Diffusion-Ordered Spectroscopy
(DOSY)
INTRODUCCIÓN
PARÁMETROS DE
RMN
T1
T2
J3
3J
NOE ∝ (1/r6)
where J is the coupling constant
NOE
CDR ∝ < 3 cos2 θ –1 > / < r3 >
δ
CDRs
KD
ESPECTROSCOPÍA RMN 1D
Una señal para cada tipo de núcleo
1H N-metil-acetamida
ESPECTROSCOPÍA RMN 2D
Experimentos:
COSY/TOCSY – correlación a través de 1 o varios
enlaces
NOESY/ROESY – correlación a través del espacio
Experimentos simétricos
HSQC/HMQC – correlación heteronuclear (dos tipos
de núcleo diferentes, 1H y13C o 1H y15N)
DOSY
¾Las señales del espectro de RMN 1D se desdoblan en una
segunda dimensión determinada por el coeficiente de
difusión.
Aumento del tamaño molecular Molécula 2
Molécula 1
logD
H2O
RMN 1D
DOSY & Stokes-Einstein
La difusión está gobernada por la ecuación de
Stokes-Einstein determinado por el
tamaño molecular
D = kT / 6πηrs
(K, Boltzman; T, temp.; η, viscosidad; rs, radio hidrodinámico)
Esta ecuación gobierna:
Cromatografía de exclusión molecular (SEC)
Ultracentrifugación analítica (AUC)
Técnicas de dispersión de luz (Light scattering
techniques)
Secuencia de pulsos básica
1 2 4 6
gradiente
desfase
refocalización
desenfoque 180 enfoque
Gradientes y difusión
La señal decae según la ecuación:
Disminución de la señal en función del tamaño
1.2
1.0
0.8
0.6 20 kDa
I/Io
0.4
200 Da
0.2
0.0 20 Da
0 20 40 60 80 100
Gradient strength (%)
Disolventes
• Disolventes de baja viscosidad (CDCl3),
efectos térmicos
tiempos Δ y δ cortos
• Humedad en disolventes orgánicos
afecta a la difusión
• Cambios en la viscosidad durante
valoraciones
D2O:H2O ratio
Pureza
mezcla puro
disolvente
-9.50
impureza
-9.00
-8.50
ppm (t1
7.0 6.0 5.0 4.0 3.0
ppm (t2)
e.g. 2
A mixture of polydimethylsiloxane (PDMS, 350 cst), mesitylene,
trimethoxybenzene, sucrose octaacetate and quinine in CDCl3,
(21) Magn. Reson. Chem. 2002; 40: S147–S152
Determinación del tamaño
molecular
logD = -9.610
¿Cómo traducir la
información del coeficiente
de difusión a tamaño
HOD molecular?
Glycobiology, 2004
RECTAS DE CALIBRACIÓN PARA DETERMINAR TAMAÑOS MOLECULARES
(GlcNAc)1-7
Glycobiology, 2004
Chito-oligosaccharides
Ac
Glycobiology, 2004 n = -1 to 4
Synthetic Chito-oligosaccharides
Aug ‘03 Jun ‘03 May ‘03
1 (992 Da) 1015 1062 1037
2 (891 Da) 827 865 848
Glycobiology, 2004
Polisacáridos
Biomacromolecules 2003; 4:1843
Rectas de calibración para proteínas
Aprotonin (6.5 kDa)
α-lactalbumin (14 kDa)
Carbonic anhydrase
(30 kDa)
Ovalbumin (44 kDa)
Bovine serum albumin (66 kDa)
Anal Biochem (2004)
Calculated MW of some proteins
Log(D) M.W. (kDa)
Calbindin -10.125 27.2 (30)
Calretinin -10.115 25.8 (32)
Calretinin I-II -10.030 16.5 (12.5)
Galectin 7 + lig -10.16 32.0 (15)
MW = 14-16 kDa by SEC. Therefore, CR I-II has an expanded conformation
or non-spherical shape
PG et al., unpublished
ESTUDIO DE INTERACCIONES
Procesos de Auto-asociación
ONa O
N
H
O N COONa
H
180 mM
LogD –9.59
120 mM LogD –9.53
LogD –9.46
60 mM
Estequiometría de complejos
heveina – carbohidrato
Oligómeros de N-Acetilglucosamina
(GlcNAc)5-8
Chemistry & Biology 2000, 7, 1-14
e.g. 6 drug-binding to cyclodextrins
(14) Magn. Reson. Chem. 2002; 40: S106–S109
1 + 2, K = 2600 M-1 1 + 3, K = 6000 M-1
Steroid-Cyclodextran Complexes
The complexes
measured in this study
satisfy the Stokes-
Einstein equation.
Magn. Reson. Chem. 2002; 40:S106
catenanos
de paladio
Caracterización de mezclas
complejas de reacción
(p3) Chem. Eur. J. 2001, 7, 4142-9
Otras aplicaciones
Experimentos 3D
3rd dimension (F1) is carbon – three HMQC spectra in planes
(p1) J. MAGN. RESON. 131, 131–138 (1998)
Mixture quinine
camphene geraniol
Estudios de intercambio químico (sacarosa) Hydroxyl
resonances
25 ms 50 ms
200 ms no added
water
(17) Magn. Reson. Chem. 2002; 40: S122–S127
CONCLUSIONES
• El experimento DOSY es un experimento rápido que
proporciona información adicional acerca de la pureza de las
muestras.
• También puede emplearse para determinar tamaños
moleculares, en estudios de interacción e intercambio químico.
