UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE QUÍMICA

VALIDACIÓN DE MÉTODO SPE-HPLC-MS/MS Y DETERMINACIÓN DE ÁCIDOS

CARBOXÍLICOS PERFLUORADOS EN EL COMPLEJO “LAGUNAS DE MONTEBELLO ” EN
CHIAPAS, MÉXICO

TESIS
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE
INGENIERO QUÍMICO

PRESENTA
JOSE ANTONIO CASTRO GUTIERREZ

CIUDAD UNIVERSITARIA, CDMX 2024

UNAM – Dirección General de Bibliotecas
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objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro,
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el
respectivo titular de los Derechos de Autor.
JURADO ASIGNADO:

PRESIDENTE: Profesor: Dra. Olivia Zamora Martínez

VOCAL: Profesor: Dra. Gema Luz Andraca Ayala

SECRETARIO: Profesor: Dra. Blanca Lucía Prado Pano

1er. SUPLENTE: Profesor: Dra. Evangelina Camacho Frías

2° SUPLENTE: Profesor: M. en C. Alejandra Mendoza Campos

SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: INSTITUTO DE GEOLOGÍA, UNAM

ASESOR DEL TEMA :

Blanca Lucía Prado Pano

SUPERVISOR TÉCNICO :
Mario Ricardo Israel Rodríguez Varela

SUSTENTANTE:
José Antonio Castro Gutiérrez

II
 AGRADECIMIENTOS:

Al proyecto DGAPA PAPIIT IV200122AELT - Efectos del cambio global y climático sobre
la limnología y biodiversidad acuática por su apoyo y financiamiento para hacer posible
este estudio.

A la Dra. Blanca Lucía Prado Pano por su gran apoyo a lo largo de este proyecto

A la Dra. Olivia Zamora por sus valioso conocimiento y experiencia para mejorar el
presente trabajo.

A la Dra. Gema Luz Andraca por sus importantes contribuciones en la producción de este
escrito.

Al Dr. Mario Ricardo Israel Rodríguez Varela por su valiosa experiencia y constante
ayuda y orientación a lo largo de todo este proyecto. No pudiera haberlo hecho sin él.

Al Laboratorio Universitario de Caracterización Espectroscópica, LUCE-ICAT-UNAM, a

la Dra. Selene R. Islas Sánchez por su apoyo en la asesoría de uso de espectroscopía
de UV-Visible-NIR y centrífuga.

Al Dr. Óscar Arnoldo Escolero Fuentes por su labor técnica y social que permitió que se
desarrollaran exitosamente las diversas actividades de todo el grupo de trabajo en
Montebello, Chiapas. Que en paz descanse.

Al Dr. Luis Alberto Oseguera Pérez por su gran apoyo en la toma de muestras en el lago
de Balamtetik, Montebello, Chiapas.

Al Laboratorio Universitario de Nanotecnología Ambiental, LUNA-ICAT-UNAM, a la M.

en C. Viridiana Maturano Rojas por su apoyo en el uso y aplicación de preparación de
muestras, así como las facilidades y asesoría para el uso general de equipos del
laboratorio.

A los Técnicos Académicos M. en C. Alejandro Esparza García y Martín Briseño García

por el apoyo técnico brindado en la reparación y uso de equipos de alto vacío para la
preparación de muestras.

III
Al Laboratorio Nacional de Geoquímica y Mineralogía, LANGEM-IQ-UNAM, a la Dra.
Maricarmen Salazar por el análisis de carbono total y nitrógeno de las muestras.
Asimismo, agradezco a Lucero Verónica López Cabrera del departamento de Edafología
Ambiental por el trabajo de las muestras.

A la Dra. Margarita Caballero Miranda por su asesoría en la toma de muestras de campo

en las lagunas de Montebello, Chiapas y a la Dra. Lucy Mora Palomino por su apoyo en
la toma de estas muestras.

A la MVZ Melisa Gallegos por su asesoría en cuestiones gráficas y de presentación, al

igual que por proporcionarme la confianza y madurez suficiente para continuar.

A mis familiares y amigos por acompañarme en todo este proceso.

IV
 ÍN DI CE DE C O NT EN ID O

Capítulo I: Introducción ................................................................................................ 1

I.1 Hipótesis .......................................................................................................... 3
I.2 Objetivo general .............................................................................................. 3
I.3 Objetivos Particulares ...................................................................................... 3
Capítulo II: Antecedentes ............................................................................................. 4
II.1 Ácidos carboxílicos perfluorados (PFCAs) ..................................................... 4
Propiedades de los PFCAs ........................................................................ 6
Producción de PFCAs................................................................................ 7
Estudios ambientales de PFCAs realizados previamente........................ 10
II.2 Metodología SPE-HPLC-MS/MS .................................................................. 14
Extracción en fase sólida (SPE) .............................................................. 14
Cromatografía .......................................................................................... 18
Espectrometría de masas ........................................................................ 24
II.3 Historia del arte de metodologías para determinación de PFCAs en matrices
de agua ambiental .............................................................................................. 27
Ventajas del uso de HPLC frente a la cromatografía de gases: .............. 28
II.4 Validación ..................................................................................................... 29
II.5 Sitio de Estudio............................................................................................. 30
Capítulo III: Metodología ............................................................................................. 33
III.1 Selección de compuestos a analizar ........................................................... 33
III.2 Estándares, reactivos y disolventes ............................................................ 33
III.3 Instrumentación ........................................................................................... 33
III.4 Columnas y cartuchos ................................................................................. 34
III.5 Materiales .................................................................................................... 34
III.6 Software ...................................................................................................... 34
III.7 Sitios de muestreo de agua ......................................................................... 35
III.8 Pre y tratamiento de muestra ...................................................................... 37
III.9 Determinación de los compuestos mediante HPLC-MS/MS........................ 38
Identificación y optimización de iones fragmento de seguimiento de los
PFCAs en el equipo ................................................................................. 39
Análisis cromatográfico ............................................................................ 40
V
 Optimización de los parámetros de HPLC-MS/MS dependientes de la fase
móvil ........................................................................................................ 41
Reducción de interferencias instrumentales ............................................ 41
Corrección de impurezas ......................................................................... 42
III.10 Validación de parámetros cromatográficos................................................ 43
Capítulo IV: Resultados de la optimización .............................................................. 46
IV.1 Espectros obtenidos y selección de iones cuantitativos y de confirmación . 46
IV.2 Optimización de parámetros espectrométricos ........................................... 50
IV.3 Verificación de la validación del método HPLC ........................................... 52
Linealidad ................................................................................................ 53
Precisión .................................................................................................. 55
Límite de detección .................................................................................. 56
Límite de cuantificación ........................................................................... 57
Exactitud .................................................................................................. 57
Efecto Matriz ............................................................................................ 58
Capítulo V: Resultados de la determinación en los lagos ....................................... 60
V.1 Análisis del contenido de PFCAs en el complejo lacustre ............................ 62
V.2 Análisis de la concentración de los compuestos estudiados por profundidad
del muestreo ....................................................................................................... 63
V.3 Análisis por compuesto ................................................................................ 63
Conclusiones ............................................................................................................... 65
Referencias .................................................................................................................. 66
Apéndice ...................................................................................................................... 79

VI
 ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1: Comparación entre ácido octanoico y ácido perfluorooctanoico, perteneciente

a la familia de los ácidos carboxílicos perfluorados de cadena lineal ............................. 5
Figura 2: Ácidos carboxílicos perfluorados estudiados en la tesis .................................. 6
Figura 3: Hitos importantes en la industria con respecto a producción y legislación de
PFCAs, sus precursores y sustancias relacionadas ....................................................... 8
Figura 4: Países productores de PFCAs en diferentes años. ....................................... 10
Figura 5: Ubicación geográfica de en dónde se han realizado estudios ambientales de
PFCAs, acorde a la matriz estudiada ............................................................................ 11
Figura 6; Matrices abióticas en las cuales se han realizado estudios ........................... 12
Figura 7: Principal PFCA encontrado en cada estudio previo. ...................................... 13
Figura 8: Esquema de preparación de muestra por extracción en fase solida (SPE) ... 15
Figura 9: Estructuras de los cartuchos para extracción en fase sólida Oasis HLB y
Strata-X ........................................................................................................................ 16
Figura 10: Estructura molecular del cartucho OASIS WAX ........................................... 17
Figura 11: Cromatograma de PFCAs utilizados en el presente trabajo ........................ 19
Figura 12: Diagrama general de equipo de HPLC ........................................................ 23
Figura 13: Diagrama general de un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo
(MS/MS) ........................................................................................................................ 26
Figura 14: Resumen de las metodologías utilizadas en la literatura para la medición de
PFCAs en aguas de distinta índole ............................................................................... 27
Figura 15: Análisis bibliográfico del número de estudios que reportan recobros de
PFCAs ........................................................................................................................... 28
Figura 16: Diagrama de proceso general de validación de un método ......................... 30
Figura 17: Mapa de Las Lagunas de Montebello y su ubicación con respecto al Parque
Nacional Lagunas de Montebello, al igual que su situación en Chiapas y Guatemala .. 32
Figura 18: Fotografía de núcleo de sedimento .............................................................. 37
Figura 19: Espectro de masa obtenido de PFBA .......................................................... 46
Figura 20: Espectro de masa obtenido del PFHxA ....................................................... 47
Figura 21: Espectro de masa obtenido del PFHpA ....................................................... 47

VII
Figura 22: Espectro de masa obtenido del PFOA. ........................................................ 48
Figura 23: Espectro de masa obtenido del PFUnA ....................................................... 48
Figura 24: Cromatograma obtenido en el que se muestran los picos obtenidos por cada
PFCA............................................................................................................................. 52
Figura 25: Curva de calibración de PFBA, PFHxA, PFHpA, PFOA y PFUnA en agua de
grado HPLC .................................................................................................................. 53
Figura 26: Curva de calibración de PFBA, PFHxA, PFHpA, PFOA y PFUnA en agua
lacustre.......................................................................................................................... 54
Figura 27 -Figura 32: Gráficas de concentración (ng/L) de cada PFCA encontrados en
cada lago, y en el fondo de los lagos Bosque Azul y Montebello .................................. 61

VIII
 ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1: Propiedades fisicoquímicas de los ácidos carboxílicos perfluorados ................ 7

Tabla 2: Distintos modos de operación de un espectrómetro de masas y su relación con
los modos de los tres componentes .............................................................................. 25
Tabla 3: Iones precursor, fragmento y confirmación seleccionados de cada PFCA .... 40
Tabla 4: Parámetros evaluados en el espectrómetro de masas ................................... 40
Tabla 5: Niveles evaluados en la optimización de parámetros del equipo de HPLC ..... 41
Tabla 6: Contribución en área de diversos parámetros en los blancos de muestra ...... 42
Tabla 7: Masa de fragmentos utilizados en el análisis de PFCAs ................................. 49
Tabla 8: Lista de condiciones operativas independientes de la fase móvil en el
espectrómetro de masas ............................................................................................... 50
Tabla 9: Parámetros obtenidos del cromatograma visto en la figura 24 ........................ 52
Tabla 10: Resumen de pendientes, ordenadas al origen y coeficientes de correlación de
las curvas de calibración de cada PFCA analizado en agua de grado HPLC y agua
lacustre.......................................................................................................................... 55
Tabla 11: Porcentajes de desviación estándar relativa (% RSD) promedio de cada
PFCA analizado (n=3) ................................................................................................... 56
Tabla 12: Relación señal-ruido (SNR) y desviación estándar relativa intermedia (% RSD
inter) en los tres niveles más bajos de la curva de calibración para los PFCAs
estudiados ..................................................................................................................... 56
Tabla 13: Niveles mínimos y máximos de recobros por cada compuesto en cada matriz
analizada ....................................................................................................................... 57
Tabla 14: Pendiente, ordenada al origen y coeficiente de correlación de las curvas de
recobro para cada componente tanto en agua HPLC como lacustre ............................ 59

IX
 AC R Ó NIM O S

Siglas Significado en español Significado en inglés

%R Porcentaje de recobro Recovery percentage
% RSD Porcentaje de desviación estándar relativa Relative standard deviation percentage
AR Agua residual Wastewater
COE Contaminantes orgánicos de interés emergente Emerging organic pollutants
EtOH Etanol Ethanol
HPLC Cromatografía de líquidos de alto rendimiento High performance (pressure) liquid chromatography
(o alta presión)
LC Cromatografía de líquidos Liquid chromatography
LDC Límite de cuantificación Limit of quantification
LDD Límite de detección Limit of detection
MeOH Metanol Methanol
MRM Monitoreo de reacciones múltiples Multiple reaction monitoring
MS Espectrometría de masas Mass spectrometry
PFAS Sustancias perfluoroalquiladas Perfluoroalkyl substances
PFBA Ácido perfluorobutanoico Perfluorobutanoic acid
PFCA Ácidos carboxílicos perfluorados Perfluoroalkyl carboxylic acids
PFHpA Ácido perfluoroheptanoico Perfluoroheptanoic acid
PFHxA Ácido perfluorohexanoico Perfluorohexanoic acid
PFNA Ácido perfluorononanoico Perfluorononanoic acid
PFOA Ácido perfluorooctanoico Perfluorooctanoic acid
PFSA Ácidos sulfónicos perfluorados Perfluoroalkyl sulphonic acids
PFUnA Ácido perfluoroundecanoico Perfluoroundecanoic acid
POP Contaminantes orgánicos persistentes Persistent organic pollutants
PTFE Politetrafluoroetileno Polytetrafluoroethylene
QqQ Triple cuadrupolo Triple quadrupole
SCAN Barrido completo de fragmentos Complete fragment scan
SNR Relación señal/ruido Signal-to-noise ratio
SPE Extracción en fase sólida Solid phase extraction
SPE-HPLC- Extracción en fase sólida seguida de Solid phase extraction followed by high
MS/MS/QqQ cromatografía de líquidos de alta presión performance liquid chromatography-triple
acoplada a espectrometría de masas de triple quadrupole mass spectrometry
cuadrupolo

X
Capítulo I: Introducción

A lo largo de los años, el ser humano ha dejado su huella en el entorno. Una de las
diversas formas es a través de sus desechos, dentro de los cuales existe una amplia
gama de sustancias desde las ampliamente estudiadas y reguladas, hasta especies que
prácticamente no han sido estudiadas y carecen de regulación con respecto a su
producción, emisión y destino ambiental, estas últimas son conocidas como
contaminantes orgánicos de interés emergente (COEs).

Los COEs son compuestos utilizados por el ser humano de manera cotidiana, los cuales
incluyen: fármacos, aditivos industriales tanto en materiales como alimenticios, productos
de cuidado personal, entre otros. Algunos de los principales ejemplos son: la
carbamazepina, el sulfametoxazol, la cafeína, el bisfenol A, y los ácidos carboxílicos
perfluorados (PFCAs)

La importancia de establecer la presencia y niveles de los PFCAs en las diferentes

matrices ambientales radica en que son sustancias cuya acumulación pueden llegar a
tener efectos adversos en organismos acuáticos, y probablemente en los terrestres.

Estos contaminantes pueden dejar su huella a través del tiempo al encontrar como
destino ambiental a los cuerpos de agua como ríos, lagos y lagunas. De este modo, la
determinación de este tipo de compuestos en lagos permite estudiar el impacto
antropogénico en el sitio. Un claro ejemplo de esto es el lago de Balamtetik, en el sistema
lacustre Lagunas de Montebello, en Chiapas, el cual es el cuerpo receptor del Río Grande
de Comitán, que recibe las descargas de desecho provenientes tanto de la población de
Comitán como de poblaciones aledañas dentro de la cuenca de las Lagunas de
Montebello, al centro-oriente del estado de Chiapas.

El proyecto de tesis tuvo como objetivo optimizar y validar un método de extracción en

fase sólida seguido por una determinación mediante cromatografía de líquidos acoplada
con espectrometría de masas de PFCAs en aguas lacustres en las Lagunas de
Montebello en Chiapas, y por el otro, usar este método para establecer las
concentraciones de estos compuestos.

1
Este proyecto es parte del proyecto del programa de apoyo a proyectos de investigación
e innovación tecnológica (PAPIIT) IV200319, en el cual se realiza un estudio comparativo
y multidisciplinario para poder entender las complejas interacciones de los distintos
agentes forzantes involucrados que han conducido al deterioro de algunos cuerpos
acuáticos de la región

2
I.1 Hipótesis
Mediante la técnica SPE-HPLC-MS/MS/QqQ es posible desarrollar y validar la
metodología analítica para la determinación de ácidos carboxílicos perfluorados (PFCAs)
en agua lacustre en concentraciones de ng/L.

La concentración de PFCAs en los lagos Balamtetik y Bosque Azul será en mayor

concentración, en el orden de ng/L, gracias a su calidad como receptores directos de las
aguas residuales provenientes de la cuenca de Comitán. A su vez, la concentración de
PFCAs en los lagos Montebello y Tziscao, aunque será menor, no será despreciable,
debido a diversos mecanismos de transporte de estos compuestos.

I.2 Objetivo general

Desarrollar una metodología analítica por medio de extracción en fase sólida seguida de
cromatografía de líquidos de alta eficiencia acoplada con espectrometría de masas de
triple cuadrupolo (SPE-HPLC-MS/MS) para evaluar la presencia de cinco ácidos
carboxílicos perfluorados lineales, con 4, 6, 7, 8 y 11 átomos de carbono, en aguas
superficiales y de fondo en lagos del conjunto Lagunas de Montebello, Chiapas.

I.3 Objetivos Particulares

• Establecer las condiciones experimentales óptimas para extraer y cuantificar cinco
ácidos carboxílicos perfluorados, a saber: ácido perfluorobutanoico (PFBA), ácido
perfluorohexanoico (PFHxA), ácido perfluoroheptanoico (PFHpA), ácido
perfluorooctanoico (PFOA) y ácido perfluoroundecanoico (PFUnA) siguiendo la
metodología de purificación y concentración a través de extracción en fase sólida
(SPE) y su análisis a través de cromatografía de líquidos de alta presión acoplada
a espectrometría de masas de triple cuadrupolo (SPE-HPLC-MS/MS/QqQ).
• Validar y evaluar el desempeño del método en muestras de agua lacustre.
• Estudiar la presencia de los ácidos carboxílicos perfluorados en agua superficial
y de fondo en cuatro lagunas del sistema lacustre.

3
Capítulo II: Antecedentes

II.1 Ácidos carboxílicos perfluorados (PFCAs)

Dentro de toda la amplia y compleja variedad de las sustancias orgánicas, existen

aquellas que destacan por su alta resistencia térmica y química, conocidas como
contaminantes orgánicos persistentes (POPs, por sus siglas en inglés). Los POPs
permanecen por largos períodos de tiempo en el ambiente, llegando incluso a presentar
vidas medias de varios días en la atmósfera y de años o décadas en suelos y sedimentos
(Jones & De Voogt, 1999)

Los POPs, además de ser clasificados por sus propiedades físicas y químicas, también
pueden catalogarse por su estatus legal. En este tenor, aquellos que no se encuentran
bajo ningún tipo de regulación y se desconocen sus efectos nocivos a la salud y al medio
ambiente, se denominan contaminantes orgánicos emergentes (COEs) (Murray et al.,
2010). Dentro de este grupo existen contaminantes orgánicos que son persistentes y
emergentes, tales como las sustancias perfluoroalquiladas (PFAS).

Las PFAS son aquellas moléculas orgánicas en las que los átomos de hidrógeno
enlazados a los átomos de carbono (C-H) han sido completamente reemplazados por
átomos de flúor (C-F) (Buck et al., 2011a). Algunos ejemplos de familias de PFAS
incluyen a los ácidos sulfónicos perfluoroalquilados (PFSAs) y los ácidos carboxílicos
perfluoroalquilados (PFCAs), entre muchas más.

En particular, los PFCAs son la serie homóloga y análoga a los ácidos carboxílicos de
cadena lineal. En la Figura 1 se observa al ácido octanoico y a su análogo, el ácido
perfluorooctanoico (PFOA).

4
 Figura 1. Comparación entre ácido octanoico (arriba) y ácido perfluorooctanoico
(abajo), perteneciente a la familia de los ácidos carboxílicos perfluorados de cadena
lineal.

Se pueden observar dos secciones bien diferenciadas en la estructura de los PFCAs. La

primera de ellas es la cadena lineal de átomos de carbono enlazada completamente por
los átomos de flúor (C-F). La segunda de ellas corresponde al grupo funcional ácido
carboxílico terminal (-CO2H). Este arreglo estructural le confiere propiedades tanto
hidrofóbicas (cadena alquílica -CF2-) como hidrofílicas (-CO2H). Esta dualidad de
comportamiento le otorga a la molécula características muy particulares, tal como la
posibilidad de reducir significativamente la tensión superficial del agua, es decir, puede
ser utilizada como un tensoactivo o surfactante (Buck et al., 2011a). Asimismo, la elevada
energía de enlace C-F le otorga a los PFCAs una estabilidad térmica y química superior
a la de sus homólogos sin flúor C-H (Banks et al., 1994).
Debido a estas propiedades, además de su capacidad de producir espumas estables,
esta familia de compuestos es utilizada para limpiar y recubrir metales, espumas para
combatir incendios, producción de polímeros, tintas, barnices, lubricantes, aceites,
gasolina y repelentes de agua para cuero, papel y textiles (Prevedouros et al., 2006a).
Este tipo de compuestos son altamente recalcitrantes, bioacumulables y móviles.
Además, han sido encontrados en seres vivos y en productos alimenticios (Z. Wang et
al., 2014a), llegando incluso a detectarse en fauna tan aislada como en los lobos marinos
antárticos y huevos de pingüino (Schiavone et al., 2009).

5
Se ha encontrado que estos compuestos tienen efectos adversos a la salud, tales como
daño al hígado y al sistema inmunológico, y podrían tener efectos adicionales, por
ejemplo: un incremento en los niveles de colesterol, cambios en las enzimas hepáticas,
decremento en el peso de neonatos y disminución en la respuesta hacia las vacunas en
niños. Se ha observado un aumento en el riesgo de padecer alta presión sanguínea en
mujeres embarazadas y un incremento en el riesgo de padecer cáncer testicular o renal
(ATSDR CDC, 2022).

Propiedades de los PFCAs

Los PFCAs estudiados en la tesis, con sus respectivas propiedades físicas y químicas,
se muestran en la Figura 2 y en la Tabla 1

Figura 2. Ácidos carboxílicos perfluorados estudiados en la tesis.

6
Tabla 1. Propiedades fisicoquímicas de los ácidos carboxílicos perfluorados. Datos
obtenidos del National Center for Biotechnology Information, 2022; Royal Society of
chemistry, 2020; De Voogt & Sáez, 2006.

Propiedad PFBA PFHxA PFHpA PFOA PFUnA

líquido sólido blanco sólido blanco sólido blanco sólido blanco
Apariencia incoloro glutinoso granular granular granular
Masa molecular 214.04 314.05 364.061 414.068 564.09
Presión de vapor a
25ºC (mmHg) 6.37 1.98 0.13 0.032 -
Punto de fusión (ºC) -17.5 14 30 60 101
Punto de ebullición
(ºC) 121 157 176.01 189 239
Densidad (g/cm3) 1.645 1.762 1.792 1.792 1.799

Debido a la baja presión de vapor, o alta volatilidad de los PFCAs de cadena corta, se
ha reportado presencia de éstos en lugares tan remotos como la isla Baffin, en el ártico
canadiense, demostrando la existencia de un transporte atmosférico de este tipo de
compuestos (Lin et al., 2020; Macinnis et al., 2022; MacInnis et al., 2019).

Producción de PFCAs
En las figuras 3a y 3b se resumen los acontecimientos importantes relacionados con la
producción y legislación de PFCAs, sus precursores y sustancias relacionadas.

7
Figura 3a. Hitos importantes en la industria con respecto a producción y legislación de
PFCAs, sus precursores y sustancias relacionadas (Z. Wang et al., 2014c;US EPA, 2020)

8
Figura 3b. Continuación de los hitos importantes en la industria con respecto a
producción y legislación de PFCAs, sus precursores y sustancias relacionadas.(Z. Wang
et al., 2014c; US EPA, 2020). Los eventos que causaron una reducción en la producción
de PFCAs están subrayados.

9
Figura 4. Países productores de PFCAs en diferentes años. Mapa creado en
[Link] utilizando datos de Z. Wang et al. (2014a).

Como se aprecia en las figuras 3 y 4, la producción de PFCAs (principalmente PFOA y

PFNA) entre 1951 y 2010 fue dominada por grandes compañías en Europa Occidental,
Estados Unidos y Japón. En 2002, 3M reportó la presencia de PFOA en la sangre de sus
trabajadores (Buck et al., 2011b), y la creciente preocupación por sus efectos en la salud,
aunado a los cambios en métodos de producción de teflón, propició que se decidiera
cambiar a este tipo de compuestos por PFCAs de menor longitud de cadena i.e., ácido
perfluorobutanoico (PFBA), creando una tendencia de usar PFCAs de cadena corta entre
las compañías en esta parte del mundo; mientras que la producción de PFCAs de cadena
larga se focalizó en China, Rusia, India y, en menor grado, en Polonia. Un problema
derivado de esto es que no se cuenta con suficiente información de estos últimos
territorios, por lo que sólo se puede estimar su producción mediante métodos indirectos,
tales como determinación en distintas matrices ambientales, como son: cuerpos de agua,
suelos y sedimentos.

Estudios ambientales de PFCAs realizados previamente

La revisión bibliográfica realizada para este proyecto arroja que entre los años 2005 y
2022 existen 330 estudios, los cuales se encuentran resumidos en las figuras 6, 7 y 8.

10
En la Figura 5 se aprecian los lugares en donde se llevaron a cabo, al igual que las
matrices que se analizaron. Se puede observar cómo los estudios están dominados por
tres regiones: E.E.U.U, Europa y el Este asiático, mientras que existe una notable falta
de estudios concernientes en África y Latinoamérica. Un desglose de número de estudios
por país y región puede ser encontrado en la Tabla suplementaria 6.

Figura 5. Ubicación geográfica de en dónde se han realizado estudios de PFCAs, en

diferentes matrices ambientales (Abunada et al., 2020; Ahmadireskety et al., 2021; Ahrens et al., 2010, 2016;

Allinson et al., 2019; Arinaitwe et al., 2021; Arvaniti & Stasinakis, 2015; Asaoka et al., 2020; Baabish et al., 2021; Bečanová et al.,
2016; Beškoski et al., 2013; Björklund et al., 2021; Bräunig et al., 2019; Campo et al., 2015a, 2016a; Chen et al., 2017; Choi et al.,
2019; Chow et al., 2021; Chu & Letcher, 2017; Coggan et al., 2019; Corsolini et al., 2012; Crane, 2019; Desclos & Gibson, 2021;
Ding et al., 2018; Elmoznino et al., 2018; Gao et al., 2019; Gu et al., 2021; Hall et al., 2020; Hamid et al., 2018; Higgins et al., 2005;
Hong et al., 2013; Hope, 2020; Janousek et al., 2019; Johnson, 2022; Kaboré et al., 2018; Kameoka et al., 2022; Lam et al., 2017;
Lee et al., 2020; Li et al., 2022; Liu, 2018; Macinnis et al., 2022; MacInnis et al., 2019; Morales-McDevitt et al., 2022; Naile et al.,
2010; Olmsted et al., 2021; Pan et al., 2018; Pétré et al., n.d.; Pico et al., 2012; Rayne & Forest, 2009; Remucal, 2019; M. Rodríguez-
Varela et al., 2021; Semerád et al., 2020; Si et al., 2021; Tavasoli et al., 2021; Thompson et al., 2011a; B. Wang et al., 2020; Q.

11
Wang et al., 2022; S. Wang et al., 2018; Y. Wang et al., 2019; Z. Wang et al., 2014d, 2014b, 2015; White et al., 2015; Winkens et
al., 2018; Xie et al., 2021; Xu et al., 2021; Yamazaki et al., 2021; Yang et al., 2020; Yao et al., 2018; Zareitalabad et al., 2013; Zhao
et al., 2016).

Figura 6. Matrices abióticas en las cuales se han realizado estudios (Abunada et al., 2020;
Ahmadireskety et al., 2021; Ahrens et al., 2010, 2016; Allinson et al., 2019; Arinaitwe et al., 2021; Arvaniti & Stasinakis, 2015;
Asaoka et al., 2020; Baabish et al., 2021; Bečanová et al., 2016; Beškoski et al., 2013; Björklund et al., 2021; Bräunig et al., 2019;
Campo et al., 2015a, 2016a; Chen et al., 2017; Choi et al., 2019; Chow et al., 2021; Chu & Letcher, 2017; Coggan et al., 2019;
Corsolini et al., 2012; Crane, 2019; Desclos & Gibson, 2021; Ding et al., 2018; Elmoznino et al., 2018; Gao et al., 2019; Gu et al.,
2021; Hall et al., 2020; Hamid et al., 2018; Higgins et al., 2005; Hong et al., 2013; Hope, 2020; Janousek et al., 2019; Johnson,
2022; Kaboré et al., 2018; Kameoka et al., 2022; Lam et al., 2017; Lee et al., 2020; Li et al., 2022; Liu, 2018; Macinnis et al., 2022;
MacInnis et al., 2019; Morales-McDevitt et al., 2022; Naile et al., 2010; Olmsted et al., 2021; Pan et al., 2018; Pétré et al., n.d.;
Pico et al., 2012; Rayne & Forest, 2009; Remucal, 2019; M. Rodríguez-Varela et al., 2021; Semerád et al., 2020; Si et al., 2021;
Tavasoli et al., 2021; Thompson et al., 2011a; B. Wang et al., 2020; Q. Wang et al., 2022; S. Wang et al., 2018; Y. Wang et al.,
2019; Z. Wang et al., 2014d, 2014b, 2015; White et al., 2015; Winkens et al., 2018; Xie et al., 2021; Xu et al., 2021; Yamazaki et
al., 2021; Yang et al., 2020; Yao et al., 2018; Zareitalabad et al., 2013; Zhao et al., 2016).

En la Figura 6 se logra observar cómo la mayoría de los estudios se enfocan en analizar

múltiples cuerpos de agua, la primera siendo agua de río, y el agua lacustre pasando a

12
segundo plano, particularmente en Latinoamérica, región en la que la determinación de
PFCAs en medios ambientales es incipiente (Figura 5). Tal y como se ve en la Figura 6,
sólo el 9 % de los estudios en matrices abióticas han sido en aguas lacustres y lagunares,
ya que la mayoría de los estudios acuáticos se han hecho en ríos y las costas. Esto
evidencia una falta de énfasis en las lagunas y lagos que, por sus características tales
como largos tiempos de retención y actividad humana en sus costas, pueden llegar a
acumular estos compuestos, facilitando estudios de persistencia ambiental, transporte,
transformación, entre muchos otros.

Principal PFCA encontrado en cada estudio previo

(n=330)
Otros
10% TFA
17%

PFBA
9%

PFHxA
9%

PFOA
55%

Figura 7: Principal PFCA encontrado en cada estudio previo. ATFA: Ácido

trifluoroacético. Otros: PFBA, PFPeA, PFHpA, PFNA, PFDA, PFUnA, PFDoA, PFTrDA,
PFTeDA, PFODA (Abunada et al., 2020; Ahmadireskety et al., 2021; Ahrens et al., 2010, 2016; Allinson et al., 2019;

Arinaitwe et al., 2021; Arvaniti & Stasinakis, 2015; Asaoka et al., 2020; Baabish et al., 2021; Bečanová et al., 2016; Beškoski et al.,
2013; Björklund et al., 2021; Bräunig et al., 2019; Campo et al., 2015a, 2016a; Chen et al., 2017; Choi et al., 2019; Chow et al.,
2021; Chu & Letcher, 2017; Coggan et al., 2019; Corsolini et al., 2012; Crane, 2019; Desclos & Gibson, 2021; Ding et al., 2018;
Elmoznino et al., 2018; Gao et al., 2019; Gu et al., 2021; Hall et al., 2020; Hamid et al., 2018; Higgins et al., 2005; Hong et al.,
2013; Hope, 2020; Janousek et al., 2019; Johnson, 2022; Kaboré et al., 2018; Kameoka et al., 2022; Lam et al., 2017; Lee et al.,
2020; Li et al., 2022; Liu, 2018; Macinnis et al., 2022; MacInnis et al., 2019; Morales-McDevitt et al., 2022; Naile et al., 2010;
Olmsted et al., 2021; Pan et al., 2018; Pétré et al., n.d.; Pico et al., 2012; Rayne & Forest, 2009; Remucal, 2019; M. Rodríguez-
Varela et al., 2021; Semerád et al., 2020; Si et al., 2021; Tavasoli et al., 2021; Thompson et al., 2011a; B. Wang et al., 2020; Q.
Wang et al., 2022; S. Wang et al., 2018; Y. Wang et al., 2019; Z. Wang et al., 2014d, 2014b, 2015; White et al., 2015; Winkens et

13
al., 2018; Xie et al., 2021; Xu et al., 2021; Yamazaki et al., 2021; Yang et al., 2020; Yao et al., 2018; Zareitalabad et al., 2013; Zhao
et al., 2016).

Dentro de la familia de los PFCAs, el ácido perfluorooctanoico (PFOA) es el compuesto

estudiado y encontrado con mayor frecuencia en concentraciones comprendidas entre
los pg/L – mg/L. Seguidos por los compuestos de menor longitud de cadena (PFCAs C≤
6) (Figura 7). Esto se debe a los patrones de producción de la industria, observados en
la Figura 3.

II.2 Metodología SPE-HPLC-MS/MS

Dentro de la literatura, existen distintas metodologías útiles para determinar PFCAs en
matrices acuosas, en donde la extracción en fase sólida (SPE) es la más utilizada para
el tratamiento de muestra previo al análisis. Después de haberse realizado la SPE es
posible usar dos técnicas cromatográficas para el análisis de PFCAs en agua lacustre:
el primero de ellos es mediante un UHPLC acoplado a un espectrómetro de masas, y
HPLC acoplado a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo. Ambas, son formas
de cromatografía líquida y permiten observar las bajas concentraciones de los PFCAs
presentes en matrices naturales, en el orden de ng/L.

Extracción en fase sólida (SPE)

La extracción en fase sólida es una técnica en la cual se utiliza una matriz sólida dentro
de un cartucho para retener el compuesto deseado a través de equilibrios de adsorción
separándolo de los demás compuestos. Este método sigue el diagrama mostrado en la
Figura 8.

14
Figura 8. Esquema de preparación de muestra por extracción en fase solida (SPE).

El primer paso de la extracción en fase sólida consiste en el acondicionamiento, en el

que por medio de una o varias fases móviles se prepara al cartucho para retener al/los
compuestos deseados. Usualmente al finalizar esta etapa se añade el disolvente en el
que están las muestras, en un paso conocido como equilibrio.

Posteriormente se añade la muestra en la etapa de carga. En esta, el cartucho retendrá

a los analitos de interés y otros compuestos indeseables. Con el objetivo de retirar la
mayoría de los compuestos interferentes será necesario aplicar una etapa de lavado.

En este punto, idealmente sólo quedan los analitos de interés retenidos en la fase sólida
del cartucho. Para retirarlo se recurre a la última etapa, la elución, en la que se utiliza un
disolvente para eluir el analito deseado (Andrade-Eiroa et al., 2016).

Los cartuchos tienen distintas fases sólidas (adsorbentes) que hacen que retengan más
distintos tipos de compuestos. Un cartucho común es el C18, que tiene una estructura
idéntica a la de las columnas C18 en cromatografía, vistas más adelante en el
acercamiento en la Figura 12.

Otros dos cartuchos comunes son los de la marca Oasis y Strata-X, que presentan una
estructura polimérica y porosa tal como se observa en la Figura 9, en ellos existe una
retención típica de la cromatografía en fase reversa en la que los compuestos menos

15
polares son retenidos. Ambos tipos de cartucho presentan una estructura lipofílica de
divinilbenceno y en el caso de OASIS HLB, está copolimerizado con una molécula de
mayor polaridad de vinil pirrolidona, lo que le confiere un mayor carácter hidrofílico.

Figura 9. Estructuras de los cartuchos para extracción en fase sólida Oasis HLB y Strata-
X (Qureshi et al., 2011).

En los casos en los que se desee retener selectivamente a un grupo de moléculas, los
polímeros del material adsorbente pueden funcionalizarse. Particularmente, en el caso
del cartucho de la marca Oasis, cuenta con otras cuatro variedades distintas, que se
caracterizan por ser funcionalizaciones distintas del mismo copolímero de divinilbenceno
y vinilpirrolidona. El cartucho más apto para retener ácidos fuertes, como lo son los
PFCAs, es el “Oasis WAX” (Intercambio aniónico débil, por sus siglas en inglés), el cual
tiene la estructura mostrada en la Figura 10 (Waters, 2004) . La piperazina de esta
estructura tiene un pKa de 6.0, por lo que a valores de pH inferiores a este, se encuentra
protonada e interacciona fácilmente con las bases débiles, favoreciendo la retención de
los PFCAs.

16
Figura 10. Estructura molecular del cartucho OASIS WAX. Se puede apreciar que se
trata de la misma estructura que el cartucho OASIS HLB funcionalizado con piperazina
(circulada en azul), la cual se protona en valores de pH ácidos permitiendo una retención
de aniones negativos, usualmente provenientes de ácidos fuertes (Waters, 2004) .

Algunas de las ventajas de usar la SPE como método de preparación de muestra son las
siguientes:

1. Se limpia la muestra, proporcionando menor interferencia al momento de hacer

un análisis cuantitativo y reduce sustancialmente los componentes que pueden entrar el
equipo y ensuciarlo o taparlo.
2. Se preconcentran a los analitos de interés, ya que se puede eluir con un volumen
menor al volumen de carga inicial.
3. Se puede cambiar el disolvente inicial, permitiendo así que se pueda controlar
de una mejor forma la solución que entra en el equipo de análisis y maximizar la señal
analítica obtenida.
4. Se almacenan las muestras que pueden ser inestables en una matriz líquida, no
obstante, pueden brindar una mayor estabilidad al ser almacenados bajo congelación
(Gallo et al., 1995).

17
5. Se eliminan interferencias analíticas propias de la matriz, mejorando así la
sensibilidad y selectividad del método.

Entre sus desventajas están:

1. Se reduce el recobro: Al introducir más tratamientos previos al análisis, se

introducen más procesos en los que hay pérdida de analito.
2. Se disminuye la reproducibilidad: De la misma forma, se presentan más lugares
en los que puede haber errores aleatorios o sistemáticos, por lo que baja la
reproducibilidad (Andrade-Eiroa et al., 2016).

Estas desventajas pueden ser reducidas al tener procesos optimizados, estandarizados

y validados.

Cromatografía
La cromatografía es un método analítico que permite la separación física, identificación
y cuantificación de analitos en una matriz líquida o gaseosa. Este proceso consiste en
que los componentes por separar son disueltos en una fase fluida (llamada fase móvil)
que fluye a través de una columna que contiene una fase sólida (denominada fase
estacionaria). La primera se mueve a través de la segunda transportando a los
componentes de una mezcla en una dirección definida favoreciendo diferencias entre los
equilibrios de distribución entre los analitos y las fases involucradas. Estas diferencias
en los equilibrios dependerán de las interacciones químicas involucradas y el flujo de la
fase móvil, ocasionando que los componentes tengan distintas velocidades al pasar por
la fase estacionaria, resultando en que, con el tiempo, se separen, en un proceso
conocido como elución (Ahuja, 2003).

Una vez separadas las sustancias, son identificadas a través de un detector, el cual
relaciona la concentración de cada sustancia con la señal analítica obtenida, la cual se
grafica en función del tiempo con una forma similar a una curva normal (gaussiana), la
cual es denominada pico cromatográfico. El conjunto de todos los picos obtenidos al
realizar un análisis se conoce como cromatograma (Ahuja, 2003).

18
Figura 11. Cromatograma de PFCAs utilizados en el presente trabajo.

En el cromatograma observado en la Figura 11 se aprecia cómo los distintos compuestos

se eluyen en tiempos distintos, y presentan una señal analítica de intensidad variable.
El área de cada pico es proporcional a su concentración, por lo que ésta se puede
calcular usando análisis computacional para integrar cada pico.
No siempre los picos están bien definidos y separados los unos de los otros. Para obtener
un cromatograma adecuado, es necesario optimizar las variables propias de la
cromatografía, tales como los tipos de fase móvil y estacionaria utilizados, condiciones
de presión y temperatura en la columna, tipo de detector, entre otros.
Para evaluar la eficiencia de una cromatografía, se puede hacer uso de variables típicas
de un cromatograma, presentadas a continuación:

Tiempo muerto (t0):

Es el tiempo requerido para que un componente que no haya sido retenido por la fase
estacionaria salga de la columna y sea analizado.

19
Tiempo de retención (tr):
Es el tiempo que transcurre entre que un analito es inyectado y analizado. Dado que los
compuestos son representados por curvas normales, el tiempo de retención se refiere al
tiempo en el que pasa el centro, o la punta, del pico, que en términos matemáticos es la
media.

Tiempo de retención ajustado: (t’r)

Es la diferencia entre el tiempo de retención y el tiempo muerto, representa el tiempo
adicional que cada analito tomó para recorrer la columna comparado con un analito que
no es retenido y se obtiene a través de la ecuación 1:
𝑡′𝑟 = 𝑡𝑟 − 𝑡0 Ecuación 1

Factor de retención: (k)

Parámetro que relaciona la cantidad de analito en la fase estacionaria con el presente en
la fase móvil. Cuando k es muy grande, el analito está predominantemente en la fase
estacionaria, y es muy retenido, por lo que su tiempo de retención es alto. El caso
contrario ocurre cuando el analito está predominantemente en la fase móvil. El parámetro
k se puede obtener mediante las ecuaciones 2 y 3:
𝑛
𝑘 = 𝑛𝑠 Ecuación 2
𝑚

donde ns es la cantidad de analito en la fase estacionaria y n m es en la fase móvil. De

igual forma se puede obtener este factor usando los tiempos muertos y de retención,
mediante la siguiente ecuación:
𝑡′𝑟
𝑘= Ecuación 3
𝑡0

Ancho del pico en la base: (W)

Es la anchura medida en tiempo, usualmente minutos, de cada pico medida en su base,
entre las dos tangentes de cada lado del pico. En un pico simétrico es igual a cuatro
veces su desviación estándar (4σ).

20
Ancho del pico a la mitad de la altura: (W1/2)
Es la anchura del pico medida a la mitad de su altura. En un pico simétrico corresponde
a 2.354 veces la desviación estándar (2.354σ). Este valor es más fácil de calcular que el
ancho del pico en la base.

Platos teóricos: (N)

Si se tratara a la columna cromatográfica como una columna de destilación, en la que se
presentan múltiples platos, o espacios en donde ocurren equilibrios simultáneos de
distribución entre la fase sólida y la estacionaria, este parámetro representaría cuántos
platos habría en la columna. Esta es directamente una medida de la eficiencia de la
columna. Entre mayor sea este número, mayor es la eficiencia de la columna. Se calcula
con la ecuación 4:
2
𝑡𝑟 2 𝑡𝑟 2 𝑡𝑟
𝑁 = ( 𝜎 ) = 16 (𝑊) = 5.54 (𝑊 ) Ecuación 4
1/2

Altura de plato: (H)

Se refiere a la altura que tendría cada plato teórico en la columna (Ecuación 5). Un menor
número indica una mejor eficiencia. Se obtiene dividiendo la longitud de la columna entre
el número de platos teóricos:

𝐿
𝐻=𝑁 Ecuación 5

Selectividad: (α)
Es la capacidad de medir con exactitud un analito en presencia de otros, para permitir
una cuantificación confiable. Se obtiene con la ecuación 6.

𝒌 𝒕′
𝜶 = 𝒌𝟐 = 𝒕′𝟐 𝒅𝒐𝒏𝒅𝒆 𝒕′𝟐 > 𝒕′𝟏 Ecuación 6
𝟏 𝟏

Resolución: (Rs)
La resolución de dos picos que se encuentran próximos es una magnitud que se refiere
a qué tan separados están, permitiendo así analizar cada pico por su propia cuenta.

21
Cuando Rs ≥ 1.5, se puede decir con certeza que los dos picos analizados están
completamente separados. Cuando Rs = 1, existe un 2 % de traslape, asumiendo que
sean picos gaussianos perfectos. Se calcula con la ecuación 7.

2(𝑡 −𝑡 )
𝑅𝑠 = (𝑊 2+𝑊1 ) Ecuación 7
1 2

La resolución también puede ser asociada a los factores de retención, selectividad y a

los platos teóricos mediante la siguiente ecuación 8.

1 𝑘
𝑅𝑠 = 4 (𝛼 − 1)√𝑁 (𝑘+1) Ecuación 8

Se puede observar cómo mejorando las variables α, N o k se mejora el cromatograma.

(Lundanes et al., 2014)

HPLC
La cromatografía líquida de alta presión (o alta eficiencia) (HPLC, por sus siglas en
inglés) es un tipo de cromatografía en la que la fase líquida pasa a altas presiones a
través de una columna sólida e impermeable facilitando así la separación de los
componentes. La mayoría de las separaciones cromatográficas en HPLC son en lo que
se conoce como fase reversa, en la que la fase estacionaria es no polar, y la fase móvil
es polar. En la Figura 12 se muestra un esquema de un equipo común de HPLC.

22
Figura 12. Diagrama general de equipo de HPLC, con un aumento en la columna y en la
estructura superficial de cada una de sus partículas, que en este diagrama representa
una columna conocida como C18, llamada así por ser cadenas alifáticas de 18 átomos
de carbono enlazadas a una matriz de sílica.

Tal y como se ve en la Figura 12, el funcionamiento de un equipo de HPLC requiere de

una o más fases móviles en diferentes proporciones, que pasan a través de un
desgasificador para eliminar cualquier gas que tengan disuelto. Posteriormente se
combinan y movilizan mediante una bomba, y después pasan a través de un filtro.
Paralelamente, mediante un inyector, se introduce la muestra al sistema. Posteriormente,
tanto la muestra como la fase móvil entran a la válvula de seis puertos, en donde se
23
combinan. Aquí pasan a través de la columna cromatográfica y posteriormente pasan
por un detector, quién registra una señal analítica y la envía a una computadora para su
graficación.

Al considerar estas diferencias y la naturaleza de volatilidad y polaridad variables de los

PFCAs y con el objetivo de evitar el paso de derivatización, en el que puede haber
pérdidas de analito, se optó por utilizar HPLC acoplado a un espectrómetro de masas de
triple cuadrupolo.

Espectrometría de masas
La espectrometría de masas es una técnica que permite la detección de la masa
molecular de un compuesto mediante la determinación de un ion característico dividido
entre su carga eléctrica (m/z). Esta técnica permite la identificación de compuestos
orgánicos que puedan ser transformados de fase líquida a gaseosa y susceptibles a
ionización.

Análisis de masa
En este proceso la fase móvil que contiene a los analitos entra a un capilar al que se le
aplica alto voltaje (+5kV o -5kV). En la salida del capilar un gas nebulizador entra a la
mezcla para facilitar la formación de gotas. Estas gotas están altamente cargadas, y van
explotando en pequeñas gotitas repetidamente hasta que quedan iones individuales en
fase gaseosa. Una vez ionizada la muestra, el siguiente paso en la espectrometría de
masas es discernir entre las distintas especies. Para esto existen distintos analizadores
de masa, siendo el más utilizado el Analizador de cuadrupolo (MS).

En este analizador, los iones entran a un campo eléctrico oscilatorio generado por cuatro
varillas posicionadas en un arreglo cuadrado. Ambos pares opuestos están conectados
eléctricamente, y, al aplicar cierta corriente directa y frecuencia de radio a un par, y la
corriente y frecuencia opuestas en el otro par, se genera un campo eléctrico oscilatorio
que sólo permite a los iones con trayectoria estable atravesarlo. De modo que, sólo los

24
iones con una relación de masa/carga (m/z) definida son estables y pueden ser
detectados.

Para alcanzar una mayor sensibilidad y selectividad en el análisis es posible acoplar dos
cuadrupolos y una cámara de colisión, a este tipo de análisis se les llama análisis de
masa tándem (MS/MS) (Waters Corporation, 2019). Los analizadores de masa tipo
tándem (MS/MS) tienen la gran ventaja de gozar con diferentes modos de adquisición
(Tabla 2), lo cual, brinda una versatilidad de análisis capaz de mejorar la sensibilidad y
la selectividad sustancialmente, además de conducir experimentos tanto exploratorios
como específicos que los convierte en la alternativa ideal para determinar PFCAs en el
medio ambiente (Figura 13).

Tabla 2. Distintos modos de operación de un espectrómetro de masas y su relación con

los modos de los tres componentes. Scan significa que el cuadrupolo está haciendo un
barrido de un intervalo de masas que deja pasar, mientras que “estático” significa que el
cuadrupolo sólo deja pasar un ion con una masa específica. Fuente: (Waters
Corporation, 2019).

Modo Cuadrupolo 1 Celda de colisión Cuadrupolo 3

Full Scan Sin filtrar Apagada Scan
Monitoreo de Ion Simple Sin filtrar Apagada Estático
(SIM)
Scan de Ion precursor Scan Encendida Estático
Scan de ion producto Estático Encendida Scan
Pérdida Neutral Scan Encendida Scan
Monitoreo de reacciones Estático Encendida Estático
múltiples (MRM)

En la Figura 13, se ejemplifica el proceso de análisis de masas de un espectrómetro de

masas de triple cuadrupolo (MS/MS) operado en el modo de adquisición de monitoreo
de reacción múltiple (MRM). La muestra ingresa al equipo por medio del ionizador de

25
electrospray, el cual, mediante la aplicación de una diferencia de potencial entre la aguja
y el orificio de entrada, separa la muestra en iones individuales. Posteriormente, los iones
son acelerados e introducidos al analizador de masas (cuadrupolo), el cual deja pasar a
los iones de una determinada relación masa/carga (m/z).
Posteriormente los iones seleccionados pasan a través de una celda de colisión, en
donde se producen colisiones entre los iones con partículas de gas inerte (N 2) para
promover la segunda fragmentación de los iones. Posteriormente, estos fragmentos
pasan por un tercer cuadrupolo, que tiene un funcionamiento idéntico al primero, en él,
los fragmentos seleccionados son separados hasta entrar en un detector, comúnmente
un multiplicador de electrones y la señal pasa a una computadora para ser analizada.

Figura 13. Diagrama general de un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo

(MS/MS).

Al acoplar el método HPLC con un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo se

obtiene un método de cuantificación sumamente eficiente, ya que combina la separación
física de los analitos proporcionada por la HPLC con la separación, sensibilidad y
especificidad ofrecida por el espectrómetro de masas, dando como resultado la
obtención de cromatogramas y perfiles de masa altamente específicos, exactos y
precisos.

26
II.3 Historia del arte de metodologías para determinación de PFCAs en
matrices de agua ambiental
En la Figura 14, se aprecia que las metodologías analíticas utilizadas para determinar el
contenido de PFCAs en matrices acuosas han sido conducidas en gran medida por
extracción en fase sólida, seguida por la cromatografía líquida de alto rendimiento con
detección mediante espectrometría de masas tándem (SPE-HPLC-MS/MS). La gran
mayoría de estos estudios reportan recobros superiores al 60 % tal y como es visto en la
Figura 15.

Acorde a la Figura 14 y Figura 15, de los 99 estudios consultados entre 2005 y 2022 que
reportan PFCAs, 69 reportan su metodología, y de éstos, 25 estudios hicieron uso de la
metodología SPE-HPLC-MS/MS.

Figura 14: Resumen de las metodologías utilizadas en publicaciones sobre la medición

de PFCAs en aguas de distinta índole, tales como agua marina, lacustre, de río, residual,
residual tratada y potable. De las 99 fuentes utilizadas para elaborar las figuras 5, 6 y 7,

27
en 69 matrices distintas se menciona qué método de cromatografía y qué detector
utilizaron. 58 mencionan la extracción y 31 mencionan el tipo de cartucho utilizado de
extracción en fase sólida. De estos estudios, 25 hicieron uso de la metodología SPE-
HPLC-MS/MS utilizada en este estudio (Ahrens et al., 2016; Allinson et al., 2019; Arinaitwe et al., 2021; Baabish
et al., 2021; Campo et al., 2015b, 2016b; Chen et al., 2017; Chow et al., 2021; Coggan et al., 2019; Desclos & Gibson, 2021;
Elmoznino et al., 2018; Gao et al., 2019; Gu et al., 2021; Hong et al., 2013; Hope, 2020; Kaboré et al., 2018; Kim et al., 2021; Lam
et al., 2017; Lee et al., 2020; Li et al., 2022; Liu, 2018; Macinnis et al., 2022; Morales-McDevitt et al., 2022; Naile et al., 2010; Pan
et al., 2018; Pico et al., 2012; Rayne & Forest, 2009; M. Rodríguez-Varela et al., 2021; Si et al., 2021; Tavasoli et al., 2021;
Thompson et al., 2011b; S. Wang et al., 2018; Y. Wang et al., 2019; Xie et al., 2021; Xu et al., 2021; Yamazaki et al., 2021; Yang et
al., 2020; Zhao et al., 2016).

Figura 15: Análisis bibliográfico del número de estudios que reportan recobros de PFCAs.
Cabe destacar que, de los 69 estudios que reportaron metodología, sólo 40 reportaron
los recobros. De estos 40, 25 utilizaron el método SPE-HPLC-MS/MS utilizado en este
trabajo (Ahrens et al., 2016; Allinson et al., 2019; Arinaitwe et al., 2021; Baabish et al., 2021; Campo et al., 2015b, 2016b; Chen
et al., 2017; Chow et al., 2021; Coggan et al., 2019; Desclos & Gibson, 2021; Elmoznino et al., 2018; Gao et al., 2019; Gu et al.,
2021; Hong et al., 2013; Hope, 2020; Kaboré et al., 2018; Kim et al., 2021; Lam et al., 2017; Lee et al., 2020; Li et al., 2022; Liu,
2018; Macinnis et al., 2022; Morales-McDevitt et al., 2022; Naile et al., 2010; Pan et al., 2018; Pico et al., 2012; Rayne & Forest,
2009; M. Rodríguez-Varela et al., 2021; Si et al., 2021; Tavasoli et al., 2021; Thompson et al., 2011b; S. Wang et al., 2018; Y. Wang
et al., 2019; Xie et al., 2021; Xu et al., 2021; Yamazaki et al., 2021; Yang et al., 2020; Zhao et al., 2016).

Ventajas del uso de HPLC frente a la cromatografía de gases:

En la figura 14 se puede apreciar cómo la mayor parte de estudios de PFCAs en matrices
ambientales utilizan las cromatografías de líquidos y de gases como estrategia de
cromatografía.

28
Ambos tipos de cromatografía son muy utilizados para el análisis de distintos tipos de
compuestos, sin embargo, para el caso particular de los compuestos a estudiar, se
prefiere la de líquidos (Bootman, 2021). Esto se debe a los siguientes factores:

En la cromatografía de gases, es necesario:

• Derivatizar a los PFCAs para promover un incremento en la volatilidad de los

derivados para promover su extracción y/o detección vía CG.
• Realizar un estudio de estabilidad de derivados que brinde información sobre las
temperaturas en las que se debe conducir el análisis CG.

Mientras que en HPLC:

• Los PFCAs serán analizados directamente sin derivatización, reduciendo la

preparación.
• Al evitarse la derivatización, se disminuyen pérdidas adicionales de analito.
• Los compuestos a analizar pueden o no ser volátiles, útil al considerar las
volatilidades diversas de la serie homóloga de PFCAs a analizar.
• La separación puede ser conducida a temperatura ambiente, evitando
degradación de los compuestos a temperaturas altas.

II.4 Validación
Acorde a la administración de alimentos y medicamentos de los Estados Unidos (FDA)
(Fda & Cder, 2018), para poder asegurar que un método de análisis es confiable, se debe
brindar información experimental que demuestre que el método desarrollado sea capaz
de: 1) Medir a los analitos que se desean medir en las condiciones que se requieran, 2)
mostrar que la variabilidad, la repetibilidad y la reproducibilidad del método son
aceptables de acuerdo a las necesidades del análisis y 3) describir el procedimiento
experimental que permite obtener los resultados con el nivel de confianza deseado. En
este sentido, la validación es un proceso en donde se desarrollan, optimizan,
implementan y evalúan las condiciones experimentales de un método de cuantificación
previo a su utilización para la determinación de analitos en una muestra, tal como se
representa en la Figura 16. Este es un proceso constante en el que se mide mediante

29
pruebas de desempeño cuantitativas si el método cumple con las condiciones
experimentales deseadas. Si estas no se cumplen, se modifica y corrige el desarrollo
experimental, haciendo de esto un proceso iterativo hasta que se cumplan las
condiciones requeridas y el método se considere validado.

Figura 16. Diagrama de proceso general de validación de un método. Tomado de Lazos

Martínez & Hernández Gutiérrez, 2004 y modificado para el presente trabajo.

II.V Sitio de Estudio

El complejo lacustre de Lagunas de Montebello está conformado por más de 60 lagos de
origen Kárstico (Caballero, 2020) ubicados al sureste del estado de Chiapas, en los
municipios de La Trinitaria y La Independencia, y al noroeste del departamento de
Huehuetenango, Guatemala (Figura 17). Estos lagos son parte de un parque nacional y
de un sitio RAMSAR.

Estos lagos reciben el flujo de agua residual (AR) de numerosas localidades de la cuenca
del Río Grande de Comitán, siendo la ciudad de Comitán (la cuarta ciudad más poblada
del estado) la que proporciona el mayor caudal. A partir del año 2003, los pobladores

30
locales notaron que una gran parte de los lagos se volvieron más turbios y empezaron a
presentar olores fétidos (Alcocer, 2021). El complejo lacustre está divido en dos grupos,
el primero consiste en los lagos considerados como “afectados” por el AR de forma
directa, los cuales se encuentran interconectados por cauces naturales y artificiales y
son los que reciben las aguas de la cuenca. Éstos se encuentran en una zona de
planicies al noroeste del conjunto. El primer lago de este grupo es Balamtetik y siguiendo
la corriente río abajo, pasando por otra docena de cuerpos de agua, se llega al lago
Bosque Azul, a partir del cual el flujo se vuelve subterráneo, moviéndose a través de la
cuenca hasta llegar finalmente al río Usumacinta desembocando en el Golfo de México
(CONAGUA, 2009).

El segundo grupo está conformado por los lagos que aparentemente no son afectados
directamente por las AR de la cuenca y son denominados “lagos prístinos”. Estos lagos
se encuentran a una mayor elevación que los del primer grupo al sureste del conjunto,
en un terreno más accidentado, y no están interconectados de forma superficial. La
mayoría de estos lagos no cuenta con actividad humana considerable, a excepción del
lago Tziscao, el cual, al estar localizado en el cruce de la frontera internacional entre
México y Guatemala, hace que dicho lago sea el más poblado del grupo de los prístinos
propiciando una posible contaminación antropogénica.

31
Figura 17. Ubicación de las Lagunas de Montebello en el Parque Nacional Lagunas de
Montebello, al igual que su situación en Chiapas y Guatemala. Los lagos analizados en
este estudio se encuentran subrayados con color rojo (Elaboración propia, usando datos
de Open Street Maps y de Caballero et al. (2022).

32
Capítulo III: Metodología
III.1 Selección de compuestos a analizar
Debido a su presencia en prácticamente todos los biomas y su estabilidad ambiental, se
seleccionaron algunos PFCAs con diferente longitud de cadena alquílica como
compuestos por monitorear. En particular, se eligieron aquellos compuestos que han sido
producidos y utilizados mayoritariamente a través del tiempo como el PFOA; algunos que
han sido implementados en los últimos 15 años, tales como el PFBA, PFHxA y el PFHpA;
y compuestos vinculados al uso industrial como PFUnA. Se considera que los
compuestos de este tipo de 4 y 6 átomos de carbono son de cadena corta, y de 8 y 11
carbonos de cadena larga, siendo el PFHpA de cadena intermedia de 7 átomos de
carbono.

III.2 Estándares, reactivos y disolventes

Los estándares de los ácidos carboxílicos analizados se adquirieron de Sigma-Aldrich
(St. Louis, Missouri) y fueron los siguientes: ácido perfluorobutanoico (PFBA, ≥98 %
pureza), ácido perfluorohexanoico (PFHxA, ≥ 98 % pureza), ácido perfluoroheptanoico
(PFHpA, 99 % pureza), ácido perfluorooctanoico (PFOA, 98 % pureza) y ácido
perfluoroundecanoico (PFUnA, 95 % de pureza).

Los reactivos y disolventes fueron comprados a la misma compañía, y son los siguientes:
acetato de amonio (CH3COONH4, ≥ 99 % pureza, HPLC), hidróxido de amonio (NH4OH,
28-30 % pureza), metil ter-butil éter (MTBE, ≥ 99.8 % pureza, HPLC), el metanol,
acetonitrilo y agua utilizados, fueron grado HPLC.

III.3 Instrumentación
• Cromatógrafo de líquidos de alta eficiencia Agilent 1620, Infinity series (Agilent
Technologies ®) acoplado a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo
Agilent 6420 (Agilent Technologies®).
• Extractor multi-muestra Manifold marca Waters® (Milford, Massachusetts, USA).
• Centrífuga con rotor de 6 ˣ 150 mL de 11, 000 rpm marca Eppendorf.
• Purificador y desionizador de agua Miling marca Merck®, modelo Elix reference
5.

33
 • Balanza analítica con capacidad de 0.0001-250 g, marca Ohaus®, modelo
explorer.
• Dispensador de nitrógeno de seis vías Mini-vap marca Supelco (Bellefonte,
Pennsylvania, USA).
• Nucleador de Gravedad marca UWITEC, modelo USC 06000.
• Tubos de PVC transparentes para nucleador de 8.6 cm de diámetro.

III.4 Columnas y cartuchos

• Columna pre guarda Zorbax SB-C8 (2.1 x 30 mm, con un tamaño de partícula de
1.8 µm) marca Agilent Technologies.
• Columna cromatográfica Zorbax SB-C18 (4.6 x 150 mm, con 3.5 µm de tamaño
de partícula) marca Agilent Technologies.
• Cartuchos de extracción en fase sólida Oasis WAX® 6 cc, con 150 mg de sorbente
de extracción y 30 µm de tamaño de partícula, Waters® (Milford, Massachusetts,
USA).

III.5 Materiales
• Filtros de acero inoxidable, Agilent Technologies®.
• Adaptador de bomba binaria de acero inoxidable, Agilent Technologies®.
• Tubos para centrífuga de polipropileno (PP) con una capacidad de 150 cc, Thermo
Scientific.
• Filtros de Nylon de tamaño de poro de 0.45 µm marca Milipore®.
• Botellas de polipropileno (PP) color ámbar con capacidad de 250 mL.

III.6 Software
• El análisis de los espectros de masa se realizó con el programa MassHunter
versión 5.3 (Agilent Technologies).
• El análisis estadístico de los resultados se hizo con el programa Statgraphics
Centurion XVI.I (Statgraphics Inc.), al igual que con Microsoft Excel 2021.
34
III.7 Sitios de muestreo de agua
Se eligieron puntos de toma de muestra localizados tanto en los lagos afectados como
en los prístinos. Asimismo, se tomaron muestras de agua superficial como columnas de
agua en el fondo de cada lago. La Figura 17 muestra los sitios de muestreo considerados
para esta investigación.

Los puntos de toma de muestra de aguas superficiales para el grupo de lagos prístinos
fueron los lagos:

• Montebello.
• Tziscao.

Los puntos de toma de muestra de aguas superficiales para el grupo de lagos afectados
fueron los lagos:
• Balamtetik.
• Bosque Azul.

De igual forma se tomó agua proveniente de la zona del fondo de los lagos Montebello y
Bosque Azul (Figura 18), la cual se obtuvo a una profundidad de 30 metros en la zona
más cercana posible al centro de cada lago.

Las muestras de agua se tomaron el mes de noviembre del 2019, para ello, se utilizaron
botellas de polipropileno de 250 mL color ámbar, las cuales fueron previamente lavadas
y acondicionadas de acuerdo con lo descrito por M. R. I. Rodríguez-Varela (2022), con
el objetivo de reducir el número de interferentes propios de los materiales y efectos de
contaminación cruzada. El lavado de los recipientes se hizo por triplicado, siendo el
primero de ellos con una disolución de metil ter-butil éter, seguido por un lavado con una
disolución de hidróxido de amonio en metanol (0.1 % v/v), finalizando con un lavado con
agua de grado HPLC, todo esto acorde con las recomendaciones señaladas por
Shoemaker et al. (2009).

La toma de las muestras de agua superficiales se hizo de acuerdo con lo señalado por
el método 537 “Determinación de ácidos alquílicos perfluorados en agua potable por

35
extracción en fase sólida y cromatografía de líquidos en conjunto con espectrometría de
masas” (LC/MS/MS) de la agencia de protección ambiental de los Estados Unidos (EPA,
por sus siglas en inglés) (Shoemaker et al., 2009) con algunas adaptaciones de la norma
mexicana NMX-AA-014-1980, donde se especifican las condiciones de muestreo para
cuerpos receptores con algunas adecuaciones dependiendo del sitio.

La toma de muestra de agua superficial se realizó tomando tres muestras aleatorias en

el centro y costas del lago. Previo a la toma de muestra, los recipientes se lavaron por
triplicado utilizando el agua del punto de muestra seleccionado. Posteriormente, se tomó
1 L de muestra asegurando que no quede aire en ella y se le adicionaron 2 mL de MeOH
y 1 mL de ácido nítrico para evitar la formación de microorganismos.

Las tomas de muestras de agua del fondo se realizaron a una profundidad de 30 metros,
lo más cercano posible de cada centro de los lagos Bosque Azul y Montebello por medio
de un nucleador de gravedad, el cual es un equipo que, por medio de un sistema de
pesas, logra obtener una columna, también llamada núcleo, de sedimento del fondo del
lago, estabilizado en su parte superior con una capa de agua del fondo, como se ve en
la Figura 18.

36
Figura 18. Fotografía de núcleo de sedimento. En la parte superior del cilindro se observa
el agua del fondo analizada en este estudio (Laboratorio de Paleolimnología, UNAM,
2020).

III.8 Pre y tratamiento de muestra

Una vez tomadas las muestras, éstas deben adecuarse para su análisis. En una primera
instancia, las muestras se centrifugaron a 10,500 RPM por 10 minutos, el remanente
acuoso se filtró a través de dos membranas de nylon de 0.45 y 0.22 μm. Los filtros fueron

37
pretratados previamente por inmersión en el agua de los lagos durante 24 h antes de su
uso.

Posteriormente los PFCAs se extrajeron, purificaron y reconcentraron por lotes mediante

la técnica de extracción en fase sólida, acorde con lo descrito por M. Rodríguez-Varela
et al. (2021).

Para ello, se utilizaron cartuchos de intercambio aniónico débil Oasis WAX® de 6 cc, los
cuales se acondicionaron con 5 mL de hidróxido de amonio en metanol (NH4OH 0.1 %
v/v), seguidos por 5 mL de metanol y 5 mL de agua de grado HPLC. Posteriormente, se
cargaron 250 mL de las muestras de agua superficial y del fondo lacustre a un flujo de 5
mL/min.

Después, los cartuchos cargados se purificaron haciendo pasar 5 mL de acetato de

amonio en agua (NH4CH3CO2 0.1% v/v) ajustado a un pH = 9.2, seguido por 5 mL de
una mezcla agua-metanol 95:5 % v/v.

La elución de los PFCAs objetivo de los cartuchos se realizó únicamente utilizando

gravedad con 6 mL de hidróxido de amonio en metanol (NH4OH 0.1 % v/v). Los extractos
fueron evaporados con N2 de ultra alta pureza con un flujo aproximado de 30 mL/min,
posteriormente, se reconstituyeron con 250 μL de fase móvil cromatográfica y se
transfirieron a insertos de análisis de 300 µL, los cuales se introdujeron en viales
cromatográficos de 2 mL.

III.9 Determinación de los compuestos mediante HPLC-MS/MS

La separación cromatográfica se hizo utilizando un HPLC (Agilent 1620-Infinity Series,
Agilent Technologies) acoplado a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo (6420,
Agilent Technologies), mediante una ionización por electrospray operado en modo
negativo (ESI-).

Es importante señalar que debido a que algunas partes del sistema HPLC-MS pueden
actuar como fuentes de ingreso de PFCAs al sistema, ya que posee aditamentos
compuestos por politetrafluoroetileno (PTFE o Teflón®), el cual, es un compuesto

38
derivado de los ácidos carboxílicos perfluorados, fue importante cambiar los filtros de la
fase móvil, la válvula de purga y la frita por sus homólogos de acero inoxidable y
adaptando una columna de guarda Zorbax SC-C8 (2.1 ˣ 30 mm, 1.8 µm de tamaño de
partícula) con el objetivo de reducir la contribución de PFCAs del instrumento al método.

Identificación y optimización de iones fragmento de seguimiento de los PFCAs en

el equipo
Para determinar los parámetros óptimos de operación del cromatógrafo y del
espectrómetro de masas, primero se preparó una muestra de 1 mg/L de cada PFCA en
metanol, se traspasó 1 mL de ésta a un vial ámbar de HPLC, y se inyectaron 10 μL por
cada prueba realizada.

Posteriormente se optimizó el espectrómetro de masas. Para ello, se utilizó el modo de

adquisición SCAN o barrido completo de iones, aplicado en el intervalo de 50 - 600 m/z.
En esta etapa inicial se utilizó el modo de ionización con electrospray negativo, un voltaje
de fragmentación de 70 V, un voltaje capilar de - 4000 V, una presión de nebulizador
igual a 11 psi, temperatura de 300°C y flujo de gas de secado igual a 11 L/min.

Una vez identificados los iones moleculares, el pico base y los fragmentos más estables,
se aplicó un barrido de ion fragmento utilizando el modo ion producto. En el cual se filtra
únicamente un ion en el primer cuadrupolo, en este caso, el ion molecular de cada PFCA,
posteriormente se fragmenta en el segundo y se cuentan todos los posibles fragmentos
en un intervalo determinado de masa. En esta etapa se aplicó una energía de colisión de
20 eV, un voltaje de fragmentación de 135 V y un voltaje de aceleración de 4 V. El barrido
de iones comprendió el intervalo 40 - 1000 m/z. En la Tabla 3 se muestran los iones
precursores, fragmento y confirmación seleccionados para cada PFCA.

39
Tabla 3. Iones precursor, fragmento y confirmación seleccionados de cada PFCA.

Compuesto Ion precursor Ion Fragmento Ion de

(m/z) (m/z) confirmación (m/z)
PFBA 212.9 168.9 N.d.
PFHxA 313 269 119
PFHpA 362.9 319 169
PFOA 412.9 369 169
PFUnA 562.9 519 169
N.d.= No disponible. No existe un ion producto observable para este compuesto

Una vez seleccionados los iones producto, se utilizó el modo de adquisición de monitoreo
de reacciones múltiples (MRM) con el cual se optimizaron los parámetros instrumentales
del espectrómetro de masas procurando siempre maximizar la señal analítica obtenida
mediante el uso de iones fragmento precursores y producto. Los parámetros evaluados
se presentan en la Tabla 4.

Tabla 4. Parámetros evaluados en el espectrómetro de masas.

Parámetro Instrumental Niveles evaluados

Voltaje de fragmentación (V) 65, 70, 75, 105, 135
Energía de colisión (eV) 0, 3, 5, 9
Voltaje de aceleración (V) 0, 2, 4, 7
Dwell (m/s) 50, 100, 200

Análisis cromatográfico
La separación cromatográfica se hizo de acuerdo con lo señalado por Rodríguez-Varela
et al. (2021) y Rodríguez-Varela (2022). Para ello, se utilizó una columna cromatográfica
ZORBAX SB-C18 (4.6 × 1500 mm y 3.5 µm de tamaño de partícula). La fase móvil estuvo
compuesta por una mezcla de disolventes donde el disolvente A fue acetato de amonio
en agua (NH4CH3CO2, 0.001 M) y la fase B se conformó por acetato de amonio en
metanol (NH4CH3CO2, 0.001 M). La elución cromatográfica se condujo aplicando el
siguiente gradiente:

40
• 40 % de B por 5 minutos.
• Incremento de B lentamente hasta 100 % durante 20 minutos.
• 100 % de B por 5 minutos.
• Decremento de B hasta 40 % durante 3 minutos.
• 40 % de B por 5 minutos.

Optimización de los parámetros de HPLC-MS/MS dependientes de la fase móvil

Terminado esto, se procedió a optimizar los parámetros que exhiben una dependencia
con respecto a la fase móvil. Los niveles evaluados para estos parámetros son
mostrados en la Tabla 5.

Tabla 5. Niveles evaluados en la optimización de parámetros del equipo de HPLC.

Parámetro Instrumental Niveles evaluados

Temperatura del gas de secado (°C) 200, 250, 300
Flujo del gas de secado (L/min) 7, 9, 11, 13
Presión del nebulizador (psi) 9, 12, 15
Voltaje capilar (V) 1000, 4000, 7000
Volumen de inyección (μL) 5, 10

Reducción de interferencias instrumentales

Debido a la presencia de numerosos PFCAs y sus precursores en partes clave del
equipo, se cambiaron piezas y se hicieron metodologías de ciclos de lavado y de análisis
para reducir el ruido de fondo lo máximo posible, acorde a la metodología empleada en
el equipo de trabajo, reportada en (Rodríguez-Varela, 2022) y descrita a continuación:

1) Entrada constante de una mezcla 50:50 de A (acetato de amonio en agua 1 mM) y

B (acetato de amonio en metanol 1 mM) por 30 minutos.
2) 5 inyecciones de blanco instrumental.
3) Se realiza el análisis de 6 muestras, blancos o estándares, dependiendo el caso.
4) 8 ciclos de lavado usando fase móvil, sin inyección. Si se quiere seguir analizando
muestras, regresar al paso 2, de lo contrario:
41
5) Entrada constante de una mezcla 50:50 de A (acetato de amonio en agua 1 mM) y
B (acetato de amonio en metanol 1 mM) por 30 minutos.

Corrección de impurezas
Como última medida para eliminar la influencia de otros interferentes del equipo y de los
materiales utilizados durante el muestreo y la preparación de muestras, se utilizaron
datos de corrección de blancos obtenidos previamente por el equipo de trabajo
(Rodríguez-Varela, 2021). Los datos de corrección de blancos son mostrados en la
Tabla 6 y fueron obtenidos tras monitorear cada tipo de blanco de forma sistemática
(n>20). El análisis tuvo por objetivo calcular la contribución de la señal analítica en cada
material utilizado para la determinación.

Tabla 6. Contribución en área de diversos parámetros en los blancos de muestra.

Tipo de Área determinada (unidades de área)

Blanco
PFBA PFHxA PFHpA PFOA PFUnA
HPLC N. D 21.6±6.6 12.9±3.5 18.2±3.3 N.D.
Agujas del
manifold
SPE 14.3±3.7 15.5±4.7 N.D. 32.1±6.8 N.D.
Cartuchos
SPE N. D N. D N. D 11.3±3.5 N. D
Botes de
polipropileno
(muestreo) 16.6±3.1 N. D N. D 18.2±3.9 N. D
Blancos
ambientales
de muestra 15.7±2.5 N. D N. D N. D N. D

42
Posteriormente, se corrigieron las áreas de cada compuesto con la siguiente ecuación:

Á. 𝑐𝑜𝑟𝑟𝑒𝑔𝑖𝑑𝑎 = Á. 𝑜𝑏𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑎 − 𝑋̅Á. 𝐻𝑃𝐿𝐶 − 𝑋̅Á. 𝑎𝑔𝑢𝑗𝑎𝑠 − 𝑋̅Á. 𝐶𝑎𝑟𝑡𝑢𝑐ℎ𝑜𝑠 − 𝑋̅Á. 𝑏𝑜𝑡𝑒𝑠 − 𝑋̅Á. 𝑎𝑡𝑚

Ecuación 9

Donde Á. se refiere a las áreas, 𝑋̅ se refiere a la media de áreas adicionales en cada

categoría, “agujas” se refiere a las del manifold, “cartuchos” a los cartuchos OASIS WAX,
“botes” a los botes de polipropileno usados para tomas muestras, y Á. atm se refiere al
área atmosférica, la cual fue obtenida dejando un contenedor al aire libre al lado del sitio
en que se realizaba el muestreo para evaluar si hubo transporte ambiental del analito en
la etapa de monitoreo.

III.10 Validación de parámetros cromatográficos

Se validaron los siguientes parámetros: intervalo lineal, precisión, límite de detección,
límite de cuantificación, exactitud y evaluación de efecto matriz utilizando curvas de
calibración de todos los PFCAs dentro del intervalo de 15 a 250 ng/L

Intervalo lineal y de trabajo

Se construyeron dos curvas de calibración, una en agua de grado HPLC, y otra en agua
lacustre del cuerpo Balamtetik utilizando el método de adición de estándar o adición de
patrón, el cual consiste en adicionar concentraciones conocidas de analito a una muestra
en la matriz a analizar, la cual contiene en sí una concentración aún desconocida de
dicho compuesto a analizar. Se crea una relación entre las concentraciones adicionadas
y la respuesta analítica, posteriormente, se extrapola hasta la concentración igual a 0, y
se obtiene la concentración inicial de analito desconocido (Bader & Morris, 1980)

La linealidad se evaluó inyectando curvas de calibración de PFCAs conformadas por diez

niveles dentro del intervalo de concentración de 15-250 ng/L por triplicado. Esto fue tanto
en agua lacustre como en agua de grado HPLC. Se consideró como linealidad aceptable,
aquellas curvas que mostraran un coeficiente de determinación r ≥ 0.99 y cuyos

43
residuales mostraran aleatoriedad en todos los niveles de concentración estudiados.
(Figura suplementaria 24).

Precisión

Se inyectaron por triplicado tres mezclas de estándares de preparaciones independientes

de los cinco PFCAs de las siguientes concentraciones: 30, 160 y 220 ng/L Para cada
compuesto se calcularon las medias (𝑋̅) y las desviaciones estándar (σ), con estos datos
se calculó el porcentaje de desviación estándar relativa (% RSD) mediante la ecuación
10.

𝜎
%𝑅𝑆𝐷 = (𝑋) ∗ 100 Ecuación 10

Límite de detección (LDD):

Para evaluar el límite de detección se inyectó una mezcla de estándares de PFCA por
septuplicado en concentraciones de 3, 5 y 8 ng/L. Para obtener el límite se determinó la
concentración a la cual la razón entre la señal analítica y el ruido de fondo fuera mayor
o igual a 3 acorde con la ecuación 11.

𝑆𝑒ñ𝑎𝑙 𝑎𝑛𝑎𝑙í𝑡𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑡𝑜

𝐿𝐷𝐷 = 𝑆𝑒ñ𝑎𝑙 𝑎𝑛𝑎𝑙í𝑡𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑟𝑢𝑖𝑑𝑜 𝑑𝑒 𝑓𝑜𝑛𝑑𝑜 ≥ 3 Ecuación 11

Límite de cuantificación (LDC)

El límite de cuantificación se determinó inyectando tres concentraciones de 15, 30 y 50

ng/L por triplicado. Se consideró un límite de cuantificación aceptable cuando la razón
entre la señal del analito y el ruido de fondo fue mayor o igual a 10, de acuerdo con la
ecuación 12.

𝑆𝑒ñ𝑎𝑙 𝑎𝑛𝑎𝑙í𝑡𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑡𝑜

𝐿𝐷𝐶 = 𝑆𝑒ñ𝑎𝑙 𝑎𝑛𝑎𝑙í𝑡𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑟𝑢𝑖𝑑𝑜 𝑑𝑒 𝑓𝑜𝑛𝑑𝑜 ≥ 10 Ecuación 12

Exactitud

La exactitud del método se evaluó para tres niveles de concentración por triplicado. Los
niveles evaluados fueron: 15, 130 y 250 ng/L. Posteriormente, se calculó el porcentaje

44
de recobro (% R) con la ecuación 13. Donde CR se refiere a la concentración recobrada
y CC la concentración teórica inicial. Se consideró como un porcentaje de recobro
aceptable para un nivel de concentración de ng/L aquellos que están comprendidos entre
el 60-120 % de acuerdo con lo recomendado por Peters et al. (2007).

𝐶𝑅
%𝑅 = ∗ 100 Ecuación 13
𝐶𝐶

El efecto matriz

El efecto matriz se evaluó mediante la construcción y comparación de las pendientes de

las curvas de recobro a diez niveles de concentración comprendidos en el intervalo 15-
250 ng/L para dos matrices, esto es: agua lacustre y agua grado HPLC.

45
Capítulo IV: Resultados de la optimización
IV.1. Espectros de masas de los PFCAs y selección de iones
cuantitativos y de confirmación

Al emplear el modo de adquisición de barrido completo de iones (Full SCAN) del

espectrómetro de masas, se obtuvieron los fragmentos de masa más abundantes y
característicos de cada PFCA estudiado (Figura 19 a Figura 23), que posteriormente, en
el modo ion producto, o fragmentación específica del tipo de barrido ion-fragmento, se
evaluaron.

Figura 19. Espectro de masa obtenido de PFBA. El ion marcado con azul corresponde al
ion molecular y el rojo al ion producto cuantitativo.

46
Figura 20. Espectro de masa obtenido del PFHxA. El ion marcado con azul corresponde
al ion molecular, el rojo al ion producto cuantitativo, y el verde al ion producto cualitativo.

Figura 21. Espectro de masa obtenido del PFHpA. El ion marcado con azul corresponde
al ion molecular, el rojo al ion producto cuantitativo, y el verde al ion producto cualitativo.

47
Figura 22. Espectro de masa del PFOA. El ion marcado con azul corresponde al ion
molecular, el rojo al ion producto cuantitativo, y el verde al ion producto cualitativo.

Figura 23. Espectro de masa obtenido del PFUnA. El ion marcado con azul corresponde
al ion molecular, el rojo al ion producto cuantitativo, y el verde al ion producto cualitativo.

En los espectros de masa se puede apreciar cómo en todos los compuestos vistos entre
la Figura 19 y la Figura 23 el ion molecular [M-H]- presenta abundancia importante, no
obstante, el pico base corresponde con la fragmentación del ion carboxilato [R-COO]/
[M-44]-, correspondiente a una pérdida de 44 unidades de m/z. Posteriormente, se
observaron fragmentaciones de grupos (-CF2)n. La segunda pérdida de 194 m/z
corresponde a la pérdida de 3 conjuntos de CF2 ([M-194]-). En el caso de los PFCAs más
pesados (PFOA y PFUnA), las siguientes fragmentaciones corresponden a la pérdida
sucesiva de 50 m/z que conforman al grupo (-CF2-).

La ruptura del grupo carboxilato se debe a la conjunción de dos motivos concomitantes,

48
a saber: 1) que, debido a la densidad electrónica y el tamaño de los átomos de flúor, se
introduce un ligero carácter iónico, y esto produce la formación de cargas parciales en el
enlace Cδ+-Cδ-, lo que aumenta la fuerza del enlace y le proporciona una estabilidad
superior. 2) el efecto inductivo por parte de los átomos de flúor y oxígeno enlazados a
los átomos de carbono propicia el desplazamiento de la densidad electrónica de los
enlaces C-C, lo cual se refleja en la energía de enlace C-F y C=O, que es superior a la
del enlace F3C-CF3 (536 kJ/mol y 749 kJ/mol contra 406 kJ/mol, respectivamente
(Cottrell, 1958). Considerando esta diferencia energética es posible establecer que la
secuencia de fragmentos más estable será (-CF2-) ya que los enlaces menos energéticos
y, por ende, los más sencillos de romper, son los C-C a lo largo de la cadena.

En el caso de PFBA, PFHxA y PFHpA, se logra observar un pico con masa 42 unidades
de m/z mayor que el ion molecular y una abundancia relativa más baja que todos los
demás picos. Esta masa sugiere que un fragmento molecular se unió al ion molecular,
también conocido como aducto, probablemente C3H6 o C2OH2 en sus fórmulas mínimas.

En todos los casos, el fragmento con mayor abundancia relativa fue el resultante de la
pérdida del carboxilo [M-44]-, este fue el que se usó como ion cuantitativo. El fragmento
resultante con la segunda mayor abundancia fue variable para todos los compuestos, no
obstante, fueron útiles para complementar la identificación molecular al ser utilizados
como iones de confirmación. En la Tabla 7 se muestra la masa de fragmentos
cuantitativos y cualitativos en el análisis de cada PFCA.

Tabla 7. Masa de fragmentos utilizados en el análisis de PFCAs.

PFCA Masa Ion precursor Ion Producto Ion producto

molecular (m/z) (Cuantitativo) (cualitativo)
(g/mol) [M-H]- [M-44]-
PFBA 214 212.9 168.9 --
PFHxA 314 313.0 269.0 119.0 [M-194]-
PFHpA 364 362.9 319.0 169.0 [M-194]-
PFOA 414 412.9 369.0 169.0 [M-244]-
PFUnA 564 562.9 519.0 169.0 [M-394]-

49
IV.2 Optimización de parámetros espectrométricos
A lo largo de la optimización del espectrómetro de masas se utilizaron las mismas
condiciones cromatográficas utilizadas por Rodríguez-Varela et al. (2021). Sin embargo,
para corroborar su correcto funcionamiento en matrices de agua lagunar, se volvieron a
optimizar las condiciones de operación espectrométricas que promueven la
maximización de la señal analítica del equipo en el proceso de fragmentación molecular
independiente de la fase móvil (voltaje de fragmentación, voltaje de aceleración, energía
de colisión y dwell) para cada PFCA estudiado. Las magnitudes de cada parámetro
evaluado se aprecian en la Tabla 8:

Tabla 8. Lista de condiciones operativas independientes de la fase móvil en el

espectrómetro de masas.

Compuesto Transición Voltaje de Voltaje de Energía Dwell

(m/z) fragmentación aceleración de (1/s)
(V) (V) colisión
(eV)
PFBA 212.9→168.9 75 4
PFHxA 313.0→269.0
65 7
313.0→119.0
PFHpA 362.9→319.0
65 4
362.9→169.0 3 100
PFOA 412.9→369.0
65 2
412.9→169.0
PFUnA 562.9→519.0
65 7
562.9→169.0

De igual forma, se optimizaron los parámetros espectrométricos dependientes de la fase

móvil (temperatura del gas de secado N2, flujo del gas de secado N2, voltaje del capilar,
presión del nebulizador y el volumen de inyección). Los detalles pueden ser observados
en las figuras suplementarias 10 a 18. Es importante señalar que para esta optimización
ya se contaba con las condiciones de separación cromatográficas estipuladas por
50
Rodríguez-Varela, et al. (2021) y Rodríguez-Varela (2022). En este sentido, los
parámetros espectrométricos que maximizaron la intensidad de la señal analítica en la
mayor cantidad de PFCAs fueron:

• Temperatura de gas: 300 °C

• Voltaje del capilar: 1000 V
• Volumen de inyección: 10 μL
• Flujo de gas: 11 mL/min
• Presión del nebulizador: 20 psi

Con los parámetros espectrométricos dependientes e independientes de la fase móvil

óptimos, se obtuvo el cromatograma correspondiente a la separación de los cinco PFCAs
bajo estudio, el cual se presenta en la Figura 24. De igual manera se calcularon los
parámetros cromatográficos para cada PFCA o par de PFCAs (Tabla 9). En esta tabla
se observaron selectividades (α) mayores a 1 y resoluciones entre picos adyacentes (Rs)
superiores a 3 para todos los casos. Estos resultados indican que las condiciones de
separación cromatográfica fueron altamente eficientes y permiten la identificación
específica de los cinco compuestos. Aunado a esto, el seguimiento de fragmentaciones
ion precursor-ion producto aumenta sustancialmente la selectividad del sistema acoplado
HPLC-MS/MS.

Las pruebas de optimización implementadas en el presente trabajo son mostradas entre

la Figura suplementaria 1 y la Figura suplementaria 18

51
Figura 24. Cromatograma obtenido en el que se muestran los picos obtenidos por cada
PFCA Se pueden observar los tiempos de retención, y a simple vista una buena
selectividad y resolución.

Tabla 9. Parámetros obtenidos del cromatograma de la figura 24.

Compuesto PFBA PFHxA PFHpA PFOA PFUnA

tr 5.39 16.73 20.11 22.14 26.07
t'r 1.89 13.23 16.61 18.64 22.57
k 0.542 3.78 4.74 5.33 6.45
α n/a 6.98 1.26 1.12 1.21
W* 0.6 1 0.85 0.5 0.6
Rs n/a 14.17 3.66 3.01 7.14

IV.3 Verificación de la validación del método HPLC

Se verificó la validación del método SPE-HPLC-MS/MS desarrollada por Rodríguez-
Varela et al. (2022) en agua de grado HPLC. Asimismo, se evaluó, validó y comparó la
aplicabilidad del método para el agua lacustre procedente del sistema Lagunas de
Montebello.

52
La validación del método SPE-HPLC-MS/MS consideró la evaluación de los siguientes
parámetros: 1) la linealidad e intervalo de trabajo del método, 2) la precisión, 3) los límites
de detección, 4) los límites de cuantificación, 5) la certeza (exactitud), y 6) el efecto
matriz.

Linealidad
Para determinar la linealidad se hicieron curvas de calibración de estándar externo y
adiciones patrón de los cinco PFCAs por analizar en agua de grado HPLC y lacustre,
respectivamente. Las curvas de calibración son mostradas en la Figura 25 y la Figura 26

3.0E+05

2.5E+05

2.0E+05
ÁREA (U.A.)

1.5E+05

1.0E+05

5.0E+04

0.0E+00
0 50 100 150 200 250 300
CONCENTRACIÓN (NG/L)

PFBA PFHxA PFHpA PFOA PFUnA

Figura 25. Curva de calibración de PFBA, PFHxA, PFHpA, PFOA y PFUnA en agua de
grado HPLC.

53
 3.0E+05

2.5E+05

2.0E+05
ÁREA (U.A.)

1.5E+05

1.0E+05

5.0E+04

0.0E+00
0 50 100 150 200 250 300
CONCENTRACIÓN (NG/L)

PFBA PFHxA PFHpA PFOA PFUnA

Figura 26. Curva de calibración de PFBA, PFHxA, PFHpA, PFOA y PFUnA en agua
lacustre.

Las curvas de calibración para cada PFCA son mostradas entre la Figura suplementaria
19 y la Figura suplementaria 23. Mientras que los valores de la ordenada, la pendiente y
el coeficiente de correlación determinados para todos los compuestos en las matrices de
agua HPLC y agua lacustre son resumidos en la Tabla 11.

Se puede apreciar cómo para todos los PFCAs estudiados en ambos tipos de matrices,
las pendientes determinadas fueron iguales entre las curvas de las aguas residuales en
comparación con las de HPLC, aceptando las H0 en las pruebas de hipótesis, por lo que
se demuestra que el equipo es sensible a los ácidos carboxílicos perfluorados. En este
sentido, las sensibilidades del método hacia los compuestos aumentan conforme
incrementa la longitud de la cadena alquílica de éstos. En todos los casos el coeficiente
de correlación fue superior a 0.998, además, las gráficas de residuales obtenidas para
cada compuesto en ambos tipos de matriz exhiben una distribución aleatoria en todos
los niveles de concentración comprendidos entre 20-250 ng/L (Figura suplementaria 24).

54
Al realizar las pruebas estadísticas sobre la ordenada al origen de cada curva de
calibración, el PFOA exhibió diferencias significativas al contrastarse mediante pruebas
de hipótesis (aceptando H0 para todas las pruebas exceptuando la de dicho compuesto).
Esto indica que para este analito el efecto producido por la matriz produce una alteración
en la señal analítica sustancialmente, de modo que, si bien para todos los demás
compuestos a analizar es posible utilizar ambas curvas de concentración para calcular
su nivel, es necesario usar la curva de agua lagunar para obtener la concentración del
PFOA.

Se pueden encontrar las gráficas de residuales completas en la Figura suplementaria 24.

En la Tabla 10 se muestra el resumen de las pendientes, ordenadas al origen, y

coeficientes de correlación de la curva de calibración de cada compuesto. Es notable
que, para todos los compuestos en ambas matrices, r es mayor o igual a 0.9988,
indicando una tendencia lineal.

Tabla 10. Resumen de pendientes, ordenadas al origen y coeficientes de correlación de

las curvas de calibración de cada PFCA analizado en agua de grado HPLC y agua
lacustre.

Agua HPLC Agua lacustre

Compuesto m b r m b r
PFBA 416.3 -4930.5 0.9988 416.3 -5027.6 0.9995
PFHxA 588.48 3437.8 0.9994 589.87 3228.4 0.9996
PFHpA 1029.5 -16229 0.9993 1038.6 -16719 0.9995
PFOA 746.91 -10305 0.9992 1151.5 -20115 0.9996
PFUnA 747.26 -10206 0.9997 748.57 10295 0.9995

Precisión
Para los análisis para la matriz de agua lacustre se llevó a cabo un análisis de precisión.
Esto se hizo en tres niveles de concentración: 30, 160 y 250 ng/L y por triplicado. La
respuesta analítica obtenida para cada nivel de concentración se utilizó para calcular el
porcentaje de desviación estándar relativa (% RSD), la cual está presentada en la Tabla

55
11. En dicha tabla se puede apreciar cómo todos los porcentajes exhiben % RSD ≤ 10
%, siendo los niveles más bajos los que demostraron mayor variabilidad. Sin embargo,
estos porcentajes son aceptables de acuerdo con Peters et al. (2007) y Taverniers et al.,
(2004) para niveles de concentración en ng/L.

Tabla 11. Porcentajes de desviación estándar relativa (% RSD) promedio de cada PFCA
analizado (n=3).

Agua HPLC Agua Lacustre

% RSD
30 ng/L 160 ng/L 250 ng/L 30 ng/L 160 ng/L 250 ng/L
PFBA 9.6 1.7 2.0 13.0 2.0 1.3
PFHxA 2.1 2.2 1.0 2.8 0.5 1.1
PFHpA 2.3 1.3 1.9 6.8 1.9 1.1
PFOA 5.2 4.1 1.4 6.2 1.1 2.1
PFUnA 5.2 0.3 0.4 6.8 1.9 1.1
Límite de detección
Tabla 12. Relación señal-ruido (SNR) y desviación estándar relativa intermedia (%
RSDinter) en los tres niveles más bajos de la curva de calibración para los PFCAs
estudiados.

PFBA PHHxA PFHpA PFOA PFUnA

Nivel de
concentració
% % % % %
n (ng/L)
SNR RSD SNR RSD SNR RSD SNR RSD SNR RSD
inter inter inter inter inter
1 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND
3 ND ND 2.7 11.4 3.1 7.6 3 6.9 ND ND
5 3.9 7.6 3.4 8.2 5.1 5.3 9.7 3.9 4.5 6.5

Para obtener el límite de detección, se hicieron pruebas en las que se medía la relación
señal/ruido (SNR, por sus siglas en inglés) y la desviación estándar relativa intermedia
(% RSD inter) en los tres niveles de concentración más bajos de la parte inferior de la
curva de calibración. Como se puede observar en la tabla 12, el PFBA, PFHxA y PFUnA
cumplen los requisitos de SNR ≥ 3 y que, % RSD ≤ 10% en el nivel de concentración de

56
5 ng/L. Mientras que los compuestos PFHpA y PFOA cumplieron las condiciones en el
nivel de 3 ng/L.

Límite de cuantificación
Para obtener el límite de cuantificación, se utilizó la concentración más baja de la curva
de calibración, a saber, 15 ng/L. De igual forma se verificó que su SNR fuera mayor o
igual a 10 acorde a los datos observados en las Tablas 11 y 12.

Exactitud
Se evaluó la exactitud del método calculando los porcentajes de recobro en una curva
de recobros en agua de grado HPLC y agua lacustre analizada en 10 puntos 15 hasta
250 ng/L por triplicado. Los niveles mínimos y máximos de recobro en cada matriz se
presentan en la Tabla 13. En general, los recobros mínimos se obtuvieron en los puntos
de menos concentración (15 ng/L y 30 ng/L)

Tabla 13. Intervalos de recobros por cada compuesto en cada matriz analizada.

% Recobros
Analitos HPLC Lacustre
min max min max
PFBA 63 83 66 84
PFHxA 78 109 73 110
PFHpA 88 106 86 108
PFOA 86 110 79 106
PFUnA 87 110 86 113

Acorde a Rodríguez Varela, et al. (2021), en su estudio posterior a la realización

experimental del presente trabajo, en el cual realizó una comparación en el paso de
secado al finalizar la extracción en fase sólida (flujo de nitrógeno de 5 mL/min contra 30
mL/min), determinó que el flujo alto, como el aquí utilizado, deriva en una alta pérdida de
PFCAs de cadena baja. Esto es evidente en los bajos recobros del PFBA y, en menor
medida, del PFHxA. La tabla que describe este comportamiento se encuentra en el

57
material suplementario de dicho estudio y también se presenta en este trabajo en la Tabla
Suplementaria 7.

Inicialmente no se realizaron estas pruebas en la presente tesis debido al supuesto de

que la influencia de este factor no era significativa. Posteriormente siguieron sin
realizarse por severas limitantes, tales como la dificultad controlando el flujo de nitrógeno
y la situación por la pandemia de SARS-CoV-2, que derivó en una incapacidad de utilizar
el equipo y en una escasez de nitrógeno.

Otra consecuencia de esta pérdida se puede apreciar en la baja pendiente de las curvas
de recobro del PFBA, vistas en la Tabla 14.

Aún con estos obstáculos, todos los valores de recobro se encuentran en el intervalo de
63 a 113 %, lo cual es aceptable para los niveles de concentración estudiados, acorde a
(CCAYAC, 2017)

Efecto Matriz
El efecto matriz se estudió a través de curvas de recobro y mediante la comparación
estadística de las pendientes a cada una de las curvas de recobro entre la matriz lacustre
y la curva de recobro del agua HPLC con la metodología descrita por Oxford Academic
(2015). Después de la comparación, se observó que para 4 de los 5 compuestos, a saber,
PFBA, PFHxA, PFHpA y PFUnA, las pendientes eran iguales, mientras que para el para
PFOA eran distintas. Esto hace ver que sí existe un efecto matriz para el PFOA que se
hace prominente en concentraciones particularmente bajas. La prueba y ecuaciones
utilizadas pueden ser encontradas en la Figura suplementaria 24. Esto nos informa que
no es posible utilizar las curvas hechas en agua HPLC para obtener la concentración de
PFOA en los lagos. Sin embargo, al utilizarse las curvas de calibración hechas con el
método de adición patrón en agua lacustre para este analito, se elimina el efecto matriz
y es posible realizar la cuantificación de PFOA en las matrices de trabajo.

Los parámetros de las curvas de recobros se presentan en la Tabla 14

58
Tabla 14. Pendiente, ordenada al origen y coeficiente de correlación de las curvas de
recobro para cada componente tanto en agua HPLC como lacustre.

Agua HPLC Agua lacustre

m b r m b r
PFBA 0.6636 1.0978 0.9997 0.6774 1.9642 0.9996
PFHxA 1.0000 7.00E-05 0.9997 1.0000 5.00E-05 0.9998
PFHpA 1.0000 0.0005 0.9996 1.0000 0.0002 0.9998
PFOA 1.0000 0.0002 0.9997 1.0000 4.00E-06 0.9997
PFUnA 1.0000 0.0004 0.9998 1.0000 0.0002 0.9996

59
Capítulo V: Resultados de la determinación de PFCAs en
muestras de agua lacustre
A continuación, en los apartados A-F de la figura 27 se presentan las concentraciones
de PFCAs determinadas en los seis conjuntos de muestras dentro del complejo lacustre
Lagunas de Montebello. De forma general se observó la presencia de 3 de los 5 PFCAs
estudiados en las muestras lacustres, los cuales corresponden a los ácidos carboxílicos
perfluorados de cadena corta PFBA, PFHxA y PFHpA, mientras que sus análogos de
mayor longitud no fueron identificados en ninguno de los sitios. Los valores numéricos
de estos resultados se presentan en la tabla suplementaria 4.

60
Figura 27: Gráficas de concentración (ng/L) de cada PFCA encontrados en cada lago, y en el fondo de los lagos Bosque Azul y
Montebello. La línea punteada morada representa el límite de cuantificación (15 ng/L). La línea punteada roja representa el
límite de detección (6 ng/L). Las barras de error están calculadas en base a dos veces el % RSD en la concentración de cada

61
analito. Estos valores se encuentran en la tabla suplementaria 5. A) Aguas superficiales del lago Bosque Azul. B) Aguas de fondo
del lago Bosque Azul. C) Aguas superficiales del lago Balamtetik. D) Aguas superficiales del lago Tziscao. E) aguas superficiales
del lago Montebello. F) Agua del fondo del lago Montebello. El color del lago en cada figura varía en función si se considera
prístino (azul) o afectado (verde). De igual forma se incluyeron como elementos gráficos algunos elementos contextuales de
cada lago.

V.1 Análisis del contenido de PFCAs en el complejo lacustre

En el lago Balamtetik se determinaron las concentraciones más elevadas de PFCAs,
seguido por Bosque Azul con concentraciones ligeramente más bajas. Esto se debe, a
que Balamtetik es el primer lago del complejo lacustre y por tanto recibe la descarga de
aguas residuales del Río Grande de Comitán, mientras que la determinación de PFCAs
en el lago Bosque Azul, quien es el último lago del complejo que recibe estas descargas
(Caballero et al., 2020) sugiere que existe una conexión entre ambos lagos; este
aumento en la concentración de compuestos perfluorados concuerda con estudios
previos conducidos en el complejo lacustre, en donde se adjudicó al Agua Residual el
incremento en la concentración de iones de Cl-, Na+ y K+. No obstante, la reducción en
la concentración de los PFCAs en el lago Bosque Azul (aguas abajo del sistema lacustre)
puede estar relacionada con una pérdida de los analitos por volatilización o retención de
los mismos en el sedimento, de igual forma, esto podría indicar una pérdida de PFCAs a
lo largo del flujo de agua, ya sea por volatilización o adsorción en el sedimento.

En cuanto a los lagos que no reciben aguas residuales de forma directa, se logró
identificar la presencia de PFBA en Tziscao y una elevada concentración de PFHxA en
la Laguna de Montebello. La presencia de estos compuestos puede ser explicada por
dos razones, la primera está ligada a la actividad humana en sus costas, ya que el lago
Tziscao está rodeado por al menos tres pequeños complejos turísticos, zonas de
restaurantes y habitacionales, mientras que en las costas del lago Montebello la actividad
humana está limitada a unos cuantos locales de alimentos y de renta de lanchas no
motorizadas. La segunda posibilidad está fuertemente ligada al transporte atmosférico
tanto de los PFCAs de cadena corta (PFBA y PFHxA) (National Center for Biotechnology
Information, 2022; Royal Society of chemistry, 2020; De Voogt & Sáez, 2006) como de
sustancias precursores (tales como Alcoholes fluorotelomerizados (FTOHs), ácidos
carboxílicos fluorotelomerizados insaturados (FTUCAs), entre otros, que encuentran

62
como estructura final de procesos de biodegradación a los PFCAs (Lin et al., 2020;
Macinnis et al., 2022).

V.2 Análisis de la concentración de los compuestos estudiados por

profundidad del muestreo
Los únicos lagos donde se evaluó la presencia de los compuestos tanto en el fondo como
en la superficie fueron Montebello y Bosque Azul. Los resultados muestran que en la
parte más profunda del lago Montebello no se determinó la presencia de ningún
compuesto. En contraste, en el agua del fondo del lago Bosque Azul se detectó la
presencia de PFHxA y PFBA en concentraciones entre los 5 y 15 ng/L. En ambos lagos,
este contenido de PFCAs en el agua del fondo es menor a la concentración determinada
en su superficie. Este comportamiento puede estar ligado al carácter hidrofóbico de los
PFCAs, el cual sugiere que estos compuestos tenderían a desplazarse hacia el agua
superficial; lo cual es lo esperado de los compuestos tensoactivos (Buck et al., 2011a).

V.3 Análisis por compuesto

Es notable la ausencia de PFOA y PFUnA de la totalidad de los lagos. Esto podría
deberse a que la producción de materiales basados en estos compuestos está regulada
y/o prohibida en distintas regiones del mundo desde los años 2010- 2015 por lo que su
arribo al medio ambiente, especialmente al medio acuoso se ha reducido gradualmente
(Z. Wang et al. 2014).

Entretanto, el compuesto PFHxA se determinó en todos los lagos y en concentraciones

de un orden de magnitud superior a los demás PFCAs. De manera análoga, el PFBA fue
otro compuesto encontrado en todas las muestras, aunque en concentraciones
sustancialmente menores a su contraparte de seis carbonos. Esta tendencia incremental
de los compuestos de cadena corta es consistente con el constante incremento de la
síntesis de materiales con PFCAs de cadena corta dentro del desarrollo industrial,
tendencia que comenzó desde los años 80’s pero que se potenció en la década de los
años 2000, en la cual se promovió la manufactura de productos perfluorados de cadena

63
corta como sustitución de sus homólogos de mayor longitud. (Z. Wang et al., 2014b,
2014d)

Por último, el PFHpA se alcanzó a detectar en el complejo lacustre, pero en menor

medida que el PFBA y el PFHxA. La identificación del PFHpA puede vincularse a la falta
de regulación y amplio uso industrial de este compuesto (Rodríguez-Varela et al, 2022).

64
Conclusiones
Se desarrolló y verificó la validación de una metodología analítica SPE-HPLC-
MS/MS/QqQ para la determinación de PFCAs en agua lacustre en concentraciones de
ng/L.

Se encontraron ácidos carboxílicos perfluorados de cadena corta y mediana en las aguas

tanto superficiales como de fondo de todos los lagos analizados del complejo Lagunas
de Montebello en concentraciones del orden de las decenas de ng/L. Sin embargo, la
mayor concentración de PFCAs se observó en los lagos que reciben directamente aguas
residuales. Mientras que la presencia de PFCAs de cadena corta en los lagos que no
reciben descarga de drenaje de forma directa sugiere que estos podrían arribar mediante
un mecanismo de transporte atmosférico o la presencia de una fuente puntual.

Perspectivas

Entre los posibles pasos a seguir para ampliar y monitorear estos compuestos en
distintas matrices ambientales se proponen los siguientes:

• Realizar un estudio de los demás lagos del complejo lacustre, tanto prístinos como
afectados.
• Utilizar la metodología descrita para analizar otros complejos lacustres.
• Adecuar el método para otras matrices, tales como agua de mar y sedimentos
marinos.
• Validar el método para más compuestos de la misma familia de los PFCAs.
• Desarrollar métodos para analizar compuestos de familias similares, tales como
los PFSAs y fluorotelómeros.
• Realizar un monitoreo constante a lo largo de todo el año, para tomar en
consideración otros efectos, tales como la temporada de secas y de lluvias, al
igual que temporadas altas y bajas de turismo.

65
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78
Apéndice

Figura suplementaria 1. Optimización de parámetros espectrométricos independientes

de la fase móvil en PFBA.

Figura suplementaria 2. Optimización de parámetros espectrométricos independientes

de la fase móvil en PFHxA en agua de grado HPLC.

79
Figura suplementaria 3. Optimización de parámetros espectrométricos independientes
de la fase móvil en PFHxA en agua de grado lacustre.

Figura suplementaria 4. Optimización de parámetros espectrométricos independientes

de la fase móvil en PFHpA en agua de grado HPLC.

80
Figura suplementaria 5. Optimización de parámetros espectrométricos independientes
de la fase móvil en PFHpA en agua lacustre.

Figura suplementaria 6. Optimización de parámetros espectrométricos independientes

de la fase móvil en PFOA en agua de grado HPLC.

81
Figura suplementaria 7. Optimización de parámetros espectrométricos independientes
de la fase móvil en PFOA en agua lacustre.

Figura suplementaria 8. Optimización de parámetros espectrométricos independientes

de la fase móvil en PFUnA en agua de grado HPLC.

82
Figura suplementaria 9. Optimización de parámetros espectrométricos independientes
de la fase móvil en PFUnA en agua lacustre.

Figura suplementaria 10. Optimización de parámetros espectrométricos dependientes

de la fase móvil para optimizar el ion producto de PFBA en agua de grado HPLC.

83
Figura suplementaria 11. Optimización de parámetros espectrométricos dependientes
de la fase móvil para optimizar el ion producto de PFHxA en agua de grado HPLC.

Figura suplementaria 12. Optimización de parámetros espectrométricos dependientes

de la fase móvil para optimizar el ion de confirmación de PFHxA en agua de grado
HPLC.

84
Figura suplementaria 13. Optimización de parámetros espectrométricos dependientes
de la fase móvil para optimizar el ion producto de PFHpA en agua de grado HPLC.

Figura suplementaria 14. Optimización de parámetros espectrométricos dependientes

de la fase móvil para optimizar el ion de confirmación de PFHpA en agua de grado
HPLC.

85
Figura suplementaria 15. Optimización de parámetros espectrométricos dependientes
de la fase móvil para optimizar el ion producto de PFOA en agua de grado HPLC.

Figura suplementaria 16. Optimización de parámetros espectrométricos dependientes

de la fase móvil para optimizar el ion de confirmación de PFOA en agua de grado
HPLC.

86
Figura suplementaria [Link]ón de parámetros espectrométricos dependientes
de la fase móvil para optimizar el ion producto de PFUnA en agua de grado HPLC.

Figura suplementaria 18. Optimización de parámetros espectrométricos dependientes

de la fase móvil para optimizar el ion de confirmación de PFUnA en agua de grado
HPLC.

87
Tabla suplementaria 1: Detalles de parámetros dependientes de la fase móvil del
espectrómetro de masas óptimos, al igual que el valor elegido como conclusión, para
abarcar la mayor área o respuesta analítica en todos los compuestos.
Compuesto Transición Temperatur Voltaje Volumen Flujo de Presión del
a de gas del de gas nebulizado
(°C) capilar inyecció (mL/min r (psi)
(V) n (μL) )
PFBA 212.9→168. 200 1000 10 11 20
9
PFHxA 313.0→269. 200 1000 10 11 20
0 200 1000 10 11 15
313.0→119.
0
PFHpA 362.9→319. 300 1000 10 11 20
0 300 1000 10 11 15
362.9→169.
0
PFOA 412.9→369. 300 1000 10 11 20
0 300 1000 10 11 15
412.9→169.
0
PFUnA 562.9→519. 350 1000 10 11 20
0 350 1000 10 11 20
562.9→169.
0
Conclusión -- 300°C 1000 10 μL 11 20 psi
: V mL/min

88
Figura suplementaria 19: Curvas de calibración y recobros de PFBA en agua de grado
HPLC y lacustre.

Figura suplementaria 20: Curvas de calibración y recobros de PFHxA en agua de grado

HPLC y lacustre.

89
Figura suplementaria 21: Curvas de calibración y recobros de PFHpA en agua de grado
HPLC y lacustre.

Figura suplementaria 22: Curvas de calibración y recobros de PFOA en agua de grado

HPLC y lacustre.

90
Figura suplementaria 23: Curvas de calibración y recobros de PFUnA en agua de grado
HPLC y lacustre.

Figura suplementaria 24: Gráficos de distribución de residuales de las curvas de

calibración de los PFCAs en agua de grado HPLC y lacustre.

91
En la siguiente tabla suplementaria, se realizaron pruebas de t-Student para comprobar
estadísticamente si las pendientes en agua lacustre y en agua de grado HPLC eran
iguales en cada PFCA. Las fórmulas utilizadas son:

HO: Las pendientes son iguales, es decir: m1-m2=0

HA: Las pendientes son diferentes, es decir: m1-m2 ≠0

Por lo que se trata de una prueba de t-Student de 2 colas.

La pendiente fue obtenida mediante la regresión lineal

n es el número de datos de cada curva (30)

SER (el error estándar de la regresión) es calculado mediante la siguiente fórmula:

∑(𝑦̂ − 𝑦)
𝑆𝐸𝑅 = √
𝑛−2

Donde ŷ se refiere a la concentración obtenida teóricamente de la curva de calibración

mientras que “y” se refiere al valor experimental obtenido. A la resta ŷ-y se le conoce
como residual

SEP (el error estándar de la pendiente) es calculado con la siguiente fórmula:

𝑆𝐸𝑅
𝑆𝐸𝑃 =
√𝜎 2 ∙ (𝑛 − 1)

Donde σ2 se refiere a la varianza de las concentraciones utilizadas en la curva, es decir,

el eje x

Para obtener SED (el error estándar de la diferencia entre las dos curvas), se utiliza la
siguiente fórmula:

𝑆𝐸𝐷 = √𝑆𝐸𝑃12 + 𝑆𝐸𝑃22

El parámetro estadístico t utilizado es calculado dividiendo la diferencia entre

pendientes entre el SED. En una tabla de dos colas de t-Student se obtiene un valor p

92
que debe superar a un valor arbitrario α para poder aceptar la hipótesis nula. En caso
contrario, se acepta la hipótesis alterna.

Tabla suplementaria 2: Parámetros obtenidos de la estudentización de los residuales

de las curvas de calibración.
Residuales
Agua HPLC Agua lagunar
m b r m b r
PFBA -2.00E-06 -3.00E-06 1.41E-04 -2.00E-04 2.00E-15 1.73E-02
PHHxA -2.00E-06 3.00E-05 1.73E-04 1.00E-06 3.00E-05 1.00E-04
PFHpA -9.00E-06 8.00E-05 7.07E-04 9.00E-06 8.00E-05 7.07E-04
PFOA -5.00E-07 6.00E-05 4.47E-05 -2.00E-04 -2.00E-06 1.41E-02
PFUnA 2.00E-06 -2.00E-04 1.73E-04 1.00E-07 9.63E-01 1.00E-04

Tabla suplementaria 3: Pruebas de t de Student para comprobar la igualdad de

pendientes de cada PFCA en agua de grado HPLC y en agua lacustre. Los datos
utilizados son los de las curvas de calibración. α=0.05 (95 % de intervalo de confianza).

Prueba t-student para confirmar igualdad PFBA PFHxA PFHpA PFOA PFUnA
de pendientes
Cálculos HPLC Lagunar HPLC Lagunar HPLC Lagunar HPLC Lagunar HPLC Lagunar
pendiente 416.30 416.53 588.48 589.87 1029.49 1038.62 746.91 1151.45 747.26 748.57
n 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30
SER (error estándar de la regresión) 1558.07 1045.63 1573.21 1220.83 2959.08 2503.09 2213.91 2375.76 1390.81 1851.99
SEP (error estándar de la pendiente) 3.80 2.55 3.84 2.98 7.22 6.11 5.40 5.80 3.39 4.52
diferencia entre pendientes 0.23 1.38 9.13 404.54 1.31
SED (error estándar de la diferencia 4.58 4.86 9.46 7.93 5.65
t-stat 0.05 0.28 0.97 51.04 0.23
df (grados de libertad) 56 56 56 56 56
p 0.96 0.78 0.34 1.1927E-48 0.82
α 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
p>α 1 1 1 0 1

Se acepta la hipótesis nula Se acepta la hipótesis nula Se acepta la hipótesis nula Se niega la hipótesis nula, Se acepta la hipótesis nula
Conclusión: de que las pendientes son de que las pendientes son de que las pendientes son por lo que las pendientes de que las pendientes son
iguales iguales iguales son diferentes iguales

Tabla suplementaria 4: Concentraciones observadas de los distintos PFCAs en las

distintas lagunas. Clave: MB Lago Montebello. IMBII: Agua del fondo en Montebello.
BA: Lago Bosque Azul. IBAI: Agua Del fondo del lago Bosque Azul. BT: Lago

93
Balamtetik. TZ: Lago Tziscao. <LDD: Debajo del límite de detección: (6ng/L); <LDC:
Debajo del límite de cuantificación (15ng/L).

Concentración (ng/L)
Clave de la muestra
PFBA PFHxA PFHpA PFOA PFUnA
Balamtetik 1 28.3 152.9 28.7 <LDD <LDD
Balamtetik 2 38.3 155.7 24.2 <LDD <LDD
Balamtetik 3 26.4 154.3 22.3 <LDD <LDD
Bosque Azul 1 25.5 146.3 17.7 <LDD <LDD
Bosque Azul 2 24.8 133.9 16.7 <LDD <LDD
Bosque Azul 3 29.5 144.2 19.2 <LDD <LDD
Bosque Azul Fondo 20.3 125.7 <LDC <LDD <LDD
Tziscao 1 18.2 <LDC <LDC <LDD <LDD
Tziscao 2 16.6 15.1 <LDC <LDD <LDD
Tziscao 3 17.1 <LDC <LDC <LDD <LDD
Montebello 1 <LDD 125.4 <LDC <LDD <LDD
Montebello 2 <LDD 123.3 <LDC <LDD <LDD
Montebello 3 <LDD 124.6 <LDC <LDD <LDD
Montebello Fondo <LDD <LDC <LDD <LDD <LDD
Leyenda:
Lagos afectados Agua de fondo de lago afectado
Lago prístino Agua de fondo de lago prístino }

Tabla suplementaria 5: % RSD calculado para las concentraciones obtenidas en los

resultados. Los resultados en rojo representan un valor por debajo del límite de

94
cuantificación (15 ng/L) pero por encima del límite de detección (6 ng/L). El valor de
10.5 ng/L fue usado para obtener las barras de error.
PFBA PFHxA PFHpA PFOA PFUnA
Concentración Concentración Concentración Concentración Concentración
Lago
Promedio % RSD Promedio % RSD Promedio % RSD Promedio % RSD Promedio % RSD
(ng/L) (ng/L) (ng/L) (ng/L) (ng/L)
Balamtetik 31.00 12.83 154.30 0.60 25.07 7.00 0 0 0 0
Bosque Azul 26.60 13.20 141.47 0.83 17.87 7.27 0 0 0 0
Bosque Azul Fondo 20.30 13.73 125.70 1.11 10.50 7.55 0 0 0 0
Tziscao 17.30 13.98 15.10 3.09 10.50 7.55 0 0 0 0
Montebello 0.00 0.00 124.33 1.13 10.50 7.55 0 0 0 0
Montebello Fondo 0.00 0.00 10.50 3.17 0.00 0.00 0 0 0 0

Tabla suplementaria 6: Desglose por regiones y países de los estudios previos de

análisis de PFCAs en matrices ambientales
Norteamérica Europa Este y Sureste Asiático África subsahariana Oceanía Territorio Internacional Latinoamérica Sur Asiático Medio Oriente y Norte de África
EEUU 94 Alemania 33 China 56 Uganda 6 Australia 13 - 15 Brasil 4 India 5 Israel 3
Canadá 15 España 17 Japón 21 Sudáfrica 5 Fiyi 1 México 4 Bangladesh 1 Egipto 1
Canadá/EEUU 2 Suiza 8 Corea del Sur 15 Etiopía 2 Islas Salomón 1 Argentina 1 Marruecos 1
Jamaica 1 Suecia 7 Hong Kong 3 Ghana 2 Kiribati 1 Ecuador 1 Túnez 1
Dinamarca 5 Corea del Norte 1 Burkina Faso 1 Palau 1
Italia 5 Filipinas 1 Costa de Marfil 1 Samoa 1
Noruega 5 Malasia 1 Kenia 1 Tuvalu 1
Rusia 5 Mongolia 1 Senegal 1 Vanuatu 1
Francia 3 Tanzania 1
Grecia 3 Zambia 1
Finlandia 2
Irlanda 2
Austria 1
Chequia 1
Malta 1
Países Bajos 1
Países Nórdicos 1
Reino Unido 1
Serbia 1
Total de la región 112 102 99 21 20 15 10 6 6

Tabla suplementaria 7: Tabla reportada por Rodríguez-Varela et al. (2021) del efecto
del flujo de nitrógeno para evaporar en la extracción en fase sólida. La matriz utilizada
fue agua residual proveniente de la Ciudad de México. Es notable la gran pérdida de
PFBA, aunque no es una sorpresa, ya que es el componente más volátil de los
analizados.

Nivel de Evaporación suave (5 mL/min) Evaporación fuerte (30mL/min)

Valor medido
concentración
PFBA PFHxA PFHpA PFOA PFUnA PFBA PFHxA PFHpA PFOA PFUnA
PFBA PFHxA PFHpA PFOA PFUnA PFBA PFHxA PFHpA PFOA PFUnA
39810 51109 103215 98325 80304 30212 44362 102015 108563 78542
Área del pico 38910 50077 95632 113221 84521 33512 42251 98632 99352 81102
(u.a.) 38123 48693 97521 109882 82213 31885 43321 88201 104330 79332
41004.0 45202.0 94021.0 99505 81302 32760 46021 97885 114521 83001
38642.0 47412.0 90014.0 112503 79885 31312 45743 87663 100738 86203
96.8 104.7 94.6 89.4 97.7 75.9 93.3 93.5 98.3 95.4
94.8 103.0 87.3 102.3 103.4 83.1 89.7 90.2 90.3 98.8
100 ng/L Concentración
93.1 100.6 89.1 99.4 100.3 79.6 91.5 80.1 94.6 96.4
(ng/L)
99.4 94.7 85.7 90.4 99.1 81.5 96.1 89.5 103.5 101.3
94.3 98.5 81.8 101.7 97.2 78.3 95.6 79.5 91.5 105.6
3.2 -4.7 5.4 10.6 2.3 24.1 6.7 6.5 1.7 4.6
5.2 -3.0 12.7 -2.3 -3.4 16.9 10.3 9.8 9.7 1.2
Pérdida (%) 6.9 -0.6 10.9 0.6 -0.3 20.4 8.5 19.9 5.4 3.6
0.6 5.3 14.3 9.6 0.9 18.5 3.9 10.5 -3.5 -1.3
5.7 1.5 18.2 -1.7 2.8 21.7 4.4 20.5 8.5 -5.6

95