TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE ZACATEPEC

DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA Y BIOQUÍMICA

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TEMA 1: CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

ASIGNATURA: BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

PRACTICA 1: “PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO PARA

MICROPROPAGACIÓN”

INGENIERÍA BIOQUÍMICA

INTEGRANTES:
MENDOZA SOTELO OLGA AZUCENA (21090010)
ALARCÓN CARRANZA KRISTIAN NAMIR (19090509)
MARTÍNEZ HERNÁNDEZ ANGELES ABIGAIL (20090016)
ROSAS QUIROZ DANNA PAOLA (20090563)
GALVEZ RIOS YOSELIN (20090502)
LEDEZMA VELAZQUEZ FERMIN ARMANDO (20090521)

DOCENTE: FLORES MORENO ABEL

PERIODO: ENERO-JUNIO 2025

LUGAR Y FECHA DE ENTREGA:
25 DE MARZO DEL 2025, ZACATEPEC DE HIDALGO.
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INTRODUCCIÓN

La micropropagación es una técnica biotecnológica que permite la reproducción

masiva de plantas a través del uso de tejidos vegetales en condiciones controladas,
como en un laboratorio. Este proceso se realiza utilizando medios de cultivo
especializados que proporcionan los nutrientes necesarios para el crecimiento y
desarrollo de las células vegetales. La preparación adecuada de estos medios es
esencial para garantizar la eficiencia de la micropropagación y el éxito en la
regeneración de plantas.

En este informe se abordará el proceso de preparación de medios de cultivo para

micropropagación, describiendo los componentes principales de estos medios, su
preparación y las condiciones necesarias para su correcta utilización en la
propagación in vitro de plantas.

El cultivo de tejidos vegetales es una técnica en la cual órganos o pequeñas

secciones de tejido, son obtenidos de una planta donadora y cultivados
asépticamente en un medio nutritivo. Por manipulación de la composición química
del medio y de otros parámetros ambientales, el crecimiento y el desarrollo de los
tejidos puede ser dirigido en diferentes formas:

a) Biosintéticos, mediante los cuales es posible la síntesis y/o trasformación de

metabolitos secundarios.
b) Morfogenéticos, por lo que es posible inducir procesos de desdiferenciación
y diferenciación celular; lo cual es aprovechado para obtener células
individuales aisladas o más comúnmente, crecimientos amorfos de células
en activa división celular (callos) y llegar a inducir su desarrollo hasta plantas
completas (regeneración).

Con base en la teoría celular, la totipotencialidad de las células hace posible que,
teóricamente, cualquier célula pueda regenerar un nuevo individuo, ya que en la
práctica, los tejidos inmaduros, meristemos y embriones han resultado con mayor
poder regenerativo que otros.

En la respuesta de los tejidos, están implicados varios factores: genético, fisiológico

y bioquímico; requerimientos nutritivos como sales orgánicas (macro y
micronutrientes), vitaminas, aminoácidos y de manera muchas veces fundamental,
los reguladores del crecimiento como son auxinas, citocininas y menos comúnmente
giberelinas.
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En términos generales, la técnica del cultivo de tejidos vegetales es relativamente

sencilla. Se fundamenta en incubar pequeños trozos de semillas o tejido, en un
medio de cultivo estéril conteniendo los nutrimentos, vitaminas y hormonas
necesarios para estimular y soportar su crecimiento; pudiendo obtenerse callos,
raíces, tallos, hojas y flores o plantas completas

MARCO TEÓRICO

La micropropagación es una técnica de cultivo de tejidos que se utiliza para la

multiplicación masiva de plantas en condiciones controladas, como en laboratorios
o invernaderos. Esta técnica permite obtener grandes cantidades de plantas
genéticamente idénticas (clones) a partir de un solo explante (por ejemplo, una hoja,
un brote o una parte de una raíz). La micropropagación es crucial tanto para la
industria agrícola como para la conservación de especies, ya que permite obtener
plantas libres de enfermedades y con características genéticas uniformes.
El proceso de micropropagación se basa en los principios fundamentales de la
totipotencia celular, que es la capacidad que tienen las células vegetales para
regenerarse y formar un organismo completo. Los explantes utilizados para la
micropropagación tienen la capacidad de dividirse y diferenciarse en distintos tipos
de células para formar raíces, brotes, hojas y otras estructuras vegetales, dado que
se les proporcionan las condiciones y hormonas adecuadas.
El proceso de micropropagación consta de varias etapas:
1. Desinfección y esterilización de los explantes.
2. Inducción de brotes (multiplicación).
3. Desarrollo de raíces (enraizamiento).
4. Acrecentamiento o aclimatación de las plántulas.

Los medios de cultivo juegan un papel fundamental en la micropropagación, ya que

proporcionan los nutrientes, hormonas, vitaminas y minerales esenciales para el
crecimiento y desarrollo de las plantas. Los medios de cultivo están diseñados para
simular, en la medida de lo posible, las condiciones naturales en las que las plantas
crecen. Los componentes principales de un medio de cultivo son:
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1. Macronutrientes: Los macronutrientes incluyen elementos como el nitrógeno

(N), fósforo (P), potasio (K), calcio (Ca), magnesio (Mg) y azufre (S). Estos
nutrientes son esenciales para el crecimiento general de las células y para la
síntesis de compuestos orgánicos como proteínas y ácidos nucleicos.

2. Micronutrientes: Los micronutrientes son elementos en menores cantidades,

pero igualmente importantes para el funcionamiento celular. Entre los más
comunes se encuentran el hierro (Fe), manganeso (Mn), zinc (Zn), boro (B),
cobre (Cu) y molibdeno (Mo). Estos micronutrientes están involucrados en
procesos como la fotosíntesis, la síntesis de proteínas y la respiración celular.

3. Vitaminas: Las vitaminas son compuestos orgánicos que actúan como

coenzimas en los procesos metabólicos de las plantas. Entre las vitaminas
utilizadas más comúnmente se encuentran la tiamina (B1), piridoxina (B6) y
nicotinamida (B3). Son especialmente útiles en la regeneración de tejidos
vegetales in vitro.

4. Hormonas vegetales: Las hormonas son reguladores esenciales del

crecimiento y la diferenciación celular. En micropropagación, las hormonas
más importantes son:

o Auxinas: Como el ácido indolacético (AIA) o ácido naftalenoacético

(ANA), que promueven el enraizamiento y la elongación celular.

o Citoquininas: Como la 6-benciloaminopurina (BAP) y la kinetina, que

estimulan la división celular y la formación de brotes.
o Giberelinas: Que influyen en la elongación de las células y en la
germinación de semillas.

5. Carbohidratos: La fuente principal de energía para las células vegetales en

los medios de cultivo es la sacarosa, un azúcar que es metabolizado por las
células para producir energía. Sin la adición de azúcar, las células vegetales
no serían capaces de crecer correctamente.

6. Agar: El agar es un gelificante utilizado en la preparación de medios sólidos.

Se utiliza para proporcionar una base sólida que permita que los explantes
crezcan en condiciones estáticas, evitando la descomposición del medio y
facilitando la manipulación de los explantes.
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OBJETIVOS
Preparar medios de cultivo para el cultivo in vitro de tejidos vegetales.

 Preparar medios de cultivo para micropropagación de acuerdo con las

necesidades específicas de la planta a propagarse.
 Fomentar la correcta esterilización de los materiales utilizados en la
preparación de los medios para evitar contaminaciones.
 Analizar el impacto de las concentraciones de hormonas en la inducción de
raíces y brotes en plantas cultivadas in vitro.
 Reconocer e identificar los principios de regulación hormonal, así como los
macro y micronutrientes necesarios para el buen desarrollo de los tejidos.

MATERIALES

2 matraces Erlenmeyer de 500 ml

2 probeta de 250 ml
2 vasos de precipitado de 500 ml
1 bisturí
1 piceta
1 agitador de vidrio o magnético
4 cajas de Petri
10 frascos tipo “Gerber” con tapa de polietileno esteriles
2 espátulas
1 matraz aforado de 1L
Algodón
Pañalina o gasa
Papel de estraza
Papel aluminio
Masking
Plumón
2 mecheros bunsen
Pinzas de diseccion
1 tripie
1 lamina de asbesto
2 pipetas de 10 ml con perilla
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Semillas y hojas o explantes de plantas que sean difíciles de propagar en la

naturaleza

EQUIPOS

 Campana de flujo laminar

 Autoclave
 Potenciómetro
 Balanza analítica

REACTIVOS

 Etanol al 70%
 HCl al 30%
 NaOH al 1N
 H2SO4 al 3M
 KNO3
 NH4NO3
 MgSO4H2O
 KH2PO4

Para la realización del medio de cultivo MS se elaboran las siguientes soluciones

Madre:

 Soluciones stock de nutrientes:

 Stock de macronutrientes
 Stock de Calcio,
 Stock de micronutrientes
 Stock de hierro y EDTA
 Soluciones Stock de vitaminas
 Soluciones Stock de Reguladores
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PROCEDIMIENTO

Todas las soluciones se preparan sobre un 70% de agua del volumen final deseado,
y sobre ella se van añadiendo uno por uno todos los componentes hasta su
completa disolución. Posteriormente se ajusta el volumen final con agua y se
almacenan.

Stock de Macronutrientes MS (x 10) g/L

 19 gramos de KNO3
 16.5 gramos de NH4NO3
 3.7 gramos de MgSO4.7H2O
 1.7 gramos de KH2PO4.

Usar 100 ml de la solución stock de macronutrientes para preparar 1 L de medio

de cultivo MS.

Stock de Calcio (x 10)

 4.4 gramos de CaCl2.2H2O

Usar 100 ml de la solución stock de Ca para preparar 1 L de medio de cultivo MS.

Stock de Micronutrientes (x 1000) mg/100mL

 620 miligramos de H3BO3

 2230 miligramos de MnSO4.4H2O
 860 miligramos de ZnSO4.7H2O
 83 miligramos de KI
 25 miligramos de Na2MoO4.2H2O
 2.5 miliogramos de CuSO4.5H2O
 2.5 miligramos de CoCl2.6H2O

Usar 10 ml de la solución stock de micronutrientes para preparar 1 L de medio de

cultivo MS.
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Stock de Fe-EDTA( x100)

El hierro se puede añadir quelado como producto comercial (por ejemplo,

Secuestrene) o preparando el siguiente stock:

 Disolver 3,72 g de EDTA disódico en 900 mL de agua destilada. Se

obtendrá́ una solución clara a los 15 min a temperatura ambiente (25 -
27oC).
 Añadir 2,78 g de sulfato ferroso heptahidratado. Se obtendrá́
inmediatamente una solución de color amarillo claro.
 Aforar a 1 L y almacenar la solución de hierro quelado en una botella ámbar
para protegerla de la exposición a la luz.

Usar 10 ml de la solución stock de hierro quelado para preparar 1 L de medio

de cultivo MS.

Stock de Vitaminas (x 100) mg/100 ml

 1000 miligramos de Mioinositol

 1 miligramo de Tiamina HCl
 5 miligramos de Ácido nicotínico
 5 miligramos de Piridoxina HCl
 20 miligramos de Glicina.

Usar 10 ml de la solución stock de vitaminas para preparar 1 L de medio de cultivo

MS.

Stock de reguladores de crecimiento.

El stock de reguladores de crecimiento se puede hacer a una concentración de 1

mg/ml.

 Soluciones de IAA de 1mg/ml

 Solución de GA3 de 1 mg/l
 Solución de Kn de 1 mg/ml
 Solución de BAP de 1mg/l
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Las auxinas de pueden disolver primeramente en una pequeña cantidad de etanol

al 95%, KOH o NaOH 1 M. Una vez disueltas, se añade agua destilada suavemente,
procurando que las auxinas no precipiten, hasta alcanzar el volumen deseado.

De la misma forma. el ácido abscisico se puede disolver previamente en NaOH 1 N

y las giberelinas en el etanol al 95%.

Las citoquininas se disuelven previamente en una pequeña cantidad de HCl 0,5 N.

Se puede calentar suavemente para favorecer la disolución y posteriormente se
enrasa al volumen deseado.

PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO DE MURASHIGE Y SKOOG

La elaboración de los medios de cultivo se realiza diluyendo las soluciones madre

previamente realizadas. Además, se añade la fuente de carbono y el agente
gelificante, que normalmente es agar. Se pueden hacer distintos medios de cultivo
manteniendo la misma concentración de algunas sustancias, por ejemplo, sales
minerales y vitaminas, y modificando o eliminando otras como los reguladores de
crecimiento.

Tomando como base las sales minerales, vitaminas y fuente de carbono de

Murashige y Skoog se pueden realizar múltiples medios de cultivo variando los
reguladores de crecimiento o su concentración. Por ejemplo, se pueden realizar los
siguientes medios de cultivo:

 MS-0: medio MS sin reguladores

 MS-K: MS con 0.3 mg/L de ácido indol-acético y 1 mg/L de kinetina
 MS-R: MS con 1mg/L de AIB

Para preparar 1L de estos medios se realiza el siguiente proceso:

Colocar en un agitador magnética una jarra de 1 L de capacidad con unos 400 ml

de agua destilada y añadir los elementos minerales y las vitaminas:

 100 ml del stock de macronutrientes.

 100 ml del stock de Ca.
 1 ml del stock de micronutrientes.
 10 ml de la solución hierro EDTA (ó 0.2g/L de secuestrene)
 10 ml del stock de vitaminas.
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 Adicionar la cantidad estimada de las soluciones de fitohormonas.

 30 g sacarosa y esperar a que se disuelva.
 Añadir agua destilada hasta un volumen de 1L.
 Colocar la mezcla en una jarra y ajustar, en un pH metro, el pH del medio
(con KOH, NaOH ó HCl) hasta 5.8.
 Añadir 7,5 g de agar y disolverlo en el autoclave o en microondas.
 Agitar el medio, dosificarlo en los recipientes de cultivo y colocar las tapas.
 Esterilizar el medio en el autoclave durante 20 min a 120oC y 1 Kg/cm2 de
presión.
 Dejar enfriar el medio antes de su utilización.

Si algún componente fuera termolábil habría que esterilizarlo por filtración con una
jeringuilla y un filtro de un tamaño de poro menor de 0.22 μm. Este proceso habría
que realizarlo en una cámara de flujo laminar y emplear material estéril.

Procedimiento de siembra para hojas y semillas.

 Lavar adecuadamente las hojas y la semilla con agua y jabón líquido.

 Cortaron las hojas en trozos pequeños (1x2) para su posterior tratamiento.
 Dejaron remojar en cloro al 30% por 10 min.
 Pasar a agua destilada estéril por 10 min y con un poco de agitación.
 Lavar en alcohol al 70% por 10 min.
 Lavar nuevamente en agua destilada estéril para su posterior siembra.
 Tomar uno o dos trozos de hoja para sembrar en los medios y de dos a tres
semillas de igual manera.
 Las muestras deberán crecer en un tiempo aproximado de dos a tres meses.

Esterilización de explantes:

 Etanol 70%, entre 5 y 10 segundos.

 Solución de hipoclorito de sodio (NaCIO) de 5 a 20%, entre 5 y 30 min.
 Enjuagues con abundante H2O estéril (4 ó 5 veces).
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RESULTADOS

Los datos obtenidos a lo largo de dos semanas en estos experimentos fueron de

gran relevancia, ya que permitieron concluir que el medio Murashige y Skoog es
adecuado para el crecimiento in vitro de explantes. La correcta preparación del
medio, junto con la aplicación rigurosa de protocolos para mantener las áreas de
trabajo estériles, fue esencial para el desarrollo exitoso de los explantes
seleccionados.

Sin embargo, al final del experimento, debido a la falta de una correcta aplicación
de las técnicas de asepsia y bioseguridad, se produjo contaminación cruzada, lo
que comprometió la viabilidad de los cultivos. Esta contaminación afectó a todos
los medios de cultivo, lo que llevó a la pérdida total de los explantes. Este
resultado subraya la importancia de reforzar las medidas de control y la
capacitación adecuada en las técnicas de manipulación para evitar la propagación
de contaminantes y garantizar el éxito de los cultivos in vitro en futuros ensayos.

Figura 1 y 2: Preparación y medición de las soluciones stock para medio MS.

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Figura 3 y 4: Preparación de solución de agar para medio solido MS

Figura 5 y 6: Selección de los explantes y corte de las partes vegetales que se van a micropropagar.
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Figura 7: Campana de flujo laminar donde se llevó a cabo el proceso de lavado y esterilización de
los explantes, para posteriormente sembrarlos en los frascos con medio MS.

Figura 8 y 9: En la primera imagen se aprecian los explantes ya sembrados en los frascos, presentan
una coloración adecuada y libres de contaminación.

En la segunda imagen se aprecian los medios contaminados debido a un mal manejo de los mismos
provocando una contaminación cruzada.
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DISCUCIÓNES

En la práctica de cultivos in vitro, una de las principales limitaciones es la alta tasa

de mortalidad de los explantes, comúnmente atribuida a la presencia de agentes
fúngicos y bacterianos que permanecen en los tejidos internos del material
vegetal. Aunque la esterilización superficial se lleva a cabo antes del aislamiento,
no siempre es completamente efectiva, ya que algunos microorganismos pueden
permanecer latentes y manifestarse cuando el tejido contaminado es escindido
durante el repicado y entra en contacto con el medio de cultivo. Esto genera
pérdidas significativas en la fase de establecimiento y puede comprometer la
eficiencia del proceso de micropropagación.

Inicialmente, la selección de explantes primarios permitió reducir la carga

microbiana y avanzar hacia la etapa de proliferación con cierto éxito. Sin embargo,
la aparición progresiva de contaminación cruzada llevó a la pérdida total de los
cultivos, lo que sugiere que la fuente del problema no solo estaba en los tejidos
internos, sino también en las condiciones del laboratorio, el material de trabajo o el
manejo de los explantes durante el proceso.

Estos resultados resaltan la necesidad de reforzar las medidas de bioseguridad en

cada fase del cultivo, incluyendo una esterilización más rigurosa de los insumos,
un monitoreo constante de los explantes y la implementación de condiciones
asépticas más estrictas para evitar la contaminación cruzada. Además, sería
fundamental evaluar la posible presencia de vectores de contaminación en el
ambiente de trabajo y ajustar los protocolos de manipulación para minimizar los
riesgos en futuras experiencias de micropropagación.

CONCLUSIONES

La preparación adecuada de los medios de cultivo es un aspecto fundamental en

la micropropagación in vitro de plantas, ya que proporciona un ambiente
controlado que favorece el crecimiento celular, la diferenciación de tejidos y la
regeneración de plantas completas. La correcta formulación de nutrientes y
fitohormonas, junto con una esterilización rigurosa, influye significativamente en la
inducción de brotes y raíces, asegurando la obtención de plántulas sanas y
viables. Además, este proceso permite la producción masiva de plantas en un
tiempo reducido, con uniformidad genética y libre de patógenos, lo que resulta
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esencial para la propagación de especies de alto valor agrícola, ornamental y

medicinal.

Asimismo, la micropropagación in vitro desempeña un papel clave en la

conservación de especies en peligro de extinción y en la recuperación de
variedades vegetales con interés ecológico y comercial. Su aplicación en la
industria agrícola permite mejorar la productividad y la calidad de los cultivos,
optimizando recursos y reduciendo la dependencia de métodos tradicionales de
propagación. En un contexto de creciente demanda de soluciones sostenibles
para la producción vegetal, el uso de técnicas in vitro representa una herramienta
innovadora con un impacto significativo en la biotecnología y la seguridad
alimentaria global.

BIBLIOGRAFÍAS

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_culture_medium_components