nojan plantas
↑
Microinyección
Transformación
material
que nos intersea

Virus
So introduce

er
ge
PEG gracias al
Liposomas virus

Electroporación


Yo que nos interesa

es
que se integre para
conservar de generación en generación el e
gen terés
 Ingeniería Genética Molecular
Aislamiento (clonación), caracterización y manipulación
de elementos genéticos.

Algunas aplicaciones:
 Conocimiento de la secuencia y estructura génica.
imp
para ver si el gen
es
-

 Modificación de la secuencia génica (estudios funcionales,

mejora genética).
insulinar mejoro ese gen
 Producción a gran escala de proteínas de interés (o sus
productos).

 Transferencia de genes de unos organismos a otros

(organismos transgénicos).

 Transferencia de la secuencia silvestre a un organismo

mutante (terapia génica).
trasgen : introduzco a un
org
un
gen que no es suyo
propio
clouación e pligen insulina
terapia génica

usos ingeniería genética fe organismos

transgénicos