PCR
(Polymerase Chain Reaction)
Luis Arturo Jaime Martínez
FUNDAMENTO
› La PCR es una reacción enzimática in vitro que amplifica
millones de veces una secuencia específica de ADN durante
varios ciclos repetidos en los que la secuencia blanco es
copiada fielmente.
• Si usamos como sustrato ADN
genómico hablamos de una PCR,
pero si usamos ADN complementario
(ADNc) proveniente del ARNm se le
conoce como RT-PCR (Reverse
Transcription-PCR).
HISTORIA
› Creada por Kary Mullis en 1985
en la compañía Cetus.
› La técnica PCR hizo uso, en un
principio, de la ADN polimerasa
de la bacteria Escherichia coli.
› Posteriormente se usó el
equivalente de la bacteria
"termófila" Thermus aquaticus
(Taq polimerasa).
MASTER PCR
› Los primers son secuencias de oligonucleótidos
que flanquean y delimitan la secuencia blanco
que se desea amplificar y son complementarios a
ésta.
3’ 5’
• Su tamaño oscila entre 5’ 3’
15-25 pares de bases y la
cantidad de G-C no debe
ser más del 55% de la
reward o
secuencia. forward o
sentido antisentido
MASTER PCR
› Los dNTP’s son los ladrillos o bases nitrogenadas con los
que la Taq polimerasa construye las nuevas cadenas de
ADN.
MASTER PCR
› El buffer es la solución
amortiguadora está
compuesta de Tris-HCL
(pH=8) cuya concentración
final de trabajo debe ser
1X.
› El agua es el disolvente en
la reacción y se usa en su
forma destilada libre de
nucleasas, enzimas que
degradan a los ácidos
nucleicos.
PASOS EN
UN CICLO
DE PCR
DESNATURALIZACIÓN
› En esta etapa, las cadenas de ADN son calentadas y
separadas a una temperatura de 95°C durante 20-30
segundos.
HIBRIDACIÓN
› Los primers se alinean al extremo 3’ del templado
separado e hibridan con su secuencia
complementaria. Para que se forme el complejo
templado-primers, es importante que la temperatura
de hibridación o temperatura melting (Tm) sea la
óptima; ésta generalmente oscila entre 50-60 °C.
EXTENSIÓN
› En esta etapa, la Taq polimerasa
actúa sobre el complejo
templado-primers y empieza su
función catalítica a una
velocidad muy rápida; agrega
dNTP’s complementarios para
crear las cadenas completas de
ADN.
› La temperatura óptima para la
reacción es de 72 °C, ya que a
esa temperatura la enzima es
funcional.
CICLOS
AMPLIFICACIÓN
RELACIÓN ENTRE EL
NÚMERO DE COPIAS Y
EL NÚMERO DE CICLO
ANÁLISIS DE AMPLIFICACIÓN
› Por electroforesis en geles de agarosa con
un marcador de peso molecular.
PCR tiempo real
› El principio de la técnica se basa en la PCR punto final,
sólo que la forma en cómo se detectan y analizan los
productos de la amplificación es diferente.
› El término en tiempo real se refiere a que la detección de
los productos amplificados sucede en cada ciclo de la
reacción.
› Si utilizamos ADN genómico entonces hablamos de una
qPCR (quantitative PCR), si se utiliza ADNc y luego
hacemos la PCR, nos referimos a una RT-qPCR.
Métodos de detección de amplicones
› SBYR Green
Es un método no especifico y
se basa en el uso de
moléculas intercalantes al ADN
de doble cadena y que al ser
oxidados generan una señal
fluorescente.
Es una molécula cargada
positivamente que no emite
fluorescencia pero, si se une al
surco menor del ADN de doble
cadena incrementa la
fluorescencia hasta 1,000
veces.
SBYR Green
Secuencias TaqMan
› Se basan en sondas fluorescentes de oligonucleótidos
etiquetados con un reportero fluorescente y un quencher,
ambos se encuentran en estrecha unión mientras la
sonda no hibride a su secuencia blanco.
› Cuando hibrida, ocurren cambios conformacionales en el
reportero y el quencher, lo cual permite que la actividad
exonucleasa 5’-3’ de la Taq polimerasa rompa esta unión,
logrando que la fluorescencia emitida por el reportero
sea liberada y capturada por el equipo.
Sondas Molecular Beacons
› Consisten en una sonda
unida a un reportero
fluorescente que está en
estrecha proximidad con un
aceptor fluorescente unido
a otra sonda.
› Cuando las dos sondas
hibriden a su templado
blanco, el reportero es
excitado genera la
fluorescencia.
