Biotecnología Vegetal - BII.
Transformación genética
Tema 10.- FUNDAMENTOS PARA LA OBTENCIÓN DE PLANTAS
TRANSGÉNICAS
Plantas transgénicas
Agrobacterium tumefaciens y rhizogenes
Proceso de infección de Agrobacterium
Vectores, promotores, marcadores y construcciones
Estrategias para la eliminación de genes marcadores
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¿QUÉ ES UNA PLANTA TRANSGÉNICA?
Es una planta cuyo genoma ha sido modificado mediante
ingeniería genética, bien para introducir uno o varios genes
nuevos o para modificar la función de un gen propio
Como consecuencia de esta modificación la planta transgénica
muestra una nueva característica
NEW GM SUPER-
FRUIT: HIGH
ANTIOXIDANT
PURPLE TOMATOES
Scientists have now created a genetically-modified (GM) purple
tomato variant that has purple flesh and 3 times more
antioxidants than normal tomatoes.
WHY ARE THEY
PURPLE?
The purple colour comes from naturally-
occurring pigments called anthocyanins.
They are flavonoids that can be found in
fruits and vegetables. Anthocyanins have
antioxidant properties and multiple health
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¿CÓMO SE HACE UNA PLANTA TRANSGÉNICA?
La producción de una planta transgénica consta de dos etapas
fundamentales denominadas transformación y regeneración
La transformación es el proceso de inserción del gen que se
pretende introducir (transgen) en el genoma de una célula de la
planta a transformar
Técnicas de transformación
La regeneración consiste en la obtención de una planta completa a
partir de esa célula vegetal transformada
Cultivos in vitro
Soja transgénica resistente a
glifosato, sin tratar (izquierda) y
tratada con glifosato (derecha)
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TRANSFORMACIÓN GENÉTICA
Ingeniería Genética + Cultivos in vitro
Ingeniería genética Cultivos in vitro
Permite diseñar nuevas combinaciones genéticas Regeneración de células transformadas y clonación
Las plantas se pueden cultivar “in vitro” Totipotencia
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PLANTAS TRANSGÉNICAS
La biotecnología se suma a las prácticas convencionales como una herramienta
más para mejorar o modificar los cultivos vegetales
VENTAJAS
• Los genes que se van a incorporar pueden provenir de cualquier especie,
emparentada o no
Permite saltar la barrera de la especie
• En la planta transformada se puede introducir un único gen nuevo preservando en su descendencia
el resto de los genes de la planta original
Permite trabajar con genes aislados en lugar de hacerlo con genomas
• Las mejoras se direccionan, ya no hay azar
• El conocimiento molecular de la modificación genética introducida es mucho más elevado
• Es un proceso más rápido que el necesario para mejora por cruzamiento
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PROCEDIMIENTO PARA LA OBTENCIÓN DE UNA PLANTA TRANSGÉNICA
Identificación de organismos con el/los gen/es de interés
Aislamiento de dicho/s gen/es
Introducción en un vector
Multiplicación (clonación)
Introducción del ADN en el organismo a transferir
Obtención del individuo transgénico
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CULTIVOS TRANSGÉNICOS A GRAN ESCALA
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AGROBACTERIUM TUMEFACIENS (Rhizobium radiobacter; Young, 2001)
Bacteria de suelo Gram - Rizosfera
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AGROBACTERIUM TUMEFACIENS
Produce tumores en plantas Agallas de corona
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AGROBACTERIUM TUMEFACIENS
1907, Smith y Townsend - Identificaron a A. tumefaciens como responsable de la enfermedad
1947, Braun - Agallas formadas por conglomerados de células indiferenciadas
Bacteria es inductora de tumores por TIP (tumor inducing principle) - ADN
1969, Kerr - La patogenicidad puede transferirse de una cepa patogénica a otra
no patogénica
Transferencia debe estar mediada por un plásmido
1970, Morel y Tempé - Tejido de la agalla contiene octopina o nopalina
El tipo de opinas depende de la cepa de Agrobacterium
Agrobacterium debe transferir ADN que codifica una enzima de síntesis de opina
1971, Hamilton y Fall - Se pierde el factor de virulencia por calentamiento (36 ℃)
Después del calentamiento todas las colonias se transformaron en avirulentas
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AGROBACTERIUM TUMEFACIENS
1974, Zaenen, Schell y Van Montagu - Identificaron un megaplásmido sólo presente en cepas virulentas
Plasmido Ti (plásmido inductor de tumores)
Plásmido estrechamente relacionado con TIP (tumor inducing principle; Braun (1947))
1977, Nester, Gordon y Chilton - Se transfieren a la célula vegetal sólo algunos genes del megaplásmido
T-DNA (ADN de transferencia)
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AGROBACTERIUM TUMEFACIENS
1983, Van Montagu y Schell; Chilton e Inv. de Monsanto - Desarmaron el plásmido Ti (+NPTII)
Plásmido Ti Plásmido Ti desarmado
desarmado cortado por enzimas
de restricción
Plásmido
recombinante
Infectaron protoplastos con AGRO modificadas
Regeneraron plantas resistentes
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AGROBACTERIUM TUMEFACIENS Transfiere genes a las células vegetales
Plásmido Ti ≈ 200 kb (T-DNA; DNA de transferencia)
Contiene 1 (o +) regiones T-DNA
Contiene 1 región vir Contiene 1 región que permite la transferencia (tra)
Contiene 1 origen de replicación (ori/inc) Contiene genes del metabolismo de opinas (occ,…)
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ESTRUCTURA DEL PLÁSMIDO Ti ≈ 200 kb - T-DNA ≈ 14-17 kb (≈ 20 kb)
ipt
24 pb
aux A, aux B
24 pb
VirA, VirG, VirB1-B11, VirC1, VirD1,
VirD2, VirD4, VirE1, VirE2, VirF, VirJ
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AGROBACTERIUM RHIZOGENES
Bacteria de suelo Gram - Rizosfera
“Hairy roots” Raíces en cabellera
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AGROBACTERIUM RHIZOGENES
Plasmido Ri plásmido inductor de raíces
T-DNA (ADN de transferencia) Dos T-DNAs
La integración y expresión de los T-DNA en
la planta dan lugar a la formación de gran
cantidad de raíces – raíces transgénicas
El cultivo posterior de estas raíces permite la
producción comercial de ciertos metabolitos
secundarios que se sabe que la planta produce
Plásmido Ri no desarmado
INCONVENIENTES
Gama de huéspedes más reducida
Fenotipos aberrantes en la parte aérea de muchas plantas
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PROCESO DE INFECCIÓN
Agrobacterium utiliza proteínas cromosómicas (Chv) y de
virulencia del plásmido Ti (Vir) para detectar los tejidos
vegetales heridos y hacer la transferencia del T-DNA
• Detección de señales 2
Agro detecta los compuestos fenólicos y azúcares
liberados por las células dañadas (señales)
Reconocimiento célula-célula
• Para la infección es necesario una Unión entre ambas
células (Agro y célula vegetal): 1
Agro se aproxima a la célula (quimiotaxis)
- Unión inicial, mediante un polisacárido
- Producción de una malla de celulosa por la bacteria para
reforzar la unión
- Unión de la bacteria a receptores (¿?) de la planta
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PROCESO DE INFECCIÓN
• Sistema bacteriano de transducción de señales de dos
componentes VirA-VirG (detección de señales) 2
• La activación de Vir G* provoca la inducción de la
región de virulencia (vir) 3
- VirD2 /VirD1 funciona como una nucleasa ssDNA,
que corta y libera al T-DNA
- VirD2 permanece unida al ssT-DNA, produciendo el
complejo T inmaduro 4
- Transporte del complejo T inmaduro a través del
sistema de secreción de tipo VirB/VirD4 (T4SS)
5
- Transporte de todas las proteínas Vir a la célula
vegetal (VirE2, VirF)
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PROCESO DE INFECCIÓN
• Se forma el complejo T maduro en el citoplasma
8
de la célula vegetal por el recubrimiento de la cadena
6
T con numerosas proteínas VirE2 y VIP1P 7
• Respuesta de defensa de la planta: 6
- Activación de la vía de señalización MAPK
- Fosforilación de VIP1 mediada por MAPK
VIP1P se une al complejo T y actúa en la activación
de los genes de respuesta de defensa 6 7
• Mecanismo por el que Agro puede alterar la defensa:
- Unión de la proteína VirF a la proteína VIP1P 8
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PROCESO DE INFECCIÓN
• Entrada en el núcleo
VirE2 y VirD2 (poseen actividad de localización nuclear)
funcionan en la importación del T-DNA
CAK2M y una proteína TATA-box
- Guía del complejo T a los sitios de preintegración
(interacción con VirD2)
Histona H2A (interacción de VIP1 con VirE2)
- Modificaciones de histonas del complejo T 9
La unión de los complejos ADN-VirE2-VIP1 con
VirF: - Proteólisis de VIP1 y VirE2 y separación 9
• Integración del T-ADN 10
10
Varias proteínas de mantenimiento y reparación del ADN
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VECTORES DE TRANSFORMACIÓN
Conservan regiones esenciales para la transformación
Un origen de replicación funcional en E. coli
• Permite a la bacteria multiplicar el plásmido para su aislamiento a gran escala
Un origen de replicación de Agrobacterium
• Permite multiplicarse en esa bacteria
Genes de resistencia a antibióticos con expresión en bacterias
• Permiten seleccionar E. coli y Agrobacterium que contengan los plásmidos vectores
Una región vir
• Para la transferencia e integración del T-DNA en el genoma de la célula vegetal
Un T-DNA desarmado
• Solo conserva los bordes (left border y right border)
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Vectores de transformación conservan regiones esenciales para la transformación
Vectores cointegrados
Plásmido Ti desarmado y plásmido de
E. coli
Recombinación homóloga
Región vir actúa en <cis> respecto al
T-DNA
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Vectores de transformación conservan regiones esenciales para la transformación
Vectores binarios
Plásmido Ti sin T-DNA y plásmido de
E. coli
Origen de replicación en ambos
Región vir puede actuar en <trans>
respecto al T-DNA
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SECUENCIAS PROMOTORAS (PROMOTORES) y TERMINADORAS
Constitutivos Promotor 35S
Promotor NOS
Específicos de tejido Promotores de proteínas específicas de semillas
Promotores específicos de anteras CoFS, END1,
.
Inducibles Elementos de respuesta a luz (LREs) Box I, Box II, Box III
Elementos de respuesta a ABA (ABREs) ABRE A, ABRE B, ABRE, CE
Elementos de respuesta a Auxinas (AuxREs) AuxRE
Respuesta a ácido jasmónico JASE 1, JASE 2
Inducible por etanol AlcR (Aspergillus nidulans)
Inducible por esteroides
.
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GENES MARCADORES - Marcadores de selección
La presencia de un gen marcador seleccionable proporciona a las células transformadas una
ventaja selectiva sobre las células no transformadas cuando se cultivan en medios que
contienen el agente de selección
• Permiten identificar los eventos de transformación a nivel celular y seleccionarlos
• Son genes que codifican resistencia a antibióticos o tolerancia a herbicidas
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GENES MARCADORES - Marcadores de selección
• Son genes que codifican resistencia a antibióticos o tolerancia a herbicidas
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GENES MARCADORES - Marcadores de selección
Selección exitosa - las células de la planta diana
deben ser susceptibles a una concentración
relativamente baja de agente de selección sin fugas
Selección negativa
Neomicina fosfotransferasa (NptII)
Higromicina fosfotransferasa (Hpt)
Gentamicin-3-N acetyltransferasa (AAC(3))
Phosphinotricin acetyltransferasa (Bar)
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GENES MARCADORES - Genes informadores
Usados en muchos vectores de expresión para medir la actividad de distintas regiones reguladoras
y para explorar la localización espacio-temporal de la expresión génica
Debe ser fácil de ensayar (en condiciones no destructivas)
Actividad endógena asociada al gen debe ser muy baja o inexistente en las plantas a transformar
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GENES MARCADORES - Genes informadores
b-glucuronidasa (GUS)
Gen uidA de Escherichia coli
Proteína GUS es bastante estable y conserva su actividad aún cuando
está fusionada a otras proteínas
Reacción histoquímica sencilla (destructiva)
La detección de la actividad es muy sensible, pudiéndose detectar a
nivel de unas pocas células
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GENES MARCADORES - Genes informadores
Fluorescencia verde (GFP)
Obtenida de Aequorea victoria (medusa)
Contiene los componentes necesarios para generar bioluminiscencia
- Fotoproteína que se activa por Ca2+ (aequorina)
Emite luz azul y verde
- Proteína accesoria, la green fluorescent protein (GFP)
Acepta energía de la aequorina y re-emite esta energía
como luz verde
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GENES MARCADORES - Genes informadores
Luciferasa (Luc o Lux)
Generada por una luciérnaga o bacteriana
Medición de los niveles de luz producidos
en una reacción catalizada por la enzima
bioluminiscente (luciferasa)
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CONSTRUCCIONES GÉNICAS
LB nptII RB
ADN
35S nptII Nos
LB ter RB
Gen chivato
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CONSTRUCCIONES GÉNICAS
Tomate “corta” vida
35S ACS Nos 35S nptII Nos
LB ter ter RB
Tomate “larga” vida
35S Nos 35S nptII Nos
LB RB
ACS
ter ter
RNAi: PTGS_ Tomate “larga” vida
35S ACS Pdk intrón OCS 35S nptII Nos
LB ACS
ter ter
RB
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CONSTRUCCIONES GÉNICAS
Tomate “larga” vida Construcción de Agrobacterium
35S Nos 35S nptII Nos
LB RB
ACS
ter ter
Maíz Bt (evento MON 810 - YielGardÒ) Biolística – no tiene LB ni RB
35S nptII Nos 35S hsp70 cryIA(b) Nos
ter int ter
Maíz Roundup ReadyÒ NK603 Biolística – no tiene LB ni RB, tampoco
gen marcador
35S hsp70 EPSPS Nos Pro act1 EPSPS Nos
int ter act1 int ter
EPSPS: 5-enolpiruvolsikimato-3-fosfato sintasa
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GENES MARCADORES - Marcadores de selección (antibióticos, herbicidas,.)
Alternativas metodológicas
• Métodos de transformación libres de marcadores selectivos MARKER-FREE METHOD
- Genes que promueven regeneración: IPT, CK1
- Señal de transducción de hormonas
- Factores de transcripción (actividad meristemática)
Trabajo de selección muy complicado
Ha sido útil sólo para pocas especies
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Alternativas metodológicas
• Métodos de transformación que posibiliten la eliminación de los marcadores selectivos
por segregación: MARKER REMOVAL METHOD
- Co-transformación - construcciones a doc
2 T-DNAs en 2 cepas de Agro
2 T-DNAs en 2 vectores binarios
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Alternativas metodológicas
• Métodos de transformación que posibiliten la escisión de los marcadores selectivos
(transposones): MARKER REMOVAL METHOD
- Recombinación específica de sitio
Sistema cre/lox, Sistema Ac/Ds
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Alternativas metodológicas
• HERRAMIENTAS DE EDICIÓN DE GENOMAS
Tecnología de genética que ha supuesto una auténtica revolución
Herramienta molecular para editar (corregir) el genoma de cualquier célula
Tijeras moleculares para cortar ADN de forma precisa y controlada
