2 ÁCIDOS NUCLEICOS Y ENZIMAS ASOCIADAS

1. LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

Los ácidos nucleicos son las (macromoléculas poliméricas) moléculas orgánicas formadas por nucleótidos unidos por enlaces
fosfodiester, encargadas de almacenar, transmitir y expresar la información genética de los seres vivos.

Diferencias ADN ARN

Composición PENTOSA: desoxirribosa PENTOSA: ribosa
química BASES NITROGENADAS: Adenina, Guanina, BASES NITROGENADAS: Adenina, Guanina, Citosina y
Citosina y Timina Uracilo
Estructura Generalmente bicatenaria Generalmente monocatenaria
Función Portador de la información genética Interviene en la transcripción y la traducción de la
(almacenamiento, conservación y transmisión) información genética permitiendo el flujo de información.
1.1. ESTRUCTURA Y COMPOSICIÓN QUIMICA
Los nucleótidos son los monómeros o componentes fundamentales de los ácidos nucleicos.
Están constituidos por la unión de una pentosa, una base nitrogenada y un grupo fosfato.
-Desoxirribonucleótidos
-Ribonucleótidos
Para nombrarlos se añade:
 Base nitrogenada púrica –osín -5´-fosfato
 Base nitrogenada pirimidínica –sín -5´-fosfato
 Si la pentosa es la desoxirribosa, desoxi-
Un nucleósido es la unión de una pentosa con una base nitrogenada.
Para nombrarlos se añade:
 -osina si la base es púrica
 -idina si la base es pirimidíica
 Si la pentosa es la desoxirribosa, desoxi-
NUCLEÓTIDO
NUCLEÓSIDO

PENTOSA BASE NITROGENADA GRUPO FOSFATO

D-RIBOSA PÚRICAS
Adenina
Guanina

DESOXIRIBOSA PIRIMIDÍNICAS
Timina
Citosina
Uracilo

1.2. PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS

 Son fuertemente ácidas en solución acuosa debido a los grupos fosfato.
 Presenta una elevada viscosidad
 Absorción de luz ultravioleta a una longitud de onda de 260 nm.
 Desnaturalización pérdida reversible o no de las dos cadenas de nucleótidos de la doble hélice de ADN, mediante un cambio de Ph o de temperatura,
perdiendo la estructura y la función. Renaturalización, vuelve a obtener su función y estructura.
 Hibridación consiste en la unión de dos cadenas complementarias en condiciones de temperatura y Ph adecuadas mediante puentes de Hidrogeno.
2. ADN
El ácido desoxiribonucleico almacena la información genética de un individuo, la transmite a los descendientes y dirige la síntesis de las
proteínas.
En las células eucarióticas el ADN se encuentra en el núcleo, en las mitocondrias y en los cloroplastos.
2.1. ESTRUCTURA DEL ADN
El ADN es un polímero formado por largas cadenas de desoxirribonucleótidos (la pentosa es siempre desoxirribosa) de adenina,
guanina, citosina y timina (no contiene uracilo).
2.1.1. CARACTERIZACIÓN DE UNA MOLÉCULA DE ADN
 El tamaño, determinado por el número de desoxinucleótidos que contiene.
 La composición, referida a la proporción de cada desoxinucleótido.
 La secuencia de bases nitrogenadas.
La estructura primaria de una molécula de ADN es la secuencia de bases nitrogenadas en el esqueleto de su cadena de
desoxinucleótidos, colocadas en dirección 5'- 3'.
2.1.2. EL PRINCIPIO DE COMPLEMENTARIEDAD O LEY DE CHARGAFF
 La adenina y la timina, entre las que se forman dos puentes de hidrógeno (A=T).
 La citosina y la quanina, entre las que se forman tres puentes de hidrógeno (C=G).
Ninguna otra combinación de bases presenta complementariedad en el ADN. Por lo que habrá = numero de bases púricas que pirimidínicas.

2.1.3. LA DOBLE HÉLICE DE WATSON Y CRICK

Watson y Crick propusieron un modelo para describir la estructura del ADN que permite explicar el principio de complementariedad y que sostiene que el
ADN es una doble hélice.
La configuración en doble hélice del ADN constituye su estructura secundaria y sostiene que el ADN está formado por dos cadenas de polinucleótidos
que forman una doble hélice alrededor de un eje central.
Las moléculas de ADN de los seres vivos son bicatenarias (ADNds), es decir, están constituidas por dos cadenas polinucleotidicas que cumplen las
siguientes condiciones:
 Las dos cadenas son antiparalelas. Los enlaces 5'- 3' están orientados en sentidos opuestos, de manera que el extremo
5' de una cadena se enfrenta al extremo 3' de la otra.
 La secuencia de bases nitrogenadas de ambas cadenas es complementaria. Es decir, si se conoce la secuencia de una
de las cadenas se puede deducir la secuencia de la otra cadena.
 Ambas cadenas se mantienen unidas por puentes de hidrógeno entre las bases complementarias.
 Forman una doble hélice, Las dos cadenas se enrollan alrededor de un eje imaginario formando una doble hélice. El
enrollamiento es dextrógiro (giran hacia la derecha) y plectonémico (para separar las cadenas hay que desenrollarlas
previamente).
 Las bases nitrogenadas se encuentran en el interior. En el exterior de la doble hélice se sitúan las cadenas de fosfato
y desoxirribosa.
 Un giro de la doble hélice equivale a 10 nucleótidos.
2.2. ORGANIZACIÓN DE LAS MOLÉCULAS DE ADN
Las moléculas de ADN según el organismo de procedencia (virus, organismos procariotas, organismos eucariotas):
 EN VIRUS DE ADN
Presentan una única molécula que puede ser lineal o circular, bicatenaria o monocatenaria.
 EN ORGANISMOS PROCARIOTAS
El ADN se encuentra en su mayor parte en un soló cromosoma y en una menor proporción en forma de fragmentos pequeños llamados plásmidos.
o Cromosoma bacteriano
Presentan una única molécula de ADN bicatenaria y circular de gran tamaño denominada cromosoma bacteriano, que se encuentra en el seno del
citoplasma.
o Plásmidos
Algunas bacterias, además contienen pequeñas moléculas circulares bicatenarias de ADN, denominadas plásmidos. Se replican independientemente del
cromosoma bacteriano
 EN ORGANISMOS EUCARIOTAS
-Núcleo de las células como parte de los cromosomas, ADN cromosómico nuclear, pero también existen pequeñas canti dades dentro de las mitocondrias,
ADN mitocondrial, y en los cloroplastos, ADN de cloroplastos.
o ADN cromosómico nuclear
La mayor parte del ADN de las células eucariotas se encuentra en el núcleo en forma de largas moléculas lineales bicatenarias, no se encuentra libre sino
asociado a proteínas básicas. Estas proteínas son de dos tipos:
 Histonas, proteínas con una función estructural.
 No histonas, proteínas muy hetereogéneas con funciones estructurales, enzimáticas y reguladoras.
El complejo formado por el ADN y las histonas constituye la cromatina.
Un nucleosoma es la estructura cilíndrica for- mada por un octámero de histonas sobre la que se enrolla la doble hélice de ADN.
La configuración tridimensional de la molécula de ADN formando las fibras de cromatina reprssenta la estructura terciaria del ADN.
o ADN mitocondrial (ADNmt)
Consiste en una molécula bicatenaria y circular de ADN de unos miles de nucleótidos.
 Contiene genes que codifican para ARN ribosómico, ARN de transferencia y enzimas empleadas en los procesos metabólicos que tienen lugar en la
mitocondria
 Se replica de manera independiente respecto al ADN nuclear.
 Su número de copias por mitocondria es muy variable
o ADN de cloroplastos
las células vegetales tienen también ADN en los cloroplastos, en forma de molécula bicatenaria y circular que codifica enzimas especificas de este
orgánulo.
 ADN copia (ADNc)
No existe como tal en la naturaleza, se obtiene en el laboratorio a partir del ARN aislado de una célula, mediante una enzima denominada
retrotranscriptasa que sintetiza ADN utilizando como molde ARN.
3. ARN
El ácido ribonucleico controla la sintesis de proteinas a partir de la información contenida en el ADN.
 Eucariotas se encuentra en el núcleo, en el citoplasma y en los ribosomas del citoplasma.
 Algunos virus solo contienen ARN mientras que otros tipos de virus solo contienen ADN.
3.1. ESTRUCTURA DEL ARN
Es un polímero formado por largas cadenas de ribonucleótidos (la pentosa es siempre ribosa) de adenina, guanina, citosina y uracilo (no contiene timina).
3.2. TIPOS Y ORGANIZACIÓN DEL ARN
Según su estructura y función:
 ARN mensajero (ARNm), ARN ribosómico (ANRr) y ARN de transferencia (ARNt), como principales.
 Con función reguladora de la expresión génica: ARNsİ, ARNmi
 Otros tipos: ARNhn, ARNsn, ARNsno
ARN mensajero (ARNm) 2%/5% Está constituido por múltiples moléculas lineales de diferentes tamaños, cada una de las cuales porta la información para
la sintesis de una proteína.
ARN ribosómico (ARNr) 80% Combinado con proteínas forma los ribosomas, orgánulos citoplasmáticos responsables de la síntesis de proteínas.
ARN de transferencia (ARNt) Transporta los aminoácidos hasta los ribosomas para su incorporación en la cadena proteica que se está sintetizando.
ARN con función reguladora Son moléculas pequeñas con secuencias complementarias de regiones específicas de ARNM. Algunas de estas molėculas
son bicatenarias (ARN interferente pequeño o ARNSİ) y otras son monocatenarias con regiones complementarias que forman una horquilla (microARN o
ARNMI).
Otros tipos de ARN
o ARN heterogéneo nuclear (ARNhn). Es una mezcla de largas moléculas lineales precursoras del ARNm. Se encuentra en el núcleo de la célula y tras un
proceso de maduración dan lugar al ARNM, que sale al citoplasma,
o ARN pequeño nuclear (ARNsn). Es un conjunto de pequeñas moléculas de ARN que se localizan en el núcleo y se unen dando lugar a
ribonucleoproteinas con actividad enzimática.
o ADN pequeño nucleolar (ARNsno). Se localiza en el nucléolo y es el precursor de varios ARN.
4. EL FLUJO DE LA INFORMACIÓN GENÉTICA
 El ADN contiene la información genética de un organismo, la cual se tiene que transmitir integramente a la descendencia. Ello implica duplicar el
material genético mediante la sintesis de nuevas moléculas de ADN con una secuencia idéntica a la de las moleculas parentales. Este proceso se
denomina replicación.
 Mediante los procesos de transcripción que consisten en la sintesis de moléculas de ARNM, con la misma secuencia que los genes de ADN, encargadas
de transportar la información al citoplasma y de traducción, por el que la secuencia de bases del ARNM se transforma en la secuencia de aminoácidos de
una proteina.
 4.1. REPLICACIÓN DEL ADN
La replicación de ADN es el proceso de duplicación del ADN mediante el cual se obtienen 2 copias idénticas a la molécula inicial.
 Su finalidad es duplicar el material genético antes de la división celular, siendo un proceso fundamental para la vida al garantizar la conservación y
transmisión del material genético.
CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LA REPLICACIÓN
o Semiconservativa. En cada molécula hija, una de las cadenas procede de la molécula original que se replica y la otra cadena es de nueva sintesis.
o Origen de replicación. La replicación comienza en unos puntos de iniciación concretos denominados orígenes de replicación. El cromosoma bacteriano
de procariotas tiene un único origen de replicación, mientras que en los cromosomas eucariotas hay muchos, por lo que la replicación se inicia de manera
simultánea en varios puntos de cada cromosoma.
o Bidireccional y secuencial. La replicación ocurre en las dos direcciones: las dos cadenas que forman la molecula de ADN son antiparalelas y ambas se
tienen que replicar, lo que da lugar a dos horquillas de replicación.
o Semidiscontinua. La sintesis de las cadenas nuevas se produce siempre en dirección 5'-3', por lo que la cadena molde tiene que leerse en dirección 3'-5'.
Al ser bidireccional desde el origen de replicacion, se plantea un problema:.uno de los lados del origen de replicación, la nueva cadena se sintetiza de
manera discontinua, en forma de fragmentos denominados fragmentos de Okazaki. La hebra que se sintetiza de manera continua se llama hebra
adelantada o conductora y la hebra que se sintetiza a fragmentos se denomina hebra retardada.
LAS ENZIMAS DEL PROCESO DE REPLICACIÓN
o Helicasa. Desenrolla y separa las dos cadenas de la doble hélice.
o Proteínas de unión a cadena sencilla (SSBP). Se unen a las cadenas desenrolladas evitando que se vuelva a formar la doble hélice.
o Girasa y topoisomerasa. La separación de las dos cadenas de ADN en la burbuja de replica- ción genera un superenrollamiento en el resto de la doble
hélice. Estas dos enzimas relajan la tensión de la doble hélice mediante cortes y empalmes.
o ADN polimerasa. Es la responsable de la sintesis de la nueva cadena, añadiendo desoxi- nucleótidos al extremo 3' de una cadena en crecimiento. La ADN
polimerasa no puede ini- ciar una cadena, solo puede elongar una preexistente de ADN O ARN.
También actividad exonucleasa, es decir, son capaces de eliminar nucleótidos uno a uno desde un extremo de la cadena, muy útil para corregir y reparar
errores.
o Primasa. Es una enzima con función ARN polmerasa que sintetiza cortos fragmentos de ARN (aproximadamente 10 nucleótidos) denominados cebadores
o primers, complementarios de zonas concretas de la cadena de ADN que se está replicando.
o Ligasa. Es la enzima responsable de unir los fragmentos de Okazaki entre sí y con la hebra conductora para conseguir la continuidad de la cadena de
nueva síntesis.
FASES DE LA REPLICACIÓN
 Iniciación.
o Se produce el desenrollamiento y la apertura de la doble hélice: una enzima llamada helicasa rompe los enlaces de hidrógeno entre las bases
nitrogenadas de la doble hebra de ADN y las separa.
o Interviene la enzima topoisomerasa (girasa), la cual evita las tensiones que se producen en el desenrallamiento de la cadena de ADN.
o En el lugar de origen de la replicación, se forman unas burbujas de replicación en las que nay dos zonas con forma de Y, llamadas horquillas de
replicación, donde se van a sintetizar las nuevas hebras de ADN y que se extienden en los dos sentidos (bidireccional).
o En procarióticos los cromosomas tienen un único origen de replicación (llamado Ori C), mientras que en eucarióticos los cromosomas, debido a su longitud,
presentan multiples origenes de replicación (de lo contrario el proceso tardaria mucho tiempo en completarse)
 Elongación.
o Las grandes protagonistas de esta fase son las enzimas ADN polimerasas que actuan recorriendo la hebra molde, selecciomando el desoxirribonucleotido
cuya base es complementario con dicha hebra y uniendo entre si los nuevos nucleotidos.
o También realizan la función de eliminar nucleótidos cuvas bases están mal apareadas, es decir, tienen actividad exonucleasa.
o En cada horquilla de replicación se fabrica una hebra adelantada y una retrasada.
o Sea cual sea la hebra, la ADN polimerasa no puede iniciar la sintesis de una nueva cadena de ADN desde cero. Necesita un fragmento de unos diez
nucleótidos de ARN, lamado cebador, que es sintetizado por una ARN polimerasa, Ilamada primasa.
o Una vez comenzada la sintesis, la propia cadena de ADN sintetizada actúa como cebador. La ADN polimerasa recorre las hebras molde en el sentido 3'-
5' por lo que las nuevas hebras formadas crecen (por adición de nucleótidos) en el sentido 5' 3'.
o Como las dos cadenas del ADN son antiparalelas (orientadas en direcciones opuestas), habrá variaciones en la elongación en función de la hebra de
la que se trate:
 Hebra conductora, lider o adelantada. Se sintetiza de manera continua y requiere un unico ARN cebador.
 Hebra retrasada o retardada. La sintesis se hace de manera discontinua conforme se va abriendo la
horquilla y requiere muchos ARN cebadores. Se produce la sintesis discontinua de pequeños fragmentos de
ADN, lamados fragmentos de Okazaki, que requieren cada cierto intervalo de ADN, de un cebador de ARN
sintetizado por la primasa. Finalmente la ADN ligasa se encarga de soldar todos los fragmentos
obtenidos para completar la sintesis de esta hebra.
o En procarióticos existen tres tipos de ADN polimerasas mientras que en eucarióticos hay hasta cinco
tipos de ADN polimerasas que se reparten las tareas de elongación y corrección de errores:
 La ADN polimerasa II leva a cabo la sintesis de la nueva cadena de ADN durante la replicación y,
posteriormente, interviene la ADN polimerasa I, que va a retirar los fragmentos de ARN del cebador y los va
a sustituir por ADN.
 Terminación.
o En procarióticos, la replicación termina cuando las horquillas de replicación llegan a un punto del cromosoma bacteriano denominado Ter. El resultado
final son dos cromosomas circulares.
o En eucarióticos hay un problema añadido al llegar al final del cromosoma (telómero) ya que al ser su ADN lineal, no circular, cuando se elimina el último
ARN cebador, la hebra retardada queda incompleta. Este hecho hace que el telómero se vaya acortando un poco cada vez que la célula se divide, lo que
puede suponer la pérdida de información genética e incluso la muerte celular. Este problema lo solventa la enzima telomerasa que lleva asociado un ARN
cebador que permite completar el proceso y evitar la pérdida de información.
4.2. TRANSCRIPCIÓN DEL ADN A ARN
o La transcripción es la sintesis de una cadena de cualquier tipo de ARN (ribosomico, mensajero, transferente) que tiene la secuencia complementaria de
una cadena de ADN que actua como molde.
o De esta forma, es un proceso fundamental para la vida al permitir la expresión de la información genética.
o Su finalidad es la sintesis de los diferentes ARNS necesarios para la sintesis de proteinas.
o Tiene lugar en el núcleo de las células eucarioticas y en el citoplasma de las células procarióticas.
FASES DE LA TRANSCRIPCIÓN
 Iniciación.
o De las dos cadenas de ADN, sólo una de ellas se transcribira (cadena molde) mientras que la otra no lo hará (cadena informativa o codificante).
o La gran protagonista de este proceso es la enzima ARN polimerasa, la cual reconoce en la cadena molde unas señales de iniciación, denominadas
promotores, que son secuencias cortas de bases nitrogenadas a las que se une la ya citada ARN polimerasa
o En los procarióticos el proceso esta catalizado por una sola ARN polimerasa mientras que en eucarióticos la llevan a cabo tres tipos de ARN
polimerasas (I, lI yII ).
o En procarióticos, la ARN polimerasa reconoce y se une al promotor directamente mientras que en eucarióticos, la ARN polimerasa necesita factores de
transcripción para unirse al promotor.
 Elongación.
o La ARN polimerasa recorre la cadena molde de ADN, leyendola en el sentido 3-5 mientras sintetiza ARN en el sentido 5-3.
o De esta forma, la ARN polimerasa selecciona el ribonucleótido trifostato cuya base (A, G, C, U) es complementaria con la de la cadena molde de ADN y lo
une al siguiente nucleótido
o El ARN se sintetiza en el sentido 5'-3
o Durante la elongación en los eucarióticos y tras la unión de los 30 primeros ribonucleotidos, se modifica el extremo 5' añadiéndole una "caperuza"
encargada de proteger ese extremo de la degradación asi como de unir y alinear el ARNm sobre el ribosoma en la traducción.
 Terminación.
o La ARN polimerasa reconoce en el ADN señales de terminación que indican el final de la transcripción.
o Se cierra la burbuja de transcripción formada en el ADN y se separa la ARN polimerasa del ARN mensajero transcrito.
o Los procarióticos, al no tener nucleo definido, realizan transcripción y traducción de manera simultánea (los ribosomas se unen al ARN mensajero
cuando aún se está transcribiendo).
o En eucarióticos, la transcripción se realiza en el núcleo y una vez separado el ARN, se modifica xtremo 3' mediante poliadenilación (incorporación
de una cadena de nucleótidos de Adenina, llamada cola poli-A) que estabiliza el ARN y regulara la traducción fuera del núcleo.
o Este ARN sintetizado, llamado ARN heterogéneo nuclear (ARNhn) se exportará al citoplasma ( a traves de los poros nucleares) para iniciar la
traducción pero antes de ello requiere una modificación conocida como maduración
o La maduración del ARNm transcrito consiste en la eliminación de intrones (partes de un gen no determinan una secuencia de aminoácidos) y union de
exones (partes que si lo hacen) mediante un mecanismo conocido con el nombre de splicing, es decir, de "corte y empalme".
4.3. TRADUCCIÓN:
o La traducción es la sintesis de una secuencia de aminoácidos (polipéptido) con la información proporcionada y dirigida por la secuencia de bases de la
molécula del ARNM.
o Su finalidad es, por tanto, la sintesis de proteinas.
o Tiene lugar en el citoplasma tanto de células eucarióticas como de células procarióticas.
o En la traducción intervienen todos los tipos de ARN y los ribosomas:
* ARN ribosómico. Se encuentra asociado a proteinas formando la estructura de los ribosomas, constituyendo asi la base fisica para la sintesis de
proteinas.
*ARN mensajero. Contiene y transporta el mensaje genético proporcionanda la secuencia de bases que debe ser traducida a secuencia de aminoácidos
en la sintesis de proteinas.
• Codón. Grupo de tres bases consecutivas (triplete) del ARN mensajero que codifica un aminoácido.
* ARN transferente. Interviene en el proceso de traducción transportando los aminoácidos ribosoma de forma especifica para la sintesis de proteinas en
función de su anticodón. En la función de traducción intervienen las siguientes partes del ARNt:
• Anticodón. Región del ARN transferente que contiene un triplete de bases que reconoce y se une especificamente a un
codón complementario del ARNM.
• Extremo aceptor (3´). Regiórn del ARN transferente que se une a un aminoácido correspondiente al anticodón. El
ARNE con su aminoácido unido se denamina aminoacil-ARNt.
EL CÓDIGO GENÉTICO
El código genético es el diccionario que permite traducir una secuencia de bases nitrogenadas a una secuencia de
aminoácidos. Se basa en que una secuencia de tres bases nitrogenadas codifica un aminoácido.
Cada triplete de bases nitrogenadas que codifican un aminoácido se denomina codón. De los 64 codones que se
pueden formar por las variaciones con repetición de cuatro bases tomadas de tres en tres, 61 codifican aminoácidos y 3 son codones de terminación.
CARACTERÍSTICAS DEL CÓDIGO GENÉTICO
 Es universal. El código genético es el mismo para todos los organismos. Es decir, un codón específico codifica el mismo aminoácido en un eucarionte, en
un procarionte y en un virus.
*Una excepción es el código genético mitocondrial, en el que algunos codones concretos co- difican un aminoácido distinto.
 No es ambiguo. Cada codón codifica un único aminoácido.
 Es degenerado. Dado que hay 20 aminoácidos y 61 codones codificantes, es evidente que la mayor parte de los aminoácidos están codificados por más
de un codón. Los distintos codones que codifican un mismo aminoácido se denominan codones sinónimos.
 Es continuo y no solapado: en la cadena de ARNM, los codones se disponen de manera secuencial uno a continuación de otro, sin espacios ni comas y
sin compartir ninguna base.
CODONES PARA LA INICIACIÓN Y PARA LA TERMINACIÓN
 Todas las secuencias de ARNM que se van traducir empiezan con el codón de inicio AUG, que codifica para metionina.
 Los codones UAA, UAG y UGA son codones de terminación.
FASES DE LA TRADUCCIÓN
Los ribosomas también juegan un papel crucial al ser los responsables de las sintesis de proteinas. Constan de las siguientes partes:
 Una subunidad grande y una subunidad pequeña
 Tres sitios de unión para los ARNT: sitio P (peptidil), sitio A (aminoacil) y sitio E (expulsion).
 Iniciación.
o Conducido por los factores de iniciación, un primer aminoacil-ARNE (en el caso de eucarióticos es el metionil-ARNE y en el caso de procarióticos es
formilmetionil-ARNE) se une al sitio P de la subunidad pequeña del ribosoma para forma el complejo de iniciación.
o Dicho complejo recorre la molécula de ARNM hasta que se encuentra con el codón iniciador AUG que producirá la liberación de los fartores de Iniciación y
la unión con la subunidad grande del ribosoma.
 Elongación.
o Consiste en el alargamiento de la cadena proteica.
o La secuencia de nucleótidos del ARNM se lee en sentido 5' 3' mientras que los aminoácidos que forman la proteina se van uniendo desde el extremo
amino terminal hasta el extremo carboxilo terminal.
o La elongación se inicia cuando un segundo aminoacit-ARNE (cuyo anticodón es complementario al codón situado a continuación del iniciador) entra en el
sitio A libre del ribosoma. A continuación, se forma un enlace peptidico entre el aminoácido que se encuentra en el sitio P y el nuevo aminoacido en el sitio
A (reacción catalizada por la enzima peptidiltransferasa).
o Al formarse el enlace peptidico, el segundo ARNE queda unido por un extremo al dipéptido formado, y por el otro, a su codón complementario.
o Finalmente, se produce la translocación del ribosoma (desplazamiento del ribosoma a lo largo del ARNM en sentido 5'-3').
o Al ser este desplazamiento de tres bases, el primer ARNE abandona el ribosoma por el sitio E y el peptidil-ARNI pasa a ocupar el sitio P (dejando libre el
sitio A al que puede incorporarse un nuevo aminoacil-ARNE para seguir alargando la proteina).
 Terminación
o La sintesis de la proteina se detiene cuando se produce la ultima translocación del ribosoma al encontrarse uno de los tres codones sin sentido o de
terminación del ARNm (UAA, UGA o UAG), los cuales no corresponden a ningun aminoacido y finalizan la sintesis de proteinas.
o Finalmente la cadena polipeptidica formada, el ARNM y el ARNE abandonan el Pibosoma, que se disocia de nuevo en sus dos subunidades hasta el
momento en el que se inicia una nueva sintesis.
5. ENZIMAS EMPLEADAS EN BIOLOGÍA MOLECULAR
5.1. NUCLEASAS
Las nucleasas son enzimas que cortan y degradan los ácidos nucleicos mediante hidrólisis del enlace fosfodiéster entre dos nucleótidos.
CLASIFICACIÓN DE LAS NUCLEASAS Dependiendo de sus características se pueden clasificar de varias maneras:
 Según el tipo de ácido nucleico que atacan:
o Nucleasas de ARN (ARNasa o ribonucleasa) Son enzimas capaces de romper enlaces fosfodiéster entre ribonucleótidos.
o Nucleasas de ADN (ADNasa o desoxirribonucleasa). Son enzimas capaces de romper enlaces fosfodiéster entre desoxirribonucleótidos.
 Según el tipo de cadena que atacan:
o Nucleasas que atacan moléculas bicatenarias, rompiendo enlaces en ambas cadenas.
o Nucleasas que solo atacan moléculas monocatenarias.
 Según la situación del punto de corte:
o Exonucleasas, que eliminan nucleótidos uno a uno desde un extremo (en dirección 5'-3', 3'-5'o en ambas).
o Endonucleasas, que cortan en puntos intermedios de la molécula. Algunas endonucleasas como la ADNasa I, son muy útiles cuando se usan a baja concentración porque son capaces
de producir en moléculas bicatenarias de ADN la rotura de un enlace fosfodiéster entre dos nucleótidos solamente en una de las cadenas. Estas roturas se denominan mellas (nick en inglés) y son
fundamentales para un tipo de marcaje de sondas denominado desplazamiento de mella (nick translation).
 Según la especificidad del corte:
o Nucleasas que cortan aleatoriamente. Son enzimas que cortan la cadena de nucleótidos de forma aleatoria.
o Nucleasas que cortan en sitios concretos de la molécula. Son enzimas que se unen a una cadena de nucleótidos en una secuencia especifica y la
cortan, como es el caso de las endonucleasas de restricción que abordaremos en el apartado siguiente dada su especial relevancia.
5.2. ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN
Las endonucleasas de restricción son endonucleasas bacterianas que reconocen secuencias cortas de ADN bicatenario (de entre 4 y 8 pares de bases) y
producen un corte en la doble cadena en esa secuencia o cerca de ella, fragmentando la molécula.
 Tipos de enzimas de restricción Hay tres tipos de enzimas de restricción:
o Enzimas de restricción tipo I: la enzima reconoce su diana de restricción y efectúa un corte en una región anterior o posterior de la diana a una distancia
aleatoria de hasta 1000 pb. Estas enzimas no generan patrones especificos de fragmentos, es decir, cada vez que cortan una misma molécula de ADN
generan fragmentos distintos, por lo que no tienen gran utilidad en biologia molecular.
o Enzimas de restricción tipo II: reconocen la diana de restricción y cortan en puntos especificos, generalmente dentro de la misma diana. En
consecuencia, estas enzimas generan patrones específicos y reproducibles de fragmentos, ya que siempre que se enfrentan a la misma molécula cortan
por los mismos puntos. Son una herramienta fundamental en biología molecular y se las llama tijeras moleculares.
o Enzimas de restricción tipo IlII: reconocen dos secuencias invertidas dentro de la misma cadena y cortan fuera de la diana de restric- ción, pero a una
distancia corta (25-30 pb)
 Tipos de corte El corte realizado por una enzima de restricción puede ser de dos maneras distintas que se carac- terizan por los extremos generados:
o Extremos romos. El corte se produce en el mismo punto en las dos cadenas, generalmente en el centro de la diana de restricción.
o Extremos cohesivos. El corte se produce en puntos distintos de ambas cadenas, normalmente en los extremos de la diana de restricción. Esto genera en
cada extremo sendas regiones monocatenarias cortas y complementarias entre sí, lo que hace que sean muy reactivos al poderse adherir a fragmentos de
ADN que tengan secuencias de bases complementarias.
 Aplicaciones en biología molecular
Las enzimas de restricción son herramientas imprescindibles en biología molecular como iremos viendo a lo largo de las siguientes unidades, pero
podemos destacar dos aplicaciones de especial importancia en
o la tecnología del ADN recombinante y en la obtención de patrones de restricción.
o Permite crear moléculas de ADN recombinante
o La propiedad de las endonucleasas de restricción de cortar dejando extremos cohesivos o reactivos, es decir, con regiones monocatenarias cortas de
bases desapareadas, es muy útil en biología molecular para crear moléculas de ADN recombinante.
El procedimiento es el siguiente:
1. Se cortan dos moléculas distintas de ADN con la misma enzima de restricción.
2. Cuando los fragmentos con extremos cohesivos de ambas moléculas se mezclan, se unirán por la complementariedad de bases de sus respectivas
regiones monocatenarias generadas por la enzima de restricción.
3. Finalmente, las mellas que quedan en cada ca- dena se unen con una ligasa y se obtiene una molécula híbrida recombinante.
Patrones de restricción Para una enzima de restricción concreta una molécula de ADN presenta un número relativamente pequeño de dianas de
restricción.
En consecuencia, la digestión con esa enzima genera un numero discreto de fragmentos de distintos tamaños. Estos fragmentos se pueden separar según
su tamaño mediante la técnica de electroforesis en gel de manera que se obtiene un conjunto de bandas que es ünico para un ADN en particular y que se
denomina patrón de restricción
Conocer el patrón de restricción de una muestra de ADN dada tiene muchas utilidades como pueden ser la identificación de muestras pertenecientes a un
mismo individuo,
5.3. ADN POLIMERASAS
La técnica básica en biología molecular es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que permite obtener millones de copias de una secuencia de
interés. Las ADN polimerasas más usadas son de los tipos ly II. Para realizar su función requieren que en el medio de reacción estén presentes:
o Los cuatro desoxinucleótidos trifosfato.
o Un ADN molde.
o Cebadores.
o Mg como cofactor.
5.4. OTRAS ENZIMAS RETROTRANSCRIPTASAS
 Las retrotranscriptasas o transcriptasas inversas son ADN polimerasas-ARN dependientes. Es decir, sintetizan moléculas de ADN utilizando ARN
como molde. El empleo de estas enzimas ha permitido:
o Realizar estudios masivos de ARN. En concreto, en combinación con técnicas de ADN recombinante, ha posibilitado la creación de genotecas de ADNC,
fiel reflejo de la expresión génica de una célula en un momento dado.
o La amplificación de ARN. La PCR convencional no amplifica ARN, puesto que las ADN polimerasas que se emplean son ADN dependientes.
 Desoxinucleotidil transferasa terminal (Tdt) La desoxinucleotidil transferasa terminal (Tdt) es una ADN polimerasa que cataliza la incorporación de
desoxinucleótidos al extremo 3' de una molécula de ADN, no requiere de un cebador ni de una cadena molde para ejercer su actividad.
 Ligasas Las ligasas unen dos moléculas de ADN mediante formación de enlaces fosfodiéster entre los extremos 3' de una molécula y 5' de la otra.
Topoisomerasas Las topoisomerasas relajan la tensión de la doble hélice de ADN próximas a las burbujas de replicación o transcripción.