| Laboratorio de técnicas de DNA recombinante

MC. Jessica Judith Gómez Lugo

Mariana Cantú López.......................................................1872447

Sofia Rodríguez Domínguez………………………………………….1947728
Integrantes. Andrea Deyanira Trejo Alvear ………………………………………2078546
Carlos Daniel Barrios Martínez ........................................2078336

Fecha de 12/10/2023 Grupo 06

entrega.

Prácticas 6
Aplicaciones de la Bioinformática. Diseño de primers y optimización de la Reacción de la PCR.
Objetivos:
Diseñar los primers para realizar una PCR in silico a la secuencia del gen de Miraculin - Richadella dulcifica.

Observaciones y Resultados:
1. Características del gel a amplificar
Gen
Entry
Organismo GenBank CDS
(UNIPROT)

Synsepalum
dulcificum
Miraculin - Richadella
(Miracle fruit) AB512278.1
dulcifica.
(Richadella
dulcifica)

2. Diseño de primers
Primer
ATGAAGGAATTAACAATGCTCTCTCT
Forward
Tamaño
Tm %GC Primers sobre la secuencia
(pb)
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26bp 58.7°C 34.6%

Primer
TTAGAAGTATACGGTTTTGTTGAACT
Reverse
Tamaño
Tm %GC Primers sobre la secuencia
(pb)

26pb 57.1°C 30.8%

3. Características de los primers

a. Primer forward
Hairpin structures Delta G Tm Imagen
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-0.02
25.6 C o

kcal/mol

0.85
4.3 C o

kcal/mol

- - -

Self dimmer structures Delta G Pb Imagen

-5.63kcal/mol 4

-4.85kcal/mol 4

-3.42
3
kcal/mol

Hetero-dimer Imagen
Delta G Pb
structures
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-7.18
5
kcal/mol

-3.9
3
kcal/mol

-3.29
3
kcal/mol

Blast

b. Primer reverse
Hairpin structures Delta G Tm Imagen

-0.26
27.7
kcal/mol

0.4 20.6
kcal/mol
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0.49
16.3
kcal/mol

Self dimmer structures Delta G Pb Imagen

-6.08
6
kcal/mol

-3.61
2
kcal/mol

-3.29
3
kcal/mol

Hetero-dimer Imagen
Delta G Pb
structures

-7.18
5
kcal/mol

-3.9 kcal/mol 3
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MC. Jessica Judith Gómez Lugo

-3.29
3
kcal/mol

Blast

Discusión de resultados:
Según la literatura, uno de los primeros pasos en el diseño de un protocolo de amplificación génica por PCR es la
selección de los oligonucleótidos iniciadores que flanquearán el gen o la porción de éste a ser amplificada (comúnmente
denominado “amplicón”). Tales iniciadores mejor conocidos como “primers” son los que confieren la alta especificidad a
la PCR al hibridar de forma precisa con una secuencia de DNA única; además deben presentar ciertas características
importantes para ser seleccionados como:
 Un rango de longitud entre 18 y 28 nucleótidos cada uno.
 Ausencia de complementariedad inter-oligo e interna.
 El contenido de dG y dC mayor al 50%.
 Una Tm más o menos similar y debe ser de aproximadamente 55-70 °C.
 La presencia de una G o C en el extremo 3´.
El primer aspecto (longitud) es importante para asegurar la especificidad de la PCR, 18-28 nucleótidos es el tamaño ideal
para conferir una buena especificidad. En este caso ambos primers poseen 26 nucleótidos, por lo que sí cumplen con
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esta característica importante y se podría decir que son primers adecuados en este primer aspecto. En caso de ser
primers más pequeños podrían correr el riesgo probabilístico de unirse inespecíficamente a otros sitios en el genoma de
la especie a estudiar, y si fuesen más grandes podrían por simple probabilidad tener mayor riesgo de presentar
complementariedad inter-oligo e interna.
Por otro lado, los primers presentaron un %GC más bajos de lo adecuado, por lo que probablemente necesitemos
diseñarlos un poco más largos para alcanzar dicho valor.
La Tm de los dos primers es muy similar están dentro del rango de temperatura preferible, por lo que en este aspecto
son primers adecuados.
En ninguno de los primers se encuentra la presencia de una G o C en el extremo 3´, pero esto solo aportaría estabilidad
del final de los dos primers. (6)
Además de estos aspectos se verificó las posibles interacciones que podrían tener los primers entre los propios primers
forward o reverse, o las interacciones entre primer forward con primer reverse. Para ello se tomó en cuenta la Delta G,
en el caso del self-dimer y del hetero-dimer se espera que la Delta G sea entre 0 a -9 kcal/mol, que en ambos primers sí
se cumplieron ambos parámetros, por lo que los dos primers se considerarían adecuados para utilizarse en una PCR. Por
ultimo se verificó la Quary Cover de ambos primers, el cual fue del 100% para ambos primers. (7)

Conclusiones:
Al concluir esta práctica obtuvimos los datos necesarios para la realización de los primers específicos del gen Miraculin -
Richadella dulcifica mediante las distintas plataformas tal como Unipront para obtener la secuencia del gen a investigar,
primer 3 plus identificación de los primers forward y reverse; así como Oligo Analizer para determinar el hairpin, self
dimmer y el análisis de cada primer obtenido.

Referencias:
1. https://www.uniprot.org/uniprotkb/C5NU63/entry#sequences
2. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AB512278.1?report=fasta
3. https://www.primer3plus.com/index.html
4. https://www.idtdna.com/calc/analyzer
5. https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
6. Universitat de Valencia (s/f). GUÍA PARA LA SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA DE DNA. Recuperado el 11 de
octubre de 2023, de https://www.google.com/url?sa=t&source=web&rct=j&opi=89978449&url=https://
www.uv.es/scsieweb/SCSIE/SCSIE-GEN/guia-secuenciacion-automatica-
dna.pdf&ved=2ahUKEwik7_fBg_GBAxUpIkQIHWcHDecQFnoECCoQAQ&usg=AOvVaw0pDLQHrJnru-jJKAFZ-0Z9
7. Lacoste, M. (s/f). Diseño de oligonucleotidos. Recuperado el 11 de octubre de 2023, de
https://www.google.com/url?sa=t&source=web&rct=j&opi=89978449&url=https://
qbpatologica.files.wordpress.com/2014/08/disec3b1o-de-primers-
2014.pdf&ved=2ahUKEwjH7p2yhvGBAxXmIEQIHddGDz4QFnoECC4QAQ&usg=AOvVaw01rCXFLL3MdNPHmcuVQ
Frt

Nombre Firma
Sofia Rodríguez Domínguez
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Mariana Cantú López

Carlos Daniel Barrios

Martínez

Andrea Deyanira Trejo Alvear

Punto
Elementos que se evalúan %
s
No. y nombre de la práctica, Fecha de
5
realización
Objetivo 10
Observaciones y Resultados 40
Discusión de Resultados 20
Conclusiones 15
Referencias 5
Firma de responsables 5
Total 100