EJERCICIOS PCR #1
1. ¿Qué reactivos se necesitan para realizar una PCR? Rellena el tubo
indicando muy brevemente para qué se añaden cada uno de los reactivos
necesarios.
− ADN molde: es el fragmento de ADN que se quiere replicar.
− Cebadores (primers): son pequeñas secuencias de ADN que marcan dónde
debe comenzar y terminar la copia del fragmento deseado.
− dNTPs: son los componentes básicos que se van uniendo para formar la
nueva cadena de ADN durante la copia.
− Taq polimerasa: es una enzima que sintetiza nuevas cadenas de ADN y
puede soportar altas temperaturas sin desnaturalizarse.
− Buffer de reacción: es una solución que mantiene el entorno químico
adecuado para que la reacción se lleve a cabo correctamente (como el pH y
la concentración de sales).
− Cloruro de magnesio (MgCl₂): es un componente esencial que permite que
la enzima funcione eficientemente.
− Agua libre de nucleasas: es agua purificada que no contiene enzimas que
puedan degradar el ADN.
2. ¿Por qué en la PCR es necesario un termociclador que alcance
cíclicamente temperaturas >90ºC para sintetizar ADN si, por ejemplo, en
nuestras células se sintetiza el ADN a 37ºC?
Porque en la PCR no se usan las enzimas celulares que separan el ADN a 37 °C,
se necesita calentar a más de 90 °C para abrir las dos cadenas, como si se
abriera una cremallera, y así permitir que la enzima copie el ADN.
3. ETAPA DEL CICLO de DESNATURALIZACIÓN: Observa la siguiente imagen
de un pequeño fragmento de ADN y contesta las cuestiones:
a. Señala el extremo 3’ y 5’ de cada hebra.
Se encuentran de manera antiparalelas. Los extremos de la primera
hebra son 5’ a 3’ y de la complementaria 3’ a 5’
b. ¿Por qué una T9 de 95ºC separa las dos hebras pero no los
nucleótidos entre sí?
Porque a 95 °C se rompen los puentes de hidrógeno que unen las dos hebras
del ADN, pero no los enlaces covalentes, que son más fuertes y son los que
mantienen unidos a los nucleótidos dentro de cada cadena.
c. ¿Crees que depende el % de C y G en la T9 necesaria para la
desnaturalización del ADN?
Sí, porque a mayor cantidad de C-G en el ADN, se requiere una
temperatura más alta para desnaturalizarlo. Esto se debe a que las bases
C y G forman tres puentes de hidrógeno, lo que hace que la estructura sea
más estable y, por lo tanto, más difícil de separar.
d. ¿Es una desnaturalización irreversible?
No, la desnaturalización es un proceso reversible. Al bajar la temperatura
después de haber desnaturalizado el ADN, las hebras se vuelven a unir, y
este proceso se conoce como renaturalización o hibridación
4. ETAPA DEL CICLO de HIBRIDACIÓN: Los oligos o primers se alinean con cada
cadena del ADN molde por complementariedad de bases formándose otra
vez los enlaces de H.
a. ¿Por qué las hebras del ADN hibridan con los primers y no se vuelven
a unir entre sí?
Porque los primers están presentes en mayor cantidad y se unen al ADN más
rápidamente que las hebras entre sí, lo que favorece que se hibriden con
los primers en lugar de volverse a unir entre ellas.
b. Diseña un par de primers (con 6 nucleótidos) para amplificar el
fragmento de ADN en negrita. Los primer siempre se escriben por
convenio siempre en sentido 5’->3’.
- Primer forward 5’-> 3’: 5’ GGTGTT 3’
- Primer reverse 5’-> 3’: 5’ GACCTG 3’
1) Calcular el volumen requerido de cada reactivo para realizar la mezcla de
reacción utilizando la siguiente tabla:
Reacti Concentraci Concentra Volumen
Volumen
vos ón o ción requerido
requerido
cantidad del para 1 Rx
para 9 Rx
final stock
Taq
1.5U 5U/µL 0.3µL 2.7µL
Pol
dNTPs 100µM=0.1mM 4mM 0.625µL 5.625µL
MgCl₂ 1.5mM 25mM 1.5µL 13.5µL
Primer
FWD 120nM 10µM 0.3µL 2.7µL
Primer
120nM 8µM 0.375µL 3.375ΜL
RV
Buffer 1X 5X 5µL 45µL
Agua --- --- 16.23µL 146.07µL
DNA 200ng 0.3µg/µL 0.67µL 6µL
Volum
en --- --- 25µL 225µL
total
2. Se realizó una PCR para la detección del VPH en pacientes con sospecha
de cáncer cervicouterino. Se sintetizaron primers específicos para un
gen viral, esperando un amplicón (fragmento amplificado) de 505pb. Los
resultados de la electroforesis en gel de agarosa se presentan a
continuación:
Con base en lo anterior conteste las siguientes preguntas: (Justifique
adecuadamente su respuesta en cada caso)
a. ¿Se obtuvo el producto (amplicón) esperado?
Sí, ya que hay una banda de 505pb
b. ¿Los primers utilizados son específicos?
No, porque si fueran específicos solo se vería una banda no varias
c. ¿Los controles funcionaron correctamente?
El positivo sí,pero el negativo no, porque se ve una banda tenue
d. ¿A qué corresponden las bandas observadas hasta abajo de la
imagen?
Corresponden a los dímeros de los primers de PCR
e. ¿Los resultados obtenidos son confiables? Si la respuesta es no,
explique cómo resolvería los problemas de esta PCR.
No, para resolverlo, lo primero es ver cuál de los componentes que
estoy utilizando está contaminado, para después poder repetirlo
correctamente.
