TEMA 11.
BIOSÍNTESIS DE PROTEÍNAS (I)
Introducción
- Sale el ARN del núcleo y se sintetizan proteínas en el citoplasma
- Recoge las ideas de cómo se sintetizaban proteínas: el RNA sale y cada
uno haría un ribosoma propio que autoharía la proteína, no sabían que existía
un ribosoma, pero había la necesidad de un mensajero y que hubiera un
ribosoma para finalmente tener la proteína. Intermediario inestable que da
lugar al ribosoma para dar la síntesis de proteínas
El código genético
- Para la existencia del mRNA, fue importante para pasar al desciframiento
del código genético que fue importante para desarrollar sus características
- Experimento clave de los 60s
● Severo Ochoa: purificó una enzima que es una especie de RNA
polimerasa y que sintetizó una molécula que fuera igual, con el mismo
nucleótido, entonces tenían una proteína que si era AAAAA →
lisina
➔ Purificación de polinucleótido fosforilasa (RNA pol.) utilizada
para sintetizar RNAs de secuencia conocida)
● Niremberg: usaba eritrocito de conejo, es una máquina de traducir,
solo tiene mRNAS y ribosomas, el mRNA tiene una proteína que es
la globina entonces le daba cualquier mRNA para ver qué proteína
daba lugar
➔ Sistema de síntesis de proteínas de reticulocitos de conejo
● Khorana: con el sistema de Ochoa había poca variedad y se le ocurrió
cómo tener más RNAs diferentes, esto es como la tabla periódica
➔ Síntesis de RNAs de secuencia conocida, (permitió descifrar un
mayor número de codones)
- Descubrieron que si había una mutación se cambiaba la fase de lectura
- Comprobaban que tenían razón de que AAAA → lys porque tenían ribosoma
ya, usaban el tRNA de cualquier aminoácido, utilizaban el codón de
alanina, lo ponían a traducir, si el tRNA se une al ribosoma lo que implica es
que el codón-anticodón se han identificado y ese es el codón para alanina
● Antes de 1960 se pensaba que el código estaba formado por
tripletes, 24/34 (16/64). G. Gamov
● Experimentos de Brenner y Crick demostraron que no era solapado
ni punteado. Hicieron experimentos con el fago T4 de E. coli, inducían
mutaciones con proflavina, que sólo adiciona o elimina 1 base,
comprobando que cuando 1, 2 o 4 mutaciones estaban juntas el fago
era inactivo, pero no cuando eran 3
● Experimentos de Niremberg y Khorana: ambos sintetizaban “in vitro”
RNAs de secuencia conocida y lo traducían “in vitro” en un sistema de
traducción obtenido de reticulocitos de conejo.
➔ polyA; poly-lys entonces AAA codifica lisina
● Niremberg y Leder también hacían otro tipo de experimento con
aa-tRNA radiactivos para confirmar los codones identificados.
➔ Ala-tRNAala + codón ala + ribosoma unión
➔ Ala-tRNAala + codón x + ribosoma no se une
Sydney Brenner (1927-2019)
- Desde finales de la década de 1950 hasta finales de la década de 1970,
Brenner y Crick compartieron una oficina.
- Brenner demostró que el código genético debe ser continuo, sin
superposiciones y planteó la hipótesis de la existencia del ARNt junto con
Crick.
- Ideó uno de los experimentos más elegantes de la época, que incluía la
creación de “mutantes con cambio de marco de lectura”, que demostraban
que el codón debe estar compuesto por un múltiplo de tres bases
La polinucleótido fosforila (una RNA polimerasa) permitía sintetizar RNAs de
secuencia conocida
- Hidrólisis de los nucleótidos
- Adicionas un fosfato, hidroliza RNA y da nucleótidos difosfato pero eran
capaces de manipular las condiciones y que hiciera la reacción al revés,
poniendo dinucleótidos trifosfato dar al final RNA y luego ponían a traducir
● La polinucleótido fosforilasa es capaz de unir nucleósido difosfato
(NDPs) en polímeros de nucleósidos monofosfato NMPs (RNA)
● La reacción es reversible. La función fisiológica de la enzima
fosforilasa es la degradación de RNA (la reacción en reverso)
● Su uso fue útil para la síntesis de polímeros de RNA de secuencia no
definida
Niremberg y Khorana
- Mezclaban nucleótidos, lo que hacían era poner diferentes combinaciones
para hacer diferentes moléculas y ver lo que hacían
● Si se mezclaban 2 NDPs en una razón conocida la polinucleótido
fosforilasa sintetizaría un polímero en el que ambos nucleosidos
estarían en la misma frecuencia que en la mezcla original
- Unión al ribosoma
- Lys es el más frecuente, confirma que AAA codifica para Lys
- Thr, Asn y Gln se incorporan con valores aprox. 24-26 %, coincide con
codones formados por 2A + 1C, aunque no se podría saber cuál corresponde
a cada uno
- Pro, His, se incorporan 6-7 %, coincidente con codones con composición 2C
+ 1A. También 1 codón codificaría para Thr.
- Hoy ya se conocen cuáles con; Thr (ACA y ACC), Asn (AAC), Gln (CAA) Pro
(CCA), His (CAC)
Niremberg y Leder
- Determinados codones estimulan la unión de aminoacil-tRNAs a los
ribosomas.
● En condiciones de altas concentración de Mg2+ el mecanismo
normal de iniciación (que requiere f-Met-tRNAi) y se pueden usar
aa*-tRNAs para analizar su unión al ribosoma.
- Se puede determinar que codón permite la unión de un determinado aa-tRNA
al ribosoma. Se pueden testar todas las combinaciones de nucleótidos
Características y propiedades del código genético
- Consiguieron completar la tabla y al final tenían el significado de los 64
codones, tenemos 61 para aminoácidos y 3 para codón de STOP
● 64 codones (61 para aas y 3 de terminación)
- El código genético es universal, lo diferente entre bacterias y eucariotas
cambia la frecuencia de uso de codones
● En eucariotas se usan más CGU, CGC, CGA, CGG que AGA, AGG
para codificar Arg
- El número de codones para cada aminoácido es variable y aunque existe
tendencia a coincidir, no coincide totalmente con la frecuencia (El número de
codones para cada aa no coincide con su frecuencia)
● Trp tiene solo un codón y aparece poco, pero Glu aparece mucho en
las proteínas y solo tiene dos codones
● Leu: es la que tiene 6 y es la más abundante pero Arg que no es tan
abundante también tiene 6
● Es más seguro que cuantos más números de codones más
probabilidad de que hayan más pero no tiene porqué
- Degenerado: más de un codón para cada aminoácido
- La redundancia aparece en la la tercera base del codón: variación en el
tercer codón, esto hace que haya relajación en la tercera base del codón,
esto es el balanceo
● En el reconocimiento codón-anticodón existe relajación en el
apareamiento de la tercera base del codón (primera del anticodón)
Apareamientos “balanceados” existentes entre codón y anticodón
- Para ahorrar tRNAs, porque no hay mucho número de estos, hay varios
nucleótidos que el final del anticodón puede interactuar con el primer
RNA del codón
- Podría haber algún nucleótido que podría interaccionar e interactuar con más
de un nucleótido, la primera base del anticodón podía ser modificada de
tal forma que establecen puentes de hidrógeno que no eran canónicos,
esto se consigue con nucleótidos distintos de la primera base o modificados
pudiendo interaccionar con la tercera base de varios codones
● Crick propuso que la base a 5’ del anticodón (primera posición) podría
formar puentes de hidrógeno alternativos (no tipo W/C), proponiendo
las reglas del balanceo
● Como consecuencia del balanceo la célula sólo necesita 31
t-RNAs (31 anticodones)
El código genético es casi universal
- Mitocondrias de protozoos, tienen un codón de stop menos que se
transforma a triptófano, 2 de los de Arg pasan a Stop y tienen un codón
más para metionina
● Cuando se analizan de manera evolutiva se ha visto que estos
cambios se han producido más de una vez de forma
independiente, no tienen un ancestro común, es una adaptación
lógica del código genético al modo de vida de estos organismos
- Hay una relajación en la tercera base y necesitan menos números de
tRNAS
- En algunos codones de terminación se añaden aminoácidos poco
frecuentes en vez de añadir la terminación
● En los mRNAs en los que se introducen el aminoácido raro suele
ocurrir que tiene una secuencia en 3’UTR y cuando se llega al
codón de STOP esta secuencia es reconocida por un factor proteico
que favorece que se incorpore la selenocisteína en lugar de los
factores de terminación y se incorpore este aminoácido
- RESUMEN: sólo se han encontrado excepciones en mitocondrias y algunos
protozoos.
● UGA de stop a Trp
● AUA 2º codón para Met
● 2 nuevos codones de terminación
● Mayor relajación en tercera base, sólo 22 t-RNAs.
● En algunos codones de terminación se pueden introducir aas poco
frecuentes como selenocisteína
El mRNA se lee por el ribosoma en dirección 5’-3’
- Va de 5’ a 3’, el experimento lo hicieron viendo cual se leía primero y cuál
después
● Experimentos de traducción “in vitro” de mensajeros de composición
conocida
● A:C 20:1 más RNasa pancreática, N-ter lys y C-ter Asn
Cambios en el DNA código mitocondrial
- El amino terminal se sintetiza primero, el aminoácido 1 es el que tiene el
amino terminal libre y el último aminoácido es el que tiene el carboxilo
terminal libre, el experimento era de marcaje en eritrocitos de conejo
● Si se analizan filogenéticamente estos cambios en el código genético
se comprueba que algunos cambios se han producido más de una vez
de forma independiente. Esto sugiere que no estaban en el antecesor
común
● La dirección de crecimiento de las cadenas polipeptídicas de
extremo amino (N-terminal) al carboxilo (C-terminal). Experimento
de Dintzis de 1961
RNA de transferencia: función, características estructurales
- Es el único RNA que se escribe al revés, para mantener el apareamiento
codón-anticodón, lo que tenemos a la derecha es el 3’ y acaba en el 5’,
se puede escribir al contrario para mantener el apareamiento, en un tRNA
maduro tenemos que acaba en ACC, tiene bucles que es donde está el
anticodón, lo que llamamos bucle aceptor que es donde se une el
aminoácido, luego tenemos el bucle D que tiene resíduos de diruridina y el
bucle variable que varía en los tRNAs de conformación y de composición
- Lo importante es que los otros brazos, el bucle D y el pseudo forma
interacciones en el núcleo central de la molécula para mantener su
conformación, todos los tRNAs son iguales, porque tienen que entrar en el
ribosoma y cabe justamente eso, por eso tienen una estructura equivalente,
tienen las características concretas para que las proteínas difieran pero
tienen que tener las mismas características para que se introduzca dentro del
ribosoma
- Se establecen interacciones entre los bucles nombrados para mantener
la estructura estable
- Bucle del anticodón: complementario al codón del mRNA con el que formar
puentes de hidrógeno.
- El tRNA se representa en dirección 3’ 5’, acorde con polaridad del codón
● Tallo aceptor, en extremo 3’, une al aminoácido y siempre lleva 5’
–CCA 3’
● Bucles D (presenta dihidrouridina) y TC (pseudouridina) contienen
varias posiciones invariables en los diferentes tRNAs, son muy
importantes para su función
● Bucle variable, varía en su longitud y composición entre los diferentes
RNAs.
- Por difracción de rayos X se ha comprobado que su estructura terciaria es
compacta
Bases modificadas presentes en los tRNAs
- Son más resistentes a la degradación a parte de otros papeles
estructurales, les van a hacer más resistentes a la degradación y pueden
tener en las 4 bases nitrogenadas con modificaciones y se hacen después
de la síntesis de tRNAs
● Afectan al apareamiento codón-anticodón:
➔ Se realiza en las cuatro bases, después de su incorporación
➔ Existen más de 50 tipos de modificación, algunas sencillas,
metilación, otras tan complejas que requiriendo reestructurar el
anillo de purina
- Metilación en timina por ejemplo o una dihidrouridina, tiouridina que tiene un
azufre, algunos son específicos de algunos RNAs pero hay otros que están
en todos
● Algunas se encuentran en todas las moléculas de tRNA, dihidrouridina
o pseudouridina
- Lo que tenemos son enzimas modificadoras de los tRNAs, algunas pueden
hacer diferentes bases y añadir la misma modificación o bien pueden ser
particulares para una determinada modificación
● Saben qué residuo modifica porque reconocen una estructura
concreta para que sea esa modificación, son muy específicas, la
que modifique los tRNAs en un sitio, va a modificar más de uno porque
tendrá la uridina que se hidrogenar para tener la pseudouridina
● Las enzimas modificadoras del tRNA varían en especificidad. Unas
producen un tipo particular de modificación en un determinado residuo,
otras modifican bases en distintas posiciones. También son variables
en la especificación de sustrato
➔ Se cree que reconocen características estructurales que rodean
al sitio de modificación. Utilizan RNAs como guías
Aminoacil-tRNA sintetasa
- Enzimas que unen a cada tRNA con un determinado codón, el
aminoácido correspondiente
- tRNA y necesitamos colocarle el aminoácido correspondiente, la reacción de
síntesis lo hacen las aminoacil tRNAs sintetasas, estas enzimas lo que van a
hacer es formar el aminoacil tRNA y van a liberar AMP y dos moléculas
de pirofosfato
● Se unen mediante éster el grupo carboxilo del aminoácido con el
extremo 3’OH del tRNA, lo que tenemos es el extremo 3’, estamos en
RNA, tenemos hidroxilo libre en 3’ e hidroxilo libre en 2’, se les va
a unir el aminoácido, entonces quedará unido el NH2-CHR-COOH
que se va a unir con el 2’OH dejando 3’ libre
➔ Los tRNAs transportan aminoácidos que son “cargados”
mediante aminoacil-tRNA sintetasas
➔ Activación de los aminoácidos: formación del
aminoacil-tRNA
➔ El enlace se realiza mediante un enlace éster entre el grupo
carboxilo y el –OH en 3’ o 2’
➔ La reacción transcurre en dos etapas
- Reconocen más de un tRNA
- La reacción la llevan a cabo las aminoacil-tRNAs sintetasas y se
requiere ATP
- En E. coli existen 20 sintetasas, cada una reconoce un aminoácido diferente
y 1 o más tRNAs
- Dos etapas:
● Se une el aminoácido a la sintetasa y va a ser activado con una
molécula de ATP, va a dar una molécula de aminoácido AMP y
pirofosfato. El intermediario de reacción se queda unido a la enzima
➔ El aminoácido, que se encuentra unido a la sintetasa, se activa
por ATP, formando un aa-AMP y PPi
● Se une el tRNA se forma el enlace éster entre el aminoácido y el
tRNA que se une a su sitio y vamos a librera el AMP
➔ El intermediario unido al enzima reacciona con el tRNA
formándose el enlace éster entre ellos (aa-tRNA) y liberándose
AMP.
● El tRNA cargado, es decir, unido al aminoácido se libera
- La primera parte es reversible por el pirofosfato, la liberación de pirofosfato lo
hace reversible
● La reacción es reversible, la hidrólisis de PPi por pirofosfatasa
desplaza la reacción hacia la derecha
● La segunda parte de la reacción es muy específica: las
aminoacil-tRNAs sintetasas pueden confundirse de aminoácido pero
no de tRNA (los aminoácidos no intervienen en el reconocimiento del
codón, esto lo realizan los tRNAs)
- No se confunde de tRNA
- En el reconocimiento no interviene el anticodón sino que la sintetasa
reconoce nucleótidos en todas las partes de tRNA, la especificidad la da el
tRNa y no el anticodón
Reacciones que tienen lugar
Clases de aminoacil-tRNA sintetasas
- Han visto que en [Link] solo existen 20 y catalizan la misma reacción pero
tienen estructuras diferentes, la clase 1 que es monoméricas, que unen el
aminoácido al grupo 2’OH o la clase 2 que son diméricas
● En E. coli sólo se encuentran 20 sintetasas, estas enzimas aunque
catalizan la misma reacción, tienen diferente estructura y número de
subunidades.
➔ Clase I, monoméricas, unen el aminoácido al grupo 2’-OH
➔ Clase II, diméricas, unen el aminoácido al grupo 3’-OH
- La clase 1 se une por una cara del tRNA y la clase 2 se une por otra
parte del tRNA
- Se cree que evolutivamente tienen un ancestro común porque cuando ven si
se parecen encuentran zonas que sí se parecen por lo que se cree que son
similares
● Se piensa que derivan de un gen ancestral común dentro de cada
clase al presentar dominios estructurales semejantes, que por
duplicaciones sucesivas generará los diferentes genes
- Si el tRNA se une a su proteína chequean los elementos de las
estructuras, llega un momento en el que el tRNA y la sintetasa se acoplan
perfecto, realizando un cambio conformacional, las partes son el tallo
aceptor y el tallo del anticodón
● En ambas clases el tRNA se une a la sintetasa por su “región en
forma de L”, y la estructura del tRNA cambia para acoplarse a la
tRNA sintetasa, principalmente en el lazo aceptor y en el tallo del
anticodón
Las tRNAS sintetasas realizan correcciones
- No se pueden equivocar, si funcionan mal es como si tuvieran una
mutación
- Tenemos que tener un sistema que si se equivoca pueda en algún momento
separarse, hacen correcciones, entonces si incorporan el aminoácido que
no es, lo elimina, la manera en la que lo hacen es interaccionando a lo largo
del tRNA y chequeando que es el tRNA correcto, si no es el correcto lo que
hacen es eliminar o el aminoácido o el tRNA, esto disminuye la frecuencia
de errores, solo se equivoca introduciendo un aminoácido entre 10000
● La unión entre tRNA y aminoácido es un proceso regulado: si se une
un aminoácido incorrecto se incorporaría a la proteína, ya que la
determinación del aminoácido a incorporar la proporciona la
complementariedad codón-anticodón
● Las aminoacil-tRNA sintetasas controlan la especificidad de
reconocimiento de aminoácido y el tRNA
➔ Las aminoacil-tRNA sintetasas presentan actividad correctora y
revierten la reacción si algún componente se ha incorporado de
manera errónea
➔ Hace que la frecuencia de errores sea menor de 1 en 10.000
¿Cómo realiza la corrección?
- No depende del anticodón, no se fija en el anticodón para corregir el fallo
- Lo han visto porque tenemos tRNAs isoaceptores, por ejemplo alanina
tienen dos tRNAs, es decir, cuatro codones, que son reconocidos por dos
tRNAs distintos pero solo tienen una sintetasa
- Hicieron mutantes que son supresores, hicieron tRNAs mutados, en el
tRNA de alanina, ponía alanina, le cambias el anticodón que es el supresor,
lo que metía era lo que tenía, si mutaban el anticodón metian el inicial, en
la proteína se introducirá alanina, esto implicó que la correlación entre el
aminoácido y el tRNA no depende del anticodón, intervienen diferentes
regiones, para confirmar que el tRNa incorporado es el que tiene que ser
1) El reconocimiento entre la sintetasa y el tRNA no depende del
anticodón. Basado en:
➔ Existencia de tRNA isoaceptores: tRNAs del mismo
aminoácido que pueden tener distinto anticodón pero que son
reconocidos por la misma sintetasa
➔ Existencia de tRNAs supresores: tRNAs presentan
mutaciones en el anticodón que hace que se introduzcan
aminoácidos incorrectos durante la síntesis. Son reconocidos
por la sintetasa a pesar del cambio en el anticodón (añade el
aminoácido correcto pero este aparea con un codón que no le
corresponde).
2) Intervienen diferentes regiones: parte del bucle del anticodón o del
tallo aceptor o del bucle D. No existe un norma sencilla para este
proceso. La región de interacción es amplia.
3) Se considera a este proceso, dada su especificidad, como el
segundo código genético
Reconocimiento del tRNA de una sintetasa de clase I
- Lo que ocurre cuando interaccionan con la sintesa es que realizan cambios
conformacionales que nos hacen ver que están bien
● La interacción con la proteína modifica la estructura del tRNA en dos
regiones:
➔ Bucle del anticodón son desplazadas hacia fuera de la
proteína
➔ El tallo aceptor se distorsiona y se interrumpe la
interacción entre U1 y A72. El tallo aceptor se localiza en un
surco de la proteína cerca del sitio de unión con el ATP
Reconocimiento de una sintetasa de clase II
- Reconoce el bucle variable y el surco mayor del tallo aceptor
- El bucle del anticodón experimenta un cambio de conformación, una
extensión, para interaccionar con la proteína
Dos clases de corrección
- Corrección química: separa el aminoácido cuando no es correcto, es capaz
de hidrolizar el aminoacil o lo puede hidrolizar después de haberlo unido al
tRNA, revierte la reacción que ha realizado
● Se elimina el aminoácido cuando este no es el correcto. Se puede
tener lugar la corrección en dos etapas:
1) Se puede hidrolizar el aa-AMP si no es el correcto
2) Hidrolizarlo después de unirse al tRNA en la sintetasa al ser
reconocido como incorrecto en el sitio de unión con el tRNA
- Corrección cinética: expulsa el tRNA, no se produce el cambio de
conformación adecuado, entonces lo expulsa cinéticamente, porque tiene una
velocidad para actuar, hay unos cambios y se produce la reacción, si eso
no es así expulsa el aminoácido
● Velocidad de incorporación del tRNA
● Tras la unión del tRNA a la sintetasa, ésta analiza al tRNA unido y si
es el correcto se produce un cambio de conformación de la enzima
que permite la rápida unión del aminoácido (A). Si es incorrecto se
disocia antes de que el aminoácido sea cargado (B)
