Estructura Del
4 Ácido Nucleico
ÍNDICE DE TEMAS
4.1 TAMAÑO Y FRAGILIDAD DEL
ADNLas moléculas de ADN varían en tamaño y en
composición de bases.
Las moléculas de ADN son frágiles.
4.2 PATRONES DE RECONOCIMIENTO EN LOS
SURCOS MAYOR Y MENOR
Las enzimas pueden reconocer patrones
. específicos en los bordes de los surcos mayor y
menor.
4.3 CURVATURA DEL ADN
Algunas. Secuencias de las bases hacen
que el ADN sea doble.
4.4 Desnaturalización y Renaturalización del ADN
El ADN puede desnaturalizarse.
Los enlaces de hidrógeno estabilizan el ADN de doble cadena.
4.2
El apilamiento de bases también estabiliza el ADN de doble
cadena.
El apilamiento de bases es una interacción cooperativa.
La fuerza iónica influye en la estructura del ADN.
La molécula de ADN está en un estado dinámico.
Las hebras cortas complementarias pueden aparearse con una
hebra de ADN simple.
El álcali desnaturaliza el ADN sin romper los enlaces fosfodiéster.
Las hebras simples complementarias pueden aparearse para formar
ADN de doble cadena.
4.5 Helicasas
Las helicasas son proteínas motoras que utilizan
la energía de los trifosfatos de nucleósidos para
desenrollar el ADN.
4.6 Proteínas de unión a ADN monocatenario
Las proteínas de unión a ADN de cadena
simple (SSB) estabilizan el ADN
monocatenario.
4.7 TOPOISOMERASAS Y TOPOISÓMEROS
Las moléculas de ADN circular cerrado covalentemente
pueden formar superhélices.
El ADN bacteriano normalmente existe como un círculo
cerrado covalentemente.
Las moléculas de ADN plasmídico se utilizan para
estudiar las propiedades del ADN circular in vitro.
Las moléculas de ADN circular suelen presentar
estructuras de superhélice.
La superenrollación del ADN se debe a un sub- o sobre-
enrollamiento del ADN circular.
Las superhélices pueden tener regiones de cadena
sencilla.
Las topoisomerasas catalizan la conversión de un
topoisómero en otro.
4.8 CONFORMACIONES DE ADN NO TIPO B
El ADN tipo A es una doble hélice dextrógira con un surco mayor
profundo y un surco menor muy estrecho.
El ADN tipo Z tiene una conformación levógira.
Los cambios conformacionales del ADN resultan de la rotación alrededor
de enlaces simples.
Parece que existen en la naturaleza varias otras estructuras de ADN que
no son del tipo B.
4.9 Estructura del ARN
El ARN cumple una gran variedad de funciones en
la célula.
La estructura secundaria del ARN está dominada
por pares de bases tipo Watson-Crick.
Las estructuras terciarias del ARN están
estabilizadas por interacciones entre dos o más
elementos estructurales secundarios.
4.10 Hipótesis del Mundo de ARN
Las primeras formas de vida en la Tierra pueden haber
usado ARN como material genético y como catalizador
biológico necesario para mantener la vida.
Lectura Sugerida
a primera parte de este capítulo se basa en la información proporcionada
en el Capítulo 1 sobre la estructura del ADN tipo B. Más
específicamente, se exploran temas como el tamaño del ADN, su
fragilidad, los surcos (mayor y menor), la flexión (curvatura), la
desnaturalización, la renaturalización y la superhelicidad.
Esta nueva información, junto con la presentada en los Capítulos 2 y 3 sobre
proteínas y enzimas, se aplica al estudio de enzimas que desenrollan el ADN de
doble cadena, proteínas que estabilizan el ADN de cadena sencilla, y enzimas
que catalizan cambios en las estructuras superhelicoidales.
Aunque el ADN tipo B es la conformación predominante dentro de la célula,
también existen otras conformaciones. Algunas de estas estructuras alternativas y
su posible significado fisiológico se abordan en esta sección.
La segunda parte del capítulo examina la estructura del ARN.
Como se describe en el Capítulo 1, los ribonucleótidos se unen mediante enlaces
fosfodiéster 5’→3’, formando cadenas lineales de polirribonucleótidos.
Las células producen muchos tipos distintos de ARN, cada uno con una secuencia
específica de nucleótidos (estructura primaria) y un tamaño característico.
Algunas moléculas de ARN pueden cumplir sus funciones como cadenas simples no
estructuradas, pero muchas otras requieren la formación de estructuras
secundarias y terciarias específicas para desempeñar su función correctamente.
Aunque las cadenas de ARN carecen de la flexibilidad de las cadenas polipeptídicas y
sus nucleótidos no presentan la misma diversidad de grupos funcionales que los
aminoácidos, algunas moléculas de ARN pueden plegarse en estructuras que se
unen a sustratos específicos y catalizan reacciones químicas.
Además, muchas moléculas de ARN interactúan con proteínas para formar
complejos ribonucleoproteicos estables.
Este capítulo introduce algunos aspectos fundamentales de la estructura del ARN.
Información más detallada sobre moléculas específicas de ARN y complejos
ribonucleoproteicos será presentada en los capítulos posteriores, en los que se
analizan las funciones del ARN.
CAPÍTULO 4 Estructura de Ácidos Nucleicos
4.1 Tamaño y Fragilidad del ADN
Las moléculas de ADN varían en tamaño y composición de bases
Las moléculas de ADN existen en una amplia variedad de tamaños y composiciones de bases en
virus, bacterias, arqueas y eucariotas. En la mayoría de los procariotas, el contenido total de ADN
suele estar contenido en una sola molécula de ADN. En los eucariotas, incluidos los organismos
unicelulares como algas, levaduras y protozoos, el ADN está dividido en varios cromosomas.
La extensa molécula de ADN en cada cromosoma se enrolla alrededor de complejos proteicos
formados por proteínas básicas llamadas histonas. Se conocen los tamaños y secuencias
exactas de muchas moléculas de ADN virales, bacterianas y eucariotas. La Tabla 4.1 enumera las
longitudes de moléculas individuales de ADN provenientes de diversas fuentes. Los tamaños
varían considerablemente entre las moléculas de ADN viral, pero mucho menos entre las
bacterianas.
La longitud de las moléculas de ADN de doble cadena puede calcularse a partir de la distancia
entre pares de bases, que es de 0.34 nanómetros (nm). Por lo tanto, las moléculas de ADN
listadas en la Tabla 4.1 varían aproximadamente de 1.7 micrómetros (µm) hasta 83,500
milímetros (mm), es decir, 8.3 centímetros (cm). El ancho de una molécula de ADN es de 2.0
nm. En general, los organismos más complejos requieren moléculas de ADN más largas, como se
muestra en la Tabla 4.1.
TABLA 4.1 TAMAÑOS DE VARIAS MOLÉCULAS DE ADN Ta
ma
Fuente de ADN Tamaño en pares de bases (pb)
Plásmido pBR322* 4,361
Virus simio 40 (SV40) 5,200
Fago 17* 39,937
Fago λ * 48,502
Plásmido F 99,159
Cepa WR del virus Vaccinia 194,711
Virus de la viruela aviar 266,145
Mycoplasma genitalium 580,073
Cromosoma IV de la levadura 1,531,929
Escherichia coli 4,639,221
Cromosoma 1 humano 245,522,847
Nota: Los fagos (virus que infectan bacterias) y los plásmidos marcados con un
asterisco tienen a E. coli como huésped. Mycoplasma genitalium es la bacteria de
vida libre más pequeña que se conoce. Para la levadura y los humanos, se
proporciona la masa molecular de la molécula de ADN más grande del organismo.
mucho más ADN que los organismos más simples (aunque las células tanto del
sapo como del pez pulmonado sudamericano tienen considerablemente más ADN
que las células humanas).
CAPÍTULO 4 Estructura de Ácidos Nucleicos
LAS MOLÉCULAS DE ADN SON
FRÁGILES
Las grandes longitudes de las moléculas de ADN las
hacen extremadamente susceptibles a la ruptura
por las fuerzas de cizallamiento hidrodinámicas
resultantes de tales operaciones ordinarias como
pipetear, verter y mezclar.
Las moléculas de ADN no rotas más cortas de
aproximadamente 300,000 pb generalmente
pueden ser aisladas de virus. A menos que se
tenga mucho cuidado, las moléculas de ADN más
grandes casi siempre se rompen durante el
aislamiento, de modo que la longitud promedio
del ADN aislado es generalmente de
aproximadamente 40,000 pb. El ADN bacteriano,
por ejemplo, se fragmenta en aproximadamente
50 a 100 piezas. El hecho de que el ADN de las bacterias y de los
organismos superiores se fragmenta invariablemente por manipulación
tiene importantes consecuencias experimentales.
FIGURA 4.1 Surcos mayor y menor en el ADN-B.
El ADN-B se muestra como una estructura de
relleno espacial con las bases en azul claro y el
resto de la molécula en la coloración estándar de
elementos CPK. (Estructura del Banco de Datos
de Proteínas 1BNA. H. R. Drew, et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 78 [1981]: 2179-2183.
Preparado por B. E. Tropp).
4.2 Patrones de reconocimiento en los
surcos mayor y menores
Las enzimas pueden reconocer patrones específicos
en los bordes de los surcos mayor y menor.
La longitud y fragilidad del ADN presenta un desafío
cuando los investigadores desean estudiar el ADN in
vitro. Sin embargo, este desafío es técnico y no influye
en nuestro concepto básico de cómo funciona el ADN.
SECCIÓN II ÁCIDOS NUCLEICOS Y
NUCLEOPROTEÍNAS
FIGURA 4.2 Reconocimiento de pares de bases desde los bordes en los
surcos mayor y menor.
(a–d) Se muestran los cuatro tipos de pares de bases. Los enlaces de
hidrógeno entre los pares de bases se representan como una serie de líneas
rojas cortas.
Los posibles donadores de enlaces de hidrógeno se muestran en azul, y los
posibles aceptores de enlaces de hidrógeno en naranja.
Los grupos metilo no polares en la timina se muestran en amarillo, y los
átomos de hidrógeno que están unidos a átomos de carbono y, por lo tanto,
no pueden formar enlaces de hidrógeno, se muestran en blanco.
(Modificado de C. Branden y J. Tooze. Introducción a la estructura de las proteínas,
Primera edición. Garland Science, 1999. Usado con permiso de John Tooze,
Universidad Rockefeller.)
Un problema más fundamental surge del hecho de que los pares de bases
están ubicados dentro de la hélice. Por lo tanto, al principio fue difícil
entender cómo las enzimas reconocen e interactúan con secuencias
específicas de bases.
Una posible solución al problema es que el ADN se desenrolle. Aunque el
ADN sí se desenrolla (ver más adelante), muchas enzimas parecen ser
capaces de reconocer secuencias de bases en la estructura helicoidal.
El examen de la estructura tridimensional mostrada en la FIGURA 4.1
revela que los bordes de los surcos mayor y menor son accesibles para las
enzimas.
Estos surcos surgen porque los grupos desoxirribofuranosa están unidos a
los pares de bases de manera asimétrica.
Es decir, los anillos de azúcar se encuentran más cerca de un lado del par de
bases que del otro. Los bordes de los surcos están revestidos con donadores
de enlaces de hidrógeno, aceptores de enlaces de hidrógeno, grupos metilo
no polares y átomos de hidrógeno (FIGURA 4.2). Cada uno de los cuatro
pares de bases proyecta un patrón único en el borde del surco mayor, pero
los pares T•A y A•T proyectan el mismo patrón en el borde del surco
menor, al igual que los pares C•G y G•C (FIGURA 4.3).
Estos patrones permiten que las enzimas lean la secuencia desde fuera de la
hélice.
CAPÍTULO 4
Estructura del
Ácido Nucleico
MAYOR MENOR
Leyenda de colores:
🔴 Aceptor de enlace de hidrógeno (H-bond acceptor)
🔵 Donador de enlace de hidrógeno (H-bond donor)
⚪ Átomo de hidrógeno (Hydrogen atom)
🟡 Grupo metilo (Methyl group)
FIGURA 4.3 Código de reconocimiento del ADN.
Se pueden observar patrones distintos de donadores de enlaces de hidrógeno,
aceptores de enlaces de hidrógeno, grupos metilo y átomos de hidrógeno
cuando se mira directamente los bordes de los pares de bases en los surcos mayor
(a) o menor (b).
Cada uno de los cuatro pares de bases proyecta un patrón único de donadores de
enlaces de hidrógeno, aceptores de enlaces de hidrógeno, grupos metilo y átomos
de hidrógeno en el borde del surco mayor.
Sin embargo, los patrones son similares en el borde del surco menor para los pares
T•A y A•T, así como para C•G y G•C
(Modificado de C. Branden y J. Tooze. Introducción a la estructura de las
proteínas Primera edición. Garland Science, 1999. Usado con permiso de John
Tooze, Universidad Rockefeller.)
4.3 Flexión del ADN (DNA Bending)
Algunas secuencias de bases provocan que el ADN se doble.
Se ha observado una gran variedad de secuencias de bases en el ADN. Aunque la mayoría de ellas
no presentan características especiales que influyan en su estructura, algunas sí lo hacen. Por
ejemplo, segmentos formados por 4 a 6 residuos de adenina adyacentes, conocidos como tractos-A
(A-tracts), provocan una curvatura en la molécula de ADN. Cada tracto-A contribuye con
aproximadamente 17° a 22.5° de curvatura. Cuando los tractos-A están en fase dentro de una
molécula de ADN —es decir, se repiten a intervalos de 10 u 11 pares de bases— sus efectos se
suman y la molécula de ADN puede doblarse sobre sí misma.
Otras secuencias, como 5'-RGCY-3', donde R representa una purina y Y una pirimidina,
también pueden inducir curvatura. Como resultado, la estructura local del ADN tipo B (B-ADN)
puede diferir ligeramente de la hélice lineal clásica.
4.4 Desnaturalización y renaturalización del ADN
El ADN puede ser desnaturalizado
Cuando se propuso por primera vez el modelo de Watson y Crick, muchos investigadores pensaron que las
largas hebras de ADN no podrían desenrollarse y que, por lo tanto, la separación completa de las hebras
sería imposible. Con el fin de disipar esta preocupación, los químicos biofísicos intentaron demostrar que el
proceso de desenrollamiento del ADN también puede tener lugar en un tubo de ensayo. El enfoque
consistió en tratar el ADN con un agente físico o químico que interrumpiera las interacciones no covalentes
débiles (ver más abajo), las cuales mantienen unidas a las bases nitrogenadas, sin romper los enlaces
covalentes. Los primeros esfuerzos, llevados a cabo por Paul Doty y sus colaboradores a fines de la década
de 1950, mostraron que las soluciones de ADN experimentan una notable disminución en la viscosidad
cuando se calientan, lo cual fue interpretado como una evidencia de que la estructura helicoidal doble
colapsa con el calor. Este colapso también estuvo acompañado por un cambio en la capacidad del ADN para
rotar la luz polarizada en un plano, resultado de la pérdida de su estructura helicoidal dextrógira. Se
consideró probable que este cambio en la estructura secundaria observado al calentar la solución de ADN
representara una conversión de la hélice doble lineal en hebras simples separadas. Diversos experimentos
ayudaron a confirmar que, efectivamente, las dos hebras del ADN se desenrollan y se separan cuando la
solución se calienta. Por ejemplo, se observó que la relación masa/longitud del ADN antes del
calentamiento era el doble que la del ADN después del calentamiento, y además, una desoxirribonucleasa
específica para ADN de cadena simple fue capaz de digerir el ADN después del calentamiento pero no
antes. Esta transición, desde la estructura helicoidal doble (estado nativo) hacia hebras simples enrolladas
aleatoriamente (estado desnaturalizado), se conoce como desnaturalización.
La forma más sencilla de detectar la desnaturalización del ADN es monitorear su capacidad para absorber
luz ultravioleta a una longitud de onda de 260 nanómetros (nm), representada como A₂₆₀. Las bases purinas
y pirimidinas del ADN absorben fuertemente la luz a esa longitud de onda. La absorbancia a 260 nm (A₂₆₀)
es directamente proporcional a la concentración del ADN en solución. El valor de A₂₆₀ para ADN de doble
SECCIÓN II ÁCIDOS NUCLEICOS Y
NUCLEOPROTEÍNAS
hebra, a una concentración de 50 µg/mL, es de 1.00 unidad. Además, la cantidad de luz absorbida
por los ácidos nucleicos depende de la estructura de la molécula: cuanto más ordenada sea la
estructura, menos luz se absorbe. Por lo tanto, el ADN de doble hebra absorbe menos luz que las
hebras simples que lo componen, y estas, a su vez, absorben menos luz que los nucleótidos libres
liberados por hidrólisis. Por ejemplo, tres soluciones con ADN de doble hebra, ADN monocatenario
y nucleótidos libres, cada una a 50 µg/mL, presentan distintos valores de absorbancia (A₂₆₀), lo
cual refleja su nivel de desorganización estructural.
Absorbancia
Tipo de muestra
(A₂₆₀)
ADN de doble hebra A₂₆₀=1 .00
ADN de hebra sencilla A₂₆₀ =1.37
Nucleótidos libres A₂₆₀=1 .60
Esta relación se describe comúnmente afirmando que el ADN de doble hebra es
hipocrómico, mientras que los nucleótidos libres son hipercrómicos. Si una
solución de ADN, en una concentración aproximada de 0.15 M de cloruro de sodio
(NaCl), se calienta lentamente mientras se mide su absorbancia a 260 nm (A₂₆₀) a
diferentes temperaturas, se obtiene una curva de fusión como la que se muestra en la
FIGURA 4.4.
Los siguientes aspectos de esta curva deben ser tenidos en cuenta:
1. La A₂₆₀ se mantiene constante hasta temperaturas considerablemente
más altas que aquellas que experimentan la mayoría de las células vivas
en la naturaleza.
2. El aumento en la absorbancia (A₂₆₀) ocurre en un rango de
temperatura de entre 6 °C a 8 °C.
3. El valor máximo de A₂₆₀ es aproximadamente un 37 % más alto que
el valor inicial.
CAPÍTULO 4
Estructura del
Ácido Nucleico
FIGURA 4.4 Curva de fusión del ADN
Una curva de fusión del ADN que muestra la Tₘ (temperatura de fusión) y las posibles
conformaciones moleculares correspondientes a diversos grados de desnaturalización.
El estado de una molécula de ADN en las diferentes regiones de la curva de fusión
también se muestra en la Figura 4.4. Antes de que comience el aumento en la absorbancia
A₂₆₀, la molécula se encuentra completamente en forma de doble hélice. En la región de
ascenso de la curva, las interacciones no covalentes entre pares de bases en diferentes
segmentos de la molécula comienzan a romperse; y la extensión de esta disrupción
aumenta conforme sube la temperatura.
En la parte inicial de la meseta superior, todavía permanecen algunas interacciones no
covalentes que mantienen unidas las dos hebras, hasta que se alcanza una temperatura
crítica en la que se rompen las últimas interacciones restantes y las hebras se separan
completamente.
Un parámetro útil para caracterizar esta transición de fusión es la temperatura a la que el
aumento en la A₂₆₀ está a la mitad de completarse. Esta temperatura se conoce como
temperatura de fusión y se representa como Tₘ.
Durante el estudio de la separación de hebras, surgió otro hallazgo importante. Si una
solución de ADN se calienta a una temperatura en la que la mayoría, pero no todas, las
interacciones no covalentes se han roto, y luego se enfría a temperatura ambiente, la
absorbancia A₂₆₀ desciende inmediatamente al valor original del ADN no
desnaturalizado. Experimentos adicionales demostraron que la estructura nativa se
restaura.
Por lo tanto, si la separación de hebras no es completa y se eliminan las condiciones
desnaturalizantes, la hélice se vuelve a enrollar. Así, si dos hebras separadas entran en
contacto y logran formar incluso un solo par de bases en la posición correcta, es posible
que la molécula nativa de ADN se reconstituya.
Volveremos a encontrarnos con este fenómeno cuando se describa la
renaturalización
LOS ENLACES DE HIDRÓGENO ESTABILIZAN EL ADN DE
DOBLE CADENA
En 1962, Julius Marmur y Paul Doty aislaron ADN de diversas
especies bacterianas, en las cuales la composición de bases varía
entre 20 % y 80 % de G + C.
FIGURA 4.5 – Efecto del contenido
de G–C sobre la temperatura de
fusión del ADN
La temperatura de fusión (Tₘ) aumenta
con el incremento del porcentaje de G +
C.
La solución de ADN contenía 0.15 M de
cloruro de sodio y 0.015 M de citrato de
sodio.
SECCIÓN II ÁCIDOS NUCLEICOS Y NUCLEOPROTEÍNAS
El apilamiento de bases también estabiliza el ADN de doble cadena.
Las bases planas en la doble hélice están apiladas de manera que
los sistemas de electrones π de los anillos en pares de bases
adyacentes se encuentran en contacto directo. Las fuerzas que
estabilizan este apilamiento en la hélice incluyen interacciones
electrostáticas entre dipolos, fuerzas de Van der Waals y efectos
hidrofóbicos. No se conoce con precisión la contribución específica
de cada una de estas interacciones débiles a la estabilidad
helicoidal, ya que es difícil modificar la estructura del ADN de forma
que solo se altere un tipo de interacción. Tanto el apilamiento de
bases como los enlaces de hidrógeno son interacciones débiles no
covalentes, y por tanto fácilmente interrumpidas por el
movimiento térmico. El apilamiento se fortalece cuando las bases
no pueden inclinarse ni desplazarse fuera del arreglo apilado. De
modo similar, la formación óptima de enlaces de hidrógeno se
produce cuando todas las bases están correctamente orientadas.
Es evidente que estas dos interacciones débiles se refuerzan
mutuamente: las bases apiladas se unen más fácilmente mediante
enlaces de hidrógeno, y a su vez, las bases unidas por enlaces de
hidrógeno, al estar orientadas por esos enlaces, se apilan con
mayor facilidad. Si una de estas interacciones se elimina, la otra
también se debilita, lo que explica por qué la temperatura de
fusión (Tₘ) disminuye tan marcadamente tras la adición de un
agente que destruya cualquiera de los dos tipos de interacción.
El apilamiento de bases es una interacción cooperativa
En una secuencia de bases apiladas, por ejemplo: ABCDEFGHIJ,
sería muy poco probable que la base E se saliera del arreglo
apilado, ya que el plano de la base tiende a mantenerse paralelo
a los planos de D y F.
Sin embargo, esta tendencia a conservar un arreglo apilado
ordenado no es tan fuerte en los extremos de la molécula. Por
ejemplo, solo una base, B, estabiliza la orientación de la base A.
Por lo tanto, una molécula de solvente en movimiento rápido
podría chocar con A y hacer que se gire y salga del apilamiento
con más facilidad que si chocara con E, cuya orientación está
reforzada por más interacciones laterales.
Dado que A tiene una menor probabilidad de permanecer
apilada en comparación con B, entonces, lógicamente, B también
es más fácil de desorientar que C.
Esta ligera tendencia hacia la inestabilidad, que también está
presente en una molécula de doble cadena, es más evidente en el
valor de Tₘ (temperatura de fusión) de los polinucleótidos de
doble cadena que contienen menos de 20 pares de bases,
conocidos como oligonucleótidos. Por ejemplo, si una molécula
con 10⁶ pares de bases se fragmenta en porciones de 10⁴ pares de
bases, no se detecta un cambio apreciable en el valor de Tₘ.
Sin embargo, bajo condiciones en las que el Tₘ de una molécula
grande de ADN es de 90 °C, el Tₘ de un hexanucleótido de
doble cadena (seis nucleótidos por hebra) puede ser tan bajo
como 30 °C.
El valor exacto depende de la composición y la secuencia de
bases.
Este efecto tiene las siguientes consecuencias:
1. Los extremos de una molécula lineal de ADN de doble
cadena generalmente no están unidos por enlaces de
hidrógeno, sino que se encuentran deshilachados (como se
muestra en la Figura 4.6), con aproximadamente siete pares
de bases rotos.
Sin embargo, algunas secuencias de bases se apilan mejor
que otras e incluso pueden mantenerse apiladas en el
extremo de una molécula.
2. Oligonucleótidos de doble cadena muy cortos, con menos
de 15 pares de bases por molécula, tienen valores de Tₘ
particularmente bajos.
Por ejemplo, un trinucleótido de doble cadena (3 bases por
hebra) no es estable a temperatura ambiente.
SECCIÓN II ÁCIDOS NUCLEICOS Y NUCLEOPROTEÍNAS
3. Las moléculas en las que las regiones apareadas son muy
cortas y están flanqueadas por regiones no apareadas (como
las dos inferiores en la Figura 4.6) no pueden mantener la
conformación mostrada a temperaturas fisiológicas.
REGIONES EN LAS QUE LAS
SECUENCIAS DE BASES NO
SON COMPLEMENTARIAS
FIGURA 4.6 – Varios efectos de la
cooperatividad en el apilamiento de bases
Cada área sombreada indica pares de bases
que se romperían a temperatura
ambiente.
Sin embargo, si estos tramos contuvieran
más de quince pares de bases, serían
estables.
SECCIÓN II ÁCIDOS NUCLEICOS Y NUCLEOPROTEÍNAS
. LA FUERZA IÓNICA INFLUYE EN LA ESTRUCTURA
DEL ADN
Además de las interacciones atractivas cooperativas entre las bases
de ADN adyacentes y entre las dos hebras, existe una repulsión
electrostática entre hebras debido a los grupos fosfato con carga
negativa.
(También hay una repulsión dentro de cada hebra, aunque
probablemente no es importante para la estructura de la doble hélice).
Esta fuerza repulsiva intensa provocaría la separación de las dos
hebras si dichas cargas no estuvieran neutralizadas.
Cuando se examina la variación de la temperatura de fusión (Tₘ) en
función de la concentración iónica de la solución tampón, se observa
que Tₘ disminuye bruscamente a medida que disminuye la
concentración de sal.
De hecho, en agua destilada, el ADN puede desnaturalizarse a
temperatura ambiente.
La explicación de este fenómeno es la siguiente:
En ausencia de sal, las hebras del ADN se repelen entre sí.
Al añadir sal, los iones positivos, como el Na⁺, forman “nubes” de
carga positiva alrededor de los grupos fosfato negativos, lo que
reduce eficazmente la repulsión entre ellos.
Finalmente, todos los grupos fosfato quedan protegidos, y la
repulsión cesa. Este efecto ocurre aproximadamente a la
concentración salina fisiológica de 0.2 M.
Sin embargo, Tₘ continúa aumentando cuando se incrementa aún
más la concentración de cloruro de sodio, ya que la solubilidad de
purinas y pirimidinas disminuye, lo que refuerza las interacciones
hidrofóbicas entre las bases.
La molécula de ADN está en un estado dinámico
Una característica estructural importante del ADN se hace evidente cuando
se examina en presencia de formaldehído (HCHO).
El formaldehído puede reaccionar con los grupos amino (–NH₂) de las
bases, lo que elimina su capacidad para formar enlaces de hidrógeno.
Por tanto, al añadir formaldehído, se provoca una desnaturalización lenta
e irreversible del ADN.
Dado que los grupos amino deben estar disponibles para reaccionar con el
formaldehído, esto indica que las bases están constantemente
apareándose y desapareándose, es decir, los enlaces de hidrógeno se
rompen y se vuelven a formar de manera continua.
Un fenómeno relacionado se observa cuando el ADN se disuelve en agua
tritiada ([³H]H₂O).
En este caso, hay un intercambio rápido entre los protones involucrados
en enlaces de hidrógeno de las bases y los iones H⁺ del agua.
Estas dos observaciones indican que el ADN es una estructura dinámica,
en la que las regiones de doble cadena se abren frecuentemente para
formar burbujas de cadena sencilla y luego se cierran nuevamente.
A esta desnaturalización localizada y transitoria se le denomina
“respiración del ADN” (DNA breathing).
Dado que un par de bases G≡C tiene tres enlaces de hidrógeno y un par
A=T tiene solo dos, la desnaturalización transitoria ocurre con mayor
frecuencia en regiones ricas en pares A=T que en aquellas ricas en pares
G≡C.
TRAMOS CORTOS Y DISTANTES DE SECUENCIAS
COMPLEMENTARIAS PUEDEN FORMAR PARES DE
BASES EN ADN DE CADENA SENCILLA
Para obtener los datos de las curvas de fusión como las que se han
mostrado, se mide la absorbancia a 260 nm (A₂₆₀) a diferentes
temperaturas, las cuales se grafican en el eje X.
La desnaturalización del ADN suele completarse a temperaturas
superiores a 90 °C.
En la mayoría de los experimentos, se observa un incremento total en
A₂₆₀ de aproximadamente un 37 %, y la solución queda compuesta
completamente por hebras simples con bases no apiladas.
Sin embargo, si la solución se enfría rápidamente a temperatura
ambiente y la concentración de sal es superior a 0.05 M, el valor de
A₂₆₀ que se alcanzó en la temperatura máxima disminuye
significativamente, aunque no totalmente (ver Figura 4.7).
Esto se debe a que, en ausencia del movimiento térmico disruptivo, se
forman enlaces de hidrógeno intrahebra aleatorios entre tramos cortos y
distantes de bases con secuencias suficientemente complementarias.
Típicamente, el valor de A₂₆₀ desciende a aproximadamente 1.12 veces
el valor inicial del ADN nativo, lo que sugiere que, después del
enfriamiento, alrededor de dos tercios de las bases están unidas por
enlaces de hidrógeno o tan próximas entre sí que el apilamiento se ha
restablecido.
Como resultado, la molécula se vuelve muy compacta (ver Figura 4.7).
La situación es muy diferente si la concentración de sal es de 0.01 M o
menor.
En este caso, la repulsión electrostática entre los grupos fosfato
negativos mantiene las hebras simples lo suficientemente extendidas
como para que las bases no puedan acercarse entre sí.
Por tanto, tras el enfriamiento, no se forman enlaces de hidrógeno y el
apilamiento de bases se mantiene al mínimo.
El álcali desnaturaliza el ADN sin romper los enlaces fosfodiéster
El calor puede utilizarse para obtener ADN desnaturalizado, lo cual
suele ser un paso esencial en muchos protocolos experimentales.
Sin embargo, las altas temperaturas pueden romper los enlaces
fosfodiéster, por lo que el producto de la desnaturalización térmica
frecuentemente resulta en una colección de hebras simples
fragmentadas.
Este problema de degradación puede evitarse utilizando otro método
para desnaturalizar el ADN.
La adición de una base, como el hidróxido de sodio (NaOH), a la
solución de ADN elimina protones de los átomos de nitrógeno del
anillo de guanina y timina.
Esta desprotonación, que ocurre a pH superiores a 11.3, interrumpe
los enlaces de hidrógeno entre las hebras sin afectar los enlaces
fosfodiéster del esqueleto del ADN.
CAPÍTULO 4
Estructura del
Ácido Nucleico
FIGURA 4.7 – Efecto de reducir la temperatura a 25 °C después de
la separación de hebras
Las moléculas de ADN en una solución con alta concentración de sal
(curva azul) o baja concentración de sal (curva roja) se calientan a
90 °C, lo que provoca que las dos hebras se desenrollen y separen
completamente.
Luego, las soluciones se enfrían rápidamente a 25 °C.
Después del enfriamiento, la absorbancia a 260 nm (A₂₆₀) del ADN en
la solución con alta concentración de sal es mucho menor que la del
ADN en la solución con baja concentración de sal, debido a que en la
solución salina alta, las moléculas de ADN forman enlaces de bases
intrahebra (representados en verde), mientras que en la solución de
La estructura de doble hélice se ve interrumpida y el ADN se
desnaturaliza.
Dado que el ADN es bastante resistente a la hidrólisis alcalina, este
procedimiento es el método preferido para desnaturalizar ADN.
Los ácidos también provocan desnaturalización, pero rara vez se
utilizan con ese fin, ya que además provocan la escisión de los grupos
purínicos de la cadena de polinucleótidos, un proceso conocido como
depurinación.
SECCIÓN II ÁCIDOS NUCLEICOS Y NUCLEOPROTEÍNAS
LAS HEBRAS SIMPLES COMPLEMENTARIAS PUEDEN
REAPAREARSE PARA FORMAR ADN DE DOBLE CADENA.
Una solución de ADN desnaturalizado puede ser tratada de forma
que el ADN nativo se vuelva a formar.
Este proceso se conoce como renaturalización o reapareamiento
(renaturation o reannealing), y el ADN que se reforma se llama
ADN renaturalizado.
La renaturalización ha demostrado ser una herramienta muy
valiosa en biología molecular.
Se puede utilizar para:
Demostrar la relación genética entre diferentes organismos,
Detectar especies específicas de ARN,
Determinar si ciertas secuencias se repiten en el ADN de un
organismo determinado,
Y localizar secuencias específicas de bases en una molécula de
ADN.
Para que ocurra la renaturalización, deben cumplirse dos
condiciones:
1. La concentración de sal debe ser lo suficientemente alta
como para eliminar la repulsión electrostática entre los
grupos fosfato de las dos hebras.
Generalmente, se emplea entre 0.15 y 0.50 M de NaCl.
2. La temperatura debe ser lo bastante alta como para romper
los enlaces de hidrógeno aleatorios, ya sean intrahebra o
interhebra, sin impedir el reapareamiento específico.
Sin embargo, la temperatura no debe ser demasiado alta, ya
que entonces no se produciría un apareamiento estable
entre las hebras complementarias.
La temperatura óptima para la renaturalización es entre 20
°C y 25 °C por debajo del valor de Tₘ (temperatura de
fusión).
CAPÍTULO 4
Estructura del
Ácido Nucleico
La renaturalización es un proceso lento en comparación con
la desnaturalización
El paso limitante en la velocidad no es el rebobinado real de la
hélice (que ocurre aproximadamente al mismo tiempo que el
desenrollado), sino la colisión precisa entre hebras
complementarias, de modo que los pares de bases se formen en
las posiciones correctas.
Dado que la renaturalización es el resultado únicamente del
movimiento aleatorio, se trata de un proceso dependiente de la
concentración. A las concentraciones normalmente utilizadas
en el laboratorio, la renaturalización puede tomar varias horas.
Los detalles moleculares de este proceso pueden entenderse
haciendo referencia a la molécula hipotética mostrada en la
FIGURA 4.8, que contiene una secuencia repetida varias veces.
Supongamos que cada hebra sencilla contiene 50 000 bases y
que las secuencias son complementarias.
Cualquier secuencia corta de bases (por ejemplo, de 4 a 6
nucleótidos) aparecerá muchas veces en una molécula de este
tipo y puede actuar como sitio de apareamiento de bases.
Una colisión aleatoria entre secuencias no complementarias
como IA e II será ineficaz, pero una colisión entre IA e IC′
puede dar lugar al emparejamiento de bases.
No obstante, este apareamiento será de corta duración, ya que
las bases adyacentes a estos tramos cortos complementarios no
pueden aparearse, y por lo tanto no se producirá
estabilización por apilamiento.
A la temperatura utilizada para la renaturalización, estas
regiones apareadas se disocian rápidamente.
Sin embargo, tan pronto como se emparejan dos secuencias
como IB e IB′, las bases adyacentes también se aparean
rápidamente, y la molécula completa de ADN de doble cadena
se "cierra" en cuestión de segundos.
MEZCLA DE HEBRAS DURANTE LA RENATURALIZACIÓN
ES IMPORTANTE COMPRENDER QUE CADA MOLÉCULA DE
ADN RENATURALIZADO NO SE FORMA
NECESARIAMENTE A PARTIR DE SUS HEBRAS
ORIGINALES.
EN UNA SOLUCIÓN DE ADN DESNATURALIZADO, LAS
HEBRAS SIMPLES SE MEZCLAN LIBREMENTE, POR LO
QUE, DURANTE LA RENATURALIZACIÓN, RARAMENTE SE
ENCUENTRAN LAS HEBRAS COMPAÑERAS ORIGINALES.
ESTE EFECTO DE MEZCLA FUE DEMOSTRADO EN UN
EXPERIMENTO CON DOS MUESTRAS DE ADN AISLADAS DE
E. COLI.
UNA FUE CULTIVADA EN UN MEDIO QUE CONTENÍA
¹⁴NH₄CL Y LA OTRA EN ¹⁵NH₄CL.
LAS DOS MUESTRAS DE ADN SE MEZCLARON, SE
DESNATURALIZARON Y LUEGO SE RENATURALIZARON.
LA MEZCLA RESULTANTE CONTENÍA TRES TIPOS DE
MOLÉCULAS DE ADN RENATURALIZADO:
25 % CON ¹⁴N EN AMBAS HEBRAS,
50 % CON UNA HEBRA CON ¹⁴N Y LA OTRA CON ¹⁵N,
25 % CON ¹⁵N EN AMBAS HEBRAS.
ESTE RESULTADO DEMUESTRA CLARAMENTE LA MEZCLA
DE HEBRAS DURANTE LA RENATURALIZACIÓN.
LOS MÉTODOS PARA DISTINGUIR ESTOS TRES TIPOS DE
DÚPLEX SE DESCRIBEN EN EL CAPÍTULO 5.
SECCIÓN II ÁCIDOS NUCLEICOS Y NUCLEOPROTEÍNAS
FIGURA 4.8 Detalles moleculares de la renaturalización usando una
molécula hipotética de ADN
Una molécula hipotética de ADN que contiene una secuencia repetida
varias veces.
Los números romanos a cada lado de la molécula de ADN hacen
referencia a los segmentos de la molécula que se discuten en el texto.
4.5 Helicasas
Las helicasas son proteínas motoras que utilizan la energía de los
nucleósidos trifosfato para desenrollar el ADN.
El ADN de doble hebra debe desenrollarse bajo condiciones fisiológicas
durante la replicación.
Las enzimas denominadas "motores moleculares", conocidas como
helicasas, catalizan el desenrollado del ADN de doble cadena en las
células, dependiente de nucleósidos trifosfato.
Las helicasas suelen formar parte de complejos proteicos más grandes,
y su actividad está influenciada por otras proteínas presentes en el
complejo.
CAPÍTULO 4 Estructura del Ácido Nucleico
