“Evaluación de la cinética de crecimiento y la fermentación alcohólica de
Saccharomyces cerevisiae en cultivo batch”
Ingeniería en Biorreactores [BQF-1012]
Ing. Cristian Alfredo Garcia Vidrio
[Acevedo Medellín, Zain Antonio, #19310499, l19310499@[Link], H]
[Castellón Ibarra, Anahí, #19310515, l19310515@[Link], H]
[Contreras Madrigal, Maricruz, #19310538, l19310538@[Link], H]
[Contreras Ruiz, Naomi Estefania, #19310473, l19310473@[Link], H]
[Lopez Aguilar, Aleydis Anaid,# 19310542, l19310542@[Link], H]
[Lucero Flores, Ramona Leonor, #19310427, l19310427@[Link], H]
Fecha: 04/10/2022
Resumen
La fermentación es un proceso metabólico de las levaduras y de varias bacterias que
transforman compuestos químicos orgánicos, principalmente azúcares, en otras sustancias
orgánicas más simples como el etanol. Cabe destacar que los hidratos de carbono son los
principales sustratos que se fermentan. Por lo general las fermentaciones ocurren en
condiciones ambientales. Mientras que, en las industrias, estos sustratos con
microorganismos específicos se depositan en biorreactores y fermentadores, para producir
diversos productos. Existen diversos tipos de fermentación según el microorganismo, el
sustrato y las condiciones. La fermentación alcohólica es el resultado del proceso respiratorio
anaerobio de las levaduras. A escala industrial se usa por excelencia la levadura
Saccharomyces cerevisiae, como microorganismo responsable de la fermentación en el
proceso de producción de alcohol. Para emprender esta práctica se comenzó la preparación
del inóculo, el cual se refrigero para su posterior aplicación. Para la preparación del caldo de
fermentación se empleó caldo nutritivo como base, se ajustaron las concentraciones de
sacarosa para poder llevar este a esterilizar al autoclave. Para el montaje del biorreactor
(previamente esterilizado) se requirió manipularlo en una zona estéril, este contaba con una
manguera conectada al equipo de aeración y otra de la cual se extrajeron las muestras. Una
vez ya montado se añadió el inóculo, enseguida se tomó la primera muestra. Posteriormente
se colocó el biorreactor en un agitador magnético a temperatura ambiente y se tomaron cinco
muestras más a la misma hora durante tres días. Una vez concluida la toma de muestras se
llevó a cabo la cuantificación de sustrato, producto y biomasa. La producción de biomasa y
etanol en un medio de cultivo YPD con concentración de dextrosa al 10% son bajas,
presentando rendimientos y velocidades de producción y consumo directamente
proporcionales a la baja concentración de sustrato inicial.
Palabras clave: Fermentación alcohólica, levaduras, Saccharomyces cerevisiae, biorreactor.
Introducción
La fermentación es un proceso metabólico de las levaduras y de varias bacterias que
transforman compuestos químicos orgánicos, principalmente azúcares, en otras sustancias
orgánicas más simples como el etanol. Los carbohidratos son los principales sustratos que se
fermentan, pero algunas bacterias pueden fermentar otros compuestos como ácidos orgánicos,
aminoácidos, purinas y pirimidinas. Los azúcares que se fermentan son la glucosa, la
fructosa, la maltosa, la sacarosa y la lactosa, los cuales se obtienen de la caña de azúcar,
melaza y suero de la leche. Las fermentaciones ocurren naturalmente en condiciones
ambientales en las frutas y vegetales. Por otro lado, en la industria, estos sustratos con
microorganismos específicos se depositan en biorreactores y fermentadores, para producir
diversos productos (Puerta, G.I., 2012).
Existen varios tipos de fermentación según el microorganismo, el sustrato y las condiciones.
La fermentación alcohólica principalmente por levaduras que producen etanol y CO2.
Cuando hay oxígeno las levaduras realizan la respiración, crecen, oxidan completamente la
glucosa y así obtienen el ATP, pero en condiciones anaerobiosis, estos microorganismos
fermentan azúcares, como la glucosa y algunas lactosas. La fermentación alcohólica es el
resultado del proceso respiratorio anaerobio de las levaduras. Las levaduras son organismos
quimiótrofos debido a que obtienen su energía por oxidación de los compuestos químicos,
además son organismos heterótrofos debido a que oxidan moléculas orgánicas de las cuales el
tipo más común son los azúcares. Las levaduras son las responsables de los procesos de
fermentación siendo la Saccharomyces cerevisiae la especie que se utiliza en la mayoría de
las fermentaciones de bebidas alcohólicas para producir etanol, dióxido de carbono y
volátiles. Durante las primeras horas de la fermentación, la población de levaduras no se
incrementa. En este periodo, llamado fase de latencia, es necesario para las células adaptarse
a las nuevas condiciones ambientales. Una vez que las levaduras se han adaptado a las
condiciones ambientales, comienzan a crecer. Esta etapa denominada fase exponencial, es
altamente influenciada por la temperatura, la concentración de nitrógeno con grupos amonio,
aminoácidos y otros nutrientes, además por la presencia de oxígeno. Después de esta etapa,
las levaduras detienen su crecimiento debido a que algunos nutrientes comienzan a ser
deficiente (Bamforth., 2007).
A escala industrial se usa por excelencia la levadura Saccharomyces cerevisiae, como
microorganismo responsable de la fermentación en el proceso de producción de alcohol. S.
cerevisiae fue uno de los primeros microorganismos utilizados para la producción de proteína
unicelular y compuestos biotecnológicos, con alrededor de 200,000 ton/año de biomasa
producida, siendo, probablemente, el microorganismo más utilizado en la industria de los
bioprocesos. Es capaz de metabolizar diferentes tipos de azúcares, entre ellos la glucosa. Se
tiene como objetivo evaluar establecer las ecuaciones para la cinética de crecimiento de
Saccharomyces cerevisiae en distintas condiciones.
Materiales y métodos
Para la elaboración del inóculo, se preparó como primer paso una cantidad de 20 mL de una
suspensión al 1.0 de McFarland en solución salina 0.85% estéril, la cual se refrigeró para su
posterior aplicación. Posteriormente, para la preparación reparación de fermentación y del
biorreactor, se preparó un caldo de fermentación utilizando caldo nutritivo como base, cada
equipo ajustó la concentración a 10 g/L, 30 g/L y 50 g/L de sacarosa, en el caso de nuestro
equipo nos correspondió la concentración de 10 g/L. Después de la preparación, el caldo se
esterilizó a 121ºC por 15 min a 15 lb de presión y se esperó a que la temperatura bajará para
el posterior resguardo de este.
Para el armado del cuerpo del biorreactor, se requirió de una zona totalmente esteril para
evitar la contaminación por hongos u otro tipo de partículas contaminantes, es por ello que el
montaje se llevó a cabo en medio de dos mecheros de Bunsen con manguera de conexión,
una botella de reacción con tapa y agitador previamente esterilizados en autoclave y
aditamento, un filtro para jeringa de 0.20 µmun, un sistema de aireación venoclisis, un
divisor de líneas y filtros para distribución de aire. Finalmente el biorreactor contaba con una
manguera conectada al equipo de aeración y otra mediante la cual se extrajeron las muestras
más tarde. Posteriormente, se adicionó el 10% (v/v) del cultivo iniciador ajustado (inóculo)
contenido en un matraz erlenmeyer de 250 mL con agitador en el fondo, para ello se empleó
un segundo agitador por la parte externa del fondo para que el del interior no cayera dentro
del biorreactor, al 80% de la capacidad total del reactor con el caldo de fermentación
contenido en un matraz erlenmeyer de 1 litro. Como último paso, la mezcla de caldo de
fermentación e inóculo fue vaciado en el biorreactor de 460 mL. Enseguida fue tomada la
primera muestra de 13 mL a las 9: 05 am del miércoles 21 de septiembre del 2022. A
continuación el sistema fue colocado en un agitador magnético a temperatura ambiente y se
tomaron 5 muestras de 13 mL en el siguiente orden: Muestra #2: 15:15 pm del miércoles 21
de septiembre del 2022, muestra #3: 7: 40 am del jueves 22 de septiembre del 2022, muestra
#4: 15: 14 pm del jueves 22 de septiembre del 2022, Muestra #5: 7: 22 am del viernes 23 de
septiembre del 2022 y finalmente la muestra #6: 15:10 pm del viernes 23 de septiembre del
2022. Una vez contando con 6 muestras, estas fueron homogeneizadas para enseguida llevar
a cabo la cuantificación de sustrato, producto y biomasa.
Para el procedimiento de la cuantificación de la biomasa como proteína celular se tomaron
100 µL de cada una de las muestras previamente homogeneizadas y fueron colocadas en los
correspondientes tubos eppendorf etiquetados del 1 al 6, a continuación se agregó 900 µL
NaOH 1N a cada uno de los tubos y se calentaron a 100ºC durante 10 minutos. Una vez que
se enfrió, se transfirió 200 µL de las soluciones digeridas a 6 tubos eppendorf marcados del 1
al 6 y se agregó 800 µL del reactivo de Bradford. Cuidando que las muestras no tuvieran
contacto con luz UV se dejaron reposar 5 minutos a temperatura ambiente y finalmente se
depositaron en celdas para llevar a cabo la lectura de muestras a 595 nm en el
espectrofotómetro, obteniendo las absorbancias indicadas en la tabla 1.
En la cuantificación de glucosa (sustrato) fueron tomados 100 µL de cada una de las 6
muestras homogeneizadas, estas fueron colocadas en 6 tubos eppendorf, posteriormente se
agregó 300 µL de reactivo de DNS a cada uno. Dichos tubos fueron llevados a 100 °C por 5
minutos y enseguida a enfriamiento a una temperatura aproximada de 8 °C. A continuación
se agregó 600 µL de agua destilada, para así depositar la solución en celdas para realizar la
lectura de absorbancia a 540 nm, obteniendo los resultados presentes en la tabla 1.
Para el procedimiento de la determinación de la producción de alcohol, se filtró el
sobrenadante con un filtro de 0.20 µm y se recuperó en un tubo limpio. Posteriormente, se
tomó 3.5 mL del filtrado y se transfirió a un tubo de cristal limpio para agregar 1.5 mL de la
solución de dicromato de potasio y ácido sulfúrico. Finalmente, se agitó e incubó a 60ºC por
30 minutos.
Para el caso 1 se agregó 1:4 mL de reactivo de Etanol, mientras que para el caso 2, se agregó
1:24 mL, esto con el fin de obtener resultados más aproximados; sin embargo, al momento de
ingresar las celdas al espectrofotómetro (Thermo scientific Genesys 150 UV-visible), no se
logró obtener dicha curva de Etanol.
Resultados
Donde:
𝑦 = 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎
𝑥 = 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛
Eficiencia del consumo de la dextrosa:
Considerando un rendimiento teórico de dextrosa del 95%, tenemos que:
𝑅𝑟 12.78
𝑅𝑃 = 𝑅𝑇
𝑥100 = 95
𝑥100 = 13. 45%
Coeficiente de rendimiento para biomasa:
∆𝑋 −0.7704+1.48
𝑌𝑋 = ∆𝑆
= 1.117−6.668
= 0. 1278 (𝑐𝑜𝑛𝑠𝑖𝑑𝑒𝑟𝑎𝑛𝑑𝑜 𝑢𝑛 𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜).
𝑆
𝑌 𝑃 másico:
𝑆
∆𝑃 0.12053−0.079765 −3
𝑌𝑃 = ∆𝑆
= 1.117−6.668
= 7. 344𝑥10
𝑆
Velocidad o tasa específica de crecimiento, µ:
µ = 𝑚, 𝑝𝑜𝑟 𝑙𝑜 𝑡𝑎𝑛𝑡𝑜:
−1
µ = 0. 011 ℎ .
Velocidad de crecimiento microbiano, 𝑟𝑥.
∆𝑋 −0.7704+1.47904
𝑟𝑥 = ∆𝑡
= 54.077−0.3
= 0. 01317 𝑚𝑔/𝑚𝐿ℎ
Velocidad del consumo de sustrato, 𝑟𝑠.
∆𝑆 −1.1171055−6.66857
𝑟𝑠 = ∆𝑡
= 54.077−0.3
= 0. 1032𝑚𝑔/𝑚𝐿ℎ
Velocidad de la formación de productos, 𝑟𝑝.
∆𝑃 0.1205−0.079765 −4
𝑟𝑠 = ∆𝑡
= 54.077−0.3
= 7. 575𝑥10 𝑚𝑔/𝑚𝐿ℎ
Velocidad de producción de producto, 𝑞𝑝.
𝑞𝑝 = 𝑌 𝑋 + 𝑌 𝑃 𝑚
𝑆 𝑆
∆𝑃
𝑞𝑝 = 𝑋∆𝑡
Por lo tanto, tenemos que:
α = 0. 1176
β =− 0. 0224
𝑌𝑃 −3
7.34𝑥10
𝑚= β
𝑆
= −0.0224
= 0. 3278.
Análisis de resultados
Comúnmente las células de un medio fresco se enfrentan a un impacto ambiental que genera
un retraso en la fase lag. El tiempo en el que las células durarán en dicha fase lo determinarán
una serie de factores dependientes del microorganismo como la edad, el tamaño del inóculo,
el pH, la temperatura y, sobre todo, los cambios en la composición de nutrientes. El efecto
que se produce en el organismo tras un cambio de nutriente implica una nueva adaptación al
medio lo que genera la producción de las nuevas enzimas requeridas. Adicionalmente, la
concentración de nutrientes influye directamente en la tasa de fermentación pues la tasa de
crecimiento es proporcional a la concentración (Vogel & Todaro, 2014). Considerando que la
concentración de la fuente de carbono y energía para el cultivo fue de 10 y que, según Vogel
& Todaro (2014), la concentración de la FCE ideal es entre 20 y 200 mg/L podemos intuir
que la baja producción de biomasa (𝑌 𝑋 = 0.1278) se debe a la baja concentración inicial de la
𝑆
FCE, pues una baja concentración dio como resultado una baja tasa de producción.
Por otra parte, la producción de etanol también se ve afectada por factores como la
temperatura, pH y concentración de sustrato. De acuerdo con Lin, et. al. (2012),
independientemente de la variación de temperatura, el crecimiento celular por Saccharomyces
cerevisiae incrementa en un inicio y después se mantiene en un estado estacionario por unos
días. Para superar el estado estacionario el microorganismo debe aumentar el proceso de
fermentación, se estima que el tiempo máximo de fermentación por lotes de este
microorganismo es de 72 horas. De acuerdo a la concentración de etanol reportada tras los
tres días de 0.12 mg/mL, valor incrementó a comparación de los primeros días donde el valor
se mantuvo prácticamente constante en 0.08 mg/mL. Estos datos indican que en las primeras
horas la concentración de etanol aumentó desde 0 a 0.08 mg/mL cuyo valor se mantuvo en un
estado estacionario hasta la última toma donde la concentración llegó hasta 0.12 mg/mL por
el tiempo máximo de fermentación. Sin embargo, los valores de concentración inicial y final
de etanol no varían mucho entre sí por lo que se pueden generar dos suposiciones a partir de
ello: (1) que el microorganismo aún no se encontraba en su etapa de fermentación máxima, o
bien, que (2) la temperatura si influyó en el crecimiento del microorganismo.
A temperaturas bajas Saccharomyces cerevisiae presenta un tasa de crecimiento específica
mucho más baja a la que se presentaría en el rango de temperatura ideal de crecimiento. Este
−1
dato concuerda con la baja tasa de crecimiento específica obtenida (0.011 ℎ ) por lo que se
puede deducir que la temperatura también jugó un papel importante en el crecimiento (Lin,
et. al., 2012). Además, los datos de producción de biomasa (0.1278) y etanol (0.007344) son
congruentes con las velocidades crecimiento microbiano (0.01317 mg/mLh) y formación de
productos (0.0007575 mg/mLh) pues ambos valores son bajos. Esto indica que los factores de
concentración inicial y temperatura afectaron directamente a todos los valores de rendimiento
y velocidad.
Altas alimentaciones de oxígeno generan que S. cerevisiae convierta completamente el
metabolismo de la glucosa en respiratorio por lo que no ocurre una fermentación alcohólica,
es decir, no hay producción de etanol (Van Dijken et. al., 1993). A pesar de que la
alimentación de oxígeno para los tres biorreactores fue baja en general, los rendimientos y
velocidades de formación de etanol pueden deberse a un exceso de oxígeno para la baja
concentración de dextrosa del medio.
En el transcurso de las horas se pudo identificar un consumo de la FCE pues en un inicio se
encontró una concentración de dextrosa de 6.4 mg/mL y una concentración de 1 mg/mL en
las horas finales. El consumo de la FCE fue considerablemente alto lo que también pudo
influir en el crecimiento del microorganismo, al tener una concentración inicial baja de
sustrato y un consumo moderado del mismo (0.1032 mg/mLh), el microorganismo llega a un
punto donde su FCE comienza a agotarse en un corto tiempo afectando directamente en la
formación de los productos como lo es el etanol (Van Dijken et. al., 1993).
Conclusión
La producción de biomasa y etanol en un medio de cultivo YPD con concentración de
dextrosa al 10% son bajas, presentando rendimientos y velocidades de producción y consumo
directamente proporcionales a la baja concentración de sustrato inicial. Además de la
concentración, los factores como la temperatura y la aireación influyeron también en el
desarrollo del Saccharomyces cerevisiae y, por lo tanto, se obtuvieron resultados pequeños en
cuanto a los parámetros cinéticos de la fermentación alcohólica y el crecimiento microbiano
del microorganismo.
Anexos
Pre-lab:
● Investigue las rutas metabólicas de S. cerevisiae involucradas en la generación de
etanol y en la degradación de la sacarosa.
Generación de etanol: Algunas especies de levaduras poseen la capacidad de metabolizar
etanol. Estas especies son conocidas como metilotróficas. En estos organismos, el etanol es
primero metabolizado por una oxidasa dependiente de oxígeno a formaldehído, el cual es
después convertido a dihidroxiacetona (DAH) por la acción de una DAH sintetasa. La DAH
puede después ser utilizada para sintetizar fructosa-6-fosfato (Feldmann, H., 2006). Por otro
lado, cuando S. cerevisiae ha agotado la glucosa disponible en el medio es capaz de adaptar
su metabolismo para consumir etanol (Zaman, S. et al., 2008). La levadura S. cerevisiae es
capaz de metabolizar el etanol por una vía conocida como PDH-bypass que requiere la
actividad metabólica de: alcohol deshidrogenasas (ADH) que catalizan la reacción reversible
de acetaldehído a etanol (Flores, C. et al., 2000), posteriormente las enzimas aldehído
deshidrogenasas (ALD) convierten el gliceraldehido a acetato, este último después es
convertido en acetil-CoA citosólico por la enzima acetil CoA sintetasa (ACS), el acetil-CoA
es transportado al interior de la mitocondria vía el sistema de la carnitina acetiltransferasa
(Rodriguez, F. et al., 2006).
Degradación de la sacarosa: En un disacárido que puede ser fácilmente aceptado como
fuente de carbono. El metabolismo de los disacáridos es precedido por la hidrólisis, que
separa el disacárido en sus monómeros básicos. Dependiendo de la especie de levadura, esta
hidrólisis puede ocurrir en el exterior de la membrana plasmática, en el espacio
periplasmático, o en el interior de la célula después de la internalización del disacárido. Por
ejemplo: en la mayoría de las levaduras la sacarosa hidrolizada en el exterior de la membrana
plasmática por una invertasas extrema (Chavez, F. et al., 1998).
● ¿Cuáles son las rutas metabólicas que deben permanecer inalteradas durante la
fermentación con levaduras para la producción de etanol?
Para poder llevar a cabo la fermentación mediante levaduras para la producción de etanol, es
importante que permanezca intacta la ruta metabólica de la glucólisis.
● ¿Cuáles parámetros de control que pueden manipularse para aumentar la
producción de etanol?
pH: Las levaduras se ven afectadas por el ambiente en el cual se desarrollan, ya sea de forma
alcalina o ácida. Por lo general, las levaduras poseen un rango óptimo de pH entre 3.5 - 5.5.
El pH suele disminuir debido a la producción de ácidos, los cuales son formados al tomar los
nitrógenos de los aminoácidos, perdiendo su carácter anfótero.
Temperatura: La temperatura no se puede elevar más de 50°C, ya que produce la muerte de
los microorganismos. La fermentación es un proceso exotérmico, donde se debe mantener un
control de temperatura que sea de 30°C.
Oxigenación: La fermentación es dependiente de oxígeno disuelto en el medio, el cual es
rápidamente consumido en el proceso. Por tanto, su disminución genera una inhibición en la
biosíntesis de ácidos grasos y esteroles, disminuyendo la biomasa producida y la glucólisis.
Concentración de alcohol: La tolerancia de alcohol presente en las levaduras depende de la
habilidad de la célula para exportar el etanol del interior al medio externo.
Concentración de azúcares: Las concentraciones altas suelen afectar los procesos de
ósmosis dentro de la membrana celular. Por lo regular, es empleado un rango óptimo de
concentración de 10 - 18%, debido a que a concentraciones de 22% las levaduras presentan
ciertos problemas en la respiración celular.
(Méndez, L., 2020)
● ¿Existe algún tipo de inhibición en la fermentación alcohólica? y si es así, ¿Qué
rutas se ven involucradas?
Si existe, el efecto Pasteur es un efecto de inhibición de la fermentación alcohólica debido a
la participación de oxígeno (O2). Es un efecto que se produce en microorganismos capaces de
realizar metabolismo fermentador y respiración aerobia, conocidos como anaerobios
facultativos. Se encuentra involucrado en la glucólisis principalmente (Vazquez, H.J. &
Dacosta, O., 2007).
● La simulación es utilizada como una herramienta en la industria de los
biorreactores que permite ahorrar grandes cantidades de dinero, explique por
qué y cuál es su utilidad en los biorreactores.
La simulación de biorreactores es muy similar a la de los reactores químicos tradicionales,
aunque con algunos elementos adicionales estrechamente ligados al carácter bioquímico del
proceso, como el crecimiento del biocatalizador y todo lo que esto implica. Esta herramienta
se utiliza principalmente para el diseño de reactores biológicos y en términos generales para
el diseño y la evaluación de bioprocesos, lo contribuye la simulación del comportamiento
microbiano dentro de un sistema de reacción. Dicha simulación permite ahondar en la
comprensión de fenómenos complejos poniendo a prueba las hipótesis formuladas y
visualizando las trayectorias descritas matemáticamente por el modelo bajo condiciones
extremas, o incluso en términos experimentales impracticables con resultados específicos
(Burgos, C., et al., 2001).
● Describa los diferentes tipos de cinéticas de crecimiento utilizadas para hongos,
bacterias y levaduras, elabore una tabla comparativa con diferencias.
Bacterias: Son microorganismos procariontes, los cuales no poseen una membrana nuclear
por lo que se ADN se encuentra libre en la célula, poseen una organización sencilla. Son
importantes en las fermentaciones de alimentos, aprovechadas por la industria y en la
producción de antibióticos. La bacteria aerobia crece en presencia de oxígeno y lo requiere
para su continuo crecimiento y existencia, en el caso de las que son anaerobias, son aquellas
que no pueden tolerar el oxígeno gaseoso.
Hongos: Son organismos eucariotas heterótrofos, que tienen digestión externa con absorción,
y que producen un micelio, formado por hifas septadas o sifonales cuyas paredes celulares
están revestidas por quitina y glucanos.
Levaduras: Se denomina levadura a cualquiera de los diversos hongos microscópicos
unicelulares que son importantes por su capacidad para realizar la descomposición mediante
la fermentación de diversos cuerpos orgánicos, principalmente los azúcares o hidratos de
carbono, produciendo distintas sustancias.
Cinética microbiana: Se encarga de entender todas las manifestaciones y reacciones de la
vida microbiana: crecimiento, supervivencia, muerte, adaptaciones, formación de producto,
ciclos celulares e interacciones con el medio ambiente.
(Caldereón, J., 2017)
Gráficas de curvas estándar:
Diagrama de flujo:
Curva de calibración para la determinación de etanol con dicromato de potasio.
Preparación de las disoluciones estándar de etanol:
NOTA: 0.1 mL = 100 μL
Construcción de la curva de calibración:
Preparación del caldo de cultivo y del biorreactor:
Referencias
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