Material Didáctico de Enzimología

para los Laboratorios Biomédicos.

Colectivo de autores

MsC. Lázaro Díaz Melgarejo

Esp. Darcia Elena Carrete Aties
MsC. Leticia Salinas Ojeda
Dr. Annia Robaina Flores
Dr. C. Madelyn Fernández Barrio

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INDICE
Epígrafe Contenido
PRESENTACIÓN
CAPÍTULO 1 LAS ENZIMAS COMO BIOCATALIZADORES.
CARACTERÍSTICAS QUE FUNDAMENTAN SU USO
EN EL LABORATORIO
Biocatalizadores o catalizadores biológicos
Origen y evolución de la enzima
Estructura de la enzima
Propiedades de la enzima
Cofactores enzimáticos
Nomenclatura enzimática
Clasificación enzimática
Mecanismo básico de acción enzimática
Cinética enzimática
Efectos de la concentración de la enzima.
Efecto de la concentración de sustrato
Efecto de la concentración de cofactores
Efecto de la concentración de iones H + (pH)
Efecto de la temperatura
Presencia de activadores
Presencia de inhibidores
Efecto de las enzimas reguladoras
Ejercicios de comprobación del capítulo 1
CAPITULO 2. USO DE LAS ENZIMAS EN LOS LABORATORIOS
BIOMÉDICO
Las enzimas como medio de diagnóstico o índice de enfermedad.
Enzimas como Medio de Diagnostico en el laboratorio clínico
Enzima Amilasa
Enzima Transaminasa (TGO/ASAT)
Enzima Transaminasa (TGP/ALAT)
Enzima Deshidrogenasa Láctica
Enzima Gamma Glutamil Transferasa (GGT)
Enzima Creatina quinasa (CK)
Enzima Creatina quinasa Isoenzima MB.
Enzima Fosfatasa Alcalina (ALP)
Enzima Fosfatasa Ácida
Enzimas como medio de diagnóstico en el laboratorio de anatomía
patológica
Enzimas Fosfatasa Ácida
Deshidrogenasa
Peroxidasa
Enzimas como Medio de Diagnóstico en el laboratorio de microbiología
Enzima Beta hemolisina estafilocosica (beta-lisina)
Enzima Fosfolipasa D (PLD)
Enzimas Catalasa y Peroxidasa.
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Enzima Coagulasa
Enzima Ureasa
Enzima Oxidasa
Enzima Fosfatasa
Ejercicios de comprobación del capítulo 2. Tema 2.1
Enzimas como Herramientas de trabajo en el laboratorio clínico
Enzima Glucosa-Oxidasa
Enzima Lipoproteina-lipasa (LPL)
Enzima Colesterol Esterasa.
Enzima Ureasa
Enzima Creatincinasa
Enzima Uricasa
Enzimas como herramientas de trabajo en el laboratorio de anatomía
patológica
Enzima a Amilasa
Enzimas como herramientas de trabajo en el laboratorio de microbiología
Definiciones importantes
Técnicas inmunoenzimáticas
Tipos de enzimoinmunoensayos
Sistema Ultra Micro Analítico (SUMA)
Componentes de la tecnología SUMA
Aplicaciones de la tecnología SUMA
Algunos de los exámenes más frecuentes en laboratorio de SUMA
Ejemplos de la aplicación de SUMA en el control epidemiológico
Precauciones en la utilización de la tecnología SUMA
Recomendaciones para lograr mejores resultados
Perspectivas de la Tecnología SUMA
Ejercicios de comprobación del capítulo 2. Tema 2.2
Bibliografía
Anexo 1.
Respuesta de los ejercicios de comprobación del Capítulo 1 y Capítulo 2

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Presentación

La competencia en la sabiduría promovido por la ciencia y la técnica en la época

actual, exige la formación de profesionales con mejor calidad, capaces de dar
respuestas efectivas a los problemas que la sociedad contemporánea plantea en
su desarrollo de lo cual no están exentas las condiciones sociales cubanas,
caracterizadas por la construcción y el perfeccionamiento del socialismo,
enmarcada en la Batalla de Ideas que libra nuestro pueblo en pos de la cultura
general integral masiva suscitada. En medio de ello el egresado de la licenciatura
en Tecnología de la Salud en Bioanalisis Clínico debe fundamentar e interpretar
los resultados de los procedimientos técnicos utilizados en la práctica para el
estudio integral del proceso salud-enfermedad; constituyendo los contenidos
relacionados con el uso de la enzima en los laboratorios biomédicos de los de vital
interés pues son numerosas las patologías que gracias a los adelantos
tecnológicos de la práctica médica pueden ser diagnosticadas mediante el uso de
métodos enzimáticos los cuales por su precisión garantizan la confiabilidad de los
resultados obtenidos que hasta hace unas décadas se basaban más en el
diagnóstico clínico convencional por no contar con el apoyo tecnológico actual.

Los primeros intentos de medir moléculas de interés médico en los fluidos

biológicos, datan de la década del 40 del siglo XX, y concernieron principalmente a
metabolitos tales como glucosa, urea y enzimas, ya que estas podían transformar
muchas moléculas de sustrato. Por su especificidad las enzimas son utilizadas en
el laboratorio como medio de diagnóstico y como herramienta de trabajo siendo
estudiadas por la enzimología clínica. La enzimología clínica evidentemente ha
proporcionado el desarrollo de los medios de diagnóstico, prevención, control y el
tratamiento de múltiples enfermedades que han afectado la humanidad,
constituyendo una pieza clave los estudios de la bioquímica para la elaboración
de nuevos fármacos, diagnosticadores y técnicas de detección precoz de
enfermedades metabólicas, hereditarias y las de carácter transmisible con vista a
llegar a la excelencia de los servicios sanitarios portadores de técnicas menos
invasivas al paciente. Dado que las perspectivas y la visión en desafíos futuros del
desarrollo científico-técnico indican que el diagnóstico a tiempo y acertado
constituye un golpe anticipado a los trastornos causantes de las patologías que
afectan la salud humana; se requiere que el profesional en Bioanálisis Clínico
sepa fundamentar e interpretar los resultados de los procedimientos técnicos
utilizados en la práctica para el estudio integral del proceso salud-enfermedad
siendo necesario entonces que este se apropie del conocimiento de la

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enzimología Clínica. Para potenciar ello es que se confecciona el siguiente
Material Didáctico sobre el Uso de la Enzima en los Laboratorios Biomédicos.

Al estudiante de la licenciatura en Bioanálisis Clínico.

Quizás te preguntaras ¿cómo se puede «digerir» lo que parece constituir un
sinnúmero de datos?. A primera vista, el éxito en el estudio de la enzimología
clínica podría depender de la capacidad de memorizar, esto es un elemento
importante de cualquier disciplina médica, pero la comprensión de los principios y
técnicas básicas y la elaboración de un sistema para almacenar esta información
desempeñan una destacada función en el dominio de las ciencias médicas.
Sugerimos entonces que el estudiante se concentre en aprender los datos más
importantes pensando como lo haría un bioanalista sin dejarse de plantear
interrogantes básicas: ¿quién?, ¿dónde? cuándo?, ¿por qué?, ¿cuáles?, ¿qué?, y
¿cómo?

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CAPÍTULO 1. LAS ENZIMAS COMO BIOCATALIZADORES:
CARACTERÍSTICAS QUE FUNDAMENTAN SU USO EN EL LABORATORIO

1.1. Biocatalizadores o catalizadores biológicos

Los catalizadores son sustancias que tienen la capacidad de disminuir la energía

de activación de la reacción química con lo cual aumentan su velocidad.

En condiciones biológicamente significativas las reacciones sin catalizar tienden

a ser lentas. La acción de un catalizador facilita el desenvolvimiento de las
transformaciones químicas; acelerando considerablemente la velocidad de la
reacción química y disminuyendo la energía de activación, entendida esta como la
energía necesaria para que se produzcan choque efectivos entre los
reaccionantes y su orientación para obtener el producto (figura 1.4) sin variar la
constante de equilibrio

Figura 1.4. Representación de comportamiento de la energía utilizada en el

curso de la reacción con y sin catalizador

Sin catalizador

Con catalizador

Velocidad de la Reacción

Los catalizadores pueden clasificarse en bióticos y abióticos. Los abióticos son

aquellos que su función es independiente de los seres vivos y pueden ser metales
como el Pt, sales como el K2Cr2O7, ácidos o bases como el H2SO4 o el NaOH,
compuestos orgánicos como el fenol, el anhídrido acético etc. Los bióticos son
aquellos que realizan su función en los seres vivos. También denominados
biocatalizadores representados por la enzima cuya naturaleza es proteica con la
excepción de un pequeño grupo de ARN y anticuerpos con actividad catalítica,
denominados ribozimas y abzimas respectivamente.
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 La mayoría de las actividades de la Ribozima( ARN con acción catalítica) se
basan en dos reacciones fundamentales: transesterificación e hidrólisis de
enlaces fosfodiéster. Algunas ribozimas intervienen en importantes reacciones
celulares como el procesamiento o maduración del ARN y la síntesis de proteínas
(molécula del ARNr componente del ribosoma encargada de catalizar la
transpeptidación o unión de los aminoácidos). Otras como la ARN polimerasa
sintetiza una cadena de ARN complementaria a un molde de ADN. Estas
representan una importante herramienta biotecnológica para degradar ARN
específicos facilitándose así su manipulación; como las ribozimas tienen la
capacidad de auto procesamiento, es decir, de auto eliminarse se está estudiando
la posibilidad de proteger al organismo humano de virus, bacterias y hongos
patógenos a partir de la eliminación de su ARN específicamente. En el caso de la
abzimas (anticuerpos con actividad catalítica) los anticuerpos(inmunoglobulina)
son componentes clave de la respuesta inmune. Una molécula o grupo químico
que se fija fuerte y específicamente a un anticuerpo determinado se denomina
antígeno. Cuando se utiliza un análogo del estado de transición como antígeno
para estimular la producción de anticuerpos, los anticuerpos que lo fijan serán
catalizadores potenciales de la reacción correspondiente, este enfoque sugerido
en 1969 por W.P.Jencks se ha podido experimentar con técnicas de laboratorio
para la producción de anticuerpos monoclonales que son todos iguales y que fijan
un anticuerpo específico. Las abzimas son en su mayoría constructos artificiales,
estas pueden encontrarse en los organismos, como es el caso de los
autoanticuerpos antipéptido vasoactivo intestinal y en el caso del lupus
eritematoso en el que los anticuerpos se pueden unir al ADN e hidrolizarlo. Las
abzimas son potenciales herramientas de la biotecnología a partir de las cuales se
realizan determinadas manipulaciones en el ADN.
Mientras que las enzimas se definen como catalizadores biológicos de naturaleza
proteica, que se encuentran en todos los tejidos de los organismos vivos, y que
facilitan las reacciones químicas necesarias para el mantenimiento de la vida
interviniendo en las reacciones metabólicas modificando su velocidad. Estas
moléculas son responsables de la dirección de la compleja red de reacciones
químicas celulares llevadas a cabo en los organismos vivos.

Respecto a su aplicación en la biotecnología, algunas enzimas se utilizan con

fines médicos, ya sea como medio de diagnostico o índice de enfermedad y como
herramienta de trabajo o reactivos químicos en diversos laboratorios para el
diagnóstico, pronostico y seguimiento de diversas enfermedades.

En los últimos años, la investigación sobre la química enzimática ha permitido

aclarar algunas de las funciones vitales más básicas. La ribonucleasa, una enzima
descubierta en 1938 por el bacteriólogo estadounidense René Jules Dubos y
aislada en 1946 por el químico estadounidense Moses Kunitz, fue sintetizada por
científicos estadounidenses en 1969. La síntesis consiste en unir 124 moléculas
de aminoácidos en una secuencia muy específica para formar la macromolécula.
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Dicha síntesis permitió identificar aquellas áreas de la molécula que son
responsables de sus funciones químicas, e hizo posible crear enzimas
especializadas con propiedades de las que carecen las sustancias naturales. Este
potencial se ha visto ampliado durante los últimos años por las técnicas de
ingeniería genética que han hecho posible la producción de algunas enzimas en
grandes cantidades que son útiles en el tratamiento médico de zonas de
inflamación local como la tripsina, la α quimotripsina y la desoxirribonucleasa
útiles para la eliminación de sustancias extrañas y tejido muerto en el tratamiento
de abscesos, quemaduras, úlceras infestadas de la piel y cervicitis; las dextrinasas
que previenen la caída de los dientes; la L-asparaginasa utilizada en el
tratamiento de las leucemia para deprimir los niveles de aspargina, aminoácido
que requieren las células tumorales en grandes gran cantidades para su
crecimiento; la estreptoquinasa obtenida a partir de Estreptococo hemolítico o por
ingeniería genética capaz de disolver el coagulo en el músculo cardiaco creado a
consecuencia de un infarto, inactivando el plasminógeno, precursor de la
plasmina; transformádose de este modo la fibrina en péptidos solubles. Por otro
lado algunas enzimas como la β galactocidasa son utilizadas como reactivos
fijados a una matriz(alimento) para evitar la incidencia negativa de algunos
alimentos, es el caso de la leche que presenta lactosa, disacárido al cual muchos
niños son intolerantes, siendo capaz la β galactocidasa de disminuir los niveles de
este en la leche.

Por otra parte el proceso de producción en muchas industrias depende de la

acción de enzimas sintetizadas por las levaduras y bacterias.

Orígenes y evolución de las enzimas

Las enzimas fueron descubiertas en la levadura, que fermentaban los azúcares

para producir el alcohol, hacia 1850 por Louis Pasteur; producto de ello. Se
conocían antiguamente como fermentos. El nombre de enzima, que fue propuesto
en 1867 por el fisiólogo alemán Wilhelm Kühne (1837-1900), deriva de la frase
griega en zymē, que significa 'en fermento'. En la actualidad los tipos de enzimas
identificados son más de 2.000.

Sin duda la fermentación alcohólica es la reacción enzimática más antigua

conocida. Se creía que este fenómeno y otros similares eran reacciones
espontáneas hasta que en 1857 el químico francés Louis Pasteur comprobó que la
fermentación sólo ocurre en presencia de células vivas. Sin embargo, el químico
alemán Eduard Buchner descubrió en 1897 que un extracto de levadura libre de
células puede producir fermentación alcohólica. La antigua incógnita fue entonces
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resuelta; la levadura produce la enzima y ésta lleva a cabo la fermentación. Ya en
1783 el biólogo italiano Lazzaro Spallanzani había observado que la carne podía
ser digerida por jugos gástricos extraídos de halcones. Éste fue el primer
experimento en el que se llevó a cabo una reacción vital fuera de los organismos
vivos. Tras el descubrimiento de Buchner, los científicos asumieron que, en
general, las fermentaciones y las reacciones vitales eran producidas por enzimas.
Sin embargo, todos los intentos de aislar e identificar su naturaleza química
fracasaron. Más tarde, en 1926, el bioquímico estadounidense James B. Sumner
consiguió aislar y cristalizar la ureasa. Cuatro años después su colega John
Howard Northrop aisló y cristalizó la pepsina y la tripsina. Northrop demostró
también la naturaleza proteica de las enzimas.

Las Enzimas son proteínas que tienen la propiedad de aumentar la velocidad de

las reacciones químicas interactuando como catalizadores biológicos, son
metabolitos que intervienen en el metabolismo celular.

1.2. Estructura de las enzimas

La actividad de la enzima viene dada por su estructura tridimensional (figura 1), la

cual está a su vez establecida por la secuencia de aminoácidos que determinan
su función.

Figura 1. Estructura enzimática que le permite realizar su función

- Sitio de reconocimiento

CENTRO ACTIVO - Sitio de catálisis

SITIO ALOSTÉRICO

Durante la catálisis, al ser la enzima de mayor tamaño que el sustrato solo hay
una pequeña zona de esta que entra en contacto directo con el sustrato; en esta
zona se encuentran dos sitios importantes, uno de ellos reconoce y fija al sustrato
(sitio de reconocimiento) y el otro cataliza la reacción (sitio de catálisis), a esta
zona de la enzima que queda íntimamente unida con el sustrato se le denomina
centro activo, por otra parte las enzimas también pueden contener una zona
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denominada sitio alostérico por donde suele ser regulada su acción catalítica.
Sitio con la capacidad de unir un cofactor requerido por algunas enzimas en el
proceso de catálisis o de unir pequeñas moléculas como sustratos o productos
directamente o indirectamente de la reacción catalizada; estas uniones pueden
incrementar o disminuir la actividad enzimática actuando.

Entre los sitios que constituyen el centro activo se pueden distinguir varios
componentes que contribuyen por su estructura a la función general que este
realiza: El sitio de reconocimiento está formado por el eje peptídico, los grupos de
ambientación y grupos de fijación mientras el sitio de catálisis está formado por los
grupos catalíticos. ( figura 1.2)

Figura 1.2. . Sitios que constituyen el centro activo y que a su ve

contribuyen con sus componentes a la función general que este realiza.

Componentes que constituyen a los sitios que forman el centro activo.

1- Eje peptídico: formado por la parte monótona de la estructura polipeptídica,

cuyos pliegues y repliegues contribuyen de manera importante a dar la forma
tridimensional del centro activo.

2- Grupos de ambientación: Son cadenas laterales de aminoácidos que se

encuentran en el centro activo y que son de naturaleza apolar, contribuyendo a
que este presente características que no permitan la entrada de agua; esta
característica provoca cambios en las propiedades catalíticas de otros grupos y
además permite que se refuercen las interacciones débiles entre la enzima y el
sustrato.

3- Grupos de fijación: También son cadenas laterales de aminoácidos que

presentan grupos funcionales capaces de establecer interacciones específicas con
el sustrato; estas interacciones suelen ser de tres tipos fundamentales: puentes de
hidrógeno, enlaces salinos o iónicos y fuerzas de Van der Wals.

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4- Grupos catalíticos: Son cadenas laterales de aminoácidos que participan en la
estructura del centro activo; pero son los que están implicados de forma directa en
la transformación del sustrato (catálisis).

1.3. Propiedades de las enzimas

Algunas enzimas, intervienen en la hidrólisis de muchos tipos de proteínas,

controlan muchas reacciones diferentes, mientras que otras son muy específicas
y sólo pueden acelerar una reacción. Otras liberan energía para la contracción
cardiaca y la expansión y contracción de los pulmones. Muchas facilitan la
conversión de azúcar y alimentos en distintas sustancias que el organismo precisa
para la construcción de tejidos, la reposición de células sanguíneas y la liberación
de energía química para mover los músculos; esta variedad de funciones es
posible por las siguientes propiedades:

- Acción catalítica: las enzimas aceleran la velocidad de transformación

(catálisis) de un sustrato en productos, sin consumirse en la reacción, por
eso se le llaman catalizadores por lo que la cinética de las reacciones
enzimáticas difiere de las reacciones inorgánicas simples.
- Especificidad: Cada enzima es específica de forma selectiva para la
sustancia sobre la que actúa y en la forma que actúa. Para explicar el
acoplamiento enzima-sustrato se han supuesto dos hipótesis, basadas en
la teoría de Emil Fischer en 1994 sobre la “llave” y su “cerradura” y la
teoría de Daniel Koshland en 1958 sobre el modelo del encaje inducido o
adaptación inducida; poniéndose de manifiesto la especificidad de sustrato
y de acción de la enzima:

o Especificidad de sustrato: la fuerza no covalente mediante la que

los sustratos y otras moléculas se unen a las enzimas son de
carácter idénticas a la fuerza que dictan las conformaciones de las
propias proteínas, en ambas intervienen interacciones de Van der
Waals, electrostáticas, enlaces de hidrógeno e hidrofóbicos. El
sitio de unión del sustrato está constituido por una entalladura o
grieta sobre la superficie de la molécula de una enzima que es de
forma complementaria con la del sustrato (complementariedad
geométrica). Además los restos de aminoácidos que forman el
sitio de unión se hallan dispuestos para interactuar
específicamente con el sustrato de una manera atractiva
(complementariedad eléctrica). Las moléculas que se diferencian
en la forma o distribución de grupo funcional respecto al sustrato

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 no puede unirse de modo productivo a la enzima, es decir, no
puede formar un complejo enzima-sustrato que conduzca a la
formación de un producto.
o Especificidad de acción: Una vez que se ha producido la unión
del sustrato al centro activo, solo alguno de los enlaces del
sustrato quedará al alcance de los grupos catalíticos de la enzima;
de esta forma la enzima podrá realizar una transformación de ese
sustrato, aunque este sea susceptible de varias transformaciones.
Por ejemplo el ácido glutámico puede experimentar una reacción
de α-descarboxilación y producir ácido GAMMA – aminobutírico,
también una desaminación o transaminación para originar ácido
α- cetoglutárico; para cada reacción hace falta una enzima
específica, todas con la misma especificidad de sustrato( ácido
glutámico) pero con diferente especificidad de acción.

- Eficiencia: Las enzimas como catalizadores, intervienen en las reacciones

químicas en cantidades muy pequeñas, pueden participar en la reacción
una y otra vez modificando la velocidad de las reacciones reversibles en
ambos sentidos, sin alterar el equilibrio final. De ahí que son muy eficaces.
Por ejemplo, unos 30 g de pepsina cristalina pura son capaces de digerir
casi dos toneladas métricas de clara de huevo en pocas horas.

1.4. Cofactores enzimáticos

La actividad de algunas enzimas depende solamente de su estructura como

proteína, mientras que otras necesitan además uno o más componentes no
proteicos, llamados cofactores. El cofactor puede ser uno o varios iones
inorgánicos tales como Fe2+. Mg 2+, Mn 2+ o Zn2+ o un complejo orgánico o
metaloorgánico denominado coenzima.

El complejo enzima-cofactor catalíticamente activo recibe el nombre de

holoenzima, cuando se separa el cofactor, la proteína restante, que por si misma
es inactiva catalíticamente, se designa con el nombre de apoenzima.

Las enzimas que precisan de iones metálicos se les llama metaloenzimas; el ion
metálico puede actuar como centro catalítico primario, como puente para unir el
sustrato y la enzima o como agente estabilizador de la conformación de la
proteína enzimática en su forma catalítica activa.

Las coenzimas actúan por lo general como transportadores transitorios de grupos

funcionales, átomos específicos o de electrones, los cuales son transferidos en la

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reacción global. Muchas vitaminas que son nutrientes orgánicos requeridos en
pequeñas cantidades en la dieta, son precursores de coenzimas; cuando la
coenzima se haya unida íntimamente a la molécula de la enzima recibe el nombre
de grupo prostético.

Las coenzimas pueden participar en reacciones de oxidación-reducción como los

piridín(NAD+ y NADP) y flavin (FMN y FDN) nudeótidos, el ácido lioico, el glutatión
y las porfirinas.

En fin la función del cofactor es apoyar a la enzima en la catálisis ya sea como

puente Enzima-Sustrato o agente estabilizador en el caso de los iones metálicos o
como transportadores transitorios de grupos funcionales, átomos específicos o
de electrones, en el caso de las coenzimas.

1.5. Nomenclatura enzimática.

La nomenclatura incluye tanto la especificidad de sustrato como la de acción.

Existen dos tipos de nomenclaturas: la sistemática y la recomendada. La
sistemática utiliza los grupos principales, describe la reacción y solo se utiliza en
revistas y textos científicos donde se requiera de un elevado grado de precisión,
mientras que la recomendada viene a ser una forma abreviada de la sistemática,
su uso es común sobre todo en textos para estudiantes; en ambos casos se tiene
en cuenta tanto la especificidad de acción como la de sustrato y el nombre de la
enzima termina con el sufijo asa. La nomenclatura sistemática de las enzimas,
toma como base a los criterios de clasificación de las mismas por lo que estos
nombres resultan muy largos y por ello habitualmente se acostumbra a utilizar la
llamada nomenclatura recomendada, que consiste en denominar a la enzima por
el nombre del sustrato sobre el que actúa seguido de la acción que sobre él ejerce
pero cambiándole su terminación por el sufijo asa. Así la ureasa cataliza la
hidrólisis de la urea y la ADN polimerasa cataliza la síntesis de ADN. Otro ejemplo
se puede observar en la siguiente figura 1.3.

Figura.1.3. Nomenclatura recomendada de la enzima que cataliza la

deshidrogenación del ácido láctico para su Interconversión con el ácido
pirúvico

13
 Podremos ver que la enzima que cataliza la deshidrogenación del ácido láctico
para su interconversión con el ácido pirúvico recibe el nombre de láctico
deshidrogenasa o deshidrogenasa láctica.

1.6. Clasificación enzimática

Para la clasificación de las enzimas según su especificidad de acción estas se

reúnen en seis grupos principales:

- Oxidorreductasas: Catalizan reacciones de oxidorreducción o redox.

Interviniendo en la transferencia de electrones o sus equivalentes, entre un
donante y su aceptor; precisando la colaboración de coenzimas. (NAD+,
NADP+, FAD). Un ejemplo de este tipo de enzima lo es la láctico
deshidrogenasa que cataliza la deshidrogenación del ácido láctico hasta
ácido pirúvico.

- Transferasas: Catalizan la transferencia de grupos químicos entre un

donante y un aceptor; transfieren grupos activos (obtenidos de la ruptura
de ciertas moléculas) a otras sustancias receptoras. Suelen actuar en
procesos de interconversión de monosacáridos, aminoácidos, etc; ejemplo
de ellas lo son las transaminasas que catalizan la transferencia del grupo
amino y la cretina quinasa que cataliza la transferencia del grupo fosfato.

- Hidrolasas: Catalizan la ruptura de enlaces químicos con la participación de

las moléculas de agua; verifican reacciones de hidrólisis con la consiguiente
obtención de monómeros a partir de polímeros. Intervienen en la digestión
de los alimentos como la amilasa que cataliza el enlace glicosidico α(1-4)
de los glúcidos, la lipasa que cataliza el enlace éster del triacilglicérico y la
fosfatasa ácida y alcalina que cataliza casi todos los monoésteres
ortofosfóricos

- Isomerasas: Actúan sobre determinadas moléculas obteniendo de ellas sus

isómeros de función o de posición. Suelen actuar en procesos de
interconversión.

- Liasas: Catalizan reacciones en las cuales se produce la adición o

sustracción de grupos químicos (H2O, CO2 y NH3) a doble enlaces.

- Ligasas: Catalizan la unión covalente de dos sustratos mediante el

acoplamiento a sustancias de alto valor energético como el ATP

14
 1.7. Mecanismo básico de acción de la enzima.

Todas las reacciones enzimáticas se realizan al menos en dos etapas, una

primera en la cual se produce el reconocimiento del sustrato y la unión física entre
la enzima (E) y el sustrato (S), que da origen al complejo enzima-sustrato (ES),
complejo reversible, etapa que se lleva a cabo en el sitio de reconocimiento, y una
segunda etapa donde se lleva a cabo la catálisis (modificación del sustrato),
dando origen al producto (P) y a la enzima libre que está en condiciones de volver
a iniciar el proceso, segunda etapa que se lleva a cabo en el sitio de catálisis(
figura1.5. )

Figura. 1.5. Representación del mecanismo básico de acción de las

enzimas.

Esta unión implica mantener juntas dos moléculas que presentan una estructura
complementaria desde el punto de vista espacial o químico o ambos, en un
complejo que se estabiliza por un número variable de interacciones débiles.

Los grupos catalíticos son los grupos que intervienen en la segunda etapa de
transformación; pero no obviemos que si la primera etapa no se realiza
satisfactoriamente, la segunda etapa se verá también afectada; pues no puede
haber una adecuada transformación si la unión ha sido deficiente.

1.8. Cinética enzimática

La función fundamental de la enzima es aumentar la velocidad de la reacción

química que ocurre en los seres vivos. El comportamiento de esta velocidad y su
modificación debido a la presencia de diferentes factores constituye objeto de
estudio de la cinética enzimática.

La velocidad de una reacción está determinada por las características

estructurales de la enzima y el sustrato; sin embargo existen una serie de factores
que pueden modificarla; estos son la concentración de la enzima, del sustrato, de
15
los cofactor, de los iones H+ (expresados como unidades de pH), así como la
temperatura, la presencia de inhibidores y activadores.

Efectos de la concentración de la enzima.

Si la concentración del sustrato está en exceso, a medida que aumenta la
concentración de la enzima se incrementa la formación del complejo enzima-
sustrato y por ende la transformación del sustrato (catálisis).(figura 1.6)

Figura 1.6. Representación gráfica del efecto de la concentración de la

enzima.

V maX

Velocidad
de la
reacción

1/2Vmax

Concentración de la enzima

La relación directamente proporcional que existe entre la velocidad de la

reacciones enzimática y la concentración de enzima permite la determinación de
la concentración de algunas enzimas en los líquidos o tejidos corporales;
constituyendo este principio la base para la determinación en los laboratorios
biomédicos de las concentraciones séricas de amilasa, transaminasas, quinasas,
peptidasas, láctico deshidroxigenasa, creatin quinasa, fosfatasa acida y alcalina
entre otras.

Este factor se debe tener en cuenta a la hora determinar la actividad de cualquier

enzima en el laboratorio biomédico, pues es de suma importancia su conocimiento
para que el médico pueda realizar un buen diagnóstico, ya que si se varia la
cantidad de suero o reactivo que describe el procedimiento técnico se corre el
riesgo de obtener un resultado por encima o por debajo de la cifra real que tiene el
paciente.

Efectos de la concentración del sustrato.

Al aumentar la concentración de sustrato en una reacción enzimética se produce
un aumento directo y proporcional de su velocidad, hasta un punto, a partir del
16
cual permanece constante, pues la enzima se satura de sustrato al llega un
momento en que determinada concentración de sustrato logra ocupar todos los
centros activos de las enzimas, por lo que si se aumenta la concentración del
sustrato la velocidad de la reacción no aumentará sino se mantendrá constante
(figura 1.7). Ello se debe tener en cuente en las determinaciones enzimáticas que
se realizan en el laboratorio; en estas la concentración del sustrato siempre se
mantiene en exceso para que haya suficiente para que con cualquier
concentración de enzima que tenga la muestra del paciente, siempre haya
sustrato para transformar, factor que debe tener en cuenta el bioanalista clínico
pues de añadir una cantidad de sustrato superior a la establecida en el
procedimiento técnico se estaría introduciendo un error por dilución de la muestra
al variar su volumen total; afectándose por ende el resultado final.

Figura 1.7. Representación gráfica del efecto de la concentración del

sustrato.

V maX

1/2Vmax

Efectos de la concentración de cofactores.

Existen enzimas que dependen solamente de su estructura proteica para
garantizar su actividad catalítica, mientras que atendiendo a su complejidad
funcional existe otro grupo numeroso que requiere de un complemento de
estructura no proteica, denominado cofactor para poder ejercer su actividad. Este
cofactor desempeña una función importante en la formación del complejo enzima-

17
sustrato, ya que su presencia le confiere a la proteína catalítica el efecto que esta
describe normalmente, y de hecho los cofactores participan en la reacción
enzimática como si fuesen sustratos; y por tal razón su comportamiento responde
a la cinética que caracteriza al sustrato. Por lo que la concentración de cofactores
suele tener un efecto similar a la concentración de sustrato, solo teniendo en
cuenta que esta vez la enzimas no se satura de sustrato sino de cofator.(figura
1.8)

Figura 1.8. Representación del efecto de la concentración de cofactores.

V maX

1/2Vmax

Efecto de la concentración de iónes H+(pH)

La mayoría de las enzimas presentan las características de presentar el máximo
de la actividad catalítica a un pH óptimo, disminuyendo su actividad a valores
superiores e inferiores de este (vea figura 1.9) ya que las variaciones del pH
puede modificar el estado de disociación de los grupos químicos presentes en la
enzima o en el complejo enzima-sustrato; afectándose la unión enzima-sustrato o
la transformación del sustrato en producto respectivamente. A valores extremos de
pH (cerca de 0 ó 14) puede producirse la desnaturalización de la enzima,
consecuencia ello de la naturaleza proteica de la enzima.

Las proteínas presentan diferentes estados de ionización de acuerdo con el pH del

medio. En el pH óptimo el estado de ionización de la enzima es el que permite que
se produzca una mejor unión de la enzima con el sustrato, un estado de ionización
18
de los grupos catalíticos del centro activo que hace más eficiente la catálisis o
ambos. A partir de ello cada enzima tiene su pH óptimo por lo que en las
determinaciones enzimáticas los sustratos vienen disueltos en una solución buffer,
que posibilita mantener el pH, por ello se debe tener cuidado de no contaminar el
reactivo, conservarlo en refrigeración y velar la fecha de vencimiento del mismo,
pues preservando el reactivo estamos garantizando que el pH no varíe y por lo
tanto que no se afecte la velocidad de la actividad enzimática.

Figura 1.9. Representación de la actividad enzimática en función del pH

Actividad

Enzimática pH óptimo

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 pH

Efecto de la temperatura.

En toda reacción química, el aumento de la temperatura produce un aumento de

la velocidad de la reacción enzimática, pues el aumento de la temperatura produce
una elevación de la energía cinética de las moléculas del sistema con lo que se
logra que haya mayor número de colisiones moleculares energéticamente
suficientes para desencadenar la reacción. Sin embargo al analizar el efecto que
provoca la temperatura sobre las reacciones enzimática debemos tener en cuenta
la naturaleza proteica de la enzima, que las hace susceptibles a los cambios de
temperatura (termolabilidad); provocando tanto el aumento como la disminución
de la temperatura, la ruptura de interacciones débiles que mantienen la estructura;
produciéndose una alteración de la estructura tridimensional; afectándose su
conformación nativa y en especial su centro activo; reduciéndose al mínimo su
actividad catalítica; existiendo por ello un rango de temperatura para el cual se
hace máxima la acción catalítica de la enzima, al cual se le denomina valor
temperatura óptima.(figura 1.10 ), Debido a ello este es un factor a tener presente
19
en las determinaciones enzimáticas que se realizan en el laboratorio, en las cuales
generalmente las muestras se incuban al baño de maría a 37ºC, lo cual debe
comprobarse con exactitud pues a valores superiores e inferiores de la
temperatura óptima, decrece la actividad catalítica, ya que se manifiestan dos
fenómenos respectivamente opuestos en las enzimas: la inactivación térmica
(desnaturalización por el calor) que disminuye considerablemente la velocidad de
la reacción hasta hacerla cero y la disminución de la movilidad molecular,
evitando este último que se produzcan las colisiones enérgicamente suficientes
para que se desencadene la reacción y ocurra la transformación del sustrato en
producto.

Figura 1.10 Representación de la actividad enzimática en función de la

temperatura

Actividad

Enzimática

o 370C 66oC Temperatura

(Temperatura óptima)

Por lo general, las enzimas ejercen su acción de forma óptima a temperaturas

inferiores a 40 °C; la congelación no destruye habitualmente las enzimas.

Presencia de los activadores

Como activadores se definen las pequeñas moléculas generalmente iones

inorgánicos que son requeridos o al menos estimulan, la actividad catalítica de una
enzima y al contrario de los cofactores no son participantes explícitos de la
reacción. La mayoría de los iones metálicos actúan como activadores de la
actividad enzimática; estos incluyen los microelementos y algunos
macroelementos. Así, el Cu, Fe, Mg, Ca, Zn, Mo, K, Na y otros, realizan esta

20
función. El mecanismo del efecto de los activadores puede ser diferente: unos
activan a la enzima, en cambio otros al sustrato

El efecto de la variación de concentración de los activadores es muy similar al de

la coenzima; la velocidad de reacción aumenta rápidamente al principio con el
incremento de la concentración hasta un punto máximo a partir del cual la
velocidad puede permanecer constante aunque generalmente decrece indicando
de nuevo un efecto inhibitorio. Los agentes que activan por extracción de metales
inhibidores pueden inhibirse a si mismos a altas concentraciones por extracción
de metales activadores y en otros caso la inhibición podría ser atribuida a cambios
iónicos. En el caso de la amilasa que es activada por los aniones cloruro, bromuro
y yoduro en orden decreciente, se encuentra un cambio en la curva de actividad
del pH, con un pH óptimo desplazado hacia el lado alcalino.

Presencia de los inhibidores.

Inhibidores son todas aquellas sustancias capaces de mostrar una interacción

con la enzima, provocando a su vez la disminución de su actividad catalítica,
incluso al extremo de que la velocidad de reacción de la enzima se anule
totalmente. La inhibición enzimática puede ser reversible o irreversible.

 La inhibición reversible es en la que el inhibidor forma con la enzima un

complejo enzima-inhibidor (EI) unido por fuerzas no covalentes. La
inhibición reversible puede clasificarse a su vez en competitiva y no
competitiva.

- La competitiva es en la cual al presentarse una similitud entre el

inhibidor y el sustrato natural de la enzima, ambos compiten por
unirse al centro activo de la enzima, no formándose el producto de
ganar el inhibidor esta competencia pues la enzima estará bloqueada
(figura 1.11), para normalizar ello solo bastará con aumentar la
concentración del sustrato.

21
Figura 1.11. En la inhibición competitiva se establece una competencia
entre el inhibidor y el sustrato por ocupar el centro activo.

Los inhibidores competitivos presentan un gran uso en la práctica médica, por

cuanto bloquean la acción enzimática en microorganismos, ya sean bacterias o
parásitos, no permitiendo el desarrollo y reproducción de los mismos; un ejemplo
de ello es la inhibición del ácido (P) aminobenzoico (PABA) por las sulfonamidas,
Las bacterias requieren PABA para formar ácido fólico( vitamina hidrosoluble); la
sustitución por las sulfamidas es fatal para ellas. En la práctica los inhibidores
competitivos son potentes quimioterápicos.

- En el caso de la no competitiva, el inhibidor tiene gran afinidad por

la enzima y se combina con esta por otro lugar que no es
precisamente el centro activo, pero se provoca una deformación en
la conformación espacial de la enzima que trae como resultado
una alteración de la actividad enzimática quedando la enzima
inactiva, pues aunque el sustrato logre unirse a la enzima no se
realizará la catálisis( figura 1.12 ); en este caso no depende de las
concentraciones relativas de sustrato ni del inhibidor.

22
Figura 1.12. En la inhibición no competitiva el inhibidor se une a la enzima
por el sitio alostérico provocando una deformación de la conformación
espacial de la enzima, que evita la unión satisfactoria entre la enzima y el
sustrato por lo tanto no se lleva a cabo la catálisis.

Como hemos visto anteriormente los inhibidores de las enzimas se dividen en dos
clases competitivos y no competitivos, puesto que la inhibición competitiva es
minimizada o abolida por el aumento de la concentración del sustrato, en el caso
de un inhibidor competitivo queda alterada la forma de la curva de
actividad/concentración de sustrato requiriéndose más elevada concentración de
sustrato para alcanzar la velocidad máxima, esto significa que en presencia de un
inhibidor competitivo resulta aumentada la Km(constante de Michaelis-Menten).
Aumentando la concentración de sustrato no se produce efecto sobre la inhibición
de tipo no competitiva por lo que en este caso permanece inalterada la Km. Por lo
tanto determinando la Km en presencia y en ausencia del inhibidor es posible
determinar si su modo de actuar es competitivo o no.

 La inhibición irreversible es en la que se establece entre la enzima y el

inhibidor una relación muy estable que impide la recuperación de la
actividad enzimática, lo cual no tiene nada que ver con el proceso de
desnaturalización y la enzima no se afecta estructuralmente. En éstas es
característico la unión covalentemente a la enzima y son útiles en
farmacología (penicilina, aspirina).

La acción de inhibidores afecta a determinadas enzimas entre los que podemos

encontrar a los detergentes y las sales de metales pesadas de ahí la importancia
de prestar extrema atención a la limpieza de la cristalería que se utiliza en la
determinación de la actividad enzimática en los laboratorios, prestando gran
atención a su enjuague y conservación de manera que quede libre de detergentes
y metales pesados.

23
La regulación de la velocidad de la reacción química por inhibidores y activadores
se pone de manifiesto en el metabolismo de productos farmacológicos; pues en
lugar de los receptores, algunos fármacos utilizan como diana las enzimas que
son las encargadas de regular la velocidad de las reacciones químicas. Un
ejemplo lo es la lovastatina, un fármaco que reduce el nivel de colesterol
endógeno, inhibe la HMG-CoA reductasa que es una enzima fundamental en la
producción del colesterol por el organismo. Mientras que, un efecto adverso es
producido por el antibiótico rifampicina, viene determinado por la activación de
las enzimas implicadas en el metabolismo de los anticonceptivos orales, pues
cuando una mujer que está tomando anticonceptivos orales, toma rifampicina de
forma simultánea, el anticonceptivo es metabolizado y eliminado del cuerpo con
más rapidez de lo habitual, y por lo tanto, su efecto puede ser ineficaz.

Efecto de las enzimas reguladoras.

Las enzimas reguladoras son enzimas que regulan el metabolismo celular

mediante formas especializadas de efectos regulatorios. Este tipo de efecto
determina el comportamiento general de los procesos metabólicos que conforman
la actividad que se lleva a cabo continuamente en las células y tejidos y está
representado por cuatro mecanismos: alostérico, modulación covalente, zimógeno
e isozinas.

Enzimas reguladoras por efecto alostérico.

Las enzimas reguladoras por efecto alostérico también conocidas como

enzimas alostéricas son aquellas cuya actividad catalítica está modulada por la
unión no covalente de un metabolito específico al sitio alostérico, denominado
efector alostérico, metabolito que provoca un cambio conformacional en la
molécula enzimática, que puede producir un aumento o disminución de la
actividad catalítica según sea el efecto, positivo (activadores) o negativo
(inhibidores). Estos efectores alostéricos no tienen efecto catalítico, sino
regulador de la actividad enzimática, convirtiéndose en el mecanismo de control
más rápido que posee la célula.

Las enzimas alostéricas se encuentran situadas al inicio de una secuencia

metabólica determinada y su actividad está regulada por la concentración del
sustrato inicial de la reacción, el cual se convierte en el modulador positivo ya
que la concentración del sustrato favorece el incremento de la velocidad de la vía
metabólica; por otra parte la actividad de la enzima puede estar regulada por la
concentración del producto final de la secuencia metabólica, convirtiéndose este
en el modulador negativo. Un ejemplo de ello lo tenemos en el comportamiento de

24
la fosfofructoquinasa la cual varía su velocidad al variar la concentración de
sustrato en sangre. La presencia de ATP disminuye la velocidad catalítica por lo
tanto actúa como un efector negativo(inhibidor), mientras que la concentración de
ADP aumenta la velocidad catalítica por lo tanto actúa como un efector
positivo(activador).Este tipo de regulación se denomina retro-inhibición. La
acumulación del producto final de la ruta hace que toda la ruta funcione más
lentamente. Un ejemplo de tal retro-inhibición es el sistema enzimático bacteriano
que cataliza la conversión de L- treonina en L-isoleucina. La primera enzima de
este sistema la treonina deshidratasa es inhibida por la isoleucina que es el
producto de la última reacción. La isoleucina es muy específica como inhibidora;
ningún otro intermediario de esta secuencia de reacciones inhibe la treonina
deshidratasa ni ninguna otra enzima es inhibida por la isoleucina, la unión de la
isoleucina es de tipo no covalente por lo que es reversible; si disminuye la
concentración de isoleucina aumenta la actividad de la treonina deshidratasa. De
este modo la actividad de la treonina deshidratasa responde rápida y
reversiblemente a las fluctuaciones de isoleucina en la célula.

Los moduladores de las enzimas alostéricas pueden ser inhibidores o

activadores. El propio sustrato es a menudo un activador y las enzimas en las que
el sustrato y modulador son idénticos se denominan homotrópicas. Cuando el
modulador es una molécula diferente de la del sustrato la enzima es heterotrópica.

Enzimas reguladoras por modulación covalente.

Las enzimas reguladoras por modulación covalente son aquellas cuya

actividad catalítica está condicionada por la acción de otras enzimas que permiten
la unión covalente o separación de un resto de ácido fosfórico o de adenilo en
otros casos, procedentes del ATP, lográndose así la interconversión reversible de
las formas activas e inactivas de las enzimas reguladoras; el ejemplo típico del
primer caso (unión covalente de un resto de ácido fosfórico) un ejemplo de ello
lo es la glucógeno fosforilasa que es activada por la incorporación de residuos
de ácido fosfórico, originando así la fosforilasa a (forma activa) y esta a su vez
puede pasar a la forma desfosforilada que es la fosforilasa b (forma menos activa);
la glucógeno fosforilasa es la enzima que regula la degradación del glucógeno en
los tejidos animales (hígado y músculo); como ejemplo del segundo tipo ((unión
covalente a un resto de adenilo) está la glutámico-sintetasa que pasa de la
forma activa a la inactiva mediante la unión o separación de residuos de adenilo a
su estructura.

25
Enzimas reguladoras por el efecto zimógeno.
Los zimógeno son precursores inactivos de algunas enzimas que son activados
mediante mecanismos relativamente específicos, en el momento adecuado,
siendo sintetizados en una forma que no poseen actividad catalítica garantizando
que no actúen hasta que las condiciones del medio sean las propicias; como
ejemplo de estas proenzimas está en el jugo gástrico el pepsinógeno, en el jugo
pancreático el tripsinógeno, quimotripsinógeno, proelastasa y procarboxipeptidasa,
las cuales son activadas mediante un fenómeno de proteólisis parcial de la cadena
polipeptídica que libra un fragmento peptídico que mantiene bloqueado el centro
activo en el zimógeno.
Dado que este tipo de activación es irreversible se necesitan otros mecanismos
para inactivar estas enzimas. Las enzimas proteolíticas son inactivadas por
proteínas inhibidoras que se fijan muy fuertemente al centro activo de la enzima.
El inhibidor de tripsina pancreática se fija a la tripsina inhibiéndola; la alfa 1-
antiproteinasa inhibe principalmente la elastasa. La insuficiencia de alfa 1
antiproteinasa que se cree debida a la exposición al humo del tabaco produce
lesión pulmonar y una enfermedad conocida como enfisema.

Otros ejemplos de activación de zimógeno se dan en las hormonas, tejido

conjuntivo y sistema de coagulación de la sangre. La hormona insulina se produce
por rotura de la pro-insulina, el colágeno se sintetiza originalmente en forma de un
precursor soluble denominado pro-colágeno y la coagulación de la sangre
transcurre a través de una compleja cascada de activaciones de zimógenos

Enzimas reguladoras por la diferencia en sus formas moleculares

(isoenzimas o isozimas).

Las isoenzimas o isozimas son enzimas que difieren en la secuencia de

aminoácidos, pero que catalizan la misma reacción química suelen mostrar
diferentes parámetros cinéticos o propiedades de regulación diferentes. En
particular, las sustituciones de aminoácidos que cambian la carga eléctrica de la
enzima (por ejemplo, la sustitución de ácido aspártico con ácido glutámico) son
fáciles de identificar por electroforesis en gel, constituyendo esto la base para el
uso de las isoenzimas como marcadores moleculares.

Las isoenzimas constituyen un grupo de enzimas específicas que presentan más

de una forma molecular, a pesar de poseer la misma función catalítica; su
característica es que poseen varias subunidades estructurales en las cuales la
composición y secuencia aminoacídica puede ser diferente en cada una de estas,
por lo que los valores de sus puntos isoeléctricos difieren y en ello se basan los
métodos de detección y separación de estas mediante la electroforesis en geles.
26
Las isoenzimas: son diferentes formas moleculares de una misma enzima que
pueden encontrarse en distintos tejidos y cuyo estudio puede tener importancia
clínica. Cada isoenzima tiene actividad diferente con cada sustrato, como por
ejemplo: La creatinfosfoquinasa es una enzima que está formada por dos
moléculas: una M y otra B. Estas moléculas se pueden combinar de varias
maneras formándose entonces tres isoenzimas que son las: CPK – MB ; CPK –
BB ; CPK – MM. Otro ejemplo de izoenzima es la glucoquinasa, una variante de
hexoquinasa que no es inhibida por la glucosa-6-fosfato. Sus diferentes funciones
de regulación y su menor afinidad por la glucosa (en comparación con otros
hexoquinasas), le permiten tener diferentes funciones en las células de
determinados órganos, como el control de la liberación de insulina por las células
beta del páncreas, o la iniciación de la síntesis de glucógeno por las células del
hígado.

1.9. Ejercicios de Comprobación del Capítulo 1

1. Seleccione verdadero (V) o Falso (F) según corresponda y subraye la

palabra que determine su selección falsa.

a) ____Las enzimas se caracterizan por presentar bajo poder catalítico.

b) ____ Los grupos de fijación catalizan la transformación del sustrato
en producto.
c) ____ Los grupos de ambientación se relacionan directamente con la
etapa de catálisis.
d) ____Un inhibidor competitivo puede ser desplazado del centro activo
de la enzima a elevadas concentraciones de sustrato.
e) ____ Las enzimas alostéricas existen en dos estados
conformacionales.
f) _____ Las enzimas reguladas por modulación covalente requiere de la
acción de otra enzima que cataliza su unión o separación del resto de
ácido fosfórico

2. Seleccione verdadero (V) o Falso (F) según corresponda. Justifique los

falsos.

a) ___ Los grupos de fijación establecen con el sustrato interacciones

covalentes.
b) ___ En la etapa de reconocimiento se forma el complejo ES.
c) ___ Los grupos fijadores son cadenas laterales de polipéptidos.
d) ____ Un inhibidor no competitivo se introduce en el sitio alostérico de la
enzima.
e) ____ Los mecanismos de modulación covalente está asociados con el
sustrato o el producto de la reacción.
27
f) ____ Las enzimas pueden catalizar cualquier tipo la reacción.

3. Complete los espacios en blanco teniendo en cuenta las características de

los biocatalizadores y de los procesos metabólicos.

a Al ARN con actividad catalítica se le conoce como__________

b Las enzimas cuya función esta relacionada con catalizan la ruptura de
enlaces químicos ______________
c La concentración de la enzima en la reacción es directamente
proporcionas a su ____________
d Los biocatalizadores tienen la propiedad de aumentar la velocidad de
la __________
e A la parte donde la enzima se une al sustrato se le
llama_____________
f El estudio de las isoenzimas tiene gran importancia clínica pues estas
son ______________

4. El uso de los biocatalizadores en el laboratorio tiene gran importancia por

las características de los mismos.

a) Argumente la afirmación anterior

5. Complete los espacios en blanco teniendo en cuenta las características de

los biocatalizadores y de los procesos metabólicos.

a) Las enzimas que transfieren grupos químicos se clasifican como

_____________
b) En las reacciones químicas al intervenir un biocatalizador se disminuye su
__________
c) La catálisis se lleva a cabo en el ___________
d) Las enzimas juegan un importante papel en las pruebas que se llevan a
cabo en el laboratorio por su___________
e) La enzima es un biocatalizador de naturaleza____________

28
 6. Las enzimas son biocatalizadores cuyas propiedades han acelerado su uso
en los laboratorio biomédicos

a) Mencione las propiedades de la enzima y explique una de ellas

b) Algunos biocatalizadores para realizar su función requieren de cofactores.
¿Cómo se les llama a las enzimas una vez que están unidas a su cofactor,
según el sustrato al que esta se una?
c) ¿Qué importancia le atribuyes al conocimiento de los factores que puedan
afectar la estructura, propiedad y función de los biocatalizadores, para su
buen desempeño profesional?

7. Complete los espacios en blanco teniendo en cuenta las características de

los biocatalizadores y de los procesos metabólicos.

a) En las reacciones químicas donde intervienen enzimas al aumentar la

velocidad esta pone de manifiesto su propiedad _________
b) Los anticuerpos con actividad catalítica son ___________
c) A las enzimas que intervienen en la ínter conversión de isómeros se les
nombra ___________
d) La complementariedad geométrica se pone de manifiesto en __________
e) El eje peptídico, los grupos de ambientación y los grupos de fijación
garantizan la unión __________
f) A los precursores inactivos de algunas enzimas que son activados
mediante un fenómeno de proteólisis parcial se les
nombra__________________

8. Selecciones verdadero (V) o Falso (F) según corresponda: y convierta los

Falsos en Verdaderos.

a) ___ Las enzimas se caracterizan por presentar un elevado poder catalítico

b) ___ El eje peptídico no permite la entrada de agua (H20) al centro activo
c) ___ Los grupos de fijación catalizan la transformación del sustrato en
producto
d) ___ Los grupos de ambientación se relacionan directamente con la etapa de
unión.
e) ___ Los grupos de fijación establecen con el sustrato interacciones no
covalentes
f) ___ La complementariedad eléctrica se establece entre los grupos del centro
activo y el sustrato
g) ___ En la etapa de transformación se forma el complejo ES
h) ___ Los grupos fijadores son cadenas laterales de aminoácidos apolares
i) ___ El eje peptídico está relacionado con la complementariedad geométrica
o espacial.
j) ___ Los grupos catalíticos están relacionados con la etapa de unión
29
9. Seleccione verdadero (V) o falso (F) según corresponda y subraye la
palabra que determine su selección falsa.
a) ___ El pH óptimo de las enzimas es 7,4, por ser el pH fisiológico.
b) ___ La velocidad máxima (Vmax) es la velocidad de reacción cuando
toda la enzima presente está formando el complejo ES.
c) ___Un inhibidor competitivo puede ser desplazado del centro activo de
la enzima al elevarse la concentración del sustrato.
d) ___ En una inhibición no competitiva el valor de Km se mantiene y
el de Vmax disminuye.
e) ___La velocidad máxima (Vmax) se relaciona con la especificidad de
sustrato de la enzima.
f) ___ Cuando se aumenta la concentración de H+, la velocidad de la
reacción enzimática se incrementa directa y proporcionalmente

10. Seleccione verdadero (V) o falso (F) según corresponda. Y justifique los
falsos

a) __ Los efectores se unen a la enzima por su centro activo.

b) __ Generalmente los mecanismos de modulación covalente
está asociados al fenómeno de amplificación.
c) __ Las enzimas de modulación covalente tienen una forma en la
que poseen un grupo fosfato unido por enlace covalente
d) __ Los activadores son participantes explícitos de la reacción
enzimática
e) __ En una vía metabólica generalmente la primera enzima es
alostérica y uno de sus efectores negativos o inhibidor es el
producto final de la vía
f) __ El aumento de la temperatura en una reacción es
directamente proporcional a su velocidad.
g) ___ Las isoenzimas son enzimas con más de una forma
molecular que presentan los mismo valores de puntos
isoeléctricos.
h) ___ Las enzimas alostéricas presentan otros sitios diferentes
del centro activo por donde se une el efector.
i) __ El ADP es un inhibidor alostérico de la enzima isocítrico
deshidrogenasa constituyendo el ATP producto de su acción.
j) __ La activación de los zimógenos es reversible
k) __ La forma activa de las enzimas reguladas por modulación
covalente es la desfosforilada.
l) __ En la inhibición irreversible se establece entre la enzima y el
inhibidor una relación que impide la recuperación de la actividad
enzimática

30
CAPÍTULO 2. USO DE LAS ENZIMAS EN EL LABORATORIO BIOMÉDICO.

Muchas enzimas son utilizadas en los laboratorios biomédicos con fines

diagnósticos; clasificándose estas atendiendo a sus características según su
uso en: enzimas como medio de diagnóstico o índice de enfermedad y enzimas
como herramientas de trabajo o reactivos químicos.

2.1. Las enzimas como medio de diagnóstico o índice de enfermedad.

Estas son enzimas internas que se utilizan como marcadores de lesión celular,
utilizadas para el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de enfermedades.

2.1.1 Las enzimas como medio de diagnóstico o índice de enfermedad en el

Laboratorio Clínico.

El interés de los clínicos por las enzimas séricas comenzó hace más de medio
siglo, con la demostración de la utilidad de la determinación de los niveles de
fosfatasa alcalina en el diagnóstico de las enfermedades óseas y hepatobiliares;
de los niveles de fosfatasa ácida en el diagnostico del carcinoma de la próstata, y
de los de amilasa y lipasa en el diagnóstico de las pancreatitis.

Pese a ello el interés clínico de la enzimología sérica no aumento hasta el año

1953 en el cual se demostró la presencia de una transaminasa(la TGO) en el
suero de individuos normales observándose que el aumento de sus niveles eran
útiles para el diagnostico de enfermedades cardiacas y hepáticas. Actualmente
son más de 50 las enzimas identificadas en suero, estudiándose sus niveles y
aplicándose pruebas para algunos problemas clínicos que se consideran como
procedimientos habituales en el laboratorio.

Todas las enzimas séricas tienen su origen en las células, muchas proceden de
numerosos tejidos, entre ellas la aldosa, la láctico deshidrogenasa, la
fosfohexoisomerasa, la málisco deshidrogeneasa entre otras. Por otra parte,
también se pueden encontrar enzimas con distribución hística como la ornitil
carbamil transferasa y alcohol deshidrogenasa que se halla casi exclusivamente
en el hígado.

En muchas enfermedades orgánicas las enzimas aumentan su salida de su lugar

de origen por el incremento de la permeabilidad de las membranas celulares o por
la pérdida de la estructura celular; originándose así las modificaciones del nivel
enzimático en el plasma sanguíneo, de indudable valor diagnóstico.

A continuación se describen algunos procedimientos en los cuales se contemplan

detalles y particularidades de cada examen de química clínica en lo que se refiere
31
a generalidades, indicaciones, modalidad de solicitud, preparación del paciente,
modalidad de la toma de muestra, transporte, conservación, verificación de la
muestra, metódicas de determinación con relativas interferencias, valores de
referencia, criterio de validación y el modo de escribir los resultados; pues muy
pocas enzimas son específicas de un solo tejidos, por esa razón en ciertas
ocasiones se debe determinar como alternativas más de una enzima (por
ejemplo “perfil hepático”).

 Enzima Amilasa
Generalidades
La amilasa es una hidrolasa que cataliza la división de los enlaces glicósido α(1-
4) de los polisacáridos vegetales ( hidrolisis del almidón a destrina) y animales
(hidrolisis del glucógeno a glucosa)
La amilasa se produce en el páncreas (isoamilasa P) , las glándulas salivales, y
en pequeña concentración, en el hígado y las trompas de Falopio ( isoamilasa S )
esta es eliminada rápidamente por el riñón debido a que es una molécula
pequeña. Los valores de referencia de la amilasa en suero: < 89 U/L (< 1,48
μkat/L) y en orina < 220 U/L.

Procedimiento del método cinético

Mezclar 2mL de reactivo amilasa con 30 μL de la muestra e incubar a 37 °C
durante 1 min. Leer la variación de absorbancia de la muestra (ΔDO/min) durante
3 min contra agua purificada a 405 nm a 37 °C. Calcular la actividad de la α
amilasa
Cálculo de la atividade de la amilasa
U/L = DO/min x 4640
Donde
U/L= Atividade de la αamilasa en la muestra
DO/min = Variación de absorbancia de la muestra por minuto..
4640 = Factor de actividad enzimática
Para las muestras de orina se multiplicará el resultado por 2.
(Se debe comprobar el factor, con los controles, cada vez que se realice por
primera vez el procedimiento).

Fundamento o principio del método

La amilasa presente en la muestra se encarga de la hidrólisis directa del sustrato
CNP-G3 (2-cloro-4- nitrofenil-α-maltotriosido) para producir CNP (2-cloro-4-
nitrofenol) que al liberarse produce un color amarillo cuya concentración, medida
espectrofotométricamente a 405 nm a partir del incremento ocurrido en la
absorbancia, es proporcionar a la actividad de la α-amilasa presente en la
32
muestra, por lo que es un método cinético colorimétrico cuya reacción se muestra
a continuación:

α- amilasa
5CNP-G3 3CNP + 2CNP – G2 +3 Maltotriosido + 2 Glucosa

CNP- G3 = (2-cloro-4-nitrofenil-α-maltotriosido)
CNP = 2-cloro-4-nitrofenol
CNP – G 2 = 2-cloro-4-nitrofenol-α-maltosa

Otros metódos para la determinación de la amilasa

- Método del amilo clásico
La medida de la actividad de la enzima se efectúa con metódicas basadas sobre la
disminución o desaparición de la concentración del sustrato con medida
turbidimétrica; viscosimétrica; colorimétrica yodo, almidón.

- Método sacarogenético
La medida de la actividad de la enzima se efectúa con metódica basada sobre la
producción de azúcar reductora.

Patologías asociadas
La determinación de la amilasa es de importancia fundamental en el diagnóstico
de las enfermedades pancreáticas como la pancreatitis aguda, crónica y en
neoplasia del páncreas; en estos casos la amilasa suele aumentar entre la 5-6
horas después de la sintomatología clínica alcanzando valores de 10-30 veces
mayor de los normales; descendiendo entre las 24 y 30 horas a valores séricos
normales, aumentando sus niveles en orina entre las 24 y 48 horas después por el
aumento de su excreción urinaria, persistiendo la hiperamilasuria 3 o 5 días, luego
de que la actividad sérica de la amilasa ha alcanzado los niveles normales; debido
a que la amilasa es una molécula pequeña que puede se depurara rápidamente
por los riñones.

El incremento sérico de la amilasa también esta relacionado con enfermedades

como la parotiditis, úlcera péptica perforada, apendicitis, rotura de un ectópico,
aneurisma diseminado de la aorta, insuficiencia renal, colecistitis aguda,
exacerbación aguda de la pancreatitis crónica, obstrucción del conducto
pancreático, alcoholismo (intoxicación), obstrucción intestinal; mientras que su
disminución esta relacionada con hepatitis, cirrosis hepática, toxemia del
embarazo y quemadura severa.

33
Materiales
Guantes descartables no estériles, tubos de ensayo 16 x 100 mm, puntas de
pipeta 10-50 ul, puntas de pipeta 50-200 ul, puntas de pipeta 200-1000 ul, puntas
de pipeta 1000-5000 ul.

Equipos
Centrífuga, espectrofotómetro, baño maría, reloj marcador, pipetas automáticas
10-50 ul, pipetas automáticas 50-200 ul, Pipetas automáticas 200-1000 ul, Pipetas
automáticas 1000-5000 ul.

Control de calidad
Se deberán usar sueros, control normal y patológico, en las mismas condiciones
que las muestras.

Verificar el resultado
- Si el valor de la amilasa es ≥1000-2000 U/I, repetir la medida.
- Si el valor del resultado repetido es el mismo, se puede entregar.
- Si el valor del resultado repetido es diferente, procesar nuevamente
la muestra utilizando un control patológico.
- Con valores de amilasa ≥ de 1500 U/I, repetir la medida, sea
concentrada y diluida ½ con solución fisiológica con un control
patológico.
- Si está dentro los rangos establecidos, se puede entregar el
resultado.
- Si el suero diluido no está en relación con el suero concentrado, diluir
la muestra 1/4, 1/8, 1/16 con solución fisiológica, siempre usando el
control patológico.

Notas sobre la metódica

Linealidad: La metódica es lineal hasta 1500 U/I.
Sensibilidad 7.0 U/I.
EspecificidadLa metódica es específica para la amilasa total y para todas las
isoamilasas (P, S).
InterferenciasHemólisis: Con Hb ≥2.0 g/l; Ictérico: bilirrubina ≥20.0 mg/dl.
El citrato y el fluoruro inhiben la reacción. El ácido ascórbico ≥30 mg/dl.
Valor de referencia: en orina menor a 220 U/L
Suero: < 89 U/L (< 1,48 μkat/L)

34
Criterio de validación
Confrontar con lipasa, calcio, funcionalidad del hígado. Controlar parámetros de
procesos inflamatorios. Controlar glucosa y metabolismo glucídico. Y los
resultados se escriben sin cifras decimales.

Comunicación de riesgo
Se tiene que comunicar inmediatamente, con valores 800.0 U/I
 Enzima Transaminasa (TGO-AST)
Generalidades
La transaminasa glutámica oxalacética (TGO) o aspartato aminotransferasa (AST)
pertenece al grupo de las transaminasas, las cuales catalizan lat trasferencia del
grupo amino (NH2) de un aminoácido a su respectivos α ceto-ácido. La AST
tienen su localización celular en mitocondrias y citoplasma por ello es una enzima
bilocular; esta se encuentra en cantidad elevada en muchos tejidos como el
cardiaco y el hepático hígado y corazón, también se le puede hallar en el
músculo, riñón, cerebro, páncreas, eritrocitos, leucocitos, pulmón y bazo pero sin
gran significación clínica. Cualquier alteración de estos tejidos produce un
aumento en los niveles de AST circulante cuyos valores de referencia oxidan
entre los 46 U/L.

Procedimiento del método

Mezclar 2 mL de reactivo con 200μL de muestra e incubar a 37 °C durante 1
min. Medir la variación de densidad óptica por minuto (ΔDO/min) durante 3 min
contra el blanco a 340 nm

Cálculo de la actividad de AST:

Actividad (U/L) = ΔDO/min x 1746
Donde:
Actividad (U/L): actividad de AST de la muestra.
ΔDO/min: variación de densidad óptica obtenida en los 3 min
1746: factor de actividad enzimática

Fundamento
La AST cataliza la transferencia de un grupo amino entre el L-aspartato y el 2-
oxoglutarato que a su vez reacciona con el NADH en presencia de la malato
deshidrogenasa (MDH) para formar NAD+. La actividad de AST se determina al
medir la oxidación de NADH a 340 nm (ó 334) lo cual se cuantifica
espectrofotométricamente, según las reacciones que se describen a continuación:
AST
35
L- aspartato + α-cetoglutarato oxalacetato + L-glutamato
MDH
oxalacetato + NADH + H+ L-malato +NAD+ +H2O

. El reactivo empleado para la determinación, también contiene lactato

deshidrogenasa que se encarga de convertir el piruvato endógeno de la muestra
en lactato durante la fase inicial previa a la determinación

AST = Aspartato-aminotransferasa
NADH = Dihidronicotinamida-adenina-dinucleótido
MDH = Malato deshidrogenasa
NAD+ = Nicotinamida-adenina-dinucleótido.

Patologías asociadas
Si la concentración de la enzima en el suero es moderada, ésta proviene del
citoplasma y, en menor medida, de las mitocondrias; si la concentración de la
enzima está elevada en relación con fenómenos lesivos y necróticos de la célula,
proviene en mayor medida de las mitocondrias, los valores más elevados de la
AST se relacionan con los procesos necróticos del órgano.
La determinación de la AST es útil en presencia de un informe dudoso de
electrocardiograma.

El aumento de la AST esta relacionado con patologías como el Infarto del

miocardio (4 a 10 veces el valor normal paralelo al aumento de la CPK), arritmia
severa, angina severa, hepatitis aguda; Cirrosis activa; necrosis hepática;
Carcinoma primario o metastásico; MNI más HVA (10 a 100 veces de lo normal) y
otras enfermedades: como la pancreatitis aguda; anemia hemolítica aguda;
quemadura severa; embolia pulmonar; enfermedades renal aguda, distrofia
muscular progresiva; gangrena, hipertermia maligna, trauma e irradiación de
músculo esquelético. La AST puede aumentar en el envenenamiento por hongos
(Amanita falloide), o por la absorción de algunos fármacos (isoniazide, rifampicina
y algunos antibióticos). Por otra parte la disminución de la concentración de la
ASAT entra relacionado con embarazo, beriberi y diabetes mellitus con acidosis.

En el infarto agudo de miocardio, se observa un aumento moderado de la enzima

a las 6 u 8 horas de ocurrido el episodio, alcanza niveles máximos alrededor de
las 48 horas y retorna a la normalidad entre el 6to y el 4to día. En los pacientes
con afecciones hepáticas se observan las mayores elevaciones de AST, sobre
todo en los casos de hepatitis con necrosis; con la determinación de la AST se
mide la intensidad de la lesión hepática.
36
Muestreo
Suero. Estable de 4 a 8 0C durante 7 días).

Modalidad de solicitud
La modalidad de solicitud puede ser de carácter emergente y rutina (ayuna), con
previa preparación del paciente, sin ninguna particularidad en la toma de muestra,
verificar la idoneidad de la muestra en lo que es la identificación y cantidad,
ictericia, hemólisis, lipemia, presencia de coágulos, filamentos de fibrina, turbidez.
Señalar eventualmente en el resultado la no idoneidad de la muestra; transportar a
temperatura ambiente; Centrifugar a 3000 r.p.m por 5 mnts y separar del suero; la
toma de muestra se puede conservar por 1 día a temperatura ambiente de 20-
25oC, 7 días a + 4oC, 1 año congelada.

Metódicas de determinación (cinético)

La enzima aspartato aminotransferasa (AST) o glutámico-oxalacética (TGO)
cataliza la transferencia del grupo amino del aspartato al cetoglutarato, formando
oxalacetato y glutamato. La concentración catalítica se determina empleando la
reacción acoplada de la malato deshidrogenasa (MDH), a partir de la velocidad de
desaparición del NADH. Tras el infarto, hay una liberación de proteínas
intracelulares de las células dañadas. La primera en ser detectada es la troponina
(5-10 h post infarto), seguida de la CK-MB (pico a 1 día), y finalmente la LDH, cuyo
máximo se alcanza a los 2-3 días post infarto.
Reactivos: R1: AST/Buffer y R2: AST/NADH

Aplicación
Para la determinación de Aspartato-aminotransferasa en suero por método
enzimático. " IN VITRO".

Control de Calidad
Se deberán usar sueros, control normal y patológico, en las mismas condiciones
que las muestras.
Verificar el resultado
- Si el valor de la AST es ≥300.0 U/L, repetir la medida.
- Si el valor del resultado repetido es el mismo, se puede entregar.
- Si el valor del resultado repetido es diferente, procesar nuevamente
la muestra utilizando un control patológico.
- Con valores de AST ≥ de 800 U/L, repetir la medida, sea
concentrada y diluida 1/2 con solución fisiológica y con un control
patológico.
37
 - Si
- la confrontación del valor concentrado está sobrepuesto al suero
diluido y el control está dentro el rango establecido, se puede
entregar el resultado.
- Si el suero diluido no está en relación con el suero concentrado, diluir
la muestra ¼ o 1/8 con solución fisiológica, siempre usando el control
patológico.

Notas sobre la metódica

Linealidad: lineal hasta 800.0 U/L.
Sensibilidad: 4.0 U/L.
Especificidad: es específica para la AST.
Interferencias, Las más significativas son: Hemólisis: con Hb ≥ 6.0 g/l.
Ictericia: con bilirrubina ≥ 60.0 mg/dl. Lipemia: con triglicéridos ≥ 1000.0 mg/dl.
Muchos fármacos (cefalosporina, cloranfenicol, rifampicina, isoniazide,
alfametildopa) pueden dar valores elevados.
Criterios de validación
Controlar el valor de otras enzimas de los parámetros cardíacos (CPK,
mioglobina, CK-MB, CK–MB masa, troponina).
Confrontar con analitos de funcionalidad hepática (ALT, GGT, TP, colinesterasa,
electroforesis de proteína, parámetros de hepatitis A, B, C).
Controlar eventual estado tóxico (alcoholemia, colinesterasa).
Confrontar con pruebas de funcionalidad musculares (CPK, aldolasa). Y los
resultados se escriben sin cifra decimal.

Comunicación de riesgo
Se tiene que comunicar inmediatamente con valores superior a 300.0 U/L.

Notas: Las muestras hemolizadas no deben usarse, ya que los eritrocitos

presentan 7 veces más la actividad de ALAT en suero, y el fosfato de piridoxal
puede elevar los niveles de la ALAT por activación de la apoenzima a partir de la
transaminasa. Dicho reactivo puede encontrarse en agua contaminada por
crecimiento microbiano. Así mismo, los niveles elevados de piruvato en suero,
pueden interferir con el desempeño de la prueba. Young y colaboradores, han
publicado una lista de drogas que interfieren en la determinación de la actividad de
la ALT. Por otro lado, los reactivos contienen preservativos y otras sustancias que
pueden ser dañinos. No ingerirlos y evitar contactos con piel y mucosas.

38
Control de calidad
Todos los sueros control con valores de ASAT determinados por este método
pueden ser empleados.

 Enzima Transaminasa (TGP-ALT)

Generalidades

La alanina aminotransferasa (ALT) o transaminasa glutámica pirúvica(TGP)

pertenece al grupo de las transaminasas, las cuales catalizan lat trasferencia del
grupo amino (NH2) de un aminoácido a su respectivos α ceto-ácido. La ALT
tienen su localización celular en el citoplasma de las células del parénquima
hepático por ello es una enzima unicular, la ALT se encuentra en cantidad
elevada en el tejido hepático, y en pequeña cantidad en el músculo, en el corazón
y en el riñón, es por ello que en el daño celular leve, los valores de la ALT son más
elevados y permanecen mayor tiempo aumentado respecto a la AST. El valores
de referencia de la ALT oscila entre los 49 U/L.

Procedimiento del método

Mezclar 2 mL de reactivo con 200μL de muestra e incubar a 37 °C durante 1
min. Medir la variación de densidad óptica por minuto (ΔDO/min) durante 3 min
contra el blanco a 340 nm

Cálculo de la actividad de AST:

Actividad (U/L) = ΔDO/min x 1746
Donde:
Actividad (U/L): actividad de AST de la muestra.
ΔDO/min: variación de densidad óptica obtenida en los 3 min
1746: factor de actividad enzimática

Fundamento o principio del método

El piruvato formado en la primera reacción se reduce a lactato en presencia del

lactato deshidrogenasa (LDH) y NADH; siendo la oxidación de este último
proporcional a la actividad de la ALT, la cual se cuantifica por espectrofotometría
a 340 nm (ó 334). según las reacciones que se describen a continuación:

ALT
L- alanina + α-cetoglutarato Piruvato  L-glutamato

LDH
39
Piruvato + NADH + H+ Lactato + NAD+ + H 2 O

ALT = Alanina-aminotransferasa
NADH = Dihidronicotinamida-adenina-dinucleótido
LDH = Lactato deshidrogenasa
NAD+ = Nicotinamida-adenina-dinucleótido

Patologías asociadas
La ALT se encuentra aumentada en la hepatitis viral aguda alcanzando valores
superiores a los de la TGO, debido a que la extensión de la lesión celular es
amplia, pero la lesión de la célula individual es ligera. En el caso de hepatitis
virales, el aumento de ALT precede a la aparición de ictericia, alcanzando un nivel
máximo luego de la observación de dicho síntoma. De persistir aumentados los
valores después de 6 semanas ello se relaciona con una hepatitis crónica, con la
determinación de la ALT se mide la extensión de la lesión hepática.

Muestreo
La solicitud puede ser de carácter emergente o de rutina (ayuna), con previa
preparación del paciente, sin ninguna particularidad en la toma de muestra,
verificar la idoneidad de la muestra en lo que es la identificación y cantidad,
ictericia, hemólisis, lipemia, presencia de coágulos, filamentos de fibrina, turbidez.
Señalar eventualmente en el resultado la no idoneidad de la muestra; transportar a
temperatura ambiente; Centrifugar a 3000 r.p.m por 5 mnts y separar del suero; la
toma de muestra se puede conservar por 1 día a temperatura ambiente de 20-
25oC, 7 días a + 4oC, 1 año congelada.

Metódica de determinación (Cinético)

Se emplea los reactivos- ALT/bufer y ALT/NADH Para la determinación de
Alanina-aminotransferasa en suero por método enzimático. "PARA USO
INVITRO". Lineal hasta 600.0 U/L y específica para la determinación de TGP con
una sensibilidad de 4,0 U/L.

Control de Calidad
Se deberán usar sueros, control normal y patológico, en las mismas condiciones
que las muestras.

40
Verificar el resultado
- Si el valor de la ALT es 300.0 U/L, repetir la medida.
- Si el valor del resultado repetido es el mismo, se puede entregar.
- Si el valor del resultado repetido es diferente, procesar nuevamente
la muestra, utilizando un control patológico.
- Con valores de
concentrada y diluida 1/2 con solución fisiológica y con un control
patológico.
- Si la confrontación del valor concentrado está sobrepuesto al suero
diluido y el control está dentro el rango establecido, se puede
entregar el resultado.
- Si el suero diluido no esta en relación con el suero concentrado, diluir
la muestra 1/4, 1/8 con solución fisiológica, siempre usando el control
patológico.

Interferencias
Las interferencias más significativas son: Hemólisis con Hb ≥6.0 g/l;
Ictericia  con triglicéridos ≥1000.0 mg/dl;
Muchos fármacos (cefalosporina, cloranfenicol, rifampicina, isoniazide,
alfametildopa) pueden dar valor elevado.

Criterios de validación
- Confrontar con analitos de funcionalidad hepática (AST, GGT, TP,
colinesterasa, electroforesis de proteína, parámetros de hepatitis A,
B, C).
- Controlar eventual estado tóxico (alcoholemia, colinesterasa).
- Confrontar con pruebas de funcionalidad musculares (CPK,
aldolasa).
- Controlar parámetros serológicos para la mononucleosis infecciosa y
para citomegalovirus.
- Controlar parámetros de las enzimas cardíacas (CPK, mioglobina,
CK-MB, CK–MB masa, troponina).

Modo de escribir los resultados

La ALT se escribe sin cifra decimal.

41
Semiología

Aumento: Enfermedades hepatocelulares (de moderado a elevado incremento),

Cirrosis activa (incremento medio), Neoplasia hepática, ictero obstructivo,
Pancreatitis, Delirium Tremens, quemadura severa, trauma, shock, Hepatitis tóxica
e infecciosa, Mononucleosis infecciosa, Infarto agudo del miocardio (puede no
aumentar), por lo que, La determinación de la ALT está relacionada con las
enfermedades del hígado. La ALT se encuentra muy elevada en las diferentes
hepatitis virales (A, B, C, delta, E) con valores 20-50 veces más elevados con
respecto a los valores de referencia. La ALT aumenta también en la
mononucleosis infecciosa y citomegalovirus. Se puede verificar leve aumento de
ALT en las miopatías, colagenopatía, hemopatía y pancreopatía.
Es útil el reporte de AST/ALT:
- En la obstrucción extrahepática, el aumento principal es el de la ALT.
- En la cirrosis, neoplasia del hígado, ictero hemolítico; en la hepatitis
alcohólica, el aumento de la ALT es inferior a la AST.

Disminución: Aspirina o salicilatos.

Comunicación de riesgo
Se tiene que comunicar inmediatamente con valores superiores a 300.0 U/L.

 Enzima Deshidrogenasa Láctica

Generalidades

La lactato deshidrogenasa cataliza la oxidación anaeróbica de la glucosa por vía

glucolítica (dehidrogenación del ácido láctico con formación de ácido pirúvico),
estas se hallan presente en todos los tejidos, particularmente en el músculo
cardíaco y el esquelético, hígado y riñón.
La enzima en circulación es una mezcla de 5 isoenzimas, las cuales difieren en su
movilidad electroforética y sus pH óptimos.
- LDH-1 18-33 % : miocardio, eritrocitos, cerebro, músculos y riñón.
- LDH-2 24-40 % : miocardio, eritrocitos, cerebro, músculos y riñón.
- LDH-3 18-30 % : riñón y cerebro.
- LDH-4 6-16 % : hígado, músculos, riñón y pulmón.
- LDH-5 2-13 % : hígado, músculo, riñón y pulmón.

El valores de referencia de la LDH oscila entre los 250-580 U/L en niños y 230-
460 U/l en adultos

42
Procedimiento del método
Mezclar 1 mL de reactivo con la muestra e incubar a 37 °C durante 1min. Leer la
variación de absorbancia de la muestra (ΔDO/min) durante 3 min contra agua
purificada a 340 nm a 37 °C

Cálculo de la concentración de LDH

(U/L) = ΔDO/min x 8095
Donde:
U/L: Actividad enzimática de LDH en la muestra
(ΔDO/min) = Variación de absorbancia de la muestra por minuto
8095: Factor de actividad enzimática.

Fundamento o principio del método

La L-lactato-deshidrogenasa (LDH) cataliza la reacción reversible de piruvato a
lactato, en presencia de coenzima niacin adenin dinucleótido reducido
dinucléotido de Nicotinamida y adenina(NADH), siguiendo el siguiente esquema
de reacciones:
LDH

Piruvato + NADH + H+ Lactato + NAD+

pH 9,0

NADH  dinucléotido de Nicotinamida y adenina, forma reducida.

NAD+  dinucléotido de Nicotinamida y adenina, forma oxidada.

La actividad de la enzima es proporcional a la oxidación del NADH la que se

cuantifica por la disminución de la densidad óptica en la medida que va
transcurriendo la reacción hasta 3 mnts.

Patologías asociadas
Por tanto, La determinación de la actividad de lactato deshidrogenasa (LDH) en
suero, tiene una gran variedad de aplicaciones clínicas. En el caso del infarto
agudo de miocardio (IAM), la actividad de LDH total junto con las de CK y GOT
constituye un elemento importante de diagnóstico. La misma comienza a aumentar
de 12 a 24 horas después de producido el infarto; alcanza un pico entre las 48-72
horas y permanece elevada hasta el 7mo o 10mo día. Por otra parte, también se
registra un aumento de la actividad de LDH total en pacientes con necrosis
hepática (producida por agentes tóxicos o por infecciones agudas como la
hepatitis viral)

43
La determinación del LDH en el suero está indicada en el monitoreo del infarto del
miocardio aumentando 10 veces los valores normales permanece elevado por un
largo período ofreciendo así la posibilidad de hacer el diagnóstico del infarto
regresando a la normalidad después de 7–15 días. La LDH también se emplea en
el diagnóstico y monitoreo de enfermedades del hígado (hepatitis viral, cirrosis,
carcinoma metastásico).
La actividad de la LDH se encuentran también aumentada en algunas hemopatías
(anemia perniciosa, crisis hemolítica, etc.), en las neoplasias malignas, en caso de
enfermedad reumática, en las leucemias agudas y crónicas, en el infarto cerebral,
en el linfoma maligno y en la pericarditis tuberculosa.

Muestreo
Suero. Estable durante 48 horas a 2-8 0C.

Modalidad de solicitud
La solicitud puede ser de carácter emergente o de rutina (ayuna), con previa
preparación del paciente, sin ninguna particularidad en la toma de muestra,
verificar la idoneidad de la muestra en lo que es la identificación y cantidad,
ictericia, hemólisis, lipemia, presencia de coágulos, filamentos de fibrina, turbidez.
Señalar eventualmente en el resultado la no idoneidad de la muestra; transportar a
temperatura ambiente; Centrifugar a 3000 r.p.m por 5 mnts y separar del suero; la
toma de muestra se puede conservar por 1 día a temperatura ambiente de 20-
25oC, 4 días a + 4oC, 6 semanas congelada.

Control de Calidad
Se deberán usar sueros, control normal y patológico, en las mismas condiciones
que las muestras.

Verificar el resultado
- Si el valor de la LDH es < 100.0 U/L y ≥ 800.0 U/L, repetir la medida.
- Si el valor del resultado repetido es el mismo, se puede entregar.
- Si el valor del resultado repetido es diferente, procesar nuevamente
la muestra utilizando un control patológico.
- Con valores de LDH ≥ de 1200 U/L, repetir la medida, sea
concentrada y diluida 1:2 con solución fisiológica y con un control
patológico.
- Si la confrontación del valor concentrado está sobrepuesto al suero
diluido y el control está dentro el rango establecido, se puede
entregar el resultado.

44
 - Si el suero diluido no está en relación con el suero concentrado, diluir
la muestra 1/4, 1/8 con solución fisiológica siempre usando el control
patológico.

Interferencias
Las interferencias más significativas son: Hemólisis con Hb  2.0 g/l;
Ictericia con bilirrubina  60.0 mg/dl; Lipemia con triglicéridos  1000.0 mg/dl y
también el paracetamol puede interferir.

Criterios de validación
- Controlar el valor de otras enzimas de los parámetros cardíacos
(CPK, TGO, mioglobina, CK-MB, CK–MB masa, troponina).
- Confrontar con analitos de funcionalidad hepática (TGP, GGT, TP,
colinesterasa, electroforesis de proteína, parámetros de hepatitis A,
B, C).
- Controlar eventual estado tóxico (alcoholemia, colinesterasa).
- Controlar parámetros tumorales.
- Controlar biometría hemática completa.
- Confrontar con pruebas de funcionalidad musculares (CPK,
aldolasa).
-
Modo de escribir los resultados
La LDH se escribe sin cifra decimal.

Semiología

Aumento: Infarto del miocardio: La elevación de la LDH en el infarto del miocardio

es caracterizada por: altos niveles (2 a 10 veces por encima de lo normal) en las
12 a 24 horas del infarto. La elevación continúa en los 6 a 10 días (más que la
TGO y la CPK), por tal razón es utilizada para el diagnóstico tardío del infarto;
retornando a la normalidad entre los 8 y 14 días, Infarto pulmonar: Usualmente
hay un incremento de la LDH a las 24 horas de iniciado el dolor.

Condiciones generales del incremento en los niveles

- Incremento importante (2 a 40 veces) en anemias megaloblásticas;
Shock y anoxia; Cáncer; infarto de miocardio (LDH1), hepatitis
víricas (LDH4, LDH5)
- Incremento moderado (2 a 4 veces) en Infarto miocardio; Infarto
pulmonar; Leucemia granulocítica; Anemia Hemolítica;

45
 Mononucleosis infecciosa; Distrofia muscular progresiva, accidente
cerebro-vascular, 5´ nucleotidasa (NTP)
- Incremento ligero en delirium Tremens, hepatitis, cirrosis, íctero
obstructivo, mononucleosis, hemólisis, shock y anoxia, La angina y la
pericarditis no producen elevación de la LDH.
- Elevación urinaria en el Cáncer de riñón o de próstata,
Glomerulonefritis, Hipertensión maligna, Lupus nefrítico, Necrosis
tubular aguda, Transplante renal, Pielonefritis(a veces).

La disminución es una buena respuesta a la terapia contra el cáncer.

Comunicación de riesgo
Se tiene que comunicar inmediatamente con valores superior a 800.0 U/L

 Enzima γ-glutamil transferasa (GGT)

Generalidades

La γ-glutamil transferasa (GGT) es una enzima del grupo de las peptidasas, las
cuales catalizan el rompimiento hidrolítico de los péptidos para formar
aminoácidos o péptidos más pequeños. Específicamente, la GGT cataliza la
transferencia de grupos -glutamil de péptidos de distinto tamaño, hacia
moléculas aceptoras de péptidos. Aún cuando los niveles más elevados de GGT
están localizados en los tejidos renales, la fuente de las enzimas presentes en
suero es de origen hepático. tambien está presente en muchos órganos como el
riñón, páncreas, pulmón, bazo, intestino y tiroides. Por ser la GGT una enzima de
membrana ampliamente distribuida en el organismo su actividad es influenciada
por cualquier factor que afecte a las membranas celulares de los órganos que la
contienen. El valor de referencia de la GGT oscila en mujeres de 5 a 32 U/L
(0,083 a 0,533 μKat/L) y en hombres de 10 a 45 U/L (0,1667 a 0,750 μKat/L)

Procedimiento técnico del método

Mezclar 2mL de reactivo con 200 μL de muestra e incubar a 37 °C durante 1 min.

Leer la variación de absorbancia de la muestra (ΔDO/min) durante 3 min contra
agua purificada a 405 nm a 37 °C.

Cálculo de la concentración de la GGT

(U/L) = ΔDO/min x 1158
Donde:
U/L: Actividad enzimática de GGT en la muestra
(ΔDO/min) = Variación de absorbancia de la muestra por minuto
1158: Factor de actividad enzimática

46
Fundamento o principio del método
La γ-glutamiltransferasa (GGT) cataliza la transferencia del grupo glutamilo de la
L-γ-glutamil-3- carboxy-p-nitroanilida (GLUPA C) a la glicilglicina, con la formación
del ácido 5-amino-2-nitrobenzoico, de acuerdo a la siguiente reacción:

GGT
GLUPA C + glicilglicina L-γ-glutamil-Glicilglicina + ácido 5-amino-2-
nitrobenzoico

El ácido 5-amino-2-nitrobenzoico formado es proporcional a la actividad de GGT

presente en la muestra y su determinación se efectúa por espectrofotómetro a 405
nm.

Patologías asociadas
Los niveles elevados de esta enzima están asociados con desórdenes
hepatobiliares y pancreáticos; también se presentan en alcohólico. En el caso de
alteraciones hepáticas, la GGT generalmente es índice de agresión tóxica
adquiriendo valor clínico su determinación cuando es comparado con los de otras
enzimas de mayor especificidad, siendo por tanto útil para el diagnóstico y
seguimiento de las patologías hepáticas.
El aumento más elevado de la GGT se encuentra relacionado con la obstrucción
de las vías biliares, su determinación es importante en el diagnóstico de la
metástasis hepática, para la identificación del alcoholismo y para el monitoreo de
la abstinencia al alcohol en la terapia de desintoxicación.

Muestreo

Suero- estable durante 8 h a 15 0C ó 3 días a 2-8 0C, o un mes a –20 0C.

Modalidad de solicitud
La solicitud puede ser de carácter emergente o de rutina (ayuna), no es necesario
la previa preparación del paciente, sin ninguna particularidad en la toma de
muestra, verificar la idoneidad de la muestra en lo que es la identificación y
cantidad, ictericia, hemólisis, lipemia, presencia de coágulos, filamentos de fibrina,
turbidez. Señalar eventualmente en el resultado la no idoneidad de la muestra;
transportar a temperatura ambiente; Centrifugar a 3000 r.p.m por 5 mnts y
separar del suero; la toma de muestra se puede conservar por 3 día a temperatura
ambiente de 20-25oC, en 7 días a 2- 4oC y 1 año en congelada.

47
Modo de escribir los resultados
La –GT se escribe sin cifra decimal

Interferencias
Las interferencias más significativas son: Hemólisis con Hb 1.5 g/l; Ictericia
con bilirrubina 40.0 mg/dl; Lipemia con triglicéridos 2000.0 mg/dl; Muchos
antibióticos pueden dar valores elevados.

Criterios de validación
- Confrontar con analitos de funcionalidad hepática.
- Confrontar con parámetros de estasis biliar (bilirrubina, fosfatasa
alcalina).
- Controlar eventual estado tóxico (alcoholismo).
- Controlar eventual absorción de terapia con antibióticos.
- Controlar parámetros serológicos para la mononucleosis infecciosa y
el citomegalovirus.

Semiología
Aumento: Colecistitis, Colelitiasis, Cáncer metastásico del hígado, Cirrosis
hepática, Pancreatitis, Cáncer de los conductos biliares, Alcoholismo, Uso de
barbitúricos, Obstrucción del tracto biliar.
- Aumento importante en hepatitis vírica, obstrucción biliar, metástasis
hepáticas, enfermedades alcohólicas.
- Aumento moderado en infecciones que afectan al hígado
(citomegalovirus, mononucleosis infecciosa).

 Enzima Creatina quinasa (CK o CPK)

Generalidades
La creatina quinasa cataliza la reacción reversible entre creatina y ATP, para
formar fosfato de cretina y ADP. La creatina-quinasa (CK o CPK) es una enzima
intracelular localizada en mayor proporción en músculos cardíaco y esquelético y
también en cerebro, pudendo encontrarse tres principales isoenzimas con formas
moleculares distintas ( CK – MM; CK – MB y CK – BB) distribuidas de tal forma
que exista cantidades elevadas de CK en músculos esqueléticos casi
exclusivamente, bajo la fórmula de CK-MM, y con pequeñas cantidades de CK-MB
(1-3.0%), en el cerebro y el intestino; en la vejiga, está presente como enzima CK–
BB. En el músculo cardíaco, están bien representadas dos de las tres isoenzimas
citoplasmáticas, la CK–MM y la CK-MB.

48
La CK se encuentra distribuida en varios órganos, registrándose su actividad más
alta en músculo esquelético, corazón y cerebro.

El valor de referencia de la CK o CPK oscila en mujeres de 24 a 170 U/L y en

hombres de 24 a 195 U/L

Procedimiento del método

Mezclar 1 mL de reactivo con 40 μL de muestra e incubar a 37 °C durante 2 min.
Leer la variación de absorbancia de la muestra durante 3 min contra agua
purificada a 340nm a 37 °C.

Cálculo de la concentración de CK
U/L = ΔAbs/min x 4127
Donde:
U/L: Actividad enzimática de CK en la muestra
ΔAbs/min: Variación de la absorbancia de la muestra por minuto
4127: Factor de actividad enzimática

Fundamento o principio del método

La creatina quinasa cataliza la fosforilación del ADP por el fosfato de creatina a
ATP. La concentración catalítica de la CK se determina empleando las reacciones
acopladas de la hexoquinasa y glucosa 6-fosfato deshidrogenasa, a partir de la
velocidad de formación del NADPH a 340 nm según el esquema de reacciones:

Creatina-quinasa
Creatina fosfato + ADP Creatina + ATP

Hexocinasa
ATP + Glucosa ADP + Glucosa 6 fosfato

Glucosa-6-fosfato-
1-deshidrogenasa
Glucosa 6 fosfato + NADP Gluconato 6 fosfato + NADPH + H+

Patologías asociadas
La determinación de la actividad enzimática de la creatina quinasa total ayuda en
el diagnóstico de distrofias musculares y otras enfermedades del músculo
esquelético, permite el diagnóstico presuntivo del infarto (IAM); también está
presente en patologías relacionadas con afecciones gastrointestinales, renales, en
mujeres en estado de gestación, problemas de próstata, hígado, entre otros.

49
 En el infarto del miocardio agudo (IMA), la CPK aumenta precozmente
normalmente después de 4-6 horas a partir de la sintomatología, alcanzando los
máximos niveles entre las18-24 horas; disminuyendo entre los 3-4 días. El interés
de esta determinación es que sirve para el diagnóstico precoz del infecto que se
puede confirmar con la AST.

Muestreo
Suero, plasma heparinizado ó con EDTA)
La solicitud puede ser de carácter emergente o de rutina (ayuna) explicando
obligatoriamente el diagnostico, con previo preparación del paciente en el sentido
de evitar el estrés muscular en los días antes de la toma de la muestra, verificar la
idoneidad del muestreo en lo que es la identificación, hemólisis, lipemia, presencia
de coágulos, filamentos de fibrina, turbidez. Señalar eventualmente en el resultado
la no idoneidad de la muestra; transportar a temperatura ambiente; Centrifugar a
3000 r.p.m por 5 mnts y separar del suero; la toma de muestra se puede
conservar por 1 día a temperatura ambiente de 20-25⁰C, 10 días en la oscuridad a
+ 4⁰C, se inactiva en congelación.

Metódica de determinación: (cinética UV y procedimiento analítico)

Se emplea los reactivos- CK/HK y CK/G6PDH Para la determinación de LA creatin
cinasa en suero por método enzimático por espectrofotometria a 340 nm. "PARA
USO INVITRO". Lineal en un rango de la concentración de la CK de 10 a 1800.0
U/L y específica para la determinación de CK, sensible hasta 5,0U/L.

Interferencias
Hemólisis: con Hb  1.0 g/l (muy sensible).
Ictérico: bilirrubina  60.0 mg/dl (poco significativo).
Lipemia: triglicéridos  1000.0 mg/dl

Criterio de validación
Controlar todos los otros parámetros cardíacos: LDH, TGO, CPK-MB, mioglobina y
troponina.
Confrontar parámetros musculares: LDH, aldolasa.
Controlar parámetros de funcionalidad hepática: TGP, GGT, TP, colinesterasa,
parámetros de hepatitis A y B.
Controlar eventuales parámetros tóxicos (alcoholemia y colinesterasa).
Controlar parámetros tumorales.
50
Modo de escribir los resultados
La CPK se escribe sin cifras decimales.

Comunicación de riesgo
Se tiene que comunicar inmediatamente con valores ≥ 400.0 U/L.

Semiología:

Aumento: Infarto del Miocardio (4 a 6 horas), Otras enfermedades que producen

incremento de la CPK: Enfermedades cerebro-vasculares agudas, Distrofia
muscular progresiva (de 300-400 veces lo normal), Dermatomiositis, Delirium
tremens, Alcoholismo crónico, Shock eléctrico, Mixedema, Cirugía cardiaca,
Desfibrilación cardíaca, Convulsiones, infarto cerebral, isquemias, o hemorragias
subaracnoidea, Hipotiroidismo, Psicosis aguda, Trauma del sistema nervioso
central, Infarto o edema pulmonar.

 Enzima Creatina quinasa, Isoenzima MB(CK-MB)

Generalidades
La creatina quinasa(CK) es una enzima intramuscular constituida por una
subunidad M (músculo) y otra subunidad B que se combinan dando lugar a las
isoenzimas CKMM (muscular), CKBB (cerebral) y CKMB (miocárdica). Por su vez
la CK-MB está formada por las subunidades CK-B y CK-M. La fracción CK-M está
inhibida por un anticuerpo específico que no influye en la fracción CK-B. La
restante actividad de esta fracción que corresponde a la actividad de la CK-MB es
determinada mediante técnica cinética. El valor de referencia de la CK-MB se
calcula a partir de la siguiente fórmula:

(CK-MB x 100)
% CK-MB =----------------------: 6-25%
Total CK

Procedimiento del método

Mezclar 1mL de reactivo con 40 μL e incubar a 37 °C durante 2 min y leer la

variación de absorbancia de la muestra durante 3 mina 340nm contra agua
purificada a 37 °C

Cálculo de la concentración de CK-MB.

U/L = ΔAbs/min x 8254

51
Donde:
U/L: Actividad de CK-MB en la muestra
ΔAbs/min: Variación de absorbancia de la muestra por minuto
8254: Factor de actividad enzimática

Fundamento o principio del método

La determinación de CK-MB en suero se basa en la inhibición específica de las
subunidades CK-M por anticuerpos policlonales anti CK-MM. Los anticuerpos
inhiben tanto la isoenzima MM como las subunidades M correspondientes a la CK-
MB. La determinación de la actividad enzimática de las subunidades B se realiza
midiendo la velocidad de formación de NADPH a 340 nm según el esquema de
reacciones siguiente:

Creatina-quinasa
Creatina fosfato + ADP Creatina + ATP

Hexocinasa
ATP + Glucosa ADP + Glucosa 6 fosfato

Glucosa-6-fosfato-
1-deshidrogenasa
Glucosa 6 fosfato + NADP Glucosa 6 fosfato + NADPH + H+

Patologías asociadas
La elevación sérica de CK y de CK-MB constituye un indicador de injuria (
disminución del riego sanguínea )de miocardio. Este tipo de isoenzima se
encuentra en las células del músculo cardíaco siendo un marcador fundamental en
las cardiopatías; también es posible detectarla en inflamaciones y enfermedades
musculares degenerativas, shock, hipotiroidismo, psicosis aguda y en las mujeres
inmediatamente después del parto. Esta determinación compete especialmente a
las especialidades de cardiología y endocrinología. Con este producto es posible
realizar estudios de pronóstico, diagnóstico y/o seguimiento de una enfermedad o
condición clínica específica.

Metódica de determinación
Cinética inmunológica y procedimiento analítico

52
Criterio de validación
El CK-MB, la troponina y la mioglobina son los parámetros más importantes en el
diagnóstico del infarto al miocadio agudo; menor importancia la tiene la TGO y
LDH, y algunos factores de la coagulación, como el fibrinógeno. Debido a que la
CK-MB está presente de modo particular en el miocardio, su mayor aumento del
6.0% del CK total indica la presencia de un daño a cargo del miocardio.

Comunicación de riesgo
Se tiene que comunicar inmediatamente con valores  100.0 U/L y/o además el
25.0% del CK- total. En caso que la fracción MB sea superior al CK- total,
comunicar al médico para verificar si existe una condición patológica que justifique
ese resultado.

Observaciones
Antes de la determinación de la CK-MB, se determina la actividad de la CPK total,
para asegurar correctamente la interpretación diagnóstica del resultado. Diluir las
muestras, 1/10, si son superiores a 1000 U/l. En los restantes puntos de la
descripción, se debe seguir las mismas instrucciones como en la CK-total.

 Enzima Fosfatasa Alcalina (AP)

Generalidades
La fosfatasa alcalina es un grupo de enzimas que cataliza la hidrólisis del
ligamiento estérico, entre álcali y ácido fosfórico, con liberación de fosfato
inorgánico. La de origen humano hidroliza todos los monoésteres ortofosfóricos.
Esta enzima está presente en casi todos los tejidos y fluidos humanos,
especialmente en los huesos, mucosa intestinal, hígado, bazo, pulmones, riñón y
tiroides. Los niveles normales de fosfatasa alcalina dependen de la edad,
incrementándose sus concentraciones durante el período de crecimiento de
huesos, oscilando sus valores de referencia de 180 a 1200 U/L en niños y de 100
a 290 U/L en adultos. La AP en el adulto proviene en parte del hígado y en parte
del hueso, sistema reticuloendotelial y vascular, dando lugar a distintas
isoenzimas.

Procedimiento del método

Mezclar 2mL de reactivo con 40 de la muestra e incubar a 37 ºC durante 1 min.
Medir la variación de densidad óptica por minutos (ΔDO/min) durante 3 min a 37
ºC contra el blanco a 405 nm.

53
Cálculo de la actividad de Fosfatasa Alcalina
Actividad (U/L) = ΔDO/min x 2750
Donde:
Actividad (U/L): actividad de Fosfatasa alcalina en la muestra.
ΔDO/min: variación de densidad óptica obtenida en los 3 min.
2750: factor de actividad enzimática.

Se debe comprobar el factor, con los controles, cada vez que se realice por
primera vez el procedimiento

Fundamento o principio del método

La AP cataliza la hidrolisis del p-nitrofenilfosfato, produciendo p-nitrofenol y ácido
fosfórico inorgánico. La reacción se interrumpe con hidróxido de sodio que
convierte el p-nitrofenol en ión paranitrofenilato. La actividad de la AP en la
muestra es proporcional al p-nitrofenol obtenido el cual se determina
espectrofotométricamente según las reacciones que se describen a continuación:

AP
p-nitrofenilfosfato + H2O----------------- p- nitrofenol + fosfato inorgánico

Patologías asociadas
El aumento de la fosfatasa alcalina se encuentra en:
Enfermedad del hígado por un aumento de la fracción hepática por obstrucción de
la vía biliares; hepatopatías celulares; hepatopatía obstructiva.
Enfermedad ósea por un aumento de la fracción ósea, debido a la incrementada
actividad; de los osteoblastos (raquitismo, enfermedad de Paget,
hiperparatiroidismo, osteomalacia, neoplasia del tejido óseo, trauma o fracturas
ósea).
Por ello, una elevación moderada de ALP no atribuida a hígado o huesos, puede
deberse a la enfermedad de Hodgkins, e infecciones bacterianas abdominales.

La disminución de la fosfatasa alcalina se origina en la disminución del magnesio,

porque éste es el ión necesario para la actividad de la fosfatasa alcalina. Por tanto,
Entre las patologías que afectan la actividad sérica de fosfatasa alcalina, se
pueden citar: carcinomas metastásicos en hígado y en hueso (productores de
enzimas), colestasis biliar, fenómenos osteoblásticos, trastornos de malabsorción
acompañados de lesiones ulcerosas e incluso lesiones en vías de reparación tales
como infarto agudo de miocardio, infarto pulmonar o renal.
Muestreo
Suero- evitar anticoagulantes como citratos, oxalatos y EDTA
54
La solicitud es solamente de carácter rutinaria en ayuna , con previo preparación
del paciente en el sentido de evitar el estrés muscular en los días antes de la toma
de la muestra, verificar la idoneidad del muestreo en lo que es la identificación,
hemólisis, lipemia, presencia de coágulos, filamentos de fibrina, turbidez. Señalar
eventualmente en el resultado la no idoneidad de la muestra; transportar a
temperatura ambiente; Centrifugar a 3000 r.p.m por 5 mnts y separar del suero; la
toma de muestra se puede conservar por 2 día a temperatura ambiente de 20-
25⁰C, 7 días en la oscuridad a 2 - 4⁰C, 4 semanas en congelación a -20⁰C.

Método de determinación
Ensayo cinético optimizado. Metódica DGKC)
Se emplea los reactivos- FAL /Dietanolamina y : FAL/p-nitrofenilfosfato Para la
determinación de Fosfatasa alcalina en suero por método enzimático por
espetrofotometria UV a 405 nm. "PARA USO INVITRO". Lineal en un rango de la
concentración de la FAL de 10 a 700.0 U/L y específica para la determinación de
FAL.

Interferencias
Las interferencias más significativas son:
Hemólisis: c
glóbulos rojos); Ictericia: con bilirrubina ≥60.0 mg/dl;
Lipemia: con triglicéridos ≥2000.0 mg/dl; La presencia de oxalato, citrato y EDTA
puede disminuir la actividad de la fosfatasa alcalina por la pérdida de iones de
magnesio.

Criterios de validación
Controlar la edad del paciente; Confrontar con funcionalidad del hígado
(transaminasa, TP, colinesterasa), parámetros de estasis biliares (bilirrubina,
GGT), parámetros del metabolismo óseo (calcio, fósforo), el valor del magnesio;
Controlar eventual estado tóxico (alcoholismo) y los parámetros de hepatitis.
Los resultados se escriben sin cifras decimales.

Control de calidad
Todos los sueros control con valores de ALP determinados por este método
pueden ser empleados.

55
  Enzima Fosfatasa Ácida (SP)
Generalidades
La fosfatasa ácida está constituida por un grupo de enzimas, las cuales hidrolizan
los esteres fosfóricos en ambiente ácido. El pH óptimo de la actividad enzimática
oscila entre 4.8 – 6.0. La de origen humano hidroliza todos los monoésteres
ortofosfóricos. La concentración más elevada de la SP se localizándose en la
próstata donde las glándulas prostáticas secretan cerca de 100 veces más que
en otros tejidos bajo el estímulo de la testosterona. Normalmente, la fosfatasa
ácida se encuentra en el plasma sólo en pequeña cantidad, proveniente de los
glóbulos rojos y plaquetas.
Los valores de referencia de la SP para mujeres pueden alcanzar hasta 4.2 U/l y
en hombre hasta 5.4 U/l.

Procedimiento del método

Mezclar y esperar 5 minutos a 37 0C. Anotar la lectura a 405 nm y poner en
marcha el cronómetro. Repetir la lectura a 1, 2 y 3 minutos. Calcular el valor medio
del aumento de extinción por minuto (E/min).

Cálculo
Fosfatasa Ácida Total (U/l)= E/min x 750
Fosfatasa Ácida Prostática (U/l)= (E/min fosfatasa ácida total - E/min
fosfatasa ácida. No inhibida por tartrato) x 750
(Se debe comprobar el factor, con los controles, cada vez que se realice por
primera vez el procedimiento).

Fundamento principio del método cinético colorimétrico

La SP a pH 5.0 cataliza la hidrólisis de el  naftilfosfato o fosfato inorgánico a 
naftol el cual se hace reaccionar con una sal de diazonio (Fast Red TR),
formándose el cromogeno azoico; compuesto coloreado cuya concentración es
proporcional a la actividad de la SP, midiéndose su absorbancia a 405 nm.

- naftilfosfato + H2O ---------  naftol + fosfato

- naftol + Fast Red TR --------------- cromogeno azoico

Patologías asociadas
La determinación de la fosfatasa ácida está correlacionada a las enfermedades
neoplásicas de la próstata, especialmente en los enfermos con metástasis ósea.
Se puede encontrar aumento de la fosfatasa ácida en: alteraciones de los
eritrocitos (anemias), alteraciones de los leucocitos (leucemia), alteraciones de las
plaquetas, cáncer metastásico de próstata y en hiperparatiroidismo.
56
Muestreo
Solamente suero, no el plasma

Modalidad de solicitud
La solicitud es solamente de carácter rutinaria en ayuna, con previo preparación
del paciente en el sentido de evitar el estrés muscular en los días antes de la toma
de la muestra, verificar la idoneidad del muestreo en lo que es la identificación,
hemólisis, lipemia, presencia de coágulos, filamentos de fibrina, turbidez. Señalar
eventualmente en el resultado la no idoneidad de la muestra; transportar a
temperatura ambiente; Centrifugar a 3000 r.p.m por 5 mnts y separar del suero;
Ejecutar el examen cuantos antes o añadir el ácido acético. La toma de muestra
se puede conservar por 2 día a temperatura ambiente de 20-25⁰C, 8 días a 4⁰C,
2 meses en congelación a -20⁰C.

Metódica colorimétrica y procedimiento de determinación

Ensayo cinético colorimétrico. Método de Hillmann modificado.

Notas: Los demás procederes coinciden con los de la Fosfatasa alcalina.

Particularidades
Enzimas séricos en la enfermedad cardiaca
- Creatín fosfoquinasa (CPK) < 160 U/L (Isoenzima “mb”); Láctico
deshidrogenasa (LDH) < 120-230 U/L; isoenzima 1 (15-25%);
Aspartato aminotransferasa (AST; GOT) < 40 U/L
Enzimas séricos en la enfermedad hepática
- Alanina aminotransferasa (ALT; GPT) < 50 U/L; Aspartato
aminotransferasa (AST; GOT) < 40 U/L; Lactato deshidrogenasa <
90 U/L (isoenzima 5); γ glutamil transpeptidasa (GGT) < 50 U/L;
Fosfatasa alcalina < 70 U/L; Fosfatasa ácida < 0.6 U/L; 5’
nucleotidasa < 5 U/L.

2.1.2 Las enzimas como Medio de Diagnóstico en el Laboratorio de

Anatomía Patológica.

Los términos histoquímica y citoquimica (citohistoquímica) se emplean

generalmente para indicar los métodos de localización de diversas moléculas en
los cortes de tejidos. Dichos métodos se basan en reacciones químicas
específicas o en la interacción macromolecular de alta afinidad. En ambos casos,
el resultado final consiste en la producción de compuestos insolubles, teñidos o
57
electrodensos que permiten localizar sustancias especificas en los cortes de los
tejidos (iones de hierro, fosfatos, ácidos nucleídos, células, lípidos, glúcidos,
glicoproteínas, enzimas y etc) con el empleo de la microscopia óptica o
electrónica.

La histoquímica enzimática se basa en la determinación de enzimas tisulares

mediante reacciones químicas de oxidación reducción a diferencia de la
inmunohistoquímica que se basa en la reacción antígeno-anticuerpo.

Entre las técnicas de inmunohistoquímica de tinción histológica o inmunotinción

esta la inmunohistoquímica enzimática en la cual las enzimas son utilizadas
para el marcaje de anticuerpos pues estas se pueden detectar mediante la
utilización de sustratos y cromógenos que dan lugar a productos coloreados
insolubles, que forman un precipitado en el lugar en el que se encuentra el
anticuerpo.

Entre los cromógenos posibles a utilizar en la inmunohistoquímica enzimática se

encuentran la diaminobenzidina (color pardo), el aminoetilcarbazol (color rojo) y
el nitroazul de tetrazolio (color azul).

A continuación se describe a modo de ejemplo tres enzimas detectables por

métodos citohistoquimicos, tanto por microscopio óptico o electrónico:

 Enzima Fosfatasa ácida

Generalidades

La fosfatasa ácida es una enzima que se halla en los riñones, en el suero, en el

semen y su mayor concentración se halla en la próstata. Se eleva en el cáncer de
próstata y en los traumatismos. Uno de los métodos para detectar la actividad de
la fosfatasa acida es el de Gomori, que consiste en incubar cortes de tejidos
fijados en formol en una solución que contiene glicerofosfato sódico y nitrato de
plomo en tampón con pH 5,0.

Fundamento del método

Gracias a la acción de la enzima que produce la hidrólisis del glicerolfosfato con

liberación de iones fosfatos que reaccionan con el nitrato de plomo formando
fosfato de plomo insoluble, que se precipita en el lugar donde hay actividad
enzimática. En una segunda fase del método se procede a sumergir los cortes en
una solución de sulfato de amonio que transforma el precipitado incoloro de

58
fosfato de plomo en un precipitado negro y electrodenso de sulfato de plomo. Este
método se utiliza mucho para localizar lisosomas que son orgánulos ricos en
fosfatasa alcalina.

 Enzima Deshidrogenasas

Generalidades

La deshidrogenasas son enzimas que extraen el átomo de hidrogeno de un

sustrato, transformándolo en otro compuesto (procesos de oxidación). Hay
muchas deshidrogenasas diferentes que se distinguen por la naturaleza del
sustrato sobre el que actúan, y desempeñan un papel importante en el
metabolismo celular.

La demostración histoquímica de estas se realiza en cortes de tejidos no fijados en

una solución que contiene el sustrato adecuado y tetrazol, compuesto receptor de
H y claramente teñidos.

Fundamento del método

Bajo la acción de la enzima, el sustrato cede hidrogeno que es transferido al

tetrazol, reduciéndolo a un compuesto fuertemente teñido e insoluble
denominado formazana que precipita en el de la actividad enzimática. De esta
manera se puede visualizar la actividad de la succinodeshidrogenasa, enzima muy
activa del ciclo de Krebs.

 Enzima Peroxidasa

Generalidades

Es una enzima que está presente en diferentes tipos celulares, estimula la

oxidación de ciertos compuestos por el peróxido de hidrogeno (agua oxigenada).

Principio del método

Se produce la transferencia de iones de hidrogeno al peróxido de hidrogeno

formándose moléculas de agua. Por ejemplo al incubar cortes de tejidos
adecuadamente fijados en 3-3”diaminoazobencidica (DAB) en presencia de agua
oxigenada, el DAB es oxidado produciéndose una sustancia insoluble, teñida y
electrodensa. Por tratarse de una enzima extremamente activa en un corto
intervalo de tiempo se producen cantidades apreciables de precipitado insoluble.
59
Por tanto, con este método pueden localizarse las estructuras con actividad
peroxidásica tanto al microscopio óptico o electrónico y es un método muy
sensible.

La técnica de DAB es la más utilizada en histoquimica, ya que permite por ejemplo

dectetar peroxidasas en los leucocitos , lo que facilita el diagnóstico de las
leucémias, y en las técnicas de inmunohistoquimica como marcadores y en
hibridacion molecular.

Revelado de la Peroxidasa

Uno de los paso a desarrollar en la técnica de inmunohistoquimica enzimática

de vital importancia lo es el revelado de la peroxidasa, para lo cual se mescla el
sustrato agua oxigenada (H2O2) con el cromógeno diaminobenzidina (DAB) que
al oxidarse hace que la benzidina deje un pigmento pardo oscuro que será el color
que tomara el sitio de la reacción antígeno-anticuerpo. Como se observa a
continuación:

Por tanto en las técnicas de inmunohistoquimica, el anticuerpo se conjuga a la

peroxidasa para catalizar la reacción con el antígeno posibilitando de este modo la
localización del anticuerpo.

60
 La peroxidasa es una enzima que normalmente se encuentra en los tejidos
humanos principalmente en la células del sistema hematopoyético por ello cuando
empleamos esta enzima como trazador o marcador de la reacción antígeno
anticuerpo se debe eliminar esta peroxidasa endógena para evitar errores en los
resultados de la técnica, esta es eliminada mediante el bloqueo de la peroxidasa
endógena durante el cual le es aplicado a la lámina con el corte de tejido H 2O2
antes de aplicar el ácido primario

Desenmascaramiento antigénico o reanimación antigénica.

Por otra parte se debe tener en cuenta que los tejidos fijados tienden a
enmascarar las moléculas antigénicas debido al intercambio proteico que se
produce entre el formaldehido y las proteínas tisulares, por ello estos antígenos
no pueden ser reconocidos específicamente por el anticuerpo aplicado por lo que
se debe llevar a cabo el desenmascaramiento antigénico o reanimación
antigénica; técnica que se realiza con el propósito de romper las uniones químicas
inducidas por el formol, desbloqueándose de esta manera el acceso de los
anticuerpos a los epitopes de los antígenos.

El desenmascaramiento antigénico se puede llevar a cabo mediante técnicas

enzimáticas o mediante el uso del calor

El desenmascaramiento antigénico mediante técnicas enzimáticas se comenzó a

realizar con enzimas proteolíticas como la tripsina, pronasa y pepsina. El uso de
esta técnica tiene sus desventajas pues es difícil la estandarización, las
concentraciones de la enzima dependen del tipo de fijador empleado y del tejido,
el tiempo de incubación es variable y existe una escasa reproducibilidad.

Para el desenmascaramiento antigénico mediante el uso del calor se debe tener

en cuenta algunas variables técnicas como: el tipo de fuente de calor a utilizar
(horno de microondas, olla de presión, vaporizadores, autoclave); tipo de solución
de desenmascaramiento, tiempo de incubación y distintos ciclos. Entre las
ventajas de esta técnica se encuentra el hecho de ser más reproducibles, de mejor
inmunotinción, mejora la limpieza del fondo y permite diluciones más altas de los
anticuerpos.

Siempre que se proceda al desenmascaramiento de los anticuerpos

independientemente de la técnica por la que se realice se deben utilizar láminas
portaobjetos pre-tratadas para que los cortes de las biopsias se adhieran
firmemente a la lámina y no se desprendan durante los procederes utilizados. Una

61
 vez llevado a cabo el bloqueo de la peroxidasa endógena y el
desenmascaramiento antigénico se tendrá listo el tejido para aplicar el anticuerpo
primario.

En las técnicas de hibridación se utiliza la peroxidasa por el proceso de

diaminoazobencidina (DAB) para la determinación de las lecitinas, proteínas
obtenidas fundamentalmente de semillas de plantas que se unen con gran afinidad
a los glicoproteínas, proteoglicanos y glucolípidos de la superficie celular y se
utilizan ampliamente para caracterizar moléculas de membrana que contienen
ciertos glúcidos.

A continuación se muestran las Ventajas y desventajas de las técnicas en

inmunohistoquímica enzimática

DESVENTAJAS VENTAJAS
- Presencia de reacción inespecífica, - Permite una localización más precisa
especialmente cuando se utilizan de las reacciones.
anticuerpos policlonales,
- Algunos reactivos son potencialmente - Puede utilizarse tejido fijado e incluido
carcinógenos y su manipulación debe en parafina.
ser cuidadosa.
- Requiere estandarización precisa y - La tinción es permanente, estable,
estricto control de calidad. puede contrastarse y puede ser
evaluada con microscopio de luz.
- En necesario reanimar los antígenos - El material así estudiado puede
tisulares. archivarse por años sin pérdida de la
intensidad de la reacción.
- Los anticuerpos monoclonales han
permitido aumentar la especificidad,
sensibilidad y gama de esta técnica.

2.1.3 Las enzimas como Medio de Diagnóstico en el Laboratorio de

Microbiología.

La microbiología médica puede resultar una disciplina desconcertante para quien

comienza su estudio. Por tanto, los estudiantes así como los investigadores de
diversos campos de esta ciencia deberán enfrentarse a un gran número de
preguntas al estudiar microbiología.

62
¿Cómo aprender todos los nombres? ¿Qué agentes infecciosos provocan
enfermedades? ¿Por qué? ¿Cuándo? ¿Qué individuos presentan un mayor
riesgo? ¿Existe algún tratamiento? Sin embargo, todas estas dudas pueden
reducirse a una pregunta esencial: ¿qué información necesito tener que me
sea útil para entender cómo diagnosticar y tratar a un paciente que presenta
una infección?

El campo de la bacteriología ha sufrido cambios significativos en cuanto a los

métodos bioquímicos empleados para la clasificación y la nomenclatura
bacteriana; para ello en los laboratorios biológicos permanecieron bastante
constantes con el transcurrir de los años, donde las relaciones del ADN , análisis
de secuencia de ARN, las reacciones especificas de antígeno anticuerpo y enzima
sustratos, y otros métodos analíticos sofisticados, proporcionaron información más
profunda sobre muchos microorganismos.

En este capítulo nos adelantan los métodos y técnicas de pruebas para la

identificación de microorganismos, en especial las bacterias, tales como; prueba
de Basiprecinas y Sulfa metoxsasol-Trimetoprima(SXT) ;prueba de beta
lactamasa, prueba de lesitinasa; prueba de lipasa; entre otras como describiremos
a continuación.

 Enzima beta hemolisina estafilocosica (beta-lisina)

La enzima beta hemolisina estafilocosica también conocida como beta-lisina se

utiliza en la prueba o reacción de CAMP para determinar la capacidad de los
estreptococos de producir un agente liquido que se manifiesta como una zona
hemolítica

Determinar las capacidades de un microorganismo para producir y elaborar el

factor Camp, que actúa de manera sinérgica con la beta hemolisina estafilocosica
(beta-lisina) sobre eritrocitos de las ovejas o bovinos para producir un fenómeno
liquido, en la unión de los dos microorganismos. El fenómeno lítico se denomina
prueba o reacción de Camp que proviene de los apellido de sus autores originales,
reacciones que más tarde se utilizaron para definir o determinar la capacidad de
los estreptococos de producir un agente liquido que se manifiesta como una zona
hemolítica con la beta-lisina estafilocosica.

63
Objetivos de la Prueba CAMP

La prueba CAMP se utiliza para diferenciar e identificar de manera presuntivas

Cepas humanas o animales de estreptococcus agalacteae del grupo (b+) de
otras especies de estreptococus negativo, cuando se incuban en aerobiosis o en
condiciones reducidas. También es utilizada para verificar o identificar especies
patógenas hemolíticas de listeria junto con la producción de acido a partir de d-
xilosa, L-raminosido y gama-metildmagnocito. La prueba de campo inversa se
utiliza para distinguir de manera presungtida de Clostridium perfringes positivos de
otra especies de clostridium, formadoras de esporas y productora de sulfito.
Además de su utilidad como coadyuvante en la distinción de Acanobacterium
haemoliticum (+) de Aerobacterum piogenes y Vernadiae (-).

Fundamento Bioquímico

La prueba o reacción CAMP se basa en el hecho de que los estreptococos del

grupo B producen un factor que actúa de manera sinérgica con la beta hemolisina
de ese Aureus Subpbes aureus en medio de agar con sangre ovina o bovina. El
sinergismo es una acción coordinada o correlacionada por 2 o más
microorganismos, el sinergista , factor CAMP, es un Adyuvante de la acción de
otro microorganismo.

 Enzima Fosfolipasa D (PLD)

La enzima fosfolipasa D es una enzima cuya producción se utiliza para distinguir

Corinebacterias pseudotuberculosis (+), y Corynebacterium ulserans (+) de otras
especies de Corynebacterium (-); constituyendo ello un marcador distinto dentro
de géneros.

 Enzimas Catalasa y Peroxidasa.

Las enzimas Catalasas y Peroxidasa se utilizan en la prueba de la catalasa y

peroxidasa para diferenciar entre los géneros Estreptococcus(-) de
Micrococcus(+) o de Staphilococcus(+) o de ambos a partir de probar la
presencia de una de estas enzima o de ambas

Objetivo de la prueba

La prueba de la catalasa es principalmente utilizada para diferenciar entre los

géneros Estreptococcus(-) de Micrococcus(+) o de Staphilococcus(+) o de ambos;
tanto como Bacillus (+) de Clostridium(v-); Listeria monocitogenes (+), especies
64
de Kurtia(+) y de otros microorganismos que pueden ser similares desde punto de
vista morfológico; Kigella dinitrificans(-) de otras de neisserias (+) y Morraxella
catarrhalis(+); Especies de Xenorhabdus(-) de otros miembros de la familia
enterobacteriaceae

Por lo que, la Prueba de la catalasa y peroxidasa también se utiliza para

diferenciar cepas cocidas de legionela p-neumophila(catalasa negativa,
peroxidasa positiva) de otras especies de legionellas (catalasa+ y peroxidasa -),
asi como para diferenciar leptospira interrogans patógenas(catalasa
fuertemente+, peroxidasa+, débil o negativa).

Reacción Bioquímica

Cuando las flavoproteínas reducidas o las proteínas con azufre y hierro reducidas
se unen con el oxigeno y las oxidasas presentes en las cadenas respiratorias de
todas las bacterias se forman dos compuestos tóxicos: el H2O2 y el radical
superóxido (O2-). El peróxido de hidrogeno es un producto final oxidativo de la
degradación aerobia de los azucares. Las flavoproteínas reducidas reaccionan de
manera directa con el oxígeno gaseoso por vía de la reducción de electrones para
formar H2O2, no por la acción directa entre el O2 Y H2 molecular. Las catalasas,
las peroxidasas y la superóxido dismutasa (SOD) eliminan en forma catalítica los
intermediarios de la reducción del oxigeno. Ambas enzimas son esenciales en la
defensa biológica contra las toxicidades del oxigeno.

Catalasa u Oxidasa

Flavoproteinas ---------------------------- Flavoproteina reducida

La catalasa y la POD están presentes en la mayoría de las bacterias aerobias y

anaerobias facultativas que contienen citocromos; las excepciones principales son
las especias de estreptococcus que carecen de catalasa. Los anaerobios
obligados carecen de ambas enzimas; La mayoría de las bacterias aerobias posen
peroxidasa en el lugar de catalasa.

Ambas enzimas son consideradas hidroperoxidasas. Las POD son enzimas

vegetales, pero también se encuentran en la leche y en los leucocitos. Mientras
que, las catasas están presentes en los animales y vegetales. Por tanto, el centro
activo de la catalasa es una proteína hemo denominada citocromo. El hemo de la
catalasa es un complejo de hierro y porfirina de alto giro de Protoporfirina 9.

65
Interpretación

Prueba de catalasa rutinaria (portaobjeto o tubo)

Positivo: burbujeo inmediato, observado con facilidad, por formación de O 2.

Negativo: ausencia de burbujas, ausencia de oxigeno.

 Enzima Coagulasa

La enzima coagulasa se utiliza en la prueba de coagulasa para diferenciar

especies del genero estaphilococcus a partir de su capacidad de coagulación.

Principio: Probar la capacidad de un microorganismo de coagular el plasma por la

acción de enzima coagulasa.

Objetivo:

a) La prueba de coagulasa se utiliza de manera especifica para diferenciar

especies dentro del genero estaphilococcus

b) Peptostreptococcus indolicus(+) de otras especies de Peptostreptococcus(-)

que puede causar infecciones en humanos

c) Diferenciaccion de Erysipelothrix(+) de Listeria(-) y especies de

corrinebacterium (-) .

Reacción Bioquímica

La estafilocoagulasa, la enzima producida por Staphilococcus aureus es

relativamente estable al calor y resiste temperaturas de hasta 60º c durante 30
minutos. Esta proteína es excretada al medio extracelular por las cepas humanas
y se inactiva con facilidad por las enzimas proteolíticas. Se desconoce la
estructura química de la estafilocoagulasa sin embargo existen muchas hipótesis
sobre el mecanismo de la acción de la coagulasa. Esta enzima actúa sobre
algunos constituyentes del suero para producir un coagulo o trombo. La coagulasa
aumenta la velocidad de coagulación del plasma lo que produce la formación de
un coagulo de fibrina.

66
Procedimiento

Prueba en potaobjeto: rápida y relativamente especifica para la determinación de

coagulasa ligada con la mayoría de las cepas de estreptococcus aureus .

a) Procedimiento en portaobjeto:

Positivo- agregación marcada en los 5-20segundos;

Positivo tardío- cualquiera agregación o granulación después de 20 segundos

y hasta minutos

Dudoso cualquier granulación después de un minuto

Negativo- sin cambios, la suspensión permanece homogénea.

b) procedimiento en tubo:

Positivo- formación de coagulo o filamentos de fibrinas separados

Negativo- ausencia de formación del coagulo.

 Enzima Ureasa

La enzima ureasa se utiliza en la prueba de ureas para determinar la velocidad

de un microorganismo de hidrolizar la urea, en dos moléculas de amoniaco, con la
resultante alcalinidad.

Objetivo de la prueba

Desde un principio esta actividad enzimática fue característica de todas las

especies de proteus y se la utilizó sobre todo para diferenciar los microorganismos
proteus rápidamente ureasa positivo de otros miembros de la familia
enterobacteriaceae; los otros géneros pueden dar una reacción positiva tardía.

Reacción Bioquímica

El sustrato urea, una diamina del ácido carbónico a menudo se designa como una
carbamina. Todas las amidas son hidrolizadas con facilidad. La urea es hidrolizada
por una enzima específica, la ureasa, para dar dos moléculas de amoniaco. En
solución la ureasa se hidroliza hasta carbonato de amonio como producto final.

67
 ureasa

Urea + 2HOH-----------------CO2 + H2O + 2NH3 ---------------(NH4)2CO3

La ureasa es una importante enzima microbiana relacionada con la

descomposición de los compuestos orgánicos, las enzimas bacterianas se
clasifican como constitutivas o adaptativas. La adaptativa o inducida solo se
produce solo cuando un sustrato especifico esta presente, pero la ureasa es
considerada constitutiva debido a que es sintetizada por ciertas bacterias sin
tomar en consideración la presencia o ausencia del sustrato, la urea.

Medios de cultivo empleados( Medios con difosfato de fenolftaleína-PDP)

Sulfato de fenolftaleína (sal sódica de PDP-0,5g+agua decionizada-100ml)

Caldo nutritivo PDP(extracto de carne-3g+ peptona-5g+1000ml)

agar nutritivo PDP(extracto de carne-3g+peptona-5g+NaCl-8g+Agar-15g+agua-

1000ml)

Interpretación de los resultados

a) Caldo con urea de Stuart:

Positivo: color rojo-rosado intenso en todo el caldo; ciertas especies de Proteeae

Negativo: sin cambios de color (amarrillo – naranja-)

b) Agar con urea de Christensen:

Positivo: color rojo-rosado o rojo violeta intenso en el pico de flauta, el color

puede penetrar en el interior de agar, cuya extensión indica la velocidad de la
horolisis de la urea.

Negativo: sin cambio de color( color piel a amarillo pálido)

 Enzima Oxidasa

La enzima oxidasa se utiliza en la prueba de la oxidasa para identificar todas las

especies de neiserias y para distinguir los miembros de la familia
Pseudomonadaceae de los miembros de la familia Enterobacteriaceae

Principio de la prueba de oxidasa

Determinar la presencia de la enzima oxidasa.

68
Objetivos de la prueba oxidasa

Identificar todas las especies de neiserias fue utilizada con posterioridad para
distinguir los miembros de la familia Pseudomonadaceae (pseudomona) de los
miembros de la familia Enterobacteriaceae oxidasa negativa. La mayoría de las
bacterias grampositiva son oxidasa negativas. Entre la familia de las
enterobacteriaceae solo plesiomonas shigelloides es oxidasa positiva y además
ayudar a la diferenciación entre los géneros.

Reacción Bioquímica

La prueba de la oxidasa esta se basa en la producción bacteriana de una enzima

oxidasa intracelular y se debe a un sistema de citocromo oxidasa que activa la
oxidación del citocromo reducido por el di oxígeno molecular que a su vez actúa
como aceptor de electrones en la fase terminal del sistema de transferencia
electrónica. Visto que todas bacterias aerobias obtienen su energía a partir de la
respiración, proceso responsable por la oxidación de varios sustratos, pues
teniendo en cuenta que la cadena respiratoria es una secuencia de enzimas y
transportadores de equivalentes reductores desde el sustrato al oxigeno molecular
que oxida un sustrato, ese oxigeno es aceptor final del hidrogeno produciéndose
agua o peróxido de hidrogeno, lo cual depende de la especie bacteriana y de sus
sistemas enzimáticos.

El sistema citocromo, por lo común se encuentra solo en microorganismos

aerobios, permitiendo que estos utilicen el oxigeno como aceptor final del
hidrogeno para reducir el oxigeno molecular a peróxido de hidrogeno.

Los anaerobios obligados carecen de la actividad de la oxidasa, no pueden vivir en

presencia de oxigeno atmosférico y no poseen un sistema de citocromo oxidasa.

Interpretación de los resultados

- Colonias oxidasa positiva: color rosa, luego marrón (rojo-oscuro) y por

ultimo negro purpureo en los 10 a 15 segundos. Pero cuando se utiliza una
mezcla reactiva de dimetil-p-fenilandiamina--naftol, un resultado positivo
se denota por un color azul en 1 a 2 minutos.

- Colonias oxidasa negativa: Sin cambios de color en las colonias o un color

rosa pálido debido al reactivo. Pero puede ocurrir un cambio al negro en el
medio circundante. También según el científico Steel, el desarrollo de color
después de los 60 segundos se considera un resultado negativo.

69
  Enzima Fosfatasa

La enzima fosfatasa se utiliza en la prueba de la fosfatasa para determinar la

patogenicidad de las especies de estaphilococcus, diferenciar especies de
Actinobacillus, diferenciar los constituyentes predominantes de la flora oral de
Mycoplasmas y diferenciar los miembros de la familia enterobacteriaceae(+) de
otras bacterias intestinales gramnegativas.

Principio: Determinar la capacidad de un microorganismo de producir la suficiente

enzima fosfatasa para hidrolizar el difosfato de fenolftaleína (PDP)

Objetivo

A partir de un medio con PDP, en un comienzo sirve para determinar

principalmente la cepas patógenas de las especies de estaphilococcus (aureus
coagulasa+); Para diferenciar especies de Actinobacillus (muris,seminis,etc),
Haemophilus+, Pasteurella testudinis, Kurthia (zopfii, gibsonii+, sibirica+),
Corinebacterium + y -; Y para diferenciar los constituyentes predominantes de la
flora oral de Mycoplasmas (salivarium+, orales-.

Y a partir de la prueba de fosfatasa con verde de metilo (MGP) se

diferencian los miembros de la familia enterobacteriaceae(+) de otras bacterias
intestinales gramnegativas.

Reacción Bioquímicas

La producción de fosfatasa se determina por la liberación de fenolftaleína, indicada

por un cambio de color en el medio. La fenolftaleína liberada reacciona con un
álcali para dar un color rosa a rojo brillante. La ftaleína es un compuesto del
anhídrido ftálico con un fenol o derivado fenòlico que contiene un anillo lactona de
cinco lados. El anhídrido ftálico combinado con dos moléculas de fenol forma el
compuesto fenolftaleína.

fosfatasa

Difosfato de fenolftaleína(sal sódica) ---------------------Fenolftaleina libre

Fenolftaleina+alcali(NaOH o NH3) ---------------------color rojo-rosado brillante.

Cuando la feniltaleina es neutralizada, el alcalis se une al grupo C=O, se rompe el

anillo de lactona y se forma un quinoide en uno de los anillo bencénicos.

70
Interpretación de los resultados

Positivo: caldo o colonias coloreados de rojo-rosado brillante.

Negativo: sin cambios de color, el caldo o las colonias permanecen claras.

Nota…Según Lewis, los métodos de tubo y placa presentan una sensibilidad igual
para los Staphilococcus coagulasa (+). Sin embargo sus estudios mostraron que el
método de placa no indica cepas patógenas pero es mejor que el de caldo para
los estaphilococcus coagulasa(-). Por otro lado, el método de caldo mostro menor
cantidad de cepas fosfatasas (+) y coagulasa(-). Por lo que el procedimiento en
caldo puede ser usado para la comprobación de la fosfatasa y coagulasa.

Características Bioquímicas de familia Enterobacteriaceae

- Son catalasa +
- oxidasa –
- todos fermentan la glucosa con producción de ácido o ácido y gas ( co2 ,
h2)
- poseen fermentación ácido láctica ( metil red +) o ácido fórmica (acetilmetil
carbinol (vogues proskauer +)
- se pueden dividir desde el punto de vista clínico en dos grandes grupos-
fermentadores de lactosa (grupo coliforme) y no fermentadores de lactosa
(Salmonella, Shigella, Proteus ).

Para la identificación Bioquímicas de los miembros de la familia

Enterobacteriaceae se recurre a las siguientes pruebas:

- Prueba del rojo de metilo

Sirve para determinar la presencia de fermentación ácido láctica en los

miembros de la familia enterobacteriaceae, los cuales cuando la efectúan,
producen gran cantidad de ácido láctico a partir de la glucosa ( 26 moles de
ácido por mol de azúcar) y por tanto, viran el indicador rojo de metilo a color
rojo ( cuando el ph es menor que 5).

- Prueba de la ureasa

Permite determinar si una bacteria es capaz de degradar la urea (nh 2conh2) por
acción de la enzima ureasa dando amoniaco y carbonato de amonio.

NH2-CO-NH2 + 2 H2O ----------- CO2+ H2O + 2 NH3 <- ------ (NH4)2 CO3
71
La aparición de coloración rojo-cereza indica la presencia de la enzima y se
considera positiva por producción de carbonato de amonio que alcaliniza el medio.

resultado + en 1-6 h: posible proteus

resultado + en 24h o más : posible klebsiella, citrobacter o enterobacter

resultado - : no hay cambio de coloración

- Producción de indol

Determina la presencia de la enzima triptofanasa, la cual permite que los bacilos

crecidos en medio como el agua de peptona en el cual se encuentra presente el
triptofano, este sea oxidado a indol y ácido. por lo que, la porción pirrólica del indol
reacciona con el paradimetil aminobenzaldehido (reactivo de kovacs) y produce
indolina de color rojo.

triptofanasa

l- triptofano---------------------indol + ácido pirúvico

Pirrol + p-dimetil-amino benzaldehído-----------------compuesto quinoidal rojo

indolina

2.1.4 Ejercicios de Comprobación del Capítulo 2.1

1. ¿Por qué para el diagnóstico de una pancreatitis además de

observar los valores séricos de amilasa se debe tener en cuenta la
excreción urinaria de la enzima?

2. ¿Por qué patologías como pancreatitis y embarazo ectópico están

relacionadas con el aumento sérico de la enzima amilasa?

3. ¿Por qué para el diagnóstico de un infarto del miocardio o hepatitis

se deben tener en cuenta los niveles séricos de las transaminasas
TGO/ASAT y TGP/ ALAT?

4. El uso de los biocatalizadores en el laboratorio tiene gran importancia

por las características de los mismos.

72
 a) De las enzimas que se muestran a continuación diga su
localización y la patología con la cual se relaciona su aumento en
sangre:
1. Creatina quinasa
2. Láctico deshidrogenasa
3. TGO

5. Seleccione V o F y subraye la palabra que determine su selección

falsa.

a) ___ La fosfatasa ácida se localiza en la próstata.

b) ___La alanina aminotransferasa está presente en pequeña
cantidades en el hígado,
c) ___Las isoenzimas de la deshidrogenasa láctica difieren en
su movilidad electroforética.
d) ___La transaminasa glutámica pirúvica está contenida
principalmente en el citoplasma de las células del parénquima
hepático.
e) ____La aspartato aminotransferasa es un enzima unicular
tener su localización celular en las mitocondrias y en el
citoplasma.
f) ____ La fuente de GGT presentes en suero es de los tejidos
renales

6. Relacione las enzimas de la columna A con su comportamiento en la

columna B.

Columna A Columna B
a) ___ Su aumento sérico está relacionado con el embarazo
1-TGP. ectópico y las úlceras peptídicas
2-TGO. b) ___Se encuentra en mayor concentración en el músculo
3-CPK. esquelético.
4-Amilasa c) ___Sus valores aumentan más significativamente en la
Hepatitis Viral.
d) ___ Mide la intensidad de la lesión hepática.
e) ___ Se encuentra en mayor concentración en el tejido cardiaco.
f) ___ Sus valores se incrementan significativamente en la
pancreatitis.
g) ___ Mide la extensión de la lesión hepática.
h) ___ Su ubicación en el tejido hepático es a nivel mitocondrial.
i) ___ Sus valores se encuentran aumentados en la prostatitis.

73
7. Seleccione con una X la prueba diagnóstica que se indica en cada
una de las entidades clínicas:

a) Hepatitis viral aguda virus B

___ TGP

___ Antígeno de superficie.

___ Fosfatasa Alcalina.

b) Hepatitis con colestasis (marcador de colestasis)

___ TGO

___ Fosfatasa Acida

___ Fosfatasa Alcalina

8. Relacione las enzimas de la columna A con su característica en la

columna B

Columna A Columna B

1-LDH1 ___Enzima pancreática

2-GGT ___Aumenta en alcohólicos y

embarazadas

3- TGP/ALT ___Diagnóstico tardío del IMA

4-Amilasa ___Su mayor aumento es en el íctero

obstructivo

5- SP ___Marcador prostático

6-AP ___Enzima hepática unilocular

7- TGO ___Enzima bilocular

____Abundante en cerebro

74
9. Los métodos citohistoquimicos se utilizan con el objetivo de localizar
diversas moléculas en los cortes de tejidos.

a) mencione al menos 5 moléculas demostrado por estos

métodos.
b) ¿Cuál es la base en que se fundamentan tales métodos?

10.¿Cuál es el fundamento de los métodos para la localización de

enzimas en determinados tejidos?

a) Mencione ejemplos de enzimas y sus respectivas localizaciones

anatómicas donde su desequilibrio tiene una significación clínica que
se logran localizar por estos métodos.

11.De los métodos utilizados en citohistoquimica, describa la técnica

más utilizada argumentando sobre su importancia y principio.

12.¿Cuál es la diferencia fundamental entre las técnicas de histoquímica

enzimática de las inmunohistoquimica también enzimática?

13.¿Con que objetivo se le realiza la prueba de coagulasa en el

laboratorio de Microbiología?

14.Mencione los dos procedimientos imprescindibles que anteceden a

la prueba de coagulasa.
15.¿Cuáles deben ser los resultados o características presentadas en
los dos procedimientos de la respuesta anterior que conducen a la
realización de la prueba de la coagulasa?
16.La prueba de catalaza es un ensayo de diferenciación bacteriano. a)
Argumente la afirmación anterior
17.¿En que circustancias laboral considera usted que sea necesario la
utilización de la prueba de ureasa? Argumente su respuesta?
18.La oxidasa nos permite diferenciar un gran numero de especies
bacteriológicas,

a) Mencione los microrganismos de interés medico que son

diferenciables por este examen.

75
2.2 Las Enzimas como Herramientas de trabajo o reactivos químicos.

Enzimas preparadas industrialmente presentes en reactivos exógenos utilizadas

para la detección y cuantificación en muestras biológicas de metabolitos como la
glucosa, la urea, el ácido úrico, el colesterol y TAG entre otros, resultantes de
alteraciones metabólicas o fisiológicas.
2.2.1. Enzimas como Herramientas de trabajo o reactivos químicos en el
Laboratorio Clínico.

En el laboratorio clínico se trabaja diariamente con reacciones donde intervienen

las enzimas como herramientas para evidenciar y cuantificar otras sustancias
como la glucosa, urea, ácido úrico, colesterol y muchos más. Esas enzimas son
preparadas industrialmente con especificidad de reaccionar con el sustrato
contenido en la muestra en estudio.

 Enzima Glucosa-Oxidasa.
Generalidades
La glucosa-oxidasa es una enzima que se encuentra en el reactivo del método
Rapigluco-Test que se usa para cuantificar la glucosa presente en el suero. La
glucosa es un el carbohidrato o glúcido más importante presente en la sangre,
constituyendo su oxidación la principal fuente de energía para las células animal
por lo que su administración en la diete bajo la forma de polisacárido y almidón es
fundamentalmente.

Son muchas las hormonas que intervienen en el metabolismo glucídico: La

insulina, como hormona hipoglicemiante, promueve la utilización de la glucosa,
facilitando su paso al interior de la célula mediante la fosforilación y su
almacenamiento en forma de glucógeno en hígado y músculo; glucagón y la
adrenalina como hormonas hiperglicemiantes promueven la glucogenólisis
hepática y muscular respectivamente; los corticoides y ACTH favorecen la
glucogénesis y la somatropina inhibe la fosforilación de la glucosa. Todas estas
hormonas mantienen la concentración de glucosa entre los límites precisos.

Indicaciones

La determinación de glucosa a partir de la utilización de la glucosa-oxidasa se usa

en el diagnóstico y control de la enfermedad del metabolismo de los carbohidratos,
como diabetes mellitus en sus diferentes formas, hipoglicemias neonatales, etc.
Pero la patología más común relacionada con el metabolismo de los hidratos de
carbono es la diabetes mellitas. El diagnóstico precoz y el control de los pacientes
diabéticos, tienen por objeto evitar la cetoacidosis y las complicaciones de los
síntomas resultantes de la hiperglicemia, mediante el tratamiento adecuado. La
diabetes puede ser primaria o secundaria en relación con enfermedades del
páncreas; endógenas, hormonales; puede ser insulino resistente por reducida
tolerancia a los carbohidratos o glúcidos. Modificaciones de la glucosa se pueden
76
encontrar en la pancreatitis, la disfunción de la tiroides, en el traumatismo craneal,
en accidente cerebro vascular y en el infarto del miocardio. Puede existir exceso
de consumo de glucosas en el trabajo muscular, como en la hiperpirexia y en la
tirotoxicosis.

Muestreo
En el suero

Modalidad de solicitud
La solicitud puede ser de carácter rutinaria en ayuna de 6 a 8 horas y en algunos
casos se prescribe una alimentación particular antes de la toma de la muestra,
con previo preparación del paciente en el sentido de evitar el estrés, ya que puede
comportase como una falsa hiperglicemia por una descarga de adrenalina
muscular en los días antes de la toma de la muestra, verificar la idoneidad del
muestreo en lo que es la identificación, hemólisis, lipemia, presencia de coágulos,
filamentos de fibrina, turbidez. Señalar eventualmente en el resultado la no
idoneidad de la muestra; transportar a temperatura ambiente; Centrifugar a 3000
r.p.m por 5 mnts y separar del suero; Ejecutar el examen cuantos antes, visto que
la glucosa es influenciada por la temperatura de conservación, desde la
contaminación de bacterias y en particular la glucolisis. La toma de muestra se
puede conservar por 8horas a temperatura ambiente de 20-25⁰C y por 3 días a 2 o
4ºC.

Métodos de determinación
Rapigluco-test (Método enzimático GOD-POD)
Se emplea los reactivos- Glucosa/GOD-POD y Glucosa 5,55 mmol/L de solución
de referencia., una vez abierto es estable por 2meses en 2 a 8 0C. Es específica
para la determinación de glucosa en suero por método enzimático de punto final.
"PARA USO INVITRO". Lineal a un rango de la actividad enzimática 2,0 a 22,0
mmol/L a una densidad óptica del blanco reactivo a 500 nm(492-550) y sensible a
2,0mg/dl.

Principio del método

Determinación de Glucosa en suero, a través de la formación de una quinonimina
que se determina espectrofotométricamente a 500 nm, según el siguiente
esquema de reacciones:

Glucosa-oxidasa
Glucosa + O2 -------------------------Ácido glucónico + H2 O2

Peroxidasa
2H2 O2+Fenol+4 Aminoantipirina--------------------- Quinonimina +4 H2O

77
Pues, la glucosa oxidasa (GOD) cataliza la oxidación de la glucosa a ácido
Glucónico o peróxido de hidrógeno el cual se valora mediante la reacción de
Trinder dando lugar a una quinoneimina coloreada en cuya intensidad es
proporcional a la cantidad de Glucosa presente en la muestra.

Cm = Am x Cr/Ar

Técnica
Mezclar 20 microlitros de muestra con 2ml de Rapigluco-test e incubar a 37 ºC
durante 5 minutos. Leer los valores de absorbencia de la muestra y la referencia
contra blanco a 500 nm (492 a 550). El color desarrollado es estable 60 minutos.
También se puede seguir las instrucciones de la casa comercial. Y los resultados
se escriben sin cifras decimales.

Verificar el resultado:
- Si el valor de la glucosa es < 50.0 mg/dl y ≥350. mg/dl, repetir la
medida.
- Si el valor del resultado repetido es el mismo, se puede entregar.
- Si el valor del resultado repetido es diferente, procesar nuevamente
la muestra utilizando un control patológico.
- Con
concentrada y diluida 1/2 con solución fisiológica y con un control
patológico.
- Si la confrontación del valor sobrepuesto al suero diluido y el control
está dentro el rango establecido, se puede entregar el resultado.
- Si el suero diluido no está en relación con el suero concentrado, diluir
la muestra 1/3 con solución fisiológica, siempre usando el control
patológico.

Interferencias
Las más significativas son: Hemólisis: con Hb ≥8.0 g/l; Ictericia: con bilirrubina
≥36.0 mg/dl; Lipemia: con triglicéridos ≥430.0 mg/dl; algunas hormonas, el ácido
ascórbico, todas las sustancias reducientes pueden dar valor bajo de glucosa. La
hormona adrenalina, algunas drogas y los derivados de las anfetaminas pueden
dar valor alto de glucosa.

Valor de referencia: 4, 20 a 6, 11 mmolo/L

Criterios de validación
- Controlar primeramente el examen de orina para eventual presencia de
glucosa y/o cuerpos cetónicos; parámetros del metabolismo glucósido
(hemoglobina glicosilada, insulinemia); eventuales parámetros de
funcionalidad tiroidea y suprarrenal; parámetros del metabolismo lipídico y
el valor del ácido úrico; electrolitos (sodio, potasio, cloro, magnesio) y
confrontar con analitos de funcionalidad hepática.

78
Comunicación de riesgo
Se tiene que comunicar inmediatamente con valores inferiores a 50.0 mg/dl y
superiores a 500.0 mg/dl.

Control de Calidad
Se deberán usar sueros, control normal y patológico, en las mismas condiciones
que las muestras.

PRUEBA DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA ORAL DE 2h (PTG-O 2h)

Fundamento
En pacientes sanos, la respuesta de la insulina para eliminar del flujo sanguíneo
una sobrecarga de glucosa administrada por vía oral es inmediata, con un pico a
los 30 - 60 minutos, retornando a la normalidad a las dos horas.

Indicaciones
Antes de la prueba
- Los 3 días precedentes se debe aplicar una dieta que contenga por lo menos
150 g/ día de carbohidratos.
- La falta de apetito o la inactividad (reposo en cama u hospitalización)
invalidan la prueba.
- Guardar ayuno de 12 horas o no más de 16 horas, suprimiendo incluso el café.
Sólo agua.
- Prohibido fumar o realizar ejercicios, incluso ligeros.
- No debe aplicarse la prueba a personas enfermas en las dos semanas
precedentes.
- Se deben tener controladas algunas enfermedades endocrinas que alteran la
prueba, Ej. acromegalia, síndrome de Cushing, hipertiroidismo, feocromocitoma.
- Evitar fármacos como diuréticos, salicilatos, hipoglicemiantes y
anticonvulcivantes por lo menos 3 días antes.
- Suprimir los anticonceptivos durante todo un ciclo.
Durante la prueba:
- Se debe permanecer en absoluto reposo, sin ingerir alimentos, ni fumar
después de la primera extracción hasta la próxima.
- Pueden ocurrir mareos o nauseas durante la prueba.
Después de la prueba:
- Puede comer o tomar normalmente.
- Se debe administrar hipoglicemiantes a las personas que lo necesiten tan
pronto termine la prueba.
Procedimiento
- Entre las 7-8 horas de la mañana, después de un ayuno de 12 h y luego de 30
min de reposo, se obtiene muestra venosa (1 ml de sangre + 1 gota [20 l] de
EDTA o fluoruro) para determinar glucosa plasmática por el método GOD PAD.

79
- 5 minutos después se ingiere una sobrecarga de 75 gr. de dextrosa (150 ml de
solución de dextrosa al 50 %) para los adultos.
- Para los niños: 1.75 g/Kg de peso hasta 75 g (peso en kilogramos del niño por
3.5 [1.75 por 100/50]; el resultado sería el volumen en ml de dextrosa al 50 % a
ingerir por el niño
- 100 g para la PTG de 6 horas (200 ml de dextrosa al 50 %).
- La próxima extracción se realizará según las indicaciones del médico (a las 2 h
ó cada 1 h).
- En caso de existir nauseas, mareos, sudoración u otra manifestación de
hiperactividad del sistema nervioso vegetativo, debe extraerse una muestra
sanguínea inmediatamente o suspender la prueba.
- Si el paciente vomita la solución de glucosa el test queda invalidado y se debe
repetir 3 días después.
- Si la primera determinación es superior a 11 mmol/l el test debe suspenderse
o de lo contrario debe ser monitoreado por las posibles reacciones severas o el
coma.
- A los pacientes con glucosa en ayunas por encima de 11.1 mmol/l no debe
realizársele esta prueba.

Indicaciones del test

Historia familiar de diabetes; Obesidad; Episodios inexplicables de hipoglicemia;
Historia de infecciones frecuentes; Mujeres con historia de macrofetos, muerte
neonatal, parto prematuro y abortos; Glicosurias o hiperglicemias transitorias en
embarazadas, cirugías, traumas, estrés e infarto agudo del miocardio; Glicemia en
ayuno dudosa (< 11.1 mmol/l).

 Enzima Lipoproteína-lipasa(LPL)
Generalidades
La lipoproteína- lipasa es una enzima que se encuentra en el reactivo del método
Monotriglitest que se usa para cuantificar los triglicéridos en suero o plasma. Los
triglicéridos son ésteres de ácidos grasos cuya hidrólisis produce glicerol y ácidos
grasos libres. Estos están compuestos de un alcohol trivalente (glicerol) y de tres
cadenas largas de ácidos grasos. Son absorbidos, una parte, con la alimentación
y, la otra parte, es sintetizada desde el hígado. Los triglicéridos alimenticios son
transportados por los quilomicrones, mientras el transporte de la cantidad
endógena a los tejidos se hace con las VLDL. Los triglicéridos son utilizados en los
tejidos con la intervención de la lipasa lipoproteica. El 95.0% del tejido adiposo
está constituido por triglicéridos. Si su determinación se realiza en conjunto con
otros ensayos para lípidos; entonces resulta útil en el diagnóstico de
hiperlipoproteinemia.

Indicaciones
La determinación de los triglicéridos se emplea en los distintos metabolismos:
alteraciones del metabolismo lipídico, diabetes mellitus, síndrome nefrótico y
muchas enfermedades endógenas, por lo que se puede afirmar que los niveles

80
anormales de Triglicéridos circulantes, están asociados a numerosas patologías,
tales como enfermedades hepáticas, renales, hiperlipidemias esenciales, están
relacionados también con la patogénesis de la arteriosclerosis coronaria. Visto que
se puede encontrar hipertrigliceridemia por falta de lipasa proteica, exógena
(introducción excesiva de alcohol, glúcidos y lípidos), endógena (congénita).

Muestreo
Suero o plasma- Los TG son estables en suero 3 días a 2-8 °C)

Modalidad de solicitud
La solicitud puede ser de carácter rutinaria en ayuna de 6 a 8 horas, con previa
preparación del paciente en el sentido de no consumir alcohol en las últimas 72
horas antes de la toma de la muestra, verificar la idoneidad del muestreo en lo que
es la identificación, presencia de coágulos, filamentos de fibrina, turbidez. Señalar
eventualmente en el resultado la no idoneidad de la muestra; transportar a
temperatura ambiente; Centrifugar a 3000 r.p.m por 5 mnts; La toma de muestra
se puede conservar por 1 día a temperatura ambiente de 20-25⁰C , 5 días a 4ºC y
3 meses en congelación.

Método (monotriglitest- enzimático de punto final)

Se emplea los reactivos-Triglicérido/LPL/GPO y Glicerol2,28mmol/L Para la
determinación de Triglicéridos en suero por método enzimático por
espectrofotometría a 500 nm. "PARA USO INVITRO". Lineal en un rango de la
concentración de triglicéridos de 0,4 a 9,12 mmol/L. y específica para la
determinación de triglicéridos. Los reactivos una vez abiertos son estables
durante 1 mes conservados de 2 a 8 °C.

Metódicas de determinación
1-Método enzimático UV
Los triglicéridos son hidrolizados a glicerol y ácidos grasos por medio de una
lipasa. El glicerol, por acción de la glicerol Kinasa (GK), es fosforilado en presencia
de ATP. El ADP producido es reconvertido en ATP a través de la piruvatokinasa
(pk), y el piruvato formado es reducido a lactato en presencia del NADH, el cual se
oxida a NAD. La cantidad del NADH oxidado se mide en absorbancia a 340 nm.

2-Método enzimático colorimétrico de punto final.

Los triglicéridos son hidrolizados a glicerol y ácidos grasos por medio de una
lipasa. El glicerol por acción de la glicerol kinasa (GK) es fosforilado en presencia
de ATP. El glicerol fosforilado es oxidado con producción de H2O2. Este, en
presencia de la peroxidasa (POD), forma con la antipirina un complejo coloreado
estable, el color del cual es proporcional a la concentración de los triglicéridos.

3-Método enzimático colorimétrico y procedimiento analítico

Los triglicéridos son hidrolizados a glicerol y ácidos grasos por medio de una
esterasa. El glicerol es fosforilado por medio de la glicerol kinasa (GK) y,
81
posteriormente, oxidado por la glicerol fosfato oxidasa (GPO), produciendo
peróxido de hidrógeno. El peróxido reacciona con un compuesto fenolado y la 4-
aminofenazona, en presencia de peroxidasa (POD), para producir un complejo
coloreado cuya intensidad de color es proporcional a la concentración de
triglicéridos en la muestra.

LPL
Triglicéridos + H2O------------------------------ Glicerol + ácidos grasos

GK
Glicerol + ATP--------------------------------------- Glicerol-3-fosfato + ADP
Mg ++

GPO
Glicerol-3-fosfato + O2 ---------------- ------- Fosfato Dehidroxiacetona + H2 O2

POD
2H2O2+ 4 -aminoantipirina + 4-clorofenol------- ----- quinonimina roja + 4 H2O

LPL = Lipoproteína-lipasa
GK = Glicerol-cinasa
GPO = Glicerol-3-fosfato-oxidasa
POD = Peroxidasa

Procedimiento:
Seguir las instrucciones de la casa comercial, como por ejemplo:
Mezclar 20 microlitros de la muestra con 2ml del reactivo e incubar a 37 ºC
durante 10 min. Leer los valores de absorbancia de la muestra y la referencia
contra el blanco a 500 nm. El color desarrollado es estable 30 min. Y los
resultados se escriben sin cifra decimal.

Valores de referencia
Hombres: de 0,68 a 1,88 mmol/L
Mujeres: de 0,46 a 1,60 mmol/L

Interferencias
Concentraciones de bilirrubina de 150,5 μmol/L o más y de 0,28 mmol/L de ácido
ascórbico o más, disminuyen la concentración de triglicéridos en el suero humano.
Concentraciones de colesterol superiores a 6,5 mmol/L en sueros normales y 11,1
mmol/L en sueros patológicos, concentraciones de hemoglobina superiores a 5 g/L
sobrestiman los valores normales de Triglicéridos.

Criterios de validación de los resultados

Observar el aspecto del suero (aspecto lipémico, cuando los triglicéridos están
mayor de 400.0 mg/dl); Controlar los parámetros del metabolismo lipídico
82
(colesterol, HDL, LDL, apolipoproteína); los parámetros del metabolismo glucídico;
los parámetros de la funcionalidad del riñón (urea, potasio, proteínas,
densidadurinaria); la funcionalidad hepática (particularmente la GGT, por toxicidad
alcohólica); la funcionalidad tiroidea (en el hipotiroidismo > triglicéridos y
colesterol).

Control de calidad
Todos los sueros control con valores de triglicéridos determinados por este
método pueden ser empleados.

Semiología
Aumento en hiperlipoproteinemias tipos: I, IIB, III, IV, V; enfermedad hepática,
síndrome nefrótico, hipotiroidismo, diabetes incontrolada, pancreatitis, enfermedad
por almacenamiento de glucógeno, endocrinopatías, IMA, disfunción pancreática,
toxemia, hipotiroidismo.
Disminución en enfermedad pulmonar obstructiva crónica, infarto cerebral,
hipertiroidismo, malnutrición, síndrome de malabsorción.

 Enzima Colesterol Esterasa.

Generalidades
La colesterol esterasa es una enzima que se encuentra en el reactivo del método
Colestet que se utiliza para la cuantificación del colesterol presente en suero o
plasma. El colesterol es un compuesto liposo que se encuentra en sangre y en
tejido biliar y cerebral; actuando como precursor de los ácidos biliares, los
esteroides y la vitamina D. Es un esteroide sintetizado en muchos tejidos,
especialmente en el hígado, la corteza supra-renal, en la pared intestinal, en las
gónadas y la aorta.
Aproximadamente ¼ de colesterol se obtiene mediante la alimentación y ¾ por
síntesis endógena. Un aumento en la dieta de colesterol disminuye la cuota
endógena. La cuota de colesterol intestinal está controlada por la concentración en
el intestino de las sales biliares. El colesterol, en relación con la alimentación, es
esterificado desde las células intestinales. La cuota endógena es esterificada
desde el hígado. Cuya determinación en suero es la principal prueba para
diagnosticar y clasificar lipemias El significado del colesterol en cada una de sus
fracciones es diferente:

VLDL: incierto (utilización directa con los tejidos periféricos).

LDL(colesterol malo): transporta colesterol del hígado a los tejidos.
HDL(colesterol bueno): transporta colesterol de los tejidos al hígado.

Indicaciones
La determinación del colesterol se hace en la patología del metabolismo lipídico y
lipoproteico. El colesterol circula en parte libre y en parte esterificado con ácidos
grasos. La esterificación se cumple en el hígado.
-El aumento del colesterol se encuentra en algunas enfermedades hereditarias y
en la alimentación no adecuada, en el hipotiroidismo, en el síndrome nefrótico, en
83
la enfermedad de Cushing, en la diabetes mellitus, en la pancreatitis, en la
glucogenosis tipo I, III, VI, y también en las glomerulonefritis. Por lo que la
colesterolemia elevada está asociada con mayor incidencia a las enfermedades
cardíacas coronarias; así como que el colesterol es uno de los factores
contribuyentes a la formación de ateromas dado que las complicaciones
arterioescleróticas producen en individuos hipercolesterolémicos, por consiguiente,
resulta de una gran importancia la determinación de los niveles séricos de
colesterol en la clínica.
-La disminución del colesterol se encuentra en el déficit de alfa lipoproteína, en la
insuficiencia hepática, hipertiroidismo, caquexia, mala nutrición, uremia,
septicemia, enfermedad de Addison.

Muestreo
Suero o plasma- Los TG son estables en suero 3 días a 2-8 °C

Modalidad de solicitud
La solicitud es solo de carácter rutinaria en ayuna de 6 a 8 horas, con previa
preparación del paciente en el sentido de no consumir alcohol en las últimas 72
horas antes de la toma de la muestra, evitar éxtasis venosa porque provoca
hemoconcentración y la liberación de colesterol tisular y, por consiguiente, un
aumento de colesterol hemático, verificar la idoneidad del muestreo en lo que es
la identificación, presencia de coágulos, filamentos de fibrina, turbidez. Señalar
eventualmente en el resultado la no idoneidad de la muestra; transportar a
temperatura ambiente; centrifugar a 3000 r.p.m por 5 mnts; La toma de muestra
se puede conservar por 1 día a temperatura ambiente de 20-25⁰C , 5 a 7 días a
4ºC y 2 meses a -20º C .

Método
Enzimático colorimétrico (CHOD - PAP)

Fundamento
La colesterol esterasa hidroliza los esteres de colesterol presentes en la
muestra dando colesterol libre que por acción de la colesterol oxidasa (CHOD) se
transforma en H2O2 o colesten-3-ona. En la reacción catalizada por la peroxidasa
(PAP) se obtiene un compuesto coloreado llamado quinoneimina. Pues el
Colesterol presente en la muestra, según las reacciones que se describen a
continuación, formándose un complejo coloreado que se cuantifica por
espectrofotometría.

CE
Esteres de Colesterol------------------ Colesterol + ácidos grasos
CO
Colesterol + O2------------------------------------- -4-colesten-3-ona + H2O2
84
 POD
2H2O2 + Fenol + 4 aminoantipirina----------------- quinonimina roja + 4H2O

CE: Colesterol esterasa

CO: Colesterol oxidasa
POD: Peroxidasa

Técnica
Mezclar 0,02ml de la muestra con 2ml del reactivo de trabajo e incubar a 37ºC,
durante 5 min. Leer los valores de absorbancia de la muestra y la referencia contra
el blanco a 500 nm (492 a 550). El color desarrollado es estable 60 min.

Valores de referencia: 3,87 a 6,71 mmol/L

Interferencias
No hay interferencia de triglicéridos hasta una concentración de 5,7 mmol/L,
glucosa 55 mmol/L, ácido ascórbico hasta 0,28 mmol/L y hemoglobina hasta 5 g/L.

 Enzima Ureasa
Generalidades
La ureasa es una enzima que se encuentra en el reactivo del método SalicUrea
que se utiliza para la cuantificación de la urea presente en suero y orina. Las
sustancias nitrogenadas de la sangre se dividen en dos fracciones: nitrógeno
proteico y nitrógeno no proteico. El nitrógeno no proteico comprende diferentes
sustancias: urea, aminoácidos, ácido úrico, creatinina, amonio, polipéptidos,
purinas, nucleótidos, fenol e indol. La Urea constituye la fracción de nitrógeno no
proteico más importante en la mayoría de los líquidos biológicos, en el hombre es
el principal producto final del metabolismo de las proteínas, y constituye alrededor
del 50% de los solutos contenidos en la orina. La concentración de urea en sangre
oscila entre 1.7 – 6.7 mmol/l y sólo aumenta de modo significativo cuando se ha
perdido más del 50% de la función renal. La concentración de urea en sangre es,
sin embargo, una medida bastante imperfecta de la función renal. Depende entre
otros factores, del aporte de proteínas en la dieta, del catabolismo proteico y del
volumen de la diuresis.
La urea es producida desde el hígado, después de la desaminación oxidativa de
los aminoácidos que representa una fuente de amoniaco para la ureogénesis o
ciclo de la urea. En condiciones normales, la intensidad del catabolismo se adapta
a la contribución exógena y, por tanto, la cantidad de nitrógeno excretada es la
misma a la de origen catabólico, la cual corresponde a la cantidad exógena. Por lo
que la urea contenida en el plasma es filtrada desde los glomérulos del riñón, y es
reabsorbida por los túbulos en el 40.0%. El grado de absorción varía con la
cantidad de agua reabsorbida. Es muy soluble, el 90.0% se excreta a través de la
vía urinaria, y el restante 10.0% por vía extrarrenal (sudor, heces).

85
Indicaciones
La determinación de la urea representa el diagnóstico más común para la
valoración de la funcionalidad renal. En el diagnóstico diferencial se emplea (con
la determinación de la creatinina) en:
- Hiperuremia prerrenal: deshidratación (disminuida absorción o excesiva
pérdida de agua), insuficiencia cardíaca, excesivo catabolismo proteico.
- Hiperuremia renal: alteraciones de la filtración glomerular y/o de la
absorción tubular (glomérulo nefritis, riñón policístico, necrosis tubular,
nefrosclerosis), alteración del flujo sanguíneo renal por enfermedad intrínseca del
riñón.
- Hiperuremia post-renal: obstrucción de las vías urinarias (cálculos,
hipertrofia prostática, neoplasia). Por lo que, una elevación de la concentración
sérica de urea, se interpreta generalmente como una posible difusión renal. Sin
embargo, no debe dejarse de lado el hecho de que los valores séricos de una urea
se encuentran íntimamente relacionados con la dieta y el metabolismo proteico,
por lo que cualquier alteración en estas variables se traducirá en un cambio de la
concentración de urea en suero.
La determinación de Urea en Suero está estrechamente vinculada con las
especialidades de Nefrología, Urología, Endocrinología, Cardiología y Nutrición.
Con este producto es posible realizar estudio de diagnóstico o pronóstico de una
enfermedad o condición clínica específica.

Muestreo
Suero y orina, la Urea es estables en suero 3 días a 2-8 °C

Modalidad de solicitud
La solicitud puede ser de carácter rutinaria (ayuna) o emergente, verificar la
idoneidad del muestreo en lo que es la identificación, presencia de coágulos,
lipemia, hemolisis, filamentos de fibrina, turbidez. Señalar eventualmente en el
resultado la no idoneidad de la muestra; transportar a temperatura ambiente;
Centrifugar a 3000 r.p.m por 5 mnts; La toma de muestra se puede conservar por
1 día a temperatura ambiente de 20-25⁰C, 7 días a 4ºC y 1 año en congelación.

Metódicas de determinación:
1-Método de diacetilmonosina
La urea reacciona a temperaturas altas en presencia de ácido fosfórico con la
diacetilmonosina, con formación de un producto coloreado en amarillo. La reacción
es catalizada por iones férricos.
2- Método enzimático cinético. Urea- UV
(Salic-Urea)
Se emplean 3 tipos de reactivos  R 1: Urea/Ureasa (3 frascos por 40 mL); R 2:
Urea/NADH (1 frasco por 32 mL) R 3: Urea 8,33 mmol/L Sol. de referencia (1
frasco por 5 mL). El reactivo es lineal en un rango de concentraciones de Urea de
1,7 a 50 mmol/L; Límite de detección: 0,915 mmol/L; Límite de cuantificación:
86
1,665 mol/L; Densidad óptica del blanco reactivo a 340 nm: De 1,700 a 1, 900 a
tiempo cero. En el que pueden interferir las Concentraciones de hemoglobina
superiores a 5 g/L, triglicéridos mayores de 11,4 mmol/L, de Glucosa mayores de
8 mmol/L y de Acido ascórbico mayores de 1,13 mmol/L sobrestiman la
concentración de Urea en suero y plasma normales y patológicos. Con fines de la
determinación de Urea en suero y plasma por método cinético ultravioleta. “PARA
USO IN VITRO”

Principio del método

Reacción enzimática de la Urea presente en la muestra, según las reacciones que
se describen a continuación, formándose un complejo coloreado que se cuantifica
por espectrofotometría, visto que, en medio alcalino y en presencia de salicilato e
hipoclorito de sodio, los iones de amonio reaccionan produciendo un compuesto
de color verde cuya absorbancia se mide a 580-620 nm según la casa comercial.
.
Ureasa
Urea + 2 H2O + H +------------------------------- NH4 + HCO3

GLDH
α-Cetoglutarato + 2 NADH----------------- 2 NAD+ + L-Glutamato + 2H2O
Donde:
GLDH: Glutamato deshidrogenasa
NADH: Nicotina adenina dinucleótido, forma reducida
NAD+: Nicotina adenina dinucleótido, forma oxidada.

Técnica:
Mezclar 4 volúmenes del Reactivo1 con 1 volumen del Reactivo 2 y juntar o
reaccionar 10microlitros de la muestra (suero o plasma) con 1ml de solución de
trabajo. Las lecturas son efectuadas a 340 nm a una temperatura de 37 ºC. Se
realiza una primera lectura (t1) a los 30 s y una segunda lectura (t2) a los 90 s
contra agua purificada a la misma longitud de onda.

Cálculo de la concentración de la urea.

t2 - t1 muestra
Conc =--------------------------- x 8,325 mmol/L
t2 - t1 referencia

Valores de referencia: De 3,3 a 8,3 mmol/L

Se asigna el valor a la solución de referencia de Urea 8,33 mmol/L utilizando

multicalibradores: ELICAL 2 (firma SEPPIM , No. Cat. CALI-1550), calibrador para
sistema automatizado (Cfas, Firma Roche No. Cat. 759350 ) y TruCal U ( Firma
DiaSys No. Cat. 591009910063).

87
Ensayo funcional
Se utilizan sueros control de concentración conocida de Urea en un rango de
valores normales y patológicos del analito: Elitrol I No. Cat. 0060 y Elitrol II No.
Cat. 0160 (Firma SEPPIM), Precinorm U No. Cat. 188 027 y Precipath U No. Cat.
188 006 (Firma Roche), Trulab N No .Cat. 590009910061 y Trulab P No. Cat.
590509910061 (Firma DiaSys

3-Método de Berthelot ( Salic-Urea)

Se emplea 4 tipos de reactivos-Urea 8,33mmol/L-sol. Referencia; Urea liofilizada-
1 tubo; reactivo color y reactivo alcalino, para la determinación de Urea en suero
por método enzimático colorimétrico a 620 nm. "PARA USO INVITRO". Lineal en
un rango de la concentración de Urea de 1,5 a 26,0 mmol/L. y específica para la
determinación dicha sustancia, por lo que al preparar el reactivo de trabajo no
debe agitarse pues podría causar la desnaturalización de la enzima. . Los
reactivos una vez abiertos son estables durante 4 semanas conservados de 2 a 8
°C y una semana a 15-25º c.

Materiales Adicionales
Reactivo 1: Fenol; R2: Hipoclorito de sodio; R3: Ureasa 100 U; R 4: Fosfato y
EDTA; Espectrofotómetro

Preparación de reactivos de referencia de la urea.

- Reactivo 1: Trasvasar cuantitativamente el contenido del reactivo 1 a un
frasco volumétrico de 500 mL, diluir con agua purificada, enrasar y homogeneizar.
La concentración del reactivo después de reconstituido es de 0,11 mol/L. Estable
durante 6 meses en frasco ámbar a un a temperatura de 2 a 8 °C Las soluciones
de referencia están listas para usarlas.
- Reactivo 2: Trasvasar cuantitativamente el contenido del reactivo 2 a un
frasco volumétrico de 500 mL, diluir con agua purificada, enrasar y homogeneizar.
La concentración del reactivo después de restituido es de 11 mol/L. Estable
durante 6 meses en frasco plástico a una temperatura de 2 a 8°C.
- Reactivo 3: Tomar una frasco del reactivo 3, reconstituir con 20 mL del
reactivo 4. Estable durante 6 días como mínimo a temperatura de 2 a 8 °C.
- Reactivo 4: Listo para usar
Nota: Dejar que los reactivos alcancen la temperatura de 25 a 30 °C y
homogeneizar perfectamente antes de

Principio del método

Reacción enzimática de la Urea presente en la muestra, según las reacciones que
se describen a continuación, formándose un complejo coloreado que se cuantifica
por espectrofotometría, visto que, en medio alcalino y en presencia de salicilato e
hipoclorito de sodio, los iones de amonio reaccionan produciendo un compuesto
de color verde cuya absorbancia se mide a 580-620 nm según la casa comercial.

88
Es decir que el método de Berthelot es una reacción enzimática de la Urea
presente en la muestra en la que se forma un complejo coloreado que se
cuantifica por espectrofotometría, en el que para preparar la curva de calibración,
realice el ensayo de referencia con cada una de las seis soluciones de Urea por
triplicado.

.
Ureasa
Urea + 2H2O Acido--------------------------- Carbónico + 2NH3
37 ºC
Na2Fe (CN)5NO
NH3 + NaCLO + Salicilato de sodio------------------------ Indofenol + H2O
NaOH

Sin embargo, la enzima ureasa reacciona sobre la urea, transformándola en iones

de amonio. Después, el amonio se hace reaccionar en medio alcalino con fenol y
hipoclorito, formándose azul de indofenol, cuya intensidad de color es proporcional
a la concentración de urea.

Técnica
Mezclar 0,02ml de muestra co 2ml del reactivo de trabajo e incubar a 37 ºC
durante 5 min. Leer los valores de absorbancia de la muestra y la referencia contra
blanco a 620 nm. Color desarrollado es estable durante 1h.
Orina: Diluir la orina, 0.1 ml (100 l) de muestra con 5 ml de agua destilada
(dilución 1:50), multiplicar el resultado por 10 y multiplicar por el volumen de orina
en litros. Ofrecer los resultados en mmol /24 h.

Notas
Todo el material a usar debe estar libre de amoniaco, metales pesados o
detergentes. Evitar contactos con las manos o contaminación con gotas de sudor.

Intervalo de referencia
De 1,7 a 8,3 mmol/L en suero y 333 – 582 mmol/24h en orina.

Chequeo del resultado

- Si el valor de la urea  150.0 mg/dl, repetir la medida.
- Si el valor del resultado repetido es el mismo, se puede entregar.
- Si el valor del resultado repetido es diferente, procesar nuevamente la
muestra utilizando un control patológico.
- Con valores de urea ≥ de 400 mg/dl, repetir la medida, sea concentrada y
diluida 1/2 con solución fisiológica y con un control patológico.
- Si la confrontación del valor concentrado está sobrepuesto al suero diluido y
el control está dentro el rango establecido, se puede entregar el resultado.
- Si el suero diluido no está en relación con el suero concentrado, diluir la
muestra 1/3 con solución fisiológica, siempre usando el control patológico.
89
Interferencias
Las interferencias más significativas son: Hemólisis- con Hb ≥ 10.0 g/l; Ictericia:
con bilirrubina ≥ 60.0 mg/dl; Lipemia- con triglicéridos ≥ 2000.0 mg/dl.

Criterios de validación de los resultados:

- Confrontar los parámetros de la funcionalidad del riñón (creatinina,
aclaramiento de la creatinina, proteínas urinarias, densidad urinaria).
- Confrontar parámetros del equilibrio electrolítico (sodio, potasio, cloro).
- Confrontar parámetros de funcionalidad hepática (AST, ALT, GGT).
- Controlar parámetros metabólicos (glucosa, ácido úrico; colesterol, HDL,
LDL).
- Controlar eventual estado de embarazo.
- Confrontar con funcionalidad sobrerrenal.

Comunicación de riesgo
Se tiene que comunicar inmediatamente con valores superiores a 100.0 mg/dl.
Control de Calidad
Se deberán usar sueros, control normal y patológico, en las mismas condiciones
que las muestras.

 Enzima Creatincinasa
Generalidades
La creatincinasa es una enzima que se encuentra en el reactivo de los métodos
enzimáticos, punto final y cinético, que se realizan mediante la reacción de Jafeé
con el propósito de cuantificar la creatinina presente en el suero. La creatinina es
una sustancia que deriva del metabolismo muscular (músculo estriado, liso y
cardíaco) de la creatina y representa el subproducto de excreción. La producción
de creatinina es independiente de la dieta y del ejercicio muscular; sin embargo,
es proporcional dentro de ciertos límites a la masa muscular. Se libera de los
glomérulos y no es reabsorbida por los túbulos, de los cuales puede ser excretada,
especialmente cuando se aumenta la concentración hemática. El aumento de la
creatinina en el suero empieza a ser evidente cuando el filtrado glomerular es por
debajo de 60 ml por minuto.

Indicaciones
La determinación de la cratinina es utilizada en el diagnóstico de las
enfermedades renales agudas o crónicas, y también para el monitoreo de la
diálisis renal. El aumento de la creatinina es un índice de la insuficiencia
glomerular en cuanto ésta es eliminada por filtración glomerular. Mientras la
uremia en la sangre puede ser controlada a través de una oportuna dieta, la
creatinina se correlaciona casi exclusivamente a la eficiencia de la filtración
glomerular. La creatinina representa el índice más fiel de la insuficiencia renal.
La creatinina, compuesto sumamente difusible, se elimina del organismo casi
exclusivamente por filtración renal. Su determinación en suero, así como el

90
clareance de creatinina endógena constituyen parámetros importantes para el
diagnóstico de diversas afecciones renales Las variaciones de las concentraciones
sanguíneas de Creatinina competen fundamentalmente a las especialidades de
Nefrología y Urología. Con este producto es posible realizar estudios de
diagnóstico, seguimiento o el pronóstico de una enfermedad o condición clínica
específica.

Muestreo
Suero, la creatitina es estables en suero 3 días a 2-8 °C
Modalidad de solicitud
La solicitud puede ser de carácter rutinaria (ayuna) o emergente, verificar la
idoneidad del muestreo en lo que es la identificación, presencia de coágulos,
lipemia, hemolisis, filamentos de fibrina, turbidez. Señalar eventualmente en el
resultado la no idoneidad de la muestra; transportar a temperatura ambiente;
Centrifugar a 3000 r.p.m por 5 mnts; La toma de muestra se puede conservar por
1 día a temperatura ambiente de 20-25⁰C, 7 días a 2-4ºC y 6 meses en
congelación.

Métodos
Para la determinación de la creatinina se puede emplear dos métodos, el de
punto final y cinético, ambos enzimáticos mediante la reacción de Jafeé. E l
reactivo de Jaffé está constituido por ácido pícrico- 14,62mmol/l(R1); Hidróxido de
sódio-1,25mol/l(R2) y creatinina 177micromol/l como blanco-muestra(sol.
referencia) útil para contrarrestar las interferencias. Estos dos métodos se difieren
uno del otro en los siguientes aspectos:
En el de punto final se debe desproteinizar la muestra, con vista a trabajar con
un filtrado libre de proteínas, mientras que en el cinético se obvia ese paso;
En el de punto final se lee a una longitud de onda de 500nm, y 510nm en el
cinético;
En el de punto final, para la preparación de la solución de trabajo se mezcla
1volume de ac.picrico con 4 volúmenes de NaOH, mientras que en el cinético se
mezcla 1volumen de ac.picrico con 9 volúmenes de NaOH. Pero en ambos casos,
la solución reactiva se preparó al momento del procesamiento y en caso de sobrar
se debe desechar.

Metódicas de determinación cinético y de punto final)

- Método físico
Absorción de la creatinina sobre la resina a cambio iónico y medir la absorbancia a
235 nm.
- Método cinético enzimático
El método enzimático colorimétrico consiste en la medida del color desarrollado
con el reactivo de Jaffe, antes y después de una reacción con la enzima
específica, la creatin cinasa; esta enzima transforma la creatinina en creatina con
medida final a 340 nm de la creatina.
91
Técnica
Mezclar bien 1ml del reactivo con 0,1ml de suero y transferir la solución a una
cubeta. Exactamente 10 s después de ser añadida la muestra o la referencia,
tomar la primera lectura (A1) y exactamente 1 min después realizar una segunda
lectura (A2). La determinación de la absorbancia se realiza a una longitud de onda
de 510 nm y a una temperatura de 37 °C.

Método colorimétrico y procedimiento analítico de punto final

Además de la determinación de la creatinina con una técnica de punto final, más
frecuentemente se utiliza una técnica cinética en la cual la creatinina en medio
alcalino reacciona con picrato produciendo un complejo coloreado rojo-naranja; la
diferencia de absorción durante el tiempo de conversión es directamente
proporcional a la concentración de creatinina en la muestra.

Principio del método.

Determinación colorimétrica de la Creatinina por la reacción con el ácido pícrico en
medio alcalino, obteniéndose un complejo de color amarillo rojizo que es
proporcional a la concentración de Creatinina en suero.

Creatin-cinasa
Picrato alcalino + creatinina---------------------------- picrato de creatinina
(ac.picrico y NaOH) (color amarrilo-naranja)

Por lo que, la cretina se convierte en fosfocreatina útil para la contracción

muscular por la acción de enzima y espontáneamente a su vez va convirtiéndose
en anhídrido (creatinina) inútil para el organismo, de allí que resulta ser expulso
por los órganos de excreción.

Técnica punto final

Reactivo de trabajo: mezcle un volumen del reactivo 2 con 4 volúmenes del
reactivo 1. Reactivo 3: Tomar 10 volúmenes del reactivo y diluir hasta 100
volúmenes con agua purificada en frasco volumétrico. Los reactivos una vez
abiertos son estables durante 6 meses conservados de 2 a 8 ºC El reactivo de
trabajo debe ser preparado en el momento de ser utilizado. Desechar el resto al
finalizar la jornada laboral. Y los resultados se escriben con una cifra decimal.

Cálculo de la concentración de creatinina

Absorbancia Muestra (1y2)
---------------------------------------- x CP = CM
Absorbancia Patrón (1y2)

Valor de referencia: De 47,83 a 113,4

92
Interferencias
Concentraciones de bilirrubina superiores a 85 μmol/L sobreestiman los valores
normales de Creatinina. La lectura de la absorbancia de la muestra debe
realizarse en el tiempo reportado para ambos métodos, de no ser así existirían
interferencias de compuestos tales como: ácido ascórbico, hemoglobina, piruvato
y glucosa entre otros.

Criterios de validación
Confrontar parámetros de funcionalidad renal (urea, potasio, proteínas, densidad
urinaria); Confrontar parámetros de equilibrio electrolíticos (sodio, potasio, cloro);
Controlar sexo y edad del paciente y también eventual estado de embarazo y
Controlar parámetros del metabolismo muscular (CPK, míoglobulina).

Comunicación de riesgo
Se tiene que comunicar inmediatamente con valores ≥ 6.0 mg/dl.

 Enzima Uricasa

La uricasa es una enzima que se encuentra en el reactivo de los métodos Uric

Ácid Mono SL que se utiliza para determinar los niveles de ácido úrico en el
suero. El ácido úrico es el producto final del catabolismo de las purinas (adenina,
guanina) provenientes del exterior con la alimentación (parte exógena) y del
interior con el ácido nucleico (parte endógena). Todas las purinas se transforman
en xantina e hipoxantina; después, la enzima xantina-oxidasa las oxida y las
convierte en ácido úrico. Al hombre, a diferencia de todas las especies animales,
le falta la enzima uricasa, y no puede transformar el ácido úrico en alantoína. El
ácido úrico es poco soluble en la sangre, se encuentra en forma de urato
monosódico y está ligado a proteínas (albúmina, alfa 1 y alfa 2 globulina). La
mayor parte del ácido úrico es eliminada por el riñón a través de un mecanismo de
filtración, reabsorción y excreción.

Indicaciones
La alteración puede estar relacionada con dietas ricas en purinas o con
aumentada producción endógena o con una reducida excreción.
La determinación del nivel del ácido úrico está indicado en el diagnóstico y
monitoreo de algunos desórdenes metabólicos dietéticos: gota, síndrome
dismetabólico alimenticio, neoplasia linfomielo-proliferativa (como linfomas,
leucemias, policitemia), anemia hemolítica, enfermedad del riñón y pacientes en
terapias citostática o radioterapia. Por lo que, los niveles de ácido úrico están
asociados al nitrógeno retenido, la urea, la creatinina y otros constituyentes no
proteicos.

93
Muestreo
Suero o plasma. El ácido úrico es estable de 3 a 5 días en suero a 2-8 0C. y
Orina: Diluir la orina, 0.1 ml (100 l) de muestra con 0.9 ml (900 l) de agua
destilada (dilución 1:10), multiplicar el resultado por 10 y multiplicar por el
volumen de orina en litros y dividir entre 1000. Ofrecer los resultados en mmol /24
h).
La solicitud es solamente de carácter rutinaria en ayuna, con previo preparación
del paciente, verificar la idoneidad del muestreo en lo que es la identificación,
hemólisis, lipemia, presencia de coágulos, filamentos de fibrina, turbidez. Señalar
eventualmente en el resultado la no idoneidad de la muestra; transportar a
temperatura ambiente; Centrifugar a 3000 r.p.m por 5 mnts y separar del suero;
transportar a temperatura ambiente y conservar por 5 días a 2 - 4⁰C, 6 semanas
en congelación a -20⁰C.

Metódicas de determinación

- Método colorimétrico
El ácido úrico en ambiente alcalino reduce el ácido fosfotúngstico con formación
de color azul; la intensidad del color es proporcional a la cantidad de ácido úrico.
Antes de desproteinizar con el Folin Wu.

- Método físico-enzimático
El ácido úrico presenta en ultravioleta un pico de absorbancia alrededor de 290
nm; la absorbancia a esa longitud de onda está completamente eliminada por la
acción de la uricasa, la cual transforma el ácido úrico en alantoína. Por la
disminución de la extinción óptica, se conoce la concentración del ácido úrico.

Método enzimático
El ácido úrico es oxidado por la uricasa a alantoína y peróxido de hidrógeno que,
en presencia de POD y 4-AF y DCPS, forma un compuesto rosáceo.

uricasa
Ácido úrico + O2 + 2 H2O------------- alantoína + CO2 + H2O2

peroxidasa
H2O2 + 4- Amino antipirina + DCFS------------ Quinoneimina + 4 H2O

Procedimiento
Mezclar e incubar 5 minutos a 37 0C ó 10 minutos a temperatura ambiente.
Ajustar a cero con blanco reactivo. Efectuar las lecturas a 505 nm (490-550) de las
absorbancias del estándar y de la muestra frente a blanco reactivo.
Coloración estable como mínimo 30minutos. O se puede seguir las instrucciones
de la casa comercial.

94
Control de Calidad
Se deberá usar sueros, control normal y patológico, en las mismas condiciones
que las muestras.

Notas sobre la metódica

Linealidad: La metódica es lineal hasta 25.0 mg/dl, esto es decir que el método
es lineal hasta 1487 umol/l. Para concentraciones superiores mezclar 0.1 ml (100
l) de muestra con 0.2 ml (200 l) de cloruro de sodio al 0.9 % y repetir la
determinación, multiplicar el resultado por 3.
Sensibilidad: La metódica tiene una sensibilidad de 0.2 mg/dl.

Especificidad
La metódica de uricasa es específica para el ácido úrico; sin embargo, también
para los otros derivados de las purinas.

Interferencias
Pueden presentar interferencias: El suero ict

de ácido úrico: fenacetina, aminofenolo, idralazina, metildopa, levadopa.

Valores de referencias
- Hombre 26 – 60 mg/L
- Mujer 35 – 32 mg/L
- Suero: M: 142 - 339 umol/l H: 202 - 416 umol/l
- Orina: 1.2 – 6 mmol/24 h.

Criterios de validación
Con valores muy elevados
Confrontar otros parámetros en relación con procesos inflamatorios: conteo de
glóbulos blancos, VSG, PCR, fibrinógeno; Controlar los parámetros de alteración
metabólica: glucosa, colesterol, triglicéridos, apolipoproteínas.
Controlar los parámetros de los procesos displásicos: VSG, parámetros
oncológicos, fórmula leucocitaria y glóbulos rojos; Controlar los parámetros de la
funcionalidad del riñón: creatinina, electrolitos, examen de orina; Antes de la
sintomatología dolorosa en la gota, se eleva el nivel de ácido úrico. Y el resultado
se escribe con una sola cifra decimal

95
2.2.2. Enzimas como Herramientas de Trabajo en el Laboratorio de Anatomía
Patológica.

 Enzima α Amilasa

La enzima α Amilasa se utiliza en la técnica del Acido periódico de Schiff (PAS)

para la determinación del glucógeno, único glúcido almacenado no ligado a
proteínas (libre) en el organismo de los mamíferos.

Como además del glucógeno, existen otras sustancias que son teñidas por el
PAS, de allí que es necesario una preparación de control que elimine
específicamente el glucógeno, tratase de la enzima amilasa, pues las estructuras
que contienen el glucógeno aparecen teñidas con el PAS tan pronto cuando se
somete a la amilasa; demostrándose así la presencia del glucógeno en el hígado y
en el musculo estriado y se establece también el diagnostico de diversas
afecciones que producen un deposito intracelular anormal del glucógeno.

2.2.3. Enzimas como Herramientas de Trabajo en el Laboratorio de

Microbiología.

Para referirse de enzimas como herramientas de trabajo en el laboratorio de

microbiología, estaríamos evidentemente ante un paso muy importante en el
desarrollo de los medios de diagnósticos, prevención, control, tratamiento de
múltiples enfermedades que han afectado la humanidad en un momento
históricamente mercado por limitaciones científico – tecnológicas en cuya
reversión se hace evidente desde los finales del pasado siglo debido la
introducción de la automatización y medios de investigaciones altamente eficientes
en los laboratorios microbiológicos. Por lo tanto, todos los métodos agrupados
bajo la denominación común de inmunoensayos se basan en la reacción de una
proteína (anticuerpo específico) con un antígeno marcado y con un antígeno
endógeno (el que se quiere determinar). Ambos antígenos compiten por la unión
con el anticuerpo y ello ha hecho que estas metodologías reciban también el
nombre de ensayos de unión competitiva. Su introducción en la década de los 60
del siglo XX significó una verdadera revolución en el laboratorio médico. La
sensibilidad del empleo de isótopos radiactivos primero y de otros ligandos
después, unido a la alta especificidad de las proteínas de unión, hizo posible
alcanzar la sensibilidad y especificidad necesarias para medir con precisión las
concentraciones fisiológicas de sustancias que se encuentran en el plasma: en
microgramos, nanogramos y picogramos.
Los primeros intentos de medir moléculas de interés médico en los fluidos
biológicos, datan de la década del 40 del siglo XX, y concernieron principalmente a
metabolitos tales como glucosa, urea y enzimas, ya que estas podían transformar
muchas moléculas de sustrato, también la determinación de la presencia de
antígenos en macro reacciones inmunológicas. Sin embargo, una importante

96
cantidad de sustancias y especies de interés vital, no podían medirse o detectarse
directamente, ni podían someterse al análisis enzimático, o estaban presentes en
concentraciones muy pequeñas para su detección por los métodos clásicos de
química clínica.
A partir de las últimas décadas del pasado siglo creció el interés por aquellos
métodos de análisis que aprovechan la gran sensibilidad y especificidad de las
reacciones inmunológicas, potabilizadas con la aparición de los inmunoensayos y
posteriormente los enzimoinmunoensayos(EIE) que se presumen en ELISA lo que
ha permitido detectar sustancias presentes en concentraciones muy pequeñas en
muestras biológicas y el actual método ultramicroanalitico también conocido por
ultramicroELISA, que visualiza especies ultramicroscópicas cuya observación con
simples inmunoensayos o radioinmunoensayos no era posible, teniendo de este
modo gran significado en la práctica médica posibilitado por el empleo de enzimas
como marcadores de las reacciones librando el ser humano del efecto de las
radiaciones que anteriormente se emitían en los radio inmunoensayos así como la
posibilidad de visualizar reacciones de especies muy pequeños(VIH).
En el año de 1950, Coons y Kaplan describieron los métodos de marcaje
fluorescente de Ac para la técnica de Inmunofluorescencia, pero, esta no podía
detectar antígenos en muestras ultramicroscópicas, ya en 1959-1960 surgen las
Técnicas de Radio inmunoensayo (RIA), a partir de los trabajos de Yalow y
Berson, donde presentan un método para la detección de algunas sustancias, las
cuales estaban marcadas con isótopos, las cuales constituían antígenos para
determinados anticuerpos. Sin embargo debido a que el tiempo de vida media de
mucho de los isótopos radiactivos es limitada, el efecto dañino de las radiaciones
tanto para la salud humana de los operadores como para el ambiente, así como la
necesidad de separar los anticuerpos unidos a los antígenos marcados y no
marcados, además del alto costo de los equipos contadores de radiactividad y las
restricciones legales en el uso de marcadores radioactivos en algunos países,
motivó a que muchos investigadores desarrollaran otros métodos de
inmunoensayo en los que utilizaban marcadores no isotópicos, fue cuando en
1971 se reportan métodos enzimoinmunoesayos conocidas como técnicas ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay) descritas casi al mismo tiempo por dos
grupos de trabajo, el de Eva Engvall y Perlman en Suecia y el de Van Wemeen y
Schuurs en Holanda, utilizando tubos de polietileno como soporte o fase sólida en
que fijaron anticuerpos, a los que se enlazaban los antígenos o sustancias a
detectar, a éstas posteriormente se le unían anticuerpos marcados con enzimas, y
en los años de 1972 y 1975 se desarrollan procedimientos de inmunoensayo
homogéneo y el de obtención de anticuerpos monoclonales dados por Rubenstein
y Kolher respectivamente.

97
2.2.3.1. Definiciones Importantes
- Inmunidad

Conjunto de mecanismos fisiológicos que permiten reconocer, neutralizar y

eliminar sustancias identificadas por el organismo como ajenas a él.
- Antígeno (Ag)
Sustancia extraña al organismo, capaz de combinarse con los efectores de la
respuesta inmunológica. Por su naturaleza pueden ser proteínas, lípidos,
carbohidratos, ácidos nucléicos.

- Anticuerpos(Ac)
Sustancias producidas por el organismo en respuesta a un determinado antígeno
(en respuesta a un determinado estímulo inmunogénico), su función fundamental
es interactuar con los antígenos. Por lo que puede considerar anticuerpo,
cualquiera de las cerca de un millón de tipos de moléculas proteicas que producen
más células denominadas linfocitos, y cuyo papel principal es actuar como
defensas contra la invasión de sustancias extrañas. Los anticuerpos, que son un
componente importante del sistema inmunológico, están en todos los vertebrados,
en la fracción de la sangre llamada gammaglobulina.

- Enzimoinmunoensayo(EIE)

inmunoensayos en los cuales la detección del compuesto a determinar es

realizada al evaluar los cambios de concentración en el producto de una reacción
enzimática fundamentadas en las reacciones antígeno-anticuerpo y enzima-
sustrato.
2.2.3.2. Técnicas inmunoenzimáticas

Las técnicas inmunoenzimáticas forman parte de las reacciones serológicas que

utilizan conjugados, los cuales deben poseer actividad inmunológica y enzimática. Al
estar uno de los componentes (antígeno o anticuerpo) marcado con una enzima e
insolubilizado sobre un soporte, la reacción Ag-Ac quedará inmovilizada y por tanto
podrá ser revelada mediante la adición de sustrato específico que al actuar sobre la
enzima producirá un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso
de espectrofotómetro o colorímetro.
Ag + AC …….. Agm + E …… + S ------ Produto de la reacción

La continuidad de este proceso de inmunodiagnóstico es asegurado por la

existencia de la muestra que puede ser el antígeno o anticuerpo, con un
conjugado que es el enlace entre propiedades inmunológicas y enzimáticas y el
sustrato que evidencian la ocurrencia de las reacciones dadas por los cambios de

98
color, turbidez, luz fluorescencia y radiaciones que podrían ser visualizados por
distintos equipos como espectrofotométricos, colorimétricos, turbimétricos, etc.
Enzimas más utilizadas en técnicas de enzimoinmunoensayos: Peroxidasa,
Fosfatasa alcalina, Beta galactosidasa, Glucosa oxidasa, Mlato-Deshidrogenasa,
Glucosa GP-Deshidrogenasa.

¿Por qué si existen diversos marcadores se prefieren las enzimas como

marcadores de Ag o Ac?

Fundamentalmente se prefiera las enzimas como marcadores en estos

inmunoenzayos debido a su alto grado de especificidad, estabilidad en condiciones
de almacenamiento y de test, fácil obtención en el mercado, baratas, gran cantidad
de sustratos disponibles: fluorigénicos-cromogénicos, forman conjugados estables y
conservan su actividad después de la conjugación, no se contaminan, no requiere de
permiso para su uso. Además de no producir efectos dañinos al manipulador como
era el caso de los radioinmunoensayos
2.2.3.3. Tipos de enzimoinmunoensayos

1) De acuerdo a si requiere o no separación de los componentes del sistema

Pueden ser homogéneos, heterogéneos.
2) De acuerdo a la naturaleza de la reacción
a) Competitivos - con antígeno conjugado a enzima y con anticuerpo
conjugado a enzima.
b) No competitivos- tipo sándwich o doble anticuerpos Indirecto y
modificación del doble anticuerpo (captura).
3) De acuerdo a la fase en que se realizan: Fase sólida y líquida
4) De acuerdo al objetivo que persiguen: Cuantitativos y Cualitativos
5) De acuerdo al trabajo en rangos (volúmenes de trabajo): Macro, micro y
ultramicroanálisis.
6) De acuerdo a la sustancia marcadora:Isotópicos y no isotópicos
7) De acuerdo a la actividad del ensayo: Amplificación y modulación.

Técnica de enzime-linked-inmunoabsorbent assay( ELISA)

El término ELISA proviene de las siglas en ingles enzime-linked-inmunoabsorbent

assay cuya traducción es ensayo de inmuno absorción con anticuerpos ligados a
enzima ósea anticuerpos acoplados a enzima cuyo principio se basa en: el suero
antiglobulínico o los anticuerpos anti-immunoglobulina como por ejemplo el anti-
IgG se acopla a una enzima para formar un conjugado desarrollándose un color
proporcionar a la cantidad de anticuerpos fijados; pudiéndose estimar por la
medición de la densidad óptica que ofrece un valor numérico.
Resulta importante a profundizar de los EIE heterogéneos más conocidos con el
nombre ELISA (enzime-linked-immunoabsorbent assay), visto que son la base
99
fundamental del funcionamiento del SUMA, Fueron los primeros en ser
descubiertos, que pueden ser directo, indirecto, sándwich y captura. Por tanto en
esta técnica el conjugado fijado en la reacción y el libre pueden ser separados
físicamente para poder evaluar el resultado de la técnica.
La técnica de enzimoinmunoensayo (ELISA) se desarrolló a partir del RIA. La
diferencia fundamental es la sustitución del isótopo por la unión de una enzima al
anticuerpo, que “activa” al marcador alternativo (sustancia que emite la señal),
cuando se libera al producirse la unión del anticuerpo con el antígeno que se
quiere detectar. Por lo general, ello acorta el tiempo de incubación de los ensayos,
y agiliza el procedimiento.
La mayor parte de los enzimoinmunoensayos son de origen comercial,
desarrollados originalmente en pequeños viales. En la actualidad se utilizan
microplacas que facilitan el trabajo, muchas de ellas con pocillos desprendibles
para ahorrar reactivos. La selección del método que se va a emplear depende de
varios factores: del tipo de muestra biológica que trabaja, del tipo de pacientes que
es atendido en el centro de salud y, sobre todo, de la relación costo beneficio que
se espera, así como de las posibilidades económicas con que se cuenta. Por lo
general, los equipos de última tecnología para inmunoensayo procesan volúmenes
de muestras de alrededor de 90 muestras por hora, hasta 120 muestras por hora,
con muy buena eficiencia. Estos pueden desarrollar varios ensayos para la misma
muestra. De acuerdo a la actividad del ensayo: Amplificación y modulación.
2.2.3.4. Sistema Ultra Micro Analítico (SUMA).
Tecnología SUMA: Sistema integral que incluye equipos, reactivos y software.

Resulta interesante tener en cuenta que los ELISA pueden estar en laboratorios
de todo el mundo sin embargo hablar de SUMA es reconocer una tecnología
cubana.
¿Por qué surge la Tecnología SUMA?

La situación de la mortalidad infantil cubana había experimentado cambios

significativos en la década de los años 70, como consecuencia de la aplicación de
un plan de medidas sanitarias y preventivas, e innumerables inversiones en
centros asistenciales, así como el establecimiento de un sistema médico
preventivo y asistencial.
Las enfermedades infecciosas y diarreicas agudas, así como las infecciones
perinatales en general, mostraron disminuciones sostenidas y comenzaron
entonces a hacerse evidentes otras causas de enfermedad y de muertes, que por
su relativa baja frecuencia habían resultado menos importantes como es el caso
de las malformaciones congénitas y de las enfermedades hereditarias y genéticas.
Sin embargo, para enfrentar esta nueva problemática de salud se requería del
establecimiento de un efectivo sistema de atención primaria, y de la realización de
100
estudios a escala masiva, con el objetivo de detectar y/o evitar de manera precoz
las enfermedades que de una u otra manera afectan la calidad de vida del ser
humano, fue así que en 1979, se inició el desarrollo de una técnica que permitiría
estudiar un gran número de muestras, con el más bajo costo posible, conjugando
las ventajas de los métodos ELISA pero utilizando ultra micro volúmenes (10
microlitros de muestras y reactivos).
El desarrollo a escala de laboratorio de un ultra micro método de inmunoensayo
de 10 microlitros para la cuantificación de AFP en el suero de las gestantes y del
instrumental necesario, condicionaron el surgimiento, desarrollo y aplicación de lo
que posteriormente sería la tecnología SUMA como un sistema de diagnóstico
integral basado en las técnicas de inmunoensayo.
2.2.3.4.1. Componentes de la tecnología SUMA

 Lavador MAS 301, MW 2001; Lector PR 521; Estuches de reactivos

En la actualidad en el CIE se diseñan y se producen todos los equipos necesarios
para llevar a cabo los programas de pesquizaje con la mejor calidad y a un costo
mínimo.

Labador Lector de Placas

Computadora
101
 Macro y Micro placas Estuche de Reactivos

Además de trabajar de modo autónomo, este equipo se puede acoplar a una

computadora y trabajarlo con un programa especializado (Strip Reader Software).
La versión más actual de este programa es la 8.0.
2.2.3.5. Aplicaciones de la tecnología SUMA
En la actualidad existen 176 laboratorios instalados en nuestro país que utilizan la
tecnología SUMA (Red Nacional de Laboratorios SUMA) ya sea en Hospitales
Maternos, Banco de Sangre, policlínicos como en Centros de Higiene y
Epidemiología, destinados a servir a toda la población en general y su buen
funcionamiento depende no sólo de la calidad de los equipos y reactivos, sino
también de la capacitación del personal que en ellos labora, constituyendo un
modelo de organización para pesquizajes masivos en países en vías de
desarrollo. Además nuestra tecnología se utiliza en otros países como Venezuela,
Brasil, Argentina, México, Colombia y China.
En todas determinaciones por el método SUMA se utilizara como marcador la
única enzima (fosfatasa alcalina) que genera un producto fluorescente pero con
una variación de la placa que viene de la fábrica especificada así como la estucha
de cada tipo de determinación.
Con la metodología establecida y partiendo del modelo inicial del UMELISA-AFP
se desarrollaron más de 20 ensayos diferentes, los cuales se aplican en diversos
programas de salud. El desarrollo y aplicación de la tecnología SUMA en los
últimos 17 años ha estado orientada fundamentalmente a programas o
aplicaciones de salud en tres líneas de trabajo principales:
1- Certificación de sangre
- UMELISA HIV 1,2 recombinante detección de anticuerpos al VIH1 y 2 en
suero, plasma y sangre seca;
- UMELISA HTLV I-II suero, plasma y sangre seca sobre papel de filtro;
- UMELISA HBs Ag PLUS determinación de antígeno de superficie del VHB;
- Test HbsAg Confirmatory confirmación de muestras positivas;

102
 - UMELISA Anti HBsAg para detección de anticuerpos anti HbsAg en suero
humano;
- UMELISA Anti HBc para la detección al antígeno core del virus de la
Hepatitis B en suero humano;
- UMELISA Chagas detección de anticuerpos IgG al Tripanosoma cruzi;
- UMELISA HCV detección de anticuerpos al virus de la hepatitis C.

2- Vigilancia epidemiológica
- UMELISA Dengue IgM detección de anticuerpos IgM al virus del Dengue
- UMELISA Dengue IgG detección de anticuerpos IgG
- UMELISA Hansen detección de anticuerpos IgM al Micobacterium leprae
- UMELISA Tetanus determinación de anticuerpos IgG al toxoide tetánico
- UMELISA Chagas detección de anticuerpos al Tripanosoma cruzi
- UMELISA Toxoplasma determinación de anticuerpos IgG al Toxoplasma
gondii

3- Materno infantil
Para la atención prenatal y neonatal dispone de estuches UMELISA con
fines de:
- Detección de alfa feto proteína en suero y líquido amniótico (AFP);
- Determinación cuantitativa de Inmunoglobulina G (IgG);
- Determinación de gonadotropina coriónica en suero u orina (HCG)-
embarazos;
- T4 neonatal para determinar tiroxina total en sangre seca sobre pf;
- Detectar cuantitativamente hormona estimulante del tiroides (tirotropina -
TSH) en sangre seca sobre papel de filtro.

2.2.3.5.1. Algunos de los exámenes más frecuentes en laboratorio de SUMA

1- Pruebas de diagnostico y certificación desangre
a) Prueba de diagnóstico del VIH
El VIH es un retrovirus humano que pertenece al género de los Lentivirus que
muestra especial afinidad por los linfocitos T los que expresan el marcador
fenotípico CD4 en su superficie, afecta también otros componentes del sistema
inmunitario tales como monocitos, macrófagos, células dendríticas tisulares.
Tipos de VIH: hasta la fecha se conoce dos especies “el VIH1 y VIH2”, de los
cuales el tipo 1 es el más extendido en el mundo debido a que es de fácil
transmisión causando enfermedades con mayor rapidez y frecuencia, más
virulento siendo así el responsable de la actual pandemia y existen más de 120
cepas y 3 grupos grandes M, N, O. Dentro del grupo M se encuentran los subtipos
A,B,C ,D ,F, G,H el E y el I han dejado de existir como subtipos independientes
para convertirse en subtipos recombinantes, mientras que el VIH tipo 2 es de difícil
transmisión, menos virulento y está limitado hacia zonas de África Occidental.

103
Características y composición del VIH

Las partículas víricas tienen la forma de pequeñas esferas y cada una lleva unas
ochenta puntas pequeñas y redondeadas en forma de gancho. Cada gancho
contiene varias moléculas de una gran proteína, la gp120 que presenta una
afinidad muy acusada con los receptores específicos de los linfocitos T4 (o CD4).
Asociadas a proteínas más pequeñas transmembranales, denominadas gp41, las
moléculas de gp120 permiten, después de la adhesión inicial de virus a la célula,
la fusión de la envoltura del virus con la membrana de la célula y así el paso de los
constituyentes internos del virus al interior de la célula. Es probable que esa fusión
dependa de un cambio de estructura de la gp120, relacionado éste con una
fijación de una de sus partes a otro receptor de la superficie de la célula.

Los componentes internos del virus, aquellos que penetran en la célula,

constituyen la nucleocápside, formada por dos células idénticas de ARN y de
proteínas, entre las que se encuentra la famosa enzima de replicación, la
transcriptasa inversa, y proteínas internas de envoltura, las principales de las
cuales son las p24 (aún denominadas p25), p18, p7 y p9. Estas proteínas
internas están codificadas por un gen denominado gag y son sintetizadas en
primer lugar en forma de una cinta larga que es cortada inmediatamente por otra
enzima específica del virus, denominada proteasa. Muchas de las investigaciones
se han centrado en la puesta a punto de los inhibidores específicos de estas dos
enzimas, la transcriptasa inversa y la proteasa.

Las pruebas de laboratorio están recomendadas para la detención de respuesta y

evolución inmunológica o vírica, valorar la respuesta a los anti retrovirus y
seguimiento que se basa en la demostración de los anticuerpos anti-VIH y serologías,
así como el cultivo del virus in vivo.

La expansión del acceso al asesoramiento y las pruebas del VIH es un imperativo

tanto de salud pública como de derechos humanos, por lo que en las nuevas
indicaciones de la OMS y el ONUSIDA se aconseja que, en todo el mundo, los
proveedores de atención recomienden el asesoramiento y las pruebas del VIH a
todos los pacientes que acudan al médico con dolencias sospechosas de infección
por VIH, pero al mismo tiempo, y en todos los casos de asesoramiento y pruebas
del VIH, se deben respetar las 3 C: consentimiento, confidencialidad y consejo.

Para el diagnóstico se emplean dos tipos de pruebas:

1-Pruebas de pesquizaje – Enzime Linked Inmunoabsorbent Assay (ELISA) y

tiras reactivas, son pruebas simples, baratas y rápidas.

2- Pruebas confirmatorias o moleculares - Western blot; Reacción en cadena

de las polimerasas (PCR); Inmunoflorescencia indirecta (IFI); aislamiento viral.

104
Por la historia natural de la enfermedad sin tratamiento, la cual se manifiesta en
diferentes fases ocupando cada una distintas particularidades.
Periodo de Ventana: en esta etapa el virus se puede detectar solo por pruebas
moleculares y abarca desde la entrada del virus al organismo hasta el comienzo de la
siguiente fase. Dentro de este mismo periodo se encuentra la etapa precoz y aguda
donde el virus comienza a multiplicarse de forma activa y puede desarrollar o no
síntomas, presentando alta carga viral lo que le resulta muy infeccioso. La infección
se detecta por aislamiento viral, presencia de antígeno P24 en el suero, el UMELISA
VIH-1y VIH-2 negativo. El tiempo que trascurre entre el contagio y la seroconversión
que varía entre 2semanas hasta 3 meses pudiéndose extender a 6 meses en algunos
individuos.
Periodo de incubación o fase intermedia o crónica: se detectan anticuerpos en el
suero pero no antígenos circulantes, puede durar de 10 a 15 años, abarca desde el
inicio de la infección hasta la de los primeros síntomas clínicos, por tanto el paciente
es asintomático, carga viral disminuye, UMELISA y Western blot reactivos.
Fase final o de crisis : se caracteriza por alta carga viral, derrumbe del sistema
inmune , disminución de los linfocitos TCD 4 , aumento del antígeno P 24 ,
disminución de los anticuerpos y la aparición de las infecciones oportunistas. Se
evidencia la enfermedad en cuyo periodo puede prolongar con el tratamiento
antirretroviral.
El UMELISA VIH 1+2 Recombinant -es un ensayo inmunoenzimático indirecto para
la determinación de anticuerpos al VIH en suero, plasma, o sangre fresca sobre papel
de filtro que emplea como antígenos de captura la gp120, gp41, y p24, proteínas
representativa de la envoltura y el núcleo del Vih1 así como la gp36 proteína
representativa de la envoltura del Vih2 obtenidas por métodos recombinantes y
péptidos sintéticos, basado en el ELISA (análisis inmuno absorbente ligando a
enzimas) que emplea el equipo SUMA (Sistema Ultra Micro Analítico) en el que su
grado de automatización ha permitido la reducción del tiempo total del ensayo por
ende el tiempo de espera de los resultados.

El Western Blot es la metodología más utilizada para determinar la reactividad al

UMELISA y se aplica a una segunda muestra para confirmar el diagnóstico Se
basa en el principio de un ELISA indirecto. Como fase sólida utiliza las tiras de
nitrocelulosa donde previamente se han fijado proteínas estructurales del VIH-1.
Como sistema revelado emplea imunoglobulina G de conejo antihumana marcada
con peroxidasa y sustrato cromogénico peróxido de hidrogeno.
La técnica UMELISA HIV 1+2 Recombinant es un examen preliminar más
empleada en nuestro sistema sanitario, pero no es determinante, por eso se
recomienda la repetitividad y en casos positivos se debe hacer tres veces el ensayo y
después hacérselo el confirmativo.

105
Principio de fundamentación del ensayo

Ensayo inmunoenzimático indirecto; Fase sólida tiras de UltramicroELISA recubiertas

con los antígenos; Se añade la muestra en los pocillos de la placa de reacción y si
contiene anticuerpos específicos, se fijan al antígeno del recubrimiento; Se añade
conjugado Anti IgG humana-Fosfatasa alcalina el cual se unirá a los anticuerpos
fijados en la reacción anterior; Al añadir un sustrato
fluorigénico(4metilumbeliferilfosfato), este será hidrolizado y la intensidad de la
fluorescencia emitida permitirá detectar la presencia de anticuerpos al VIH1 0 VIH2
en la muestra. Las cantidades de la muestra, enzima y sustrato adicionados en el
procedimiento siempre será de 10 microlitros, así como la temperatura de incubación
de 37ºc; Sensibilidad y especificidad 100%.(figura1.13)

Figura 1.12. Procedimiento del UMELISA HV 1-2. Recombinat

Tomado de los Manuales de SUMA

El procesamiento de la información se puede realizar directamente en el equipo,

mediante funciones establecidas en el o a través de una computadora acoplada
vía RS-232, permitiendo el uso de programas más diversos y especializados,
suministrados por el fabricante.

106
Tratamiento con Antirretrovirales

Muchas de las investigaciones se han centrado en la puesta a punto de los

inhibidores específicos de las dos enzimas, la transcriptasa inversa (enzima de
replicación) y la proteasa (proteínas internas de la envoltura) que integran a los
componentes internos del virus, los que penetran en la célula constituyendo la
nucleocápside formada por dos células idénticas de ARN y de proteínas, las
principales de las cuales son las p24 (aún denominadas p25), p18, p7 y p9. Estas
proteínas internas están codificadas por un gen denominado gag y son
sintetizadas en primer lugar en forma de una cinta larga que es cortada
inmediatamente por otra enzima específica del virus, denominada proteasa.

El curso clínico de la enfermedad es funesto, sin embargo el pronóstico de la

infección por VIH ha cambiado radicalmente con la aparición de fármacos
antirretrovirales que inhiben la retrotranscriptasa inversa y los de la proteasa, en
cuya administración combinada permiten detener la evolución de la enfermedad e
incluso mantener la viremia en tasas prácticamente indetectables, aun poca
porcentaje de enfermos de SIDA en el mundo se benefician de este tratamiento.

Criterios para el inicio del tratamiento con antirretrovirales según la OMS:

- Sintomática de SIDA en el estadio IV

- Carga viral superior 5 000 ò 10 000 copias/ml de sangre
- Sintomático de SIDA en el estadio III con CD4 (T4) menor de 350
células/ml de sangre.
- Sintomático o asintomático con CD4 menor de 200 células/ml de sangre,
pero en todos los nos casos el inicio del tratamiento debe ser precedido de
una equitativa preparación del paciente o familiares de este, ya que una vez
iniciado la quimioterapia será para toda su vida.

Grupos Farmacológicos más utilizados

1- Inhibidores nucleosídicos de la retrotranscriptasa inversa, donde

encontramos combinaciones de zidovudine (AZT), lamivudine (3TC),
stavudine (D4T), didanosine (DDI), abacavir (ABC), tenofovir DF (TDF);
Estas medicinas interfieren con un paso crítico durante el ciclo de vida
del virus e impiden que este pueda reproducirse.
2- Inhibidores no nucleosídicos de la retrotranscriptasa inversa,
constituyen a este grupo la efaverenze (EFV) y niverapina (NVP),
también conocidos como inhibidores de fusión, pues bloquean el virus
de entrar en las células del cuerpo. 3-Inhibidores de la proteasa,
formados por la nelfinavir (NFV), indinavir (IDV), ritonavir (RTV),
107
 lopinavir/rtv (LPV/r), saquinavir (SQr), que interfieren como efectores
negativos del sitio alostérico de la proteína estructural del VIH que usa
para producir las partículas virales infecciosas.

El esquema de la quimioterapia de primera línea es básicamente formado por

dos fármacos del grupo 1 asociados a uno del segundo o tercer grupo, mientras
que en la segunda fase se usa fármacos del grupo 2 y 3 pero no es muy adherido
en la mayoría de los países por las políticas económicas debido a su alto costo en
la adquisición, por lo que el precio de los tratamientos de primera línea ha bajado
de forma alentadora en la mayoría de los países de ingreso bajo y en algunos
países de ingreso mediano, la demanda de tratamientos costosos de segunda
línea seguirá aumentando. A menos que los precios de los tratamientos de
segunda línea bajen apreciablemente, las limitaciones presupuestarias podrían
hacer peligrar a los programas de tratamiento.

b) Prueba de detección del antígeno de superficie de la Hepatitis B (HBsAg)

- UMELISA HBsAg PLUS
PRINCIPIOS

Análisis inmunoenzimático heterogéneo tipo “sándwich”

UMELISA HBs Ag

Análisis inmunoenzimático heterogéneo tipo “sandwich”

Muestras
Suero, plasma, sangre seca en papel de filtro.
Se emplean las ventajas de la alta afinidad entre la estreptovidina y la
biotina; Se usan tiras de ultramicroelisa de 8 pocillos por tiras, revestidos con;
anticuerpos monoclonales murinos de alta afinidad contra el Antígeno de
superficie; Si el HBsAg está presente los anticuerpos en su superficie lo
capturan; Se añaden los anticuerpos biotilinados que se unen a
inmunocomplejo formado sobre la fase sólida; Se añade el conjugado
Estreptavidina-Fosfatasa Alcalina; Se añade el sustrato fluorigénico 4 metil
umbeliferil fostato que será hidrolizado y la intensidad de la fluorescencia
emitida permitirá detectar el antígeno de superficie. Cuya Sensibilidad: 100%;
Especificidad de 99,2%.

Esquema de reacción

Sustrato fluorigénico: 4 metil umbeliferil fostato

Conjugado: complejo estreptavidina-biotina

Anticuerpos biotilinados

108
Muestra: AntÍgeno de superficie???????

Fase sólida: anticuerpo monoclonal murino de alta afinida contra el HBsAg

Características
- La muestra más frecuentemente utilizada para la determinación de antígeno
de superficie es el suero, también se pueden procesar plasma o sangre
seca sobre papel de filtro.
- Las tiras de ultramicroelisa están revestidas con anticuerpos monoclonales
murinos de alta afinidad dirigidos contra el HBsAg.
- Si el antígeno de superficie está presente los anticuerpos en su superficie lo
capturan.
- Se añaden anticuerpos monoclonales biotilinados específicos contra el
antígeno de superficie que se unirán al inmunocomplejo formado sobre la
fase sólida.
- Se añade el conjugado Estreptavidina-Fosfatasa Alcalina
- El sustrato fluorigénico 4 metilumbeliferil fosfato será hidrolizado por la
enzima fosfatasa alcalina y la intensidad de la fluorescencia emitida
permitirá detectar la presencia del HBsAg en la muestra.
Este ensayo emplea las ventajas de alta afinidad entre la Estreptavidina y Biotina.
tener HBsAg.
Leer precauciones del estuche

- Controles internos P al menos uno entre 75-180 UF N al menos dos entre

1-7 UF
- Al cumplir con los requisitos y finalizar el ensayo se garantiza la detección
de 0,125 UPEI/ml de HBsAg para los subtipos ad y ay del VHB y 0,325
UI/ml para el subtipo ad según estándar secundario calibrado frente al
patrón internacional de la OMS (ese valor es la detectabilidad del ensayo)
- El nivel de corte estará en las muestras en que (F1-NN)/(P-NN) mayor o
igual 0,03. Para cálculo manual es 0,03(P-NN) NN; Sensibilidad 100% y
especificidad 99,92 %.

Teste confirmatorio

- Se basa en el principio de la neutralización mediante el cual una muestra

repetidamente positiva reaccionará con un suero neutralizante (suero de
conejo anti-HBsAg positivo) y como referencia un suero control, libre de
HBsAg (suero de conejo normal). Los anticuerpos en exceso neutralizarán
los determinantes antigénicos de la muestra, lo que será demostrado por
una disminución significativa de la señal de fluorescencia con respecto a la
muestra tratada con el reactivo control.
- Con las muestras se trabaja puras y diluídas 1/101.

109
 - Las muestras pura y diluída se enfrentan cada una a 20ul de control y 20ul
de neutralizante (a 100ul de muestra)
- La relación PN/PC debe ser mayor de 0,5
- PC mayor de 75 y PN entre 1-5 UF; Sensibilidad 100% Y Especificidad
100%

c) Prueba de detección del virus de Hepatitis C (UMELISA HCV)

Características

- Ensayo inmunoenzimático indirecto

- Fase sólida tiras de ultramicroelisa recubiertas con péptidos sintéticos
correspondiente a las regiones del núcleo, regiones no estructurales NS4 y
NS5 y una proteína recombinante de la región NS3 del VHC.
- Si la muestra posee anticuerpos específicos se fijarán al antígeno de
recubrimiento
- Se añade conjugado Anti IgG humana-Fosfatasa alcalina.
- En caso de reacción positiva el anticuerpo marcado se une al
inmunocomplejo previamente formado sobre la fase sólida.

Procedimiento de la prueba de detección del virus de Hepatitis C (UMELISA

HCV)
- Utiliza como fase sólida placas de tiras de ultramicroELISA recubiertas con
péptidos sintéticos correspondientes a las regiones del núcleo, regiones no
estructurales NS4 y NS5 y una proteína recombinante de la región NS3 del
VHC.
- Si la muestra tiene anticuerpos específicos se fijarán al antígeno de
recubrimiento.
- Se añade el conjugado Anti IgG humana/Fosfatasa Alcalina.
- En caso de reacción positiva este anticuerpo marcado se unirá al complejo
previamente formado sobre la fase sólida.
- Se añade el sustrato fluorigénico 4 metilumbeliferil fosfato, este será
hidrolizado y la intensidad de la fluorescencia emitida permitirá detectar la
presencia de anticuerpos al VHC en la muestra
- Cuidados especiales en la neutralización del conjugado, tomar todas las
precauciones, puede contaminarse con suero humano. Leer precauciones
del Insert
- Al menos uno de los duplicados del Blanco (B1-B2) debe tener un valor de
fluorescencia menor de 10 unidades
- Al menos uno de los dos duplicados del control Positivo (P1-P2) debe ener
un valor de fluorescencia entre 60-180 unidades, NC mayor o igual a 0,3;
Sensibilidad y Especificidad 100% .

110
2- Programa materno infantil
a) Prueba de diagnóstico del PKU

UMTEST PKU.
Prueba fluorescente para la cuantificación de fenilalanina (phe) en sangre seca
sobre papel de filtro para uso in vitro.
La fenilcetonuria es un trastorno autosómico recesivo que se produce por el déficit
completo o casi completo de hidroxilasa de fenilalanina. Esta enfermedad se
describió en 1934 por Folling, en la forma completa se presenta fenilalanemia
mayor de 1mM (16mgx100ml). La misma cursa con retraso mental y excreción
urinaria de ácido fenilpirúvico. La fenilalanina se acumula por bloqueo de la vía
catabólica y el organismo recurre a otras vías no ordinarias que dan lugar al
ácido fenilpirúvico que finalmente se excreta en la orina.

Muestra
Para el diagnóstico se utiliza la sangre seca tomada del talón por punción y
depositada en papel de filtro absorbente. Es enviada al centro de genética de cada
municipio y de aquí al laboratorio de inmunoensayo donde se desarrolla el
programa en cada provincia.
Son positivos si se cuantifica más de 15 mgxdl. Los positivos son enviados al
centro nacional de referencia nutricional para imponer el tratamiento.

Principios y características del ensayo.

Es un ultramicroensayo-fluorescente para la determinación cuantitativa de
Fenilalanina (Phe), en sangre seca sobre papel de filtro. Se basa en la reacción de
la Phe presente en la muestra con la ninhidrina con condiciones de pH óptimo y
temperatura óptima, donde se forma un complejo poco fluorescente, con la adición
de iónes cobre se amplifica la fluorescencia, aumentando la intensidad, por la
previa adición de L-leucil-L-alanina a la mezcla de reacción, en el que la intensidad
de la fluorescencia emitida es directamente proporcional a la concentración de
Phe en la muestra.

Precauciones
- Manipule los calibradores, el control y las muestras como potencialmente
infecciosos. Utilice guantes desechables. Los materiales utilizados deben
colocarse en soluciones desinfectantes de hipoclorito de sodio al 5% y
esterilizarse en autoclave.
- Considere a los equipos y accesorios que han estado en contacto directo
con las muestras como contaminados. Realice la limpieza que se
recomienda en los manuales.
- Las muestras de sangre seca colectadas sobre papel de filtro no deben
permanecer a temperatura ambiente por más de una semana. Almacenar
de 2 a 8 grados durante 4 meses como máximo.
111
 - Antes de comenzar a trabajar verifique que todos los reactivos se
encuentran a temperatura ambiente y que el reactivo R2(Ninhidrina) y el
R3(L-leucil-L-alanina), una vez preparados según las especificaciones, se
encuentran completamente disueltos.
- Verificar que las tiras de reacción se encuentran bien niveladas sobre el
soporte.
- Utilice puntas limpias o nuevas para l reconstitución y trabajo con las
soluciones y las muestras.
- Garantice el adecuado control de la humedad en todos los pasos de la
prueba. Las Placas de reacción con las muestras y reactivos deben
mantenerse en las cámaras húmedas para evitar su evaporación ya que
esto puede alterar los resultados.
- Verifique periódicamente la exactitud y precisión de las pipetas.
- Cumpla las normas de manipulación de los equipos y verifique su adecuado
funcionamiento, tenga especial cuidado con el pipeteo.
- Si utiliza la pipeta ERIZO para transferir los calibradores, controles y
muestras, debe lavar profusamente sus puntas para evitar la
contaminación.
- Evite la exposición a la luz de los frascos que contienen ninhidrina.
- Evite el contacto de la ninhidrina con los ojos o la piel, el concentrado de
cobre puede resultar nocivo por ingestión y provocar irritación en los ojos.
- El juego de reactivos no puede emplearse después de la fecha de
vencimiento.
- Los reactivos de lotes diferentes no pueden intercambiarse.

Interpretación y cálculo de los resultados

Los valores de fluorescencia de las muestras de concentración desconocida se

interpolan en un gráfico de fluorescencia contra el logaritmo de la concentración
de Fenilalanina (Phe) correspondiente a la curva de calibración, obteniéndose los
resultados en umol de Fenilalanina/L de sangre total. Entre el calibrador A y el
calibrador B se utiliza una escala lineal-lineal. Este procedimiento es realizado
automáticamente por el lector SUMA.
La validación, interpretación e impresión de los resultados es realizada de forma
automática por el programa UMTEST PKU.
Teniendo en cuenta los diferentes factores genéticos y ambientales que actúan
sobre las poblaciones, la práctica internacional recomienda que cada laboratorio
establezca sus propios valores de referencia.
Generalmente se acepta como valor límite 240umol/L de Fenilalanina de sangre
total, las muestras que presentan una concentración igual o superior son
consideradas como elevadas.
Factor de conversión más usado: umol/L=60,54mg/dl.

112
Características específicas del ensayo

Precisión
Se calcula evaluando muestras comprendidas en tres niveles de concentración de
Phe: Alto, medio y bajo.
Exactitud
Se realizan diluciones seriadas a muestras de sangre con diferentes
concentraciones de Phe antes de que fueran colectadas sobre papel de filtro. Las
concentraciones calculadas después de la corrección con el factor de dilución fue
de +/- 10 % de la concentración original en la muestra pura.

Detectabilidad
La concentración mínima fue de 50 umol de Fenilalanina/L de sangre total. Se
definió como la concentración calculada para una fluorescencia equivalente al
calibrador A+ 2 DE.

Figura 1.14. Procedimiento del UMTEST PKU

Tomado de los Manuales de SUMA

b) Examen para la determinación de Gonadotropina Coriónica Humana
en suero y orina.
Fundamento

El UMELISA H.C.G utiliza como fase solida de ultra micro ELISA (10 unidades
landas por pocillo) revestidas con anticuerpos monoclonales y policlonales Anti
beta HCG. Las muestras se incuban en los pocillos de la tiras y si estas contienen
HCG la misma se fija a los anticuerpos del recubrimiento. La realización de un
lanzado posterior elimina los componentes de la muestra no fijados se adiciona
entonces un conjugado anti HCG ( cadena alfa y beta) fosfatasa alcalina , el cual
113
se une a la HCG fijada en la reacción anterior. Un nuevo lavado de las tiras
elimina el conjugado en exceso. Al adicionar un sustrato fluorigènico (4-
metilumberiferilfosfato ) en los pocillos de las tiras, este resultara hidrolizado por la
enzima del conjugado y la intensidad de la fluorescencia emitida , será
proporcional a la concentración de HCG en la muestra.
Interés Clínico

1- El diagnostico temprano de embarazo: la presencia de HCG en orina es

índice de embarazo.
2- La evolución de trastornos del embarazo ( en orina ) : embarazo ectópico y
amenaza de aborto espontanea, se diagnostican por una baja
concentración de HCG en un periodo determinado de gestación .
3- Como marcador tumoral ( en suero) se asocia a enfermedades malignas
trofoblásticas.
4- Marcador de riesgo para el síndrome de Down: cuando los niveles de HCG
están elevados.

c) Examen de cuantificación de inmunoglobulina en suero humano

Fundamento

El UMELISA es un ensayo inmuno enzimático heterogéneo tipo sándwich en el

cual se utiliza como fase solida tiras de ultra micro ELISA revestidas previamente
con anticuerpos monoclonales anti- IGE. La muestra se incuba en los pocillos de
las tiras de reacción fijándose la inmunoglobulina E presente a los anticuerpos de
recubrimiento. La realización de un lavado posterior elimina los componentes no
fijados, permaneciendo en el pocillo el complejo anticuerpo inmunoglobulina IGE
se adiciona entonces un conjugado anti – IGE fosfatasa alcalina el cual se unirá a
la inmunoglobulina IGE fijada en la reacción anterior. Un nuevo lavado de las
placas eliminara el conjugado del suero en exceso. Al adicionar un sustrato
fluorigénico (4- metilumberilfosfato ) en los pocillos de las tiras este resultara
hidrolizado por la enzima del conjugado y la intensidad de la fluorescencia emitida
será proporcional a la concentración de inmunoglobulina E presente en la
muestra.
Interés Clínico

 permite el diagnóstico y el estudio de las enfermedades alérgicas ya que su

función principal IGE es la de las reacciones alérgicas ( identificación de asma
intrínseco y extrínseco, shok anafilático- síndrome de Jonson, reacciones alérgicas
alas penicilinas, entre otras).
 Definir la posible causa alérgica de una rinitis o diferenciar una dermatitis
atópica de otras enfermedades de la piel.

114
 d) Examen para la determinación cuantitativa de la hormona estimulante
de la Tiroide en sangre seca sobre papel de filtro.
Fundamento

El UMELISA TSH neonatal es un ensayo heterogéneo inmunoenzimático tipo

sándwich en el cual se utiliza como fase solida placa de tiras con pocillos
revestidos previamente con anticuerpos monoclonales anti cadena beta de la TSH
lo cual garantiza la especificidad del ensayo , las muestras en los calibradores y el
control en marchas de sangre seca se e luyen con un conjugado anti TSH humana
(carnero) fosfatasa alcalina. Este aluato se deposita en l0os pocillos de las tiras
permitiendo la formación del complejo anticuerpo TSH anticuerpo-enzima, la
realización de un lavado posterior elimina los componentes no fijados. Al adicionar
un sustrato fluorigenico (4- metilumberilfosfato) en los pocillos de las tiras , este
resultar hidrolizado por la enzima del conjugado y la intensidad de la fluorescencia
emitida será proporcional a la concentración de TSH presente en la muestra .
Interés Clínico

Diagnóstico del hipotiroidismo congénito en recién nacidos (ausencia anatómica o

funcional de la glándula tiroides.
e) Examen de la cuantificación de hormonas estimulantes del tiroides en
suero humano.
Fundamento

La hormona estimulante de la tiroides TSH es una hormona glicoproteica con un

peso molecular de 28 mil Dalton. Está compuesta de 2 cadenas polipeptídicas que
se han denominado alfa y beta. La cadena alfa muestra una gran similitud con la
cadena de las otras hormonas hipofisarias de estructura similar ( FSH,LH y HCG)
mientras que la cadena beta confiere a la hormona su especificidad inmunológica
y funcional .
Interés Clínico

1- Pesquizaje de hipotiroidismo congénito en recién nacidos.

Nota: estas pruebas son de vital importancia pues se les realizan a niños recién
nacidos para determinar a edades tempranas alguna irregularidad o desequilibrio
que , de no ser tratado a tiempo pueda traer a ese bebe daños mayores una vez
que comience a crecer, es por ello que representan un puntal fundamental del
programa materno infantil.

115
2.2.3.6. Ejemplos de la aplicación de SUMA en el control epidemiológico
- Virus de Dengue, UMELISA de captura, IgM.

El Dengue es un antiguo enemigo de la salud de la humanidad que en la década

de los 80 del siglo pasado reemergió y aparecieron brotes explosivos en países
que hacía años no lo reportaban o inclusive en países que nunca antes lo habían
tenido.

En la actualidad es un fenómeno que alcanza a los países tropicales y con

magnitud importante en las Américas, esta región ha sido víctima de su forma
más grave: el Dengue Hemorrágico (DH) y el Síndrome de Choque por Dengue
(SCD).

En 1981 Cuba fue el escenario del más devastador brote de DH y SCD registrado
en Las Américas con 344 203 casos de Dengue y DH con 158 defunciones de las
cuales 101 fueron niños. En 1989 al 1990 Venezuela sufrió el segundo brote de
importancia en la región con 5 990 casos de DH y 70 defunciones.

La participación comunitaria constituye la piedra angular en la prevención del

Dengue y el lugar del laboratorio en el diagnóstico sirve de base al diagnóstico
individual y la vigilancia epidemiológica.

Complejo Dengue

Existen cuatro serotipos: D1, D2, D3, D4. Que pertenecen a la familia Flavoviridae,
género Flavovirus. Estos poseen una molécula de ARN de cadena única, miden
aproximadamente 50 nm de diámetro y presentan una envoltura lipídica. La
infección del hombre por un serotipo produce inmunidad para toda la vida contra la
reinfección con ese serotipo pero protege parcial y temporalmente contra los otros.
La circulación simultánea de varios serotipos predispone a la ocurrencia de
Dengue Hemorrágico Epidémico.

Presentación del agente

El genoma codifica para tres proteínas estructurales: proteína C de la cápside, una

proteína asociada a la membrana llamada M y la proteína E de la envoltura.
También codifica para siete proteínas no estructurales con funciones no bien
definidas.

Vías de transmisión

El dengue es una enfermedad viral aguda transmitida por mosquitos del género
Aedes, fundamentalmente el Aedes aegypti y el Aedes albopictus.

116
Cuadro clínico

Las infecciones virales por Dengue causan un espectro de enfermedades que

varía desde el proceso asintomático a la fiebre indiferenciada o al dengue clásico y
de este a la fiebre hemorrágica. Su período de incubación es de 4 a 6 días, Por lo
que , la enfermedad clásica se caracteriza por inicio brusco, fiebre alta, cefalea
intensa, dolor retrorbital, dolores musculares, dolores articulares, erupción
cutánea. Donde el cuadro grave (DH) incluye las hemorragias en la piel (prueba de
torniquete positiva, petequias) hemorragias nasales, gingivales, gastrointestinal,
hematuria e hipermenorrea. Los análisis de laboratorio clínico demuestran
leucopenia, trombocitopenia y hemoconcentración que indica extravasación de
plasma y se encuentra siempre inclusive en los casos sin choque a causa de un
aumento de la permeabilidad vascular.

Diagnóstico

El diagnóstico puede ser complicado

- Circulación del Dengue y otros flavivirus

- La mayoría de las pruebas serológicas miden anticuerpos
- Dos o más tipos de virus pueden infectar de forma secuencial un
huésped
- Alguno de los reactivos no están disponibles comercialmente.
- El tiempo requerido para obtener los resultados del laboratorio es largo.

El diagnostico se hace con el objetivo de detectar de forma individual la

presencia del virus de la dengue y como suporte de vigilancia epidemiológica.
Por lo que, el Diagnóstico individual permite hacer la confirmación de casos y
diagnóstico diferencial; Manejo clínico así como la confirmación de casos FHD .
Mientras que el Soporte a la vigilancia de dengue sirve para la detección
temprana de circulación en áreas nuevas; Estudios de Incidencia después de
epidemias y la Caracterización Cepas.

El diagnóstico definitivo de la infección por el virus del Dengue solo puede ser
realizado en al laboratorio y depende del aislamiento viral, detección del antígeno
viral, detección de genoma (PCR) y la detección de anticuerpos específicos.

Muestra

La efectividad del diagnóstico serológico depende de la calidad de la muestra

recibida y del momento de la toma de la muestra. Obviamente que la muestra
ideal para estudios virológicos y serológicos es el suero.

117
Cuidados con la muestra para diagnóstico serológico

Tomar 1ml de la muestra de suero en el 5º día, evitar la hemólisis, ciclos de

congelación y descongelación, Conservar y trasladar en frío, observar la correcta
identificación, breve información clínica y epidemiológica del paciente: fecha de
inicio de los síntomas, fecha de la toma de la muestra (esto permitirá la selección
de la muestra, su aceptación para la correcta interpretación de los resultados).

Para el diagnóstico serológico de Dengue se han utilizado las siguientes pruebas

- ELISA - IgM de captura y IgG indirecto

- Inhibición Hemaglutinación
- Fijación de complemento
- Neutralización

En Cuba el Centro de Inmunoensayo ha diseñado un estuche diagnóstico para la

detección de anticuerpos IgM al virus del Dengue: UMELISA heterogéneo en su
variante de captura válido para detectar anticuerpos IgM contra los cuatro
serotipos y recomendable para la vigilancia seroepidemiológica y diagnóstico de
casos clínicamente sospechosos en la infección por cualquier serotipo del virus del
Dengue.

IgM

- Es la protagonista o blanco del diagnóstico

- Es la principal inmunoglobulina producida tempranamente en la respuesta
inmune primaria
- Es importante en la defensa ante las infecciones virales.
- Es pentavalente, aglutinadora por excelencia.
- La detección de anticuerpos IgM específicos contra el virus dengue indica
infección activa o reciente.
- Se desarrolla tempranamente y de forma general se puede detectar a partir
del quinto día de comienzo de los síntomas y como promedio disminuyen a
partir de los 30 días, aunque pueden detectarse hasta los 60 días o más,
donde se puede tener 10% falsos positivos y 1.7% falsos negativos

Fundamento del ensayo

El UMELISA DENGUE IgM PLUS es un ensayo inmunoenzimático heterogéneo en

su variante captura que emplea las ventajas de la reacción de alta afinidad entre la
Estreptavidina y la Biotina.
Se utilizan como fase sólida tiras de ultramicroELISA(10 microlitros por pocillo)
revestidas con anti IgM humana. Las muestras se incuban en los pocillos de las
118
tiras y los anticuerpos en su superficie capturan la IgM presente en el suero. Se
añade el antígeno de dengue (mezcla de los 4 serotipos del virus) que se unirá a
la IgM específica capturada en el paso anterior. Se añaden anticuerpos
monoclonales biotilinados específicos al virus dengue (Anticuerpos Biotinilados),
que se unirán al complejo formado sobre la fase sólida. Se aplica el conjugado
Estreptavidina /Fosfatasa Alcalina (F.A.), que se unirá al complejo formado
anteriormente en casa de reacción positiva. Por último, se adiciona el sustrato
fluorigénico (4-Metilumbeliferíl fosfato), que será hidrolizado y la intensidad de la
fluorescencia emitida permitirá detectar en la muestra la presencia de anticuerpos
IgM específicos al virus del dengue.

PCR: Diagnóstico; Vigilancia; Epidemiología Molecular; Estudios etiopatogenia;

Drogas antivirales, vacunas.

Ventajas del PCR: Rápido; Alta sensibilidad; Alta Especificidad; Contaminación?

Para flaviviruses se utilizara como muestra el suero, células infectadas ; larvas

infectadas; pooles mosquitos y órganos de fallecidos.

2.2.3.7. Precauciones en la utilización de la tecnología SUMA

 Para la lectura en fluorescencia se debe colocar el filtro secundario de

fluorescencia.
 Para la medición en absorbancia se debe retirar el filtro secundario de
fluorescencia y colocar el filtro de interferencia adecuado.
 La operación DEL para borrar datos de lectura debe ser utilizada
cuidadosamente. Una vez borrados los datos son irrecuperables.
 Revise con la opción PROG. Los valores para el cálculo de los resultados
de las técnicas cualitativas.

2.2.3.8. Recomendaciones para lograr mejores resultados.

 Se recomienda no colocar el equipo en planos inclinados, o lugares donde

esté sometido a vibraciones mecánicas.
 No ubicarlo cerca de las paredes u objetos que dificulten su ventilación.
Tampoco sobre lugares sometidos al polvo excesivo.
 No colocar el equipo cerca de fuentes de calor tales como calefacción o la
luz solar.
 No colocar objetos pesados sobre el equipo.
Los datos almacenados en memoria pueden perderse en caso de permanecer
desconectado de la corriente el equipo por más de 72 horas.

119
2.2.3.9. Perspectivas de la Tecnología SUMA

El SUMA, por ser un UMELISA originario de Cuba y usado hasta la fecha

solamente en Cuba, Brasil, Venezuela, Argentina, México, Colombia y China se
prospera que sea expandido por mas diversificados países con vista su aplicación
en las diversas esferas diagnosticas, pesquisaje, preventivas, seguimientos e
control evolutivo de múltiples enfermedades. Además se está tomando en
evidencia en la investigación de enfermedades cancerígenas.
2.2.4. Ejercicios de Comprobación del Capítulo 2. Subtema 2.2

1- Complete los espacios en blanco atendiendo a la determinación de

Glicemia,
a) Cuando separamos el suero del coagulo de inmediato evitamos la
__________________.
b) La hemólisis trae como consecuencia un resultado ________________.
c) Para la determinación de glucosa en sangre se utiliza el método de Rapi-
gluco-test ( glucosa –oxidasa y peroxidasa)
d) La prueba de tolerancia a la glucosa (PTG) se utiliza como diagnóstico de
certeza de la diabetes mellitus
e) Cuando las muestras tienen un color anormal se debe montar un
_____________________.

2- Sobre la determinación de Glucosa responda Falso(F) o Verdadero(V)

según corresponda. Justifique lo falso.
a) ___ Si la muestra no se va a procesar de inmediato debe separar el suero
del coagulo.
b) ___ La determinación de glucosa por el método de glucosa oxidasa tiene
una baja especificidad.
c) ___ Los resultados se expresan en micromol / L
d) ___ Para la determinación de Glicemia Postpandrial el paciente tiene que
estar en ayunas.
e) ___ Los valores por debajo de 4,22 se consideran como Hipoglicemia.

3- Complete los espacios en blanco

a) La formación de la urea tiene lugar en el _________________.

b) La eliminación renal de amoniaco tiene lugar en forma
_____________________.
c) El compuesto nitrogenado más utilizado para medir función renal es:
__________________

120
d) En las enfermedades reumáticas el compuesto nitrogenado que sus
concentraciones se ven aumentadas es el _____________________
e) La reacción de Jaffé se utiliza la cuantificación de ____________________.

4- Indique la razón por la cual se utiliza como adicional la enzima -amilasa

en el procedimiento de la técnica de PAS
5- ¿Qué es un inmunoensayo?

6- ¿Qué se entiende por enzimoinmunoensayo (EIE)?

7- ¿Cuáles son las propiedades de las enzimas que permiten su uso como
herramientas de trabajo?

8- ¿Como se clasifican los enzimoinmunoensayos?

9- Ponga en ejemplos de ensayos EIE homogéneos y heterogéneos en el

Laboratorio SUMA.

121
Bibliografía consultada

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Medio Ambiente y Desarrollo Sostenible. Pinar de Río. Universidad
“Hermanos Saiz Montes de Oca”; 2011
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Habana: Editorial Ciencias Médicas; 2007.
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Regulación Ambiental y Seguridad Nuclear; 2007
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- Macfaddin Jean F. Pruebas Bioquímicas para la identificación de bacterias
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Editorial Ciencias Medicas; 2006
- Manual de uso de los diagnosticadores. Empresa de producción de
biológicos “Carlos J. Finlay. La Habana; 2008
- Matarama Peñate M, Llanio Navarro R, Muñiz Iglesias P, Quintana Setien
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los antimicrobianos de patógenos bacterianos de importancia para la salud
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II. La Habana: editorial Ciencias Medicas; 2002
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bioestadística. Ciudad de la Habana: Editorial Ciencias Medicas; 2004

123
 Anexo 1.
Respuesta a los ejercicios de los capítulos

Respuesta de los ejercicios de Comprobación del Capítulo 1

Respuesta de la pregunta 1
a) F -bajo
b) F-catalizan la transformación del sustrato en producto.
c) F- con la etapa de catálisis.
d) V
e) V
f) V

Respuesta de la pregunta 2
a) V
b) V
c) F porqué los grupos fijadores son cadenas laterales de
aminoácidos
d) V
e) F - porqué los mecanismos de modulación covalente
están asociados con la acción de otras enzimas que
permiten la unión covalente o separación de un resto
de ácidofosfórico o de adenilo
- Los que están asociados con el sustrato o el producto de la
reacción son los mecanismos alostéricos
f) F porqué entre las propiedades de la enzima esta la de tener
especificidad de acción lo que hace que solo pueda llevar a
cabo sobre el sustrato una transformación dígase
descarboxilación, deshidrogenación, carboxilación,
transaminación entre otras

Respuesta de la pregunta 3
a. Ribozama
b. Hidrolasas
c. Velocidad
d. Reacción
e. Sitio de catálisis o centro activo
f. Marcadores moleculares.

124
 Respuesta de la pregunta 4
R/ El uso de los biocatalizadores en el laboratorio tiene gran importancia
pues son económicos por su fácil adquisición, además al no ser
contaminantes son específicos, rápidos y eficientes garantizándose así la
confiabilidad de los resultados.

Respuesta de la pregunta 5
a.Transferasa
b.Energía de activación
c.Sitio de catálisis
dEspecificidad
e.Proteica

Respuesta de la pregunta 6

a) R/
Acción catalítica que consiste en la capacidad de aceleran la velocidad
de la reacción, sin consumirse
Especificidad de sustrato solo se une a un tipo de sustrato y especificidad
de acción: solo realiza un tipo de acción.
Eficiencia pues intervienen en las reacciones químicas en cantidades muy
pequeñas modificando la velocidad de las reacciones reversibles sin
alterar el equilibrio final.
b) R/ Los cofactores pueden ser metaloenzima si esta unido a un ion
metálico y coenzima si esta unido a una vitamina
c) R/ El conocimiento de los factores que pueden afectar la estructura,
propiedad y función de la enzima tienen gran importancia para un
bioanalista pues ello permite que se tengan en cuenta durante la
realización de la técnica o método para evitar procedimientos no
adecuados y obtener por ende resultados erróneos.

Respuesta de la pregunta 7
a) Catalítica
b) Abzimas
c) Isomerasas
d) La especificidad de sustrato
e) Enzima-Sustrato
f) Zimógenos

125
 Respuesta de la pregunta 8

a) V
b) F - Los grupos de ambientación no permite la entrada de agua (H20) al
centro activo
c) F- Los grupos de catálisis catalizan la transformación del sustrato en
producto
d) V
e) V
f) V
g) F - En la etapa de transformación se lleva a cabo la catálisis o en la etapa
de reconocimiento se forma el complejo ES
h) F - Los grupos ambientación son cadenas laterales de aminoácidos
apolares
i) V
j) F - Los grupos catalíticos están relacionados con la etapa de
transformación

Respuesta de la pregunta 9

a) F- 7,4, por ser el pH fisiológico.

b) V.
c) V
d) F- la especificidad.
e) F- incrementa directa y proporcionalmente

Respuesta de la pregunta 10

a) F – Porqué estos se unen a la enzima por el sitio alostérico

b) V
c) V
d) F – Porqué estos son generalmente iones inorgánicos que son requeridos o
al menos estimulan, la actividad catalítica de una enzima
e) V
f) F- Porqué un aumento de temperatura de la reacción incide negativamente
en la velocidad de la reacción pues trae consigo la alteración de la
estructura tridimensional de la enzima que tiene naturaleza proteica
g) F– Porqué estas presentan diferentes valores de punto isoeléctricos siendo
esta la base de su detección y separación mediante la electroforesis en gel
h) V
i) F- Porqué al ser el ATP producto el ADP se convierte en un activador
(efector positivo) de la reacción.

126
 j) F– porqué la activación es irreversible, lo que las enzimas proteolíticas
pueden inactivarse nuevamente mediante la acción de proteínas
inhibidoras.
k) V
l) V

Respuesta de los ejercicios de Comprobación del Capítulo 2. Subtema 2.1

Respuesta de la pregunta 1

R/ Porqué la enzima amilasa alcanza su niveles séricos más elevados en un

paciente con pancreatitis aguda entre las 24 y 30 horas disminuyendo hasta llegar
a los niveles normales entre las 24 y 48 horas siguientes por lo que de no realizar
el análisis entre las 12 y 30 horas, el diagnóstico quizás no coincida con la realidad
mientras que los niveles de la enzima amilasa se mantiene aumentados en orina
de 3 a 5 días luego de haber alcanzado los niveles séricos normales la enzima.
Respuesta de la pregunta 2

R/ Normalmente la enzima amilasa es producida por el páncreas y las trompas de

falopio alcanzando valores séricos menores a las 89 U/L. Cuando estos niveles
séricos aumentan quiere decir que el órgano esta afectado

Respuesta de la pregunta 3

R/ Para el diagnóstico de la hepatitis se deben tener en cuentea los niveles

séricos de la TGO/ASAT y TGP/ ALAT pues la TGP se encuentra en citoplasma
del hepatocito(enzima unicular) por lo que su incremento sérico determina la
evidencia de la afección del tejido hepático mientras que la TGO además de ser
una enzima cardiaca se encuentra también en el citoplasma y en la mitocondria
del hepatocito (enzima binocular) por lo que su incremento sérico indica la
profundidad de l daño hepático.

Respuesta de la pregunta 4

R/

Enzimas Localización Patología

Creatina quinasa CK- -músculo cardíaco Cardiopatías, en

MB inflamaciones,
enfermedades
musculares
degenerativas, shock,
127
 hipotiroidismo, psicosis
aguda y en puerperio

Láctico deshidrogenasa -citoplasma - infarto, necrosis

hepática, necrosis tubular
-músculo esquelético, renal, pielonefritis.
hígado, cerebro,
corazón, riñón, páncreas,
pulmones y en los
eritrocitos

TGO -mitocondrias y -infarto agudo de

citoplasma miocardio

-hígado y corazón -afecciones hepáticas

Respuesta de la pregunta 5

a) V
b) F- pequeñas
c) V
d) V
e) F - unicular
f) F- tejidos renales

Respuesta de la pregunta 6

a) 4
b) 3
c) 1
d) 2
e) 2
f) 4
g) 1
h) 2
i) __

Respuesta de la pregunta 7

a) __ X ___

b) X ___ ___
128
Respuesta de la pregunta 8

Respuesta de la pregunta 9

a) iones de hierro, fosfatos, ácidos nucleídos, células, lípidos, glúcidos,

glicoproteínas, enzimas y etc.
b) Dichos métodos se basan en reacciones químicas específicas o en la
interacción macromolecular de alta afinidad.

Respuesta de la pregunta 10

R/ Los métodos para la localización enzimática se fundamentan en la producción

de un precipitado intensamente teñido o electrodenso en el lugar de la actividad de
la enzima con el empleo de la microscopia óptica o electrónica.

a) por ejemplo la Fosfatasa ácida: que se halla en los riñones, en el suero,

en el semen y su mayor concentración se halla en la próstata. Se eleva
en el cáncer de próstata y en los traumatismos, las deshidrogenasas:
importantes en el metabolismo celular permitiendo visualizar la actividad
de la succinodeshidrogenasa del ciclo de Krebs y la peróxidasa:
enzima que normalmente se encuentra en los tejidos humanos
principalmente en la células del sistema hematopoyético, estimula la
oxidación de ciertos compuestos por el peróxido de hidrogeno.

129
Respuesta de la pregunta 11

R/ La técnica más utilizada en los métodos histoquimicos es la de 3-

3”diaminoazobencidica (DAB) donde se produce la transferencia de iones de
hidrogeno al peróxido de hidrogeno formándose moléculas de agua, por si tratar
de una enzima extremamente activa en un corto intervalo de tiempo se producen
cantidades apreciables de precipitado insoluble. Por tanto, con este método
pueden localizarse las estructuras con actividad peroxidásica tanto al microscopio
óptico o electrónico.

Respuesta de la pregunta 12

R/ La histoquímica enzimática se basa en la determinación de enzimas tisulares

mediante reacciones químicas de oxidación reducción a diferencia de la
inmunohistoquímica enzimática que se basa en la reacción antígeno-anticuerpo
valiéndose de la enzima( peroxidasa) para el marcaje de los anticuerpos mediante
la utilización de sustratos y cromógenos que dan lugar a productos coloreados
insolubles, que forman un precipitado en el lugar en el que se encuentra el
anticuerpo.

Respuesta de la pregunta 13

R/ Una vez identificado el género de estaphilococcus de acuerdo a las

características de las colonias del medio de cultivo previo, se realizara la prueba
bioquímica de la coagulasa para establecerse la patogenicidad de esta especie
bacteriana, pues el estafilo coagulasa positiva es patógena en cualquier
localización anatomica, mientras que el estafilo coagulasa negativa solo es
patógena en liquidos corporales naturalmente estériles, visto que en ello no hay
microbiota indígena.

Respuesta de la pregunta 14

R/Los dos procedimientos que anteceden a la prueba de coagulasa en las

investigaciones bacteriológicas son la coloración de Gram y el respectivo cultivo,
puesto que son cocos Gram positivo, anaerobios facultativos.

Respuesta de la pregunta 15

R/Se ha demostrado que la pared bacteriana es la base de la reacción diferencial

frente a coloración de gran, por lo que las floras teñidas de azul-violeta empleando
este método son gran (+) debido a que estas posen en su pared grandes
cantidades de acido teicoico que tiene mayor afinidad con colorantes de
naturaleza básica(complejo violeta+lugol) es el caso de los estafilococos, mientras
que las teñidas de rojo son Gram (-) por poseer grandes cantidades de
130
lipopolisacaridos en su pared teniendo afinidad con colorantes de naturaleza
acida(safranina); Además de que las colonias del medio puro deben ser células
pequeñas, esféricas y inmóviles .

Respuesta de la pregunta 16

R/La catalaza es una prueba de la bioquímica bacteriana que nos permite

diferenciar el género Estaphilococcus del Estreptococcus, visto que los Estreptos
son bacterias fermentadoras de diversos glúcidos produciendo el ácido láctico, es
dicir que son catalaza positiva, mientras que los Estafilos no son fermentadoras lo
que les hace catalaza negativa.

Respuesta de la pregunta 17

R/Sera necesario utilizar la prueba de Ureasa cuando en el cultivo hay un

crecimiento sospechoso de Proteus, por lo que es un examen aplicable a bacterias
Gram (-), pero solamente el Proteus es exclusivamente Ureasa (+).

Respuesta de la pregunta 18

R/ La prueba de la oxidasa se utiliza para identificar todas las especies de

neiserias y para distinguir los miembros de la familia Pseudomonadaceae de los
miembros de la familia Enterobacteriaceae

Respuesta de los ejercicios de Comprobación del Capítulo 2. Subtema 2.2

Respuesta de la pregunta 1

a) Glucólisis
b) Falso aumentado
c) Glucosa Oxidasa.
d) Diabetes Mellitus.
e) Blanco Muestra.

Respuesta de la pregunta 2
a) V
b) F alta especificidad.
c) F mmol/L
d) V
e) V

131
Respuesta de la pregunta 3

a) Hígado
b) Cloruro de amonio.
c) Creatinina.
d) Ácido úrico.
e) Creatinina

Respuesta de la pregunta 4

R/ La enzima amilasa se adiciona en la técnica de PAS como preparación de

control por su especificidad por el glucógeno ya que el PAS(ácido periódico de
Schiff) puede teñir otras sustancias además del glucógeno.

Respuesta de la pregunta 5

R/ Es un ensayo basado en la reacción antígeno – anticuerpo.

Respuesta de la pregunta 6

R/ Son inmunoensayo que para la detección o cuantificación de la reacción

Antígeno- Anticuerpo requiere de una enzima.

Respuesta de la pregunta 7

R/ Por su……

- Su gran especificidad y versatilidad.

- Estabilidad en condiciones de almacenamiento y en la realización del
análisis.
- Formación de conjugados estables.
- Actividad detectable fácilmente.
- Gran cantidad de sustratos disponibles.

Respuesta de la pregunta 8

R/ Se clasifican como homogéneos y heterógamos:

- Homogéneos. La reacción solo ocurre en una sola fase (fase líquida).

- Heterogéneos. La reacción ocurre en dos fases (fase sólida –fase líquida)

132
Respuesta de la pregunta 9

R/ Ejemplos de ensayos EIE homogéneos y heterogéneos en el Laboratorio

SUMA.

- Homogéneos. Determinación de Digoxina. Determinación de IgE y IgM.

- Heterogéneos Determinación del Ag de Superficie de la Hepatitis B,

Determinación de Anticuerpos contra el Virus del Inmunodeficiencia
Adquirida serotipos I y II, Determinación de Anticuerpos contra el virus de
la HCV

133