Nayara Fernández Julián
TEMA 4: ANÁLISIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS: TÉCNICAS BASADAS EN LA HIBRIDACIÓN DE SONDAS
(SOUTHERN, NORTHERN Y SOUTHWESTERN BLOT
Métodos de caracterización de ácidos nucleicos:
- Técnicas de hibridación (análisis de Southern y Northern blot).
- PCR, RT-qPRC, Rt-qPCR de RNA pequeños (perfil de miARN).
1. ANÁLISIS DE HIBRIDACIÓN DE BLOTS DE ÁCIDOS NUCLEICOS
El principio del análisis de hibridación es que una molécula de DNA o RNA de cadena simple (la “sonda”)
puede emparejarse con una segunda molécula de DNA o RNA que contiene una secuencia
complementaria (“la diana”) y la estabilidad del híbrido depende del grado de emparejamiento de
bases. Experimentalmente, el análisis suele llevarse a cabo con una sonda que ha sido marcada y un
DNA diana que ha inmovilizado en un soporte de membrana. La sonda marcada se aplica entonces en
una solución que promueve la hibridación. Después de un tiempo de incubación adecuado, se lava la
membrana para eliminar cualquier sonda unida de forma inespecífica, dejando solo la sonda que está
emparejada con el DNA.
La historia de la sonda con el DNA objetivo es específica y sigue el emparejamiento de bases
complementarias.
Las sondas están marcadas con isótopos o moléculas que permiten su detección.
Así, las sondas marcadas permiten detectar ácidos nucleicos de secuencias específicas.
Controlando la rigurosidad de las condiciones de lavado, pueden sondarse secuencias 100%
complementarias (sondeo totalmente homólogo) o parcialmente complementarias (sondeo heterólogo).
En el sondeo heterólogo, se permite cierto desajuste entre el objetivo y la sonda, de modo que también
se detectan secuencias con grados de similitud más bajos. El sondeo heterólogo se usa para detectar
secuencias relacionadas, pero no completamente complementarias en un único o más de un genoma.
El análisis de hibridación se llevó a cabo originalmente con sondas de ADN marcadas radiactivamente
largas (100 a 1000 pb). Más recientemente se han introducido otros tipos de sondas (ARN,
oligonucleótidos), así como estrategias de marcaje y detección no radiactivas.
El análisis de hibridación es sensible y permite la detección de genes de una sola copia en genomas
complejos.
En el análisis de hibridación, los ácidos nucleicos deben inmovilizarse en una membrana.
El tamaño de poro de la membrana debe ser de 0,45 um para ácidos nucleicos de más de 100-150
nucleótidos. Para ácidos nucleicos más pequeños, se encuentran disponibles membranas con tamaños
de poro de 0,22 um y 0,1 um.
Tipos de membranas:
- Nitrocelulosa. Mayor capacidad de unión.
- Nailon. Máx. Intensidad de señal.
- PVDF (difluoruro de polivinilideno). Se requiere optimización de fondo.
- Nailon con carga positiva.
2. TRANSFERENCIA DE ÁCIDO NUCLEICO
Normalmente, los ácidos nucleicos se separan primero mediante electroforesis y luego se
transfieren a la membrana, que posteriormente se sondea.
La transferencia puede ser activa: los métodos de transferencia por vacío, electroforéticos y
por gravedad descendente son RÁPIDOS (menos de 3 horas) y eficientes (>90 %), aunque
depende del espesor del gel y la concentración de agarosa (o poliacrilamida), y del ácido
nucleico concentración y tamaño de los fragmentos.
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Pasivo (transferencia capilar o transferencia) es MÁS LENTO.
Ejemplo: la transferencia capilar de ARN de más de 2,5 kb tarda más de 12 horas, mientras que la
transferencia por vacío descendente tarda solo de 1 a 3 horas.
DEPURACIÓN
Descomposición de los ácidos nucleicos mediante depuración parcial en pH ácido (una reacción química
de desoxirribonucleósidos de purina, desoxiadenosina y desoxiguanosina, y ribonucleósidos, adenosina
o guanosina, en la que el enlace β-N-glucosídico se escinde hidrolíticamente liberando una base
nucleica, adenina o guanina, respectivamente) aumenta la eficiencia de transferencia.
La incubación de geles con HCl provoca la depuración del ADN. Los geles tratados con ácido deben
enjuagarse con agua. La incubación posterior con NaOH corta el ADN despurinado en fragmentos más
pequeños y desnaturaliza el ADN antes de la transferencia. Los fragmentos cortos se transfieren más
fácilmente.
Ejemplo: la transferencia de dianas de más de 5 kb, concentraciones de agarosa superiores al 1 % y geles
con un espesor superior a 0,5 cm mejoran con la depuración.
La concentración de sal puede afectar la unión.
Las membranas, como geles, se pueden teñir para monitorear la eficiencia de la
transferencia. Algunos protocolos informan que los tintes intercalados como EtBr o
azul de metileno pueden afectar los procedimientos de transferencia e hibridación.
SYBR Green y SYBR Gold se promocionan como tintes que no interfieren.
Una solución ácida producirá una depuración parcial del ADN en un gel de agarosa.
Cuando le sigue una base fuerte, el enlace fosfodiéster se hidrolizará en los sitios de
depuración.
3. ENTRECRUZAMIENTO
Después de la transferencia, los ácidos nucleicos deben entrecruzarse con la membrana.
RETICULACIÓN UV
En los reticuladores UV, los rayos UV fotoactivan el uracilo (U) o la timina (T) para que puedan
reaccionar con los grupos amino de la membrana de nailon.
Por lo tanto, los ácidos nucleicos cortos ricos en GC (<100 pb) pueden unirse con menos fuerza a la
membrana.
Si la duración de la exposición UV es demasiado larga, o la salida de energía UV es demasiado alta, se
reduce el potencial de hibridación.
Las membranas pueden estar húmedas o secas (¡la nitrocelulosa es inflamable!).
Los transiluminadores UV provocan resultados inconsistentes.
¡Utilice sólo hornos UV!
HORNEANDO
Hornear las membranas a 80 oC expulsa toda el agua del ácido nucleico y la membrana hasta que las
bases de nucleótidos hidrofóbicas establecen interacciones hidrofóbicas con los grupos aromáticos de la
membrana. Tan solo 15 min pueden ser suficientes.
El horneado al vacío se usa para membranas de nitrocelulosa para reducir el riesgo de combustión.
La temperatura excesiva (>100 oC) o el calentamiento prolongado (2 h) destruirán la capacidad de la
membrana para absorber tampones de manera eficiente, lo que provocará problemas de fondo, pérdida
de señal y daños en la membrana.
TRANSFERENCIA ALCALINA
Usado en membranas de nailon cargadas positivamente produce unión covalente de ácidos nucleicos
pero el proceso es lento.
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Las transferencias de corta duración (pocos minutos versus horas) no producirán unión covalente.
La reticulación UV, la cocción y la transferencia alcalina son técnicas de fijación no específicas, por lo que
cualquier biopolímero presente en el filtro tiene el potencial de unirse, lo que aumenta el riesgo de
formación de fondo.
Por lo tanto, los filtros deben mantenerse libres de suciedad o residuos.
Una vez fijados los ácidos nucleicos.
- Las manchas secas se pueden almacenar durante meses a temperatura ambiente.
- Entre re-sondeos, las membranas se pueden guardar en tampones 2X SSC en el refrigerador
durante unos días.
4. PROTOCOLO BÁSICO PARA EL ANÁLISIS DE HIBRIDACIÓN CON UNA SONDA DE DNA
Un experimento de hibridación se puede dividir en tres etapas.
En primer lugar, la membrana se incuba en una solución de prehibridación que contiene reactivos que
bloquean los sitios de unión al ADN no específicos en su superficie, lo que reduce la hibridación de
fondo. En este protocolo, los agentes de bloqueo son la solución de Denhardt y el ADN de esperma de
salmón desnaturalizado.
La solución de Denhardt es una mezcla de polímeros de alto peso molecular capaces de saturar sitios de
unión no específicos y aumentar artificialmente la concentración de sonda disponible.
En la segunda etapa, la solución de prehibridación se reemplaza por un tampón fresco que contiene la
sonda marcada y se lleva a cabo una incubación durante la noche para permitir
que la sonda se una a las secuencias objetivo en el ADN inmovilizado.
Las sondas de ADN se pueden marcar con isótopos radiactivos como 32P y 35S
(abajo), con moléculas fluorescentes o con moléculas como digoxigenina que
pueden ser reconocidas por anticuerpos. Para el marcaje, la síntesis de ADN debe
realizarse en presencia de nucleótidos marcados.
El marcaje de ADN se puede realizar mediante traducción de muescas, utilizando nucleótidos marcados
libres.
En la traducción de muescas, el ADN se trata con ADNasa I para producir "muescas"
monocatenarias. Luego se utiliza la ADN polimerasa I para eliminar los nucleótidos mediante
la actividad exonucleasa 5'-3' y reemplazarlos con dNTP, alargando así el extremo hidroxilo
3'. Para marcar un fragmento de ADN para su uso como sonda, los nucleótidos incorporados
proporcionados en la reacción se marcan radiactivamente en la posición alfa fosfato. La
muesca traducida puede sellarse con ADN ligasa.
Las sondas de ADN de doble cadena deben desnaturalizarse mediante calentamiento (100ºC,
10 min) antes de su uso.
El marcaje de ADN también se puede realizar con ADN polimerasas mediante cebado
aleatorio.
Los cebadores aleatorios son una mezcla de hexanucleótidos degenerados que ceban
aleatoriamente la síntesis de ADN en ADN monocatenario. La síntesis de ADN se puede
lograr con la holoenzima ADN polimerasa I o con el fragmento Klenow de la ADN
polimerasa I. Como el fragmento Klenow carece de la actividad de exonucleasa 5' → 3',
su uso evita la pérdida de la etiqueta incorporada.
Las sondas de oligonucleótidos se marcan terminalmente con polinucleótida quinasa T4 (T4PNK) usando
g[32P]-ATP.
T4PNK transfiere el fosfato de [32P]-ATP marcado con 32P al extremo 5' del oligonucleótido.
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PROTOCOLO BÁSICO PARA ANÁLISIS DE HIBRIDACIÓN CON SONDA DE ADN RADIOMARCADA
Durante el paso de hibridación, la sonda se empareja no solo con los sitios diana con un 100 % de
complementariedad, sino también con secuencias relacionadas.
En la etapa final del experimento, la membrana se lava con una serie de soluciones que eliminan
gradualmente las moléculas de sonda unidas hasta que solo quedan híbridos altamente compatibles.
Tenga en cuenta que a veces no se puede obtener una señal limpia, fuerte y específica que esté
totalmente libre de fondo no específico. La reducción de fondo, especialmente a través del aumento de
la temperatura de hibridación, tendrá el costo de disminuir la señal de hibridación específica.
5. LA REACCIÓN DE HIBRIDACIÓN
Paso central: opciones de tampón, temperatura y tiempo de hibridación, tipo de membrana, sonda y
marcador.
Determinar las mejores condiciones de su experimento requerirá experimentos de optimización.
- Optimización de la temperatura
Depende de: Tm de la sonda (los valores de Tm de la sonda de oligonucleótidos son inferiores a los de
las sondas largas de ADN), la composición del tampón y la naturaleza del híbrido diana: sonda (ADN-
ARN, ADN-ADN, ARN-ARN).
Las sondas de ARN podrían admitir temperaturas de hibridación más altas debido a la mayor Tm de los
heterodúplex ADN-ARN. Sin embargo, como el ARN puede ser inestable a altas temperaturas, las sondas
de ARN se utilizan normalmente con temperaturas de hibridación más bajas, pero con tampones que
contienen los agentes desnaturalizantes formamida o urea, que reducen la hibridación inespecífica de
fondo.
Un buen punto de partida para los tampones inorgánicos (no desnaturalizantes) son las temperaturas de
hibridación de 50 a 65ºC para las sondas de ADN y de 55 a 70ºC para las sondas de ARN.
Para los tampones desnaturalizantes con urea o formamida, la temperatura de hibridación puede ser
tan baja como 30ºC, pero normalmente se utilizan temperaturas de 37 a 45ºC.
Las sondas de oligonucleótidos de ADN cortas requieren temperaturas de hibridación de 37ºC.
Las sondas ligadas a enzimas deben usarse a la temperatura más baja posible para garantizar la
estabilidad de las enzimas.
Optimización de los tampones de hibridación:
DESNATURALIZANTES
Los tampones Hyb pueden ser de 2 tipos: tampones desnaturalizantes (es decir, formamida o urea) y
tampones de sal/detergente (es decir, tampón de fosfato de sodio).
Se prefieren los tampones desnaturalizantes si se sabe que la membrana, la sonda o el marcador son
menos estables a altas temperaturas.
SALES
La formación de híbridos debe superar las fuerzas de repulsión electrostática entre los esqueletos de
fosfato cargados negativamente de la sonda y el objetivo. Los cationes de sal, típicamente sodio o
potasio, contrarrestarán estos efectos de repulsión.
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La estabilidad del híbrido y la concentración de cloruro de sodio se correlacionan en una relación lineal
en un rango de hasta 1,2 M. La estabilidad puede incrementarse agregando sal hasta una concentración
final de 1,2 M o disminuirse al disminuir la cantidad de cloruro de sodio. Es la concentración real de
cationes lo que influye en la estabilidad.
Ejemplo: concentraciones finales de 5-6X SSC (tampón de citrato de sodio salino) equivalentes a
aproximadamente 0,8 a 0,9 M de NaCl y 80-90 mM de tampón de citrato.
EFECTOS DE pH
Un pH incorrecto puede perjudicar la hibridación porque la carga del esqueleto del ácido nucleico
depende del pH.
Típicamente es 7.0-7.4.
A veces se añade EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) a 1-2 mM para proteger contra la degradación
por nucleasas.
DETERGENTE
Los detergentes promueven la humectación uniforme de las membranas y previenen la unión no
específica de las sondas causada por interacciones con sitios hidrófobos en la membrana (reducción del
fondo).
Ejemplos (1-7 % SDS; 0,05-0,1 % Tween-20 o 0,1 % Nonidet P-40).
REACTIVOS DE BLOQUEO
Se utilizan para prevenir la unión no específica de ácidos nucleicos a la membrana.
Se pueden utilizar reactivos bloqueadores de ácidos nucleicos y proteicos como BSA (albúmina de suero
bovino), BLOTTO (leche descremada en polvo), ADN genómico desnaturalizado (ADN de timo de
ternera, arenque o esperma de salmón). La solución de Denhardt (una mezcla de reactivos de bloqueo y
excluidor de volumen) generalmente se conoce como el reactivo de bloqueo de elección.
La concentración óptima de reactivos de bloqueo debe determinarse empíricamente. Si se observa una
unión no específica (señal de fondo alta), aumente la concentración del reactivo de bloqueo o cambie a
otro tipo.
Los reactivos de bloqueo deben estar presentes tanto en la prehibridación como en las soluciones de
hibridación.
ACELERADORES DE LA TASA DE HIBRIDACIÓN
Los agentes que disminuyen el tiempo requerido para la hibridación son polímeros hidrofílicos grandes
que actúan como excluidores de volumen. Es decir, limitan la cantidad de moléculas de agua "libres",
aumentando efectivamente la concentración de sonda por ml de tampón sin disminuir realmente el
volumen del tampón.
Los aceleradores comunes son: sulfato de dextrano, Ficoll y PEG (polietilenglicol).
Si el fondo es un problema, los aceleradores deben reducirse.
Los polímeros pueden cambiar de un lote a otro, por lo que se deben ajustar las condiciones óptimas
después de cada pedido.
¿CÓMO SE OPTIMIZAN LOS PASOS DE LAVADO?
Después de la hibridación, las membranas deben lavarse para eliminar la sonda no unida o unida de
forma no específica. El lavado se realiza mediante la disminución secuencial de la concentración de sal
(de menor a mayor rigurosidad).
También se logra una mayor rigurosidad aumentando la temperatura de lavado.
Dado que no se conoce la rigurosidad óptima del lavado, comience con lavados de baja rigurosidad y
controle la eficiencia del lavado.
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Si la reducción de la concentración de sal o el aumento de la temperatura comprometen la eliminación
del fondo de la señal específica, solo se verá favorecida aumentando los tiempos de lavado con la misma
rigurosidad.
EXTRACCIÓN DE SONDAS DE MEMBRANAS HÍBRIDAS
Si el ADN ha sido inmovilizado en la membrana por entrecruzamiento UV (para membranas de nailon sin
carga) o por transferencia alcalina (para nailon con carga positiva), la interacción membrana-ADN
objetivo (que es de naturaleza covalente) es mucho más fuerte que la interacción objetivo-sonda.
interacción (que resulta del enlace de hidrógeno). Por lo tanto, es posible eliminar (o "quitar") el ADN de
la sonda hibridada sin eliminar el ADN diana unido a la membrana.
Por lo tanto, las membranas de nailon se pueden reutilizar varias veces: es posible realizar una docena
de reprobaciones de forma rutinaria.
El ADN de la sonda hibridada también se puede extraer de las membranas de nitrocelulosa, pero la
debilidad de las interacciones hidrofóbicas que unen el ADN objetivo a la matriz, más la fragilidad de la
nitrocelulosa, limita la vida útil de estas membranas a tres resondeos como máximo.
La extracción se puede realizar mediante la incubación de la membrana en SDS al 0,1-0,5 % a 100ºC
durante 1 hora.
Para quitar la sonda de una membrana Northern (con ARN inmovilizado), use solo el tratamiento suave.
No agregue NaOH al ARN; será destruido.
ARN contra ADN
A diferencia del ARN, el ADN carece de un grupo hidroxilo en la posición 2' de cada grupo de azúcar. Esta
diferencia hace que el ADN sea mucho más estable en solución alcalina.
PARÁMETROS CRÍTICOS
Para tener éxito, un experimento de hibridación debe cumplir dos criterios:
Sensibilidad: Una sonda de ADN suficiente debe hibridarse con el objetivo para producir una señal
detectable después de la autorradiografía.
Especificidad: Después del último lavado, la sonda debe conectarse solo a la secuencia objetivo-
deseada.
Los parámetros que influyen en estos dos criterios se consideran a su vez, seguidos de otros factores
misceláneos que afectan la hibridación.
FACTORES QUE INFLUYEN EN LA SENSIBILIDAD
La sensibilidad del análisis de hibridación está determinada por cuántas moléculas de sonda marcadas se
unen al ADN objetivo. Cuanto mayor sea el número de moléculas de sonda marcadas que se hibridan,
mayor será la intensidad de la señal de hibridación observada después de la autorradiografía.
Actividad específica de la sonda. De los diversos factores que influyen en la sensibilidad, el que más
frecuentemente causa problemas es la actividad específica de la sonda. La actividad específica de una
sonda se relaciona con el grado de marcaje de la sonda. Cuantos más nucleótidos marcados contiene
una sonda, mayor es su actividad específica.
La actividad específica es baja cuando el marcaje de la sonda ha sido ineficaz. La presencia de moléculas
de sonda "frías", sin marcar, reduce la sensibilidad ya que las moléculas de sonda sin marcar compiten
con las marcadas por la unión al objetivo.
En las sondas marcadas con isótopos radiactivos, la actividad específica se mide en desintegraciones por
minuto (dpm) por mg de sonda (dpm/mg).
Si la actividad específica de la sonda es de 108 a 109 dpm/μg, podrá detectar tan solo 0,5 pg de ADN
objetivo.
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Para el ADN genómico humano, 0,5 pg de una secuencia de copia única de 500 pb de longitud
corresponde a 3,3 μg de ADN total. Por lo tanto, esta es la cantidad mínima de ADN humano que debe
usarse en un ensayo de hibridación si se va a detectar un gen de una sola copia.
GARANTIZAR LA ESPECIFICIDAD EN EXPERIMENTOS DE HIBRIDACIÓN HOMÓLOGA
La incubación de hibridación se lleva a cabo en una solución con alto contenido de sal que promueve el
apareamiento de bases entre la sonda y las secuencias diana. En 5xSSC, la Tm para el ADN genómico con
un contenido de GC del 50 % es de aproximadamente 96 °C.
La hibridación normalmente se lleva a cabo a 68°C, por lo que la especificidad del experimento no se
determina en esta etapa.
La especificidad normalmente depende de los lavados posteriores a la hibridación, siendo los
parámetros críticos la fuerza iónica (concentración de sal) de la solución de lavado final y la temperatura
a la que se realiza este lavado (condiciones de rigurosidad).
6. ¿CÓMO SE DETECTA LA SEÑAL?
Sondas radiactivas (32P): emisión β de corto alcance.
Autorradiografía directa: exposición de la membrana a una película de rayos X en un casete.
Autorradiografía indirecta: la membrana se expone a la película de rayos X a -70 °C en presencia de
pantallas intensificadoras, es decir, placas planas recubiertas con un material como el tungstato de
calcio que, cuando es bombardeado con radiación, fosforecerá para producir fotones de luz. Las placas
generalmente se colocan en el interior a ambos lados del casete.
Los fotones de luz y las emisiones radiactivas reducen una parte de la plata iónica en un cristal de haluro
de plata a átomos de plata que forman el núcleo catalítico que, al desarrollarse, provoca la precipitación
del cristal entero.
Estos cristales precipitados forman las imágenes que se ven en la película.
-70ºC mejora la formación de la imagen.
El uso de películas de rayos X requiere el uso de equipos de revelado (imagen de la derecha) y productos
químicos en un cuarto oscuro.
GENERADOR DE IMÁGENES DE FÓSFORO
La formación de imágenes con fósforo de almacenamiento es un método de autorradiografía que
funciona de manera muy similar a una película de rayos X.
La energía de la radiación ionizante de las etiquetas radioisotópicas se almacena en cristales inorgánicos
que se forman en una pantalla plana. La energía almacenada en los cristales se puede liberar en forma
de luz cuando los cristales se irradian con una iluminación intensa.
Después de la exposición por contacto a la membrana, la pantalla se
escanea con un rayo láser enfocado y la emisión de luz se registra con
un detector de luz sensible. Las pantallas de fósforo de
almacenamiento evitan la necesidad de una película de
autorradiografía, productos químicos de revelado y un cuarto oscuro.
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Son muy sensibles y pueden requerir solo una décima parte del tiempo de exposición requerido por la
película de autorradiografía.
SOUTHERN BLOT
Técnica desarrollada originalmente por un biólogo británico llamado Edwin Southern en 1975.
Aplicaciones de transferencia del sur:
A. Detección de secuencias de ADN específicas en una muestra de ADN, por ejemplo, un extracto
de ADN genómico.
B. Estudio de deleciones, duplicaciones y mutaciones de genes causantes de diversas
enfermedades.
C. Estudio de reordenamientos de genes: la FDA requiere transferencias de Southern para
confirmar que la estructura del ADN genómico de un banco de células es estable y sin cambios
y que no se ha producido ningún reordenamiento clonal.
Protocolo:
1. El ADN se digiere primero con endonucleasas de restricción y luego se somete a electroforesis
con un gel de agarosa.
2. El gel se tiñe y se fotografía.
3. Para facilitar la transferencia de ADN a la membrana, el ADN se fragmenta mediante la
incubación del gel en HCl solución durante 10 minutos.
4. Después de la incubación en solución ácida, el gel se enjuaga con agua.
5. El gel se incuba en una solución básica (NaCl 1,5 M / NaOH 0,5 N) que desnaturaliza el ADN.
6. Después de la desnaturalización del ADN, el gel se incuba en una solución de neutralización.
7. Después de la neutralización, el ADN se transfiere a una membrana de nitrocelulosa o nailon
por acción capilar. Se usa SSC 20X (NaCl 3 M, citrato 0,3 M, pH 7) como tampón de
transferencia.
8. La pirámide de transferencia se desarma y la membrana se enjuaga en tampón 2X SSC.
9. En caso de utilizar una membrana de nitrocelulosa, el entrecruzamiento debe realizarse en un
horno UV o horneándose a 80 oC durante 2 horas al vacío.
10. La membrana debe incubarse durante la noche en una solución de prehibridación a 68 oC.
11. Después de la prehibridación, la membrana se incuba con la sonda marcada diluida en solución
de hibridación durante doce horas a 68 oC.
12. Se retira la sonda y se enjuaga la membrana varias veces con tampones de concentraciones
salinas decrecientes.
13. El ADN diana se visualiza según el tipo de marcaje de la sonda.
Por ejemplo, en caso de que la sonda esté marcada con un isótopo radiactivo (es decir, 32P), la
membrana se expone a películas de rayos X o a una pantalla de imágenes de fósforo.
