Estudios Citogenéticos:
Citogenética Clásica y
Molecular.
Catedra de Genética Medica-
FCM- cohorte 2020
Docente: Auadt, María Emilia
Técnicas Diagnosticas!!!
Citogenética clásica
• Limite de resolución: 5MB
o • Alteraciones cromosómicos
numéricas o estructurales
Cariotipo por bandeo G
• Limite de resolución menor a 3 MB
FISH • Microdeleciónes o duplicaciones
• Analiza regiones especificas de los
cromosomas
• Analiza varias regiones cromosómicas al
MLPA mismo tiempo
• Variante en el nro de copias “CNV”
Array CGH • Depende de la densidad y el tamaño de
los segmentos inmovilizados
• Resolución variable 5Kb ~ 100Kb
• Variantes de nucleótidos
Secuenciación simples “SNV”
Citogenética Humana:
Es la disciplina que tiene por objeto el estudio de la morfología, estructura
y comportamiento cromosómico y su relación con la patología genética.
El complemento cromosómico es característico de cada especie.
Existen tres constantes cromosómicas:
• Número
• Morfología
Célula en metafase
• Estructura 46 cromosomas
Cultivo de Linfocitos en Sangre Periférica
Preparación del material a
analizar!!
Se diferencian de acuerdo a:
Tamaño
Posición del centrómero
Técnica standart: Bandeo G:
Análisis numérico y morfológico Identificación de cada
cromosoma
Cada par cromosómico tiene un patrón de bandas
específico.
El número de bandas de cada par depende de la
condensación
Nivel de resolución mayor a 5Mb
Trisomía21 95% No disyunción MI materna
Anomalías Estructurales
p25.2
p15.33
2 der (2) der (4) 4
Se basa en la hibridación de una sonda de ADN marcada con una
FISH sustancia fluorescente sobre una secuencia complementaria del
genoma fijado a un soporte sólido
Aplicaciones del FISH:
* Diagnóstico Prenatal
* Diagnóstico Postnatal
* Oncología Tumores sólidos
Hematología
Síndromes de Microdeleción
•Causados por una deleción cromosómica que involucra uno o varios
genes contiguos
•La deleción es muy pequeña como para ser detectada bajo el
microscopio usando métodos citogenéticos convencionales.
•Síndromes mas frecuentes:
– Di George del(22)(q11.2q11.2)
– Prader Willi del(15)(q11q13) paterna
– Angelman del(15)(q11q13) materna
– Smith Magenis del(17)(p11.2p11.2)
– Miller Diecker del(17)(p13.3p13.3)
– Williams del(7)(q11.23q11.23)
– Kallmann del(X)(p22.3p22.3)
Síndrome de Williams
Multiplex
Ligation- Primer Primer
MLPA dependent Forward reverse
Probe
Amplification
Secuencia
SONDAS: complementaria
•Sondas de ADN (130 y 500 nt)
complementarias
a la secuencia
estudiar.
•Uno de los
Primers está
marcado con
fluorescencia. Target A Target B
Ligación
Ligasa
Si las sondas se unen
correctamente, una
LIGASA las une.
Primer Forward Primer reverse
Amplificación Secuencia
complemen
taria
(130 y 500
Amplificación de las nt)
sondas ligadas por
PCR.
El patrón de picos es generado sobre la muestra de un paciente y una
muestra de ADN de referencia. Se compara la altura relativa de los picos y
las diferencias reflejan los cambios en el número de copias
La amplificación es de las sondas de MLPA.
.
Técnica para la detección de deleciónes y/o duplicaciones
de varias patologías genéticas.
Acorta el proceso significativamente, investigando varias
regiones cromosómicas al mismo tiempo.
Es una alternativa precisa, confiable y rentable con respecto
a FISH en el screening de Síndromes de Microdeleción.
Además puede estimar la extensión de la deleción.
Utilidades Diagnosticas:
aCGH
“Array Compatative
Genomic hibridization”
•Hibridación de manera
competitiva entre el ADN del
paciente y el referencia
Permite identificar variaciones
en el Numero de copias o CNV
PASO 1: PREPARACION DE LA MUESTRA
El ADN genómico, tanto de la muestra como el
de referencia son preparados utilizando
técnicas estándar de biología molecular
PASO 2: MARCADO
El ADN genómico de referencia y el de
la muestra son marcados
independientemente con Cy3 y Cy5
PASO 3: HIBRIDACION
El ADN genómico de referencia y el de la
muestra son con-hibridados a la
plataforma.
El array es escaneado a 532nm (para la
marca Cy3) y a 635nm (para la marca Cy5)
PASO 4: ANALISIS DE LA INFORMACION
Las perdidas y ganancias en el numero de
copias son identificados utilizando un
algoritmo incluido en el software
La resolución del Array- CGH está determinada por la
densidad y el tamaño de los segmentos inmovilizados en
las plataformas
Regiones criticas para
Genes implicados en el síndromes de microdelecion
desarrollo y microduplicacion
Regiones
Regiones Sondas
asociadas a
Psedoautosómicas Subtelomericas
Autismo
Las plataformas se fueron desarrollando para el análisis de un cromosoma entero,
porciones de un cromosoma, regiones específicas, y el genoma entero.
SECUENCIACIÓN
Código genético, proyecto genoma humano
• Proyecto multicentrico iniciado en 1991
• Realizando Secuenciación Sanger
Secuencia: orden en el que se presentan los nucleótidos
en el ADN
Tenemos 3.000 millones de bases colocadas en un único orden con aproximadamente 20.000 genes que dirigen
la síntesis de proteínas que nos forman.
Secuencia de referencia
ATGCCTAGTTGA
ATGCCGAGTTGA Sustitución
Inserción
ATGCCTTTAGTTGA
ATGCAGTTGA Deleción
MUTCIONES PUNTUALES
¿Cómo se interpreta
la Información?
(Single Nucleotide Polymorphism) SNP SNV (Single Nucleotide Variant)
Los cambios se clasifican en función de su posible efecto e implicación en el
desarrollo de una determinada patología.
Los cambios detectados con respecto a la secuencia de referencia pueden ser:
Probablemente Significado Probablemente
Patogénicos Benignos
patogénicos clínico incierto benignos
Citogenética clásica
• Limite de resolución: 5MB
o • Alteraciones
Cariotipo por bandeo G cromosómicos numéricas
o estructurales
• Limite de resolución menor a 3 MB
hasta 100kb
FISH • Microdeleciónes o duplicaciones
• Analiza regiones especificas de los
cromosomas
• Analiza varias regiones cromosómicas al
MLPA mismo tiempo
• Variante en el nro de copias “CNV”
Array CGH • Depende de la densidad y el tamaño de
los segmentos inmovilizados
• Resolución variable 5Kb ~ 100Kb
• Variantes de nucleótidos
Secuenciación pimples “SNV”
1kb= 1000pb 1Mb= 1.000.000pb
MUCHAS GRACIAS!!!
Catedra de Genética Medica
Facultad de Ciencias Medicas-UNSE
ZZZ
Cultivo
Toma de celular Preparado Análisis al
Bandeo Informe
Muestra del material Microscopio
72hs
Envejecimiento
7 días 1 o 2 días
Oligo microarray
BAC array CGH
100 Kb
mutaciones
FISH MLPA, RT-PCR puntuales
Sanger sequencing
karyotyping
5 Mb
100 Mb 10 Mb 1 Mb 100 Kb 10 Kb 1 Kb 100 bp 10 bp 1 bb
Las técnicas diseñadas para detectar cambios en el número de copias, como MLPA
y real-time PCR, son complementarias a las técnicas de FISH y secuenciación, pero
todas ellas requieren la elección de targets candidatos ántes de llevarse a cabo el
ensayo, a diferencia del aCGH.
