UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO
FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD
CARRERA DE LABORATORIO CLÍNICO
INFORME DE LABORATORIO GUÍA APE N° 11
ASIGNATURA: BIOLOGÍA MOLECULAR
INTEGRANTES:
• Belén Escobar
• Guamanquispe Ana
• Rodríguez Paulina
• Andrés Saif
SEMESTRE: Séptimo PARALELO: “A”
FECHA: 10 de enero de 2025
1. TEMA: PRÁCTICA DE LABORATORIO DE ELECTROFORESIS EN GEL
2. OBJETIVOS:
2.1. GENERAL:
Introducir a los alumnos en el conocimiento de la teoría electroforética mediante
los procedimientos implicados en la electroforesis en gel de agarosa para separar
moléculas biológicas.
2.2. ESPECÍFICOS:
• Determinar las funciones de cada material utilizado en la electroforesis.
• Analizar cuál es la importancia de una correcta extracción, purificación y
amplificación de ADN para una electroforesis exitosa.
• Identificar si existe la amplificación del gen de interés en las diferentes
muestras utilizadas.
3. MARCO TEÓRICO
ELECTROFORESIS
La electroforesis en gel de agarosa es un procedimiento analítico comúnmente utilizado
en biotecnología, laboratorios de investigación biomédica y forense. Este método
separa fragmentos de ADN, ARN, proteínas y otras biomoléculas según su tamaño,
carga y forma.
El proceso implica disolver agarosa en un tampón, enfriarlo y verterlo en un molde con
pocillos para las muestras. Una vez solidificado, el gel se coloca en una unidad de
electroforesis con electrodos de platino. Las muestras, preparadas con un tampón de
carga, se siembran en los pocillos y se aplica una corriente eléctrica. Las moléculas
cargadas migran a través del gel hacia el electrodo opuesto según su carga. El gel de
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agarosa actúa como un tamiz molecular, permitiendo que las moléculas más pequeñas
se muevan más fácilmente que las más grandes.
Este método es especialmente útil para analizar fragmentos de ADN generados por
enzimas de restricción o PCR, y es conveniente para determinar su tamaño en un rango
de 500-30,000 pares de bases. La electroforesis en gel de agarosa separa moléculas
cargadas según su tamaño, forma y carga. Las moléculas negativas migran hacia el
ánodo (electrodo positivo) y las positivas hacia el cátodo (electrodo negativo). El
tampón mantiene la conductividad eléctrica y el pH, crucial para la estabilidad de las
moléculas biológicas.
El gel de agarosa actúa como un tamiz molecular, permitiendo que las moléculas más
pequeñas se muevan más fácilmente que las más grandes. La movilidad de las
moléculas también depende de la concentración del gel, el voltaje y las condiciones del
tampón. Las moléculas con mayor carga migran más rápido, mientras que las que se
unen más fuertemente a la agarosa lo hacen más lentamente.
Cuando se usan colorantes para simular fragmentos de ADN, la migración puede
observarse directamente sin necesidad de tinción posterior, aunque las moléculas
pequeñas pueden difundir fuera del gel. La separación de fragmentos de ADN genera
un “smear” si hay una amplia gama de tamaños, y los fragmentos lineares migran más
rápido a través del gel.
4. LISTADO DE MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS
MATERIALES REACTIVOS EQUIPOS
• Micropipeta de 20ul • Tampón de
• 2 envases de 500ml electroforesis • Equipo de
• Rack de puntas concentrado 10X electroforesis
• Microtubos de muestra agarosa 2gr
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5. ACTIVIDADES POR DESARROLLAR
A. Preparación del molde
• Coger el molde para hacer los geles y cerrar los extremos con los topes para
que no se salga la agarosa.
• Después colocar el peine para formar los pocillos.
B. Preparación del gel de agarosa
1. Utilizar un vaso o erlenmeyer de 100 ml para preparar la solución del gel:
2. Para geles de 7 x 7 em: Añadir 32 gr de Tampón de electroforesis 1 X más 0.30
gr de agarosa. agitar la mezela para disolver los grumos de agarosa. Para geles
de 7 x 10 cm: Añadir 42 gr de Tampón de electroforesis 1 X más 0.40 gr de
agarosa, agitar la mezela para disolver los grumos de agarosa. Asegurarse que
se ha añadido los 450 ml de agua destilada al Tampón de electroforesis 10X
3. Calentar la mezcla para disolver la agarosa, el método más rápido es la
utilización de un microondas, también puede utilizarse una placa calefactora,
en ambos casos, para que la agarosa se disuelva se ha de llevar la solución a
punto de ebullición. La solución final debe aparecer clara sin partículas
aparentes.
4. Enfriar la solución de agarosa más o menos a 55°C (para acelerar el proceso se
puede enfriar colocando el envase debajo de un grifo de agua y agitar). Si se
produce mucha evaporación del líquido, añadir tampón de electroforesis.
5. Añadir la solución de agarosa al molde.
6. Permitir que el gel solidifique. Para acelerar el proceso se puede sembrar el gel
en una nevera (si la electroforesis se realizará al día siguiente, conservar el gel
a 4°C)
C. Preparación del gel para la electroforesis
1. Después que el gel se ha solidificado con mucho cuidado sacar los topes.
2. Colocar el gel en la cámara de electroforesis correctamente orientada con los
pocillos más cerca del polo negativo (color negro)
3. Llenar la cámara de electroforesis con 300 ml de Tampón de electroforesis. El
tampón de electroforesis se puede utilizar para 2 experimentos de electroforesis,
una vez terminada la electroforesis guardar este tampón utilizado en un envase
diferente al suministrado para utilizarlo en una nueva electroforesis.
4. Asegurarse que el gel está completamente cubierto de tampón.
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5. Sacar el peine que ha formado los pocillos con mucho cuidado de no romper
ningún pocillo.
6. Proceder a la siembra del gel y llevar a cabo la electroforesis.
D. Siembra del gel y electroforesis
a. Muestras de electroforesis: Chequear el volumen de las muestras. Algunas
veces pequeñas gotas de la muestra pueden estar en las paredes de los
microtubos. Asegurarse de que toda la cantidad de muestra se encuentra
uniforme antes de sembrar el gel. Centrifugar brevemente los microtubos de
muestra, o golpear los microtubos contra una mesa para obtener toda la muestra
en la parte inferior del microtubo.
1. Se suministran muestras diferentes
2. Sembrar 20 microlitros de cada muestra, utilizar para ello la micropipeta
de volumen fijo que se suministra con una punta de pipeta.
b. Llevar a cabo la electroforesis
1. Después que se han sembrado las muestras, cuidadosamente colocar la
cubierta del aparato de electroforesis en los terminales de los electrodos.
2. Insertar la clavija del cable negro en la entrada de color negro de la
fuente de corriente (entrada negativa). Insertar la clavija del cable rojo
en la entrada de color rojo de la fuente de corriente (entrada positiva).
3. Configurar la fuente de corriente a 75 voltios (30 minutos) o a 150
voltios (20 minutos) Vigilar que los colorantes no salen fuera del gel.
4. Después de 10 minutos empezará a observarse la separación de los
colorantes.
5. Después de que la electroforesis ha terminado, apagar la fuente de
corriente, desconectar los cables y sacar la cubierta.
6. Colocar el gel en un transiluminador
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6. IMÁGENES
Ilustración 1: La PCR amplifica el ADN de Ilustración 2: El buffer TAE es esencial para
interés, asegurando una cantidad suficiente para conducir la electricidad, mantener el pH estable
su análisis preciso y visualización en y garantizar la integridad de las moléculas
electroforesis. durante la electroforesis.
Ilustración 4: Conectar la fuente de corriente
Ilustración 3: Usar una micropipeta de volumen
correctamente asegura que las moléculas migren
fijo garantiza precisión en la cantidad de muestra
en la dirección deseada y a la velocidad adecuada
sembrada para obtener resultados consistentes.
para una correcta separación.
Ilustración 6: El transiluminador permite
Ilustración 5: La separación de los colorantes se
visualizar los fragmentos de ADN teñidos con
observa cuando las moléculas migran a través del
colorantes fluorescentes al exponerlos a luz
gel bajo la influencia de la corriente eléctrica,
ultravioleta, facilitando su identificación en el
formando bandas según su tamaño y carga.
gel.
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7. RESULTADOS
Ilustración 1: Al interpretar los resultados obtenidos con el transiluminador, se
observa que los grupos 1, 2 y 5 muestran bandas de ADN muy visibles, lo que indica
una amplificación exitosa y una alta concentración de fragmentos amplificados. El
grupo 3 presenta visibilidad media, lo que sugiere una amplificación parcial o menor
cantidad de ADN. En el grupo 4, no se observa ninguna banda, lo que podría indicar la
ausencia de amplificación o que no se generaron fragmentos de ADN detectables en el
gel. Esta variabilidad en los resultados puede ser atribuida a factores como la calidad
de las muestras, la eficiencia de la PCR o problemas en la preparación de las muestras.
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8. DISCUSIÓN
La electroforesis en gel permite diferenciar moléculas de ADN, ARN o proteínas en
función de su tamaño y carga eléctrica. Dado que el ADN tiene una carga uniforme por
masa, su separación se basa principalmente en la longitud de los fragmentos,
comparándolos con patrones conocidos. Las formas estructurales, como el ADN
circular o superenrollado, pueden modificar su desplazamiento en el gel. Esta técnica
es esencial en biología molecular para analizar y caracterizar muestras (1).
En la práctica realizada se identificó la electroforesis en gel mismo que (visto tabla#1).
Se puede identificar que los resultados del gel de la electroforesis contienen varias
muestras de ADN. El carril principal tiene un marcador de peso molecular que funciona
como una guía para medir el tamaño de los otros fragmentos. Este marcador tiene
bandas claras y bien separadas, lo que indica que todo está bien controlado. Sin
embargo, las otras muestras no están funcionando de manera correcta, por lo que
algunas bandas logran ser poco visibles, otras no tienen ninguna señal y algunas no se
movieron correctamente a través del gel. Estas diferencias podrían deberse a varios
factores, como la falta de ADN en algunas muestras, lo que podría indicar un error en
su preparación o una baja concentración, o incluso la degradación del ADN por
contaminación o condiciones de almacenamiento inadecuadas (2).
Según Michael R. Green and Joseph Sambrook en su investigación Análisis de ADN
mediante electroforesis en gel de agarosa, mencionan que las fallas en la migración del
ADN en el gel de agarosa pueden ocurrir debido a la electroendoósmosis (EEO), un
fenómeno en el que el líquido del gel se desplaza en dirección opuesta al ADN,
dificultando su movimiento, especialmente en fragmentos grandes. Además, una
concentración incorrecta de agarosa o un gel con alta EEO puede afectar la separación
adecuada de los fragmentos.
También es importante que el gel y el tampón estén bien preparados para evitar
problemas de migración. Para obtener buenos resultados, es esencial usar agarosa de
calidad y ajustar las condiciones de preparación del gel (3). De acuerdo con
mencionado autor y la información adquirida, pueden ocurrir errores en la carga de las
muestras o una concentración de agarosa inadecuada, que afecta el desplazamiento de
fragmentos grandes. Asimismo, es posible que no se haya aplicado la corriente eléctrica
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de forma adecuada, o que haya ocurrido un fallo en la tinción del ADN, lo que
dificultaría su visualización bajo luz UV. Para obtener mejores resultados, sería
importante verificar la calidad y cantidad del ADN antes de cargar las muestras,
asegurándose de que el gel y el sistema de electroforesis estén configurados
correctamente.
9. CONCLUSIONES
• A través de la electroforesis se aprenderá a separar y analizar moléculas biológicas,
como ADN, ARN y proteínas, basándose en su tamaño y carga eléctrica, este no
solo permite comprender mejor los principios físicos y químicos que rigen la
electroforesis, sino que también les proporcionará habilidades prácticas esenciales
para llevar a cabo experimentos de laboratorio con precisión y eficacia. Esta
experiencia práctica es invaluable para su desarrollo académico y profesional, ya
que los prepara para enfrentar desafíos en investigaciones científicas y
aplicaciones biotecnológicas.
• En la electroforesis en gel de agarosa, el gel actúa como una matriz porosa que
separa moléculas biológicas según su tamaño, mientras que los tampones de carga,
que contienen glicerol y colorantes de seguimiento, permiten que las muestras se
hundan en los pocillos del gel y monitorean el progreso de la electroforesis. Los
tampones de corrida, como TAE o TBE, mantienen un pH constante y
proporcionan iones para la conducción eléctrica, asegurando una migración
uniforme de las moléculas. Los colorantes de ADN, como el bromuro de etidio,
permiten visualizar las bandas de ADN bajo luz ultravioleta, y los marcadores de
peso molecular sirven como referencia para determinar el tamaño de las moléculas
separadas. La fuente de alimentación proporciona la corriente eléctrica necesaria
para la migración de las moléculas a través del gel, mientras que la placa de gel y
la cámara de electroforesis sostienen el gel y contienen los tampones y electrodos.
Finalmente, el transiluminador de luz ultravioleta se utiliza para visualizar y
documentar las bandas de ADN teñidas con colorantes fluorescentes, permitiendo
un análisis preciso de las moléculas biológicas en el laboratorio.
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• Una correcta extracción, purificación y amplificación de ADN es vital para el éxito
de la electroforesis, ya que garantiza que las muestras estén libres de
contaminantes y en cantidades suficientes para ser detectadas. Estos pasos previos
aseguran que el ADN se separe de manera eficiente en el gel, permitiendo una
interpretación precisa de los resultados.
• En base a los resultados obtenidos, al interpretar los resultados obtenidos con el
transiluminador, se observa que los grupos 1, 2 y 5 muestran bandas de ADN muy
visibles, lo que indica una amplificación exitosa y una alta concentración de
fragmentos amplificados. El grupo 3 presenta visibilidad media, lo que sugiere una
amplificación parcial o menor cantidad de ADN. En el grupo 4, no se observa
ninguna banda, lo que podría indicar la ausencia de amplificación o que no se
generaron fragmentos de ADN detectables en el gel. Esta variabilidad en los
resultados puede ser atribuida a factores como la calidad de las muestras, la
eficiencia de la PCR o problemas en la preparación de las muestras.
10. RECOMENDACIONES
• Para obtener resultados precisos y reproducibles, es crucial realizar una correcta
extracción, purificación y amplificación de ADN.
• Asegurarse de que las muestras estén libres de contaminantes y en cantidades
suficientes para ser detectadas en el gel.
• Utilizar técnicas como la PCR para amplificar el ADN y verifica la calidad de las
muestras antes de proceder con la electroforesis.
• Después de realizar la electroforesis, comparar las bandas obtenidas con un
marcador de tamaño conocido para identificar si el gen de interés ha sido
amplificado correctamente.
11. CUESTIONARIO
1) ¿En base a qué la electroforesis de agarosa separa moléculas
La electroforesis en gel de agarosa es de las más utilizadas para analizar y
caracterizar ácidos nucleicos de distintas procedencias. Los geles se comportan
como un tamiz molecular y permiten separar moléculas cargadas en función de su
tamaño y forma. Así, moléculas de DNA de diferente tamaño van a emigrar de
forma distinta en una electroforesis en gel de agarosa, de esta forma determinar el
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contenido de ácidos nucleicos de una muestra, teniendo una estimación de su
concentración y grado de entereza. (4)
2) Explicar la migración de acuerdo con la carga.
La electroforesis separa las moléculas según su carga eléctrica. En este caso, el
ADN, al poseer una carga negativa, migra hacia el electrodo positivo (ánodo)
cuando se aplica un campo eléctrico. Además, la velocidad de migración depende
de diversos factores; por ejemplo, una mayor carga favorece un desplazamiento
más rápido, mientras que las moléculas más pequeñas se mueven con mayor
facilidad. Por otro lado, la concentración del gel influye, ya que poros más
pequeños dificultan el paso de moléculas grandes. Finalmente, el tampón es
esencial, ya que asegura la conducción eléctrica y mantiene un pH estable para
obtener resultados precisos. (5)
3) ¿Qué conclusión se puede sacar del experimento realizado?
Mediante la aplicación de la electroforesis se pudo separar los fragmentos de ADN
del gen de interés, sin embargo, en los métodos previos a este, como son la
extracción, purificación y amplificación del ADN pudo existir interferencias en
los procedimientos los cuales no permitieron una correcta concentración y pureza
del material genético para poder utilizarlo en nuestra practica de electroforesis.
Aplicar los protocolos necesarios y adecuados al desarrollar estas técnicas es de
suma importancia para poder obtener los resultados deseados.
4) ¿Qué sucedería si se utilizará agua destilada en lugar del Tampón de
electroforesis en la cámara de electroforesis o en la solución del gel de
agarosa?
Usar agua destilada en lugar del tampón de electroforesis afectaría negativamente
el proceso. En primer lugar, el agua destilada no conduce bien la electricidad, lo
que impediría que las moléculas migraran correctamente. Además, el tampón
mantiene el pH estable, lo cual es esencial para la carga del ADN; sin él, el pH
podría variar y alterar la migración. También, el agua destilada generaría calor
debido a la baja conductividad, lo que podría dañar el gel y las muestras.
Finalmente, sin el tampón, las moléculas de ADN no migrarían adecuadamente o
no lo harían en absoluto. (5)
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5) ¿El ADN hacia qué electrodo migrará?
La carga negativa de su columna vertebral de fosfato mueve el ADN hacia el
ánodo cargado positivamente durante la electroforesis. (6)
12. BIBLIOGRAFÍA
1) J Vis. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. Nih.gov.
[citado el 10 de enero de 2025]. Disponible en:
https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles
2) Hanada K. Introduction and perspectives of DNA electrophoresis. Methods Mol
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0716-0323-9_1
3) Green, M. R., & Sambrook, J. (2019). Analysis of DNA by agarose gel
electrophoresis. Cold Spring Harbor Protocols, 2019(1).
https://doi.org/10.1101/pdb.top100388
4) Arbizú Medina O, Romero Oviedo F, Narváez González Y, Rizo Obregón R.
Migración de bromuro de etidio a GelRed en la tinción de ácidos nucleicos en gel
de agarosa. Rev Torreon Univ [Internet]. 28 de noviembre de 2024 [consultado el
10 de enero de 2025];13(38):145-50. Disponible
en: https://doi.org/10.5377/rtu.v13i38.19325
5) Montalvo C, Logo M. Dialnet [Internet]. ELECTROFORÉSIS:
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enero de 2025]. Disponible
en: https://dialnet.unirioja.es/servlet/articulo?codigo=7934364
6) Academia Lab. (2025). Electroforesis en gel de agarosa. Enciclopedia. Revisado el
10 de enero del 2025. https://academia-lab.com/enciclopedia/electroforesis-en-gel-
de-agarosa/
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