4 Análisis de

Proteínas

4.1. Determinación de Proteínas

4.1.1. Método de Kjeldahl

En el trabajo de rutina se determina mucho más frecuentemente la proteína total que

las proteínas o aminoácidos individuales. En general, el procedimiento de referencia
Kjeldahl determina la materia nitrogenada total, que incluye tanto las no proteínas
como las proteínas verdaderas (Aurand, et al, 1987).

El método que se basa en la determinación de la cantidad de nitrógeno contenido

en productos alimentarios, compromete dos pasos consecutivos:

a) La descomposición de la materia orgánica bajo calentamiento en

presencia de ácido sulfúrico concentrado.

b) El registro de la cantidad de amoniaco obtenida de la muestra.

Durante el proceso de descomposición ocurre la deshidratación y carbonización de la

materia orgánica, combinada con la oxidación de carbono a dióxido de carbono. El
nitrógeno es transformado a amoniaco que se retiene en la disolución como sulfato de
amonio. La recuperación del nitrógeno, y la velocidad del proceso pueden ser incre-
mentadas adicionando sales que abaten la temperatura de descomposición (sulfato de
potasio), o por la adición de oxidantes (peróxido de hidrógeno, tetracloruro, persulfato
o ácido crómico) y por la adición de un catalizador (Nollet, 1996).

45
Análisis de Alimentos

El método de Kjeldahl consta de las siguientes etapas:

a) Digestión Proteína + H2SO4 → CO2 + (NH4)2SO4 + SO2

b) Destilación (NH4)2SO4 + 2NaOH → Na2SO4 + NH3 ↑+ H2O

(recibiendo en HCl)
(recibiendo en H3BO3) NH3 + H3BO3 → NH4H2BO3
c) Titulación

(si se recibió en HCl) NH4Cl + HCl + NaOH → NH4Cl + NaCl + H2O

(si se recibió en H3BO3) NH4H2BO3 + HCl → H3BO3 + NH4Cl

En la mezcla de digestión se incluye sulfato sódico para aumentar el punto de ebullición

y un catalizador para acelerar la reacción, tal como sulfato de cobre. El amoniaco en
el destilado se retiene, o bien por un ácido normalizado, y se valora por retroceso,
o en ácido bórico y valora directamente. El método Kjeldahl no determina, sin em-
bargo, todas las formas de nitrógeno, a menos que se modifiquen adecuadamente;
esto incluye nitratos y nitritos (Pearson, 1993).

Para convertir el nitrógeno a proteína, se emplea el factor de 6.25, el cual proviene

de la consideración de que la mayoría de las proteínas tienen una cantidad aproxi-
mada de 16% de nitrógeno.

100g Proteína
factor = = 6.25
16g Nitrógeno

En la Tabla 3 se muestran algunos de los factores comúnmente empleados en los

alimentos.

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 Fundamentos y Técnicas

Tabla 3. Factores de conversión de nitrógeno a proteína para algunos alimentos

Alimento % N en proteína Factor

Huevo o carne 16.00 6.25
Leche 15.70 6.38
Trigo 18.76 5.33
Maíz 17.70 5.65
Avena 18.66 5.36
Soya 18.12 5.52
Arroz 19.34 5.17

Nielsen S. (ed); (1998). Food Analysis, Second Edition; An Aspen Publication, Gaith-
ersburg, Maryland. USA Pág 241

4.1.2. Absorción a 280 nm

La mayoría de las proteínas muestra una absorción a 280 nm, la cual se atribuye al
grupo fenólico de la tirosina, al grupo indólico del triptofano y al grupo aromático de
la fenilanalina (Fig. 8). La cuantificación de proteínas basada en la absorción en la
región de UV, tiene la ventaja de que no es necesario utilizar reactivos, y la muestra no
se daña o destruye durante la determinación. Se toma en cuenta la absorción del
disolvente, ya que este puede absorber en la misma región. Este método sufre inter-
ferencias de compuestos que contengan anillos de purina y pirimida. Se realiza una
comparación con una proteína estándar, de la que se debe conocer su composición
(Nollet, 1996).

COO COO COO

HN3 C H NH3 C H NH3 C H
CH2 CH2 CH2
C
CH
N
H
Triptofano OH Fenilalanina
Tirosina
Fig. 8. Estructura química de los aminoácidos aromáticos

47
Análisis de Alimentos

4.1.3. Método de Biuret

El método comprende un ensayo colorimétrico de un paso donde se cuantifica la for-

mación de un complejo estable entre el enlace peptídico de las proteínas y el cobre
(II). El complejo presenta un color violeta característico, que se puede observar a
310 nm o 540-560 nm, el cual se da por la coordinación de un átomo de cobre con
cuatro átomos de nitrógeno. El complejo se basa en la desprotonación de los grupos
amida para formar el enlace con el cobre (II), o por el establecimiento de un enlace
coordinado entre el metal y los pares de electrones libres de los átomos de oxígeno
y de nitrógeno del péptido (Ver Fig. 9).

Después de la adición del reactivo de cobre, se requiere tiempo para desarrollar una
coloración de Biuret estable; es necesario considerar la posible influencia de amino-
ácidos libres que forman buffer en configuración tris y amoniaco (Nollet, 1996).

H N N H
O O
Cu 2+ R
R
H N N H
O O

R R

Fig. 9. Estructura del complejo entre el cobre y los enlaces peptídicos.

4.1.4. Método de Lowry

El método de Lowry, et al, (1951) combina la reacción de Biuret con la reducción del
reactivo de Folin-Ciocalteu (ácidos fosfomolíbdico y fosfotúngstico) por la oxidación
de tirosina, triptofano, cisteína, cistina de las cadenas polipeptídicas (Nielsen, 1988).
El proceso de óxido-reducción se acompaña de la formación de un color azul carac-
terístico (Ver Fig 10).

48
 Fundamentos y Técnicas

Los quelatos de cobre en la estructura del péptido facilitan la transferencia de elec-

trones de los grupos funcionales amino al cromóforo ácido. Este método es útil para
determinar pequeñas cantidades de proteína en una disolución. El desarrollo de color
es dependiente en gran cantidad del pH, que se debe mantener entre 10 y 10.5
(Nollet, 1996).

R R
CH C NH CH C NH
O O
OH-
+ Cu2+ COMPLEJO DE Cu+ CON PROTEÍNA
O O
CH C NH CH C NH
R R OH-

COMPLEJO DE Cu+ CON PROTEÍNA + Mo6+/ W6+ AZUL

Absmáx = 750 nm
reactivo de folin
ácido fosfomolíbdico
ácido fosfotúngstico

Fig. 10. Esquema general de las reacciones que se llevan a cabo

en el método de Lowry.

4.1.5. Método turbidimétrico

La turbiedad producida cuando una proteína se mezcla con alguno de los precipitantes
comunes (ácido tricloroacético 3-10%, ácido sulfosalicílico y ferrocianuro de potasio en
ácido acético) para proteínas en bajas concentraciones, se puede utilizar como un índice
de la concentración de proteínas. La turbiedad se mide espectofotométricamente.

Las técnicas turbidimétricas son rápidas y convenientes; sin embargo, las principales
desventajas que presentan es que las proteínas difieren en la velocidad de precipi-
tación, así como no permiten diferenciar entre proteínas y compuestos insolubles en
ácidos tales como ácidos nucleicos (Layne, 1957).

49
Análisis de Alimentos

4.1.6. Unión de colorantes

Controlando el pH y la fuerza iónica del medio, los grupos funcionales ácidos y bási-
cos de las proteínas pueden interactuar con grupos orgánicos de carga opuesta. Al
realizarse la unión, se presenta coloración o bien un cambio de ésta. Comúnmente se
usan colorantes sulfonados, los cuales reaccionan a pH ácido con el grupo a-amino de
la lisina y el grupo guanidina de la arginina, el imidazol de la histidina y un número
limitado de a-amino terminales (Nollet, 1996).

En la Tabla 4 se comparan las ventajas y desventajas de los métodos más comunes

para la determinación de proteínas.

Método Ventajas Desventajas

 Puede presentarse
interferencia de compuestos
 Es apropiado para varios tipos nitrogenados no proteicos.
de productos.
 Durante la digestión se
 Su alta confiabilidad y produce demasiado humo.
Kjeldahl disponibilidad.
 Uso de catalizadores caros o
 Esta incluido en los métodos tóxicos.
aprobados por las
organizaciones internacionales.  Baja sensibilidad.

 Tarda demasiado tiempo.

 Rápida y no destructiva.

 No se necesitan reactivos.  La interferencia de otros

compuestos que absorban
 Alta sensibilidad.
en UV.
Absorción a
280 nm  Baja dependencia de la
 Se necesita usar muestras
respuesta de la señal a la
limpias y lámparas
composición del aminoácido.
relativamente nuevas.
 Baja interferencia de ácidos
nucleicos y nucleótidos.

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 Fundamentos y Técnicas

 No hay interferencia de
aminoácidos libres.

 Pequeña influencia de la  Interferencia de amoniaco,

composición del aminoácido en buffer, detergentes.
Biuret
el desarrollo de color.
 Baja sensibilidad.
 La operación es simple y se
puede manejar número grande
de muestras.

 Dependencia del color con la

composición del aminoácido.
 Alta sensibilidad.
 Interfieren un gran número de
 Fácil de operar.
Lowry compuestos.
 Fácil de manejar un gran
 Inestabilidad del reactivo
número de muestras.
Folin-Ciocalteau a pH
alcalino.

Nollet, L. M. L (Ed); (1996). Handbook of Food Analysis; Marcel Dekker, Nueva

York. Pág 285-286

4.2. Extracción de proteínas (Método de Osborne y Mendel)

El método se fundamenta en la relación estructura-solubilidad de las proteínas. Por

ejemplo, se sabe que la zeína que es soluble en un alcohol fuerte o en disoluciones
alcalinas diluidas, pero es insoluble en agua o en soluciones neutras inorgánicas. Las
glutelinas, por ejemplo, son insolubles en agua, en soluciones salinas y en alcohol, y
bastante soluble, en sosa y potasa.

Es importante notar que la mayor parte de nitrógeno proveniente de proteínas

es soluble en alcohol y en disoluciones alcalinas. Las globulinas, albúminas y prolinas son
solubles en disoluciones alcalinas diluidas (Osborne, 1914).

51
Análisis de Alimentos

4.3. Propiedades Funcionales de las Proteínas

4.3.1. Capacidad de gelificación

Cuando las proteínas desnaturalizadas se agregan para formar una red proteica
ordenada, al proceso se le denomina gelificación.

La gelificación es una propiedad funcional muy importante de algunas proteínas, se

utiliza, no sólo para formar geles sólidos viscoelásticos, sino también para mejorar
la absorción de agua, los efectos espesantes, la fijación de partículas (adhesión) y
para estabilizar emulsiones y espumas (Fennema, 1993).

La capacidad de una proteína a gelificar depende de factores intrínsecos relacio-

nados con las propiedades químicas, de las condiciones que afectan la velocidad de
desnaturalización y de las interacciones subsecuentes de las cadenas desdobladas.
Las proteínas grandes que tienen PM arriba de 60kDa y contienen más de 30 de
residuos hidrofóbicos tienden a formas geles irreversibles tipo coágulo, debido a
que pueden interaccionar fácilmente con sus fragmentos hidrofóbicos; por ejemplo,
hemoglobina y albúmina de huevo. Las proteínas que gelifican contienen grupos hi-
drofóbicos, por ejemplo proteínas de la soya y gelatina.

El mecanismo de gelificación se da en dos etapas. En la primera ocurre una disociación

de la estructura cuaternaria y despliegamiento de la molécula de proteína (dependerá
de la estabilidad térmica; la desnaturalización generalmente ocurre a temperaturas
cercanas a 40°C). En la segunda etapa, usualmente a mayores temperaturas,
las moléculas desnaturalizadas se reacomodan y forman una red tridimensional debido
a interacciones de los grupos reactivos de las cadenas (Sikorski, 2001).

4.3.2. Capacidad de emulsificación

La capacidad de las proteínas para actuar como surfactantes y emulsificantes, depende

de su habilidad para adsorberse en una interfase agua-aceite.

Las emulsiones son dispersiones de dos líquidos inmiscibles, uno de los cuales se en-
cuentra bajo la forma de pequeñas gotas dispersas en el otro líquido que constituye
la fase continua dispersante (Cheftel, et al, 1989).

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 Fundamentos y Técnicas

Las proteínas se adsorben en la interfase entre las gotas de aceite disperso y la fase
acuosa continua, y aportan propiedades físicas y reológicas (viscosidad, elasticidad,
rigidez, etc.) que determinan resistencia a la coalescencia. Asímismo, según el pH,
se puede producir la ionización de las cadenas laterales de los aminoácidos y esto
aporta fuerzas de repulsión electrostática que favorece la estabilidad de la emulsión
(Damodoran y Paraf, 1997).

4.3.3. Capacidad de espumado

Las espumas son sistemas coloidales, en el cual pequeñas burbujas de aire son dis-
persas en una fase acuosa. Muchos alimentos procesados, como crema batida, helado,
pastel, merengues y malvaviscos, son productos obtenidos aplicando la propiedad
funcional de formación de espuma. En esos productos, las proteínas son los agentes
principalmente estabilizadores de la fase gaseosa dispersa.

Generalmente, las espumas se forman por burbujeo, agitación o batido de la solución

de proteína. Las propiedades de espumado consideran dos aspectos a) la habilidad
de producir un área en la interfase tal, que una gran cantidad de gas puede incorpo-
rarse en el líquido (comúnmente referido como espumado o capacidad de espumado),
y b) la habilidad de formar una película determinada que pueda contrarrestar las
fuerzas internas y externas (Yada, 2004).

La capacidad de espumado (CE) de una proteína se puede definir como (Damodoran

y Paraf, 1997):

Vol. Espuma – Vol. líquido inicial X 100

CE =
Vol líquido inicial

4.3.4. Capacidad de retención de agua

La capacidad de retención del agua puede definirse como la cantidad de agua que se
mantiene unida a la proteína hidratada, aun después de la aplicación de una fuerza
externa como presión, o más comúnmente centrifugación (Theobaudin, et al, 1997).
En este método se mide tanto el agua ligada (agua de hidratación, no congelable),
como el agua capilar, retenida físicamente entre las moléculas proteicas. La concen-
tración proteínica, el pH, la temperatura, el tiempo, la fuerza iónica y la presencia

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Análisis de Alimentos

de otros componentes afectan a las fuerzas que toman parte en las interacciones
proteína-proteína y proteína-agua.

La fijación de agua por las proteínas desciende generalmente a medida que se eleva
la temperatura, debido a la disminución de los puentes de hidrógeno. El calentamiento
provoca la desnaturalización y la agregación, pudiendo esta última reducir el área
superficial y el número de grupos amino polares disponibles para fijar agua. Por otro
lado, cuando se calientan proteínas con una estructura muy compacta, la disociación
y el desplegamiento ocasionados pueden exponer enlaces peptídicos y cadenas late-
rales polares previamente ocultas, lo que aumenta la fijación.

El tipo y la concentración de iones ejercen un considerable efecto sobre la absorción

de agua. Generalmente, se establece una competencia en la interacción entre el agua,
la sal y las cadenas laterales de los aminoácidos (Fennema, 1993).

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