Capitulo 6.

Diagmol
Amplificación de ácidos nucleicos
Los primeros análisis de los ácidos nucleicos estaban limitados por la disponibilidad
de ADN. La generación de suficientes copias de un solo gen requirió la propagación
de millones de células en cultivo o el aislamiento de grandes cantidades de ADN
genómico. Si se hubiera clonado un gen, se podrían generar muchas copias en
plásmidos bacterianos, pero esta preparación fue laboriosa y algunas secuencias
fueron resistentes a la propagación de esta manera.
La capacidad de amplificar una secuencia específica de ADN abrió la posibilidad de
analizar a nivel de nucleótidos prácticamente cualquier fragmento de ADN en la
naturaleza. El primer método de amplificación específico de cualquier tipo fue la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se han desarrollado otros métodos de
amplificación basados en la realización de modificaciones en la PCR. Los métodos
que se han desarrollado para amplificar los ácidos nucleicos se pueden dividir en
tres grupos, en función de si se amplifica el propio ácido nucleico objetivo, una
sonda específica para la secuencia objetivo o la señal utilizada para detectar el
ácido nucleico objetivo. Estos métodos se analizan en este capítulo.
AMPLIFICACIÓN DE OBJETIVOS
La amplificación de dianas implica hacer muchas copias de una secuencia
específica de ADN. Esto es análogo al cultivo de células en cultivo y permitir que las
células repliquen su ácido nucleico así como a sí mismas para que, por ejemplo,
puedan visualizarse en una placa de agar. Esperar a que las células se repliquen a
niveles detectables puede llevar días, semanas o meses, mientras que replicar el
ácido nucleico in vitro solo lleva de minutos a horas. La PCR es el primer método
prototípico para amplificar el ácido nucleico objetivo.
Reacción en cadena de la polimerasa
Kary Mullis visualizó la idea de amplificar el ADN in vitro en 1983 mientras conducía
una noche por una carretera de California. 1,2 En el proceso de trabajar en un
método de detección de mutaciones, Mullis se dio cuenta de que al agregar los
cuatro nucleótidos a su mezcla de reacción, podría duplicar su objetivo de prueba,
una región corta de ADN de doble cadena, lo que le daría 2 1 o 2 copias. Si repetía
el proceso, el objetivo se duplicaría de nuevo, dando 2 2 o 4 copias. Después de N
duplicaciones, tendría 2 N copias de su objetivo. Si N = 30 o 40, habría millones de
copias.
Lo que Mullis había imaginado era la PCR. Durante los meses siguientes, en el
laboratorio, sintetizó oligonucleótidos cortos (cebadores) complementarios a las
secuencias de una región del factor de crecimiento nervioso humano e intentó
amplificar la región a partir del ADN humano, pero el experimento no funcionó. No
estaba seguro de la información de la secuencia de nucleótidos que tenía en el gen
humano, así que intentó un objetivo más defi nido. La primera ampli f i cación exitosa
fue un fragmento corto del plásmido Escherichia coli, pBR322. El primer artículo que
describe una aplicación práctica, la amplificación de la beta-globina y la isis anal
para el diagnóstico de pacientes con anemia de células falciformes, se publicó 2
años después. 3 Llamó al método una "reacción en cadena catalizada por la
polimerasa" porque la ADN polimerasa era la enzima que utilizaba para impulsar la
repetición del ADN en una reacción en cadena. El nombre se acortó rápidamente a
PCR. Desde que se inició la PCR, se ha vuelto cada vez más fácil de usar, más
automatizada y más susceptible de usar en un laboratorio clínico.
PCR básica
Procedimiento La replicación del ADN en una célula requiere un ADN bicatenario
existente como molde para dar el orden de las bases de nucleótidos; las bases de
desoxirribonucleótidos en forma de trifosfatos de desoxinucleótidos (dNTP): dATP,
dGTP, dCTP, dTTP; ADN polimerasa para catalizar la adición de nucleótidos a la
hebra en crecimiento; y un cebador (sintetizado por primase in vivo) al que la ADN
polimerasa añade bases posteriores.
La PCR esencialmente duplica la replicación in vivo del ADN in vitro, utilizando los
mismos componentes ( Tabla 6.1 ) para replicar el ADN, con el mismo resultado
final: una copia de ADN bicatenario se convierte en dos copias ( Fig. 6.1 ). En menos
de 2 horas, la PCR puede producir millones de copias, llamadas colectivamente
amplicones, de ADN, en contraste con los días que tarda una célula en producir el
mismo número de copias in vivo. La verdadera ventaja de la PCR es la capacidad
de amplificar objetivos específi cos. Al igual que el primer cebador de Southern
permitió el análisis de regiones específi cas en un contexto complejo, la PCR ofrece
la oportunidad de amplificar y clonar eficazmente las secuencias diana. A
continuación, el objetivo amplificado puede someterse a innumerables
procedimientos analíticos.
Para realizar una amp cación de PCR, los componentes de la plantilla de ADN de
reacción, los cebadores cortos de oligonucleótidos, los nucleótidos, la polimerasa y
el tampón se someten a un programa de amplificación, que consiste en un número
específi co de ciclos que se dividen en pasos durante los cuales las muestras se
mantienen a temperaturas determinadas durante los tiempos designados. La tabla
6.2 muestra los pasos de un ciclo común de PCR de tres pasos.
El programa de amplificación comienza con un objetivo de ADN bicatenario. En el
primer paso (desnaturalización), el ADN bicatenario se desnaturaliza en dos
cadenas simples ( Fig. 6.2 ). Esto se logra calentando la muestra a 94 °C a 96 °C
durante varios segundos a varios minutos, dependiendo de la plantilla. El paso inicial
de dena turación se alarga para fragmentos genómicos u otros fragmentos grandes
de molde de ADN. Las desnaturalizaciones posteriores pueden ser más cortas.
El siguiente paso en el programa de amplificación, el más crítico para la
especificidad de la PCR, es el paso de recocido. Este es el segundo paso del ciclo
de PCR en el que los dos cebadores de oligonucleótidos que prepararán la síntesis
de ADN se recocen (hibridan) a secuencias complementarias en la plantilla (Fig.
6.3). Los cebadores dictan la parte de la plantilla que se amplificará; En otras
palabras, los cebadores determinan la especificidad de la amplificación. Es
importante que la temperatura de recocido se optimice con los cebadores y las
condiciones de reacción. Las temperaturas de recocido oscilarán entre 50 °C y 70
°C y generalmente se establecen empíricamente. Se puede determinar un punto de
partida utilizando la T m de las secuencias de cebadores. Las condiciones de
reacción, la concentración de sal, los desajustes de la secuencia del cebador, la
condición del molde y la estructura secundaria afectarán al T m real de los
cebadores en la reacción.
El tercer y último paso del ciclo de PCR es el paso de extensión del cebador ( Fig.
6.4 ). Aquí es donde se produce la síntesis del ADN. En este paso, la polimerasa
sintetiza una copia del ADN molde mediante la adición de nucleótidos a los
cebadores hibridados. La ADN polimerasa replica el ADN molde extendiendo
simultáneamente los cebadores en ambas hebras de la moldura. Este paso se
produce a la temperatura óptima de la enzima, de 68 °C a 72 °C.
Al final de los tres pasos, o un ciclo (desnaturalización, recocido del cebador y
extensión del cebador), una copia de ADN bicatenario se ha replicado en dos copias
bicatenarias. Volviendo a la temperatura de desnaturalización, comienza el segundo
ciclo ( Fig. 6.5 ), con el resultado final de una duplicación en el número de moléculas
de ADN bicatenario nuevamente. Al final del programa de PCR, se habrán generado
millones de copias de la región original definida por las secuencias de cebadores. A
continuación se presenta una discusión más detallada de cada uno de los
componentes de la PCR.
COMPONENTES DE LA PCR
La PCR es un método de síntesis de ADN in vitro. Por lo tanto, para realizar la PCR,
todos los componentes necesarios para la replicación del ADN in vivo se combinan
en concentraciones óptimas para que la replicación del ADN ocurra in vitro. Esto
incluye la plantilla que se va a copiar; cebadores para la síntesis prima de la plantilla;
nucleótidos; enzima polimerasa; y componentes de búfer. incluyendo cationes
monovalentes y diva prestados. para proporcionar condiciones óptimas para una
replicación precisa y efi capaz.
Imprimaciones
Los cebadores son el componente crítico de la reacción, ya que determinan la
especificidad de la PCR. Los cebadores son análogos a las sondas en los
procedimientos de secado e hibridación. Los cebadores se fabrican químicamente
en un sintetizador de ADN. La mayoría de los laboratorios compran cebadores a
proveedores comerciales. Las secuencias de cebadores se presentan en forma de
texto, junto con otras especificaciones, como la cantidad, el grado de purifi cación y
cualquier modificación, como biotina o colorantes fluorescentes.
Los cebadores están diseñados para contener secuencias completas con respecto
a los sitios que fluyen en la región que se va a analizar. Por lo tanto, el diseño del
cebador es un aspecto crítico de la PCR. Los cebadores son fragmentos de ADN
monocatenario, generalmente de 20 a 30 bases de longitud. El cebador directo
hibrida a la hebra complementaria a solo 5' de las secuencias a amplificar. El
cebador inverso hibrida sólo 3 ′ a la secuencia que se va a amplificar (ver Fig. 6.1 ).
Por lo tanto, el diseño de cebadores requiere cierto conocimiento de la región
objetivo. La colocación de los cebadores también determinará el tamaño del
producto amplificado.
Los órdenes de secuencia de nucleótidos de los cebadores directos e inversos se
diseñan utilizando secuencias genómicas disponibles en el Centro Nacional de
Información Biológica u otros recursos. Cuando se publican los procedimientos, las
secuencias de cebadores se proporcionan en las descripciones de los métodos. Los
cebadores se pueden diseñar manualmente o, alternativamente, las secuencias de
cebadores pueden ser generadas automáticamente por programas de software a
partir de una secuencia de destino de entrada y los parámetros elegidos, como la
longitud deseada del icono ampl.
La hibridación de cebadores está sujeta a las mismas limitaciones físicas que la
hibridación de sondas. La secuencia del cebador (% GC) y la longitud afectan a las
condiciones en las que el cebador se unirá a su objetivo. La temperatura aproximada
de fusión del soldado, o T m , de los cebadores puede calcularse utilizando la
ecuación para fragmentos cortos de ADN descrita en el Capítulo 5 . Este cebador T
m sirve como punto de partida para establecer la temperatura óptima de recocido,
el paso crítico para la especificidad de la reacción de amplificación. Los cebadores
deben diseñarse de tal manera que los cebadores delantero e inverso tengan una
T m similar para que ambos se hibriden de manera óptima con la misma temperatura
de recocido. T m se puede ajustar aumentando la longitud de los cebadores o
colocando los cebadores en áreas con más o menos G y C en la plantilla.
La secuencia de cebadores determina la precisión de la unión a su secuencia
complementaria y no a otras secuencias. Al igual que la hibridación cruzada puede
ocurrir con la hibridación por transferencia, en la PCR puede producirse una unión
aberrante de cebadores, o un cebado incorrecto. Un fragmento sintetizado como
resultado de un mal cebado llevará la secuencia del cebador y se convertirá en una
plantilla para los ciclos posteriores de amplificación ( Fig. 6.6 ). Eventualmente, los
productos mal cebados alejarán los componentes de la reacción prevista. También
pueden interferir con la interpretación adecuada de los resultados o con los
procedimientos subsiguientes, como la secuenciación o el análisis de mutaciones.
La estructura secundaria (plegamiento interno e hibridación dentro de las hebras de
ADN) también puede interferir con la PCR. Las secuencias de cebadores que tienen
homologías internas, especialmente en el extremo 3 ', o homologías con el otro
miembro del par de cebadores pueden no funcionar tan bien en la PCR. Un artefacto
que se observa a menudo en la PCR es la aparición de dímeros de cebadores, que
son productos de PCR que tienen aproximadamente el doble del tamaño de los
cebadores. Son el resultado de la unión de cebadores entre sí a través de
homologías cortas (de 2 a 3 bases) en sus extremos de 3 'y la copia de cada
secuencia de cebadores ( Fig. 6.7 ). El doblete resultante es entonces un objetivo
muy efi ciente para la amplificación subsesciente.
Toda la secuencia de cebadores no tiene que unirse a la plantilla para cebar la
síntesis; Sin embargo, la posición de la marea del núcleo de 3 ′ es crítica para la
extensión del cebador. La polimerasa no formará un enlace fosfodiéster si el
extremo de 3 pies del cebador no está unido a hidrógeno a la placa tem. Esta
característica de la unión del cebador se ha aprovechado para modificar el
procedimiento de PCR para el análisis de mutaciones de la plantilla. No existe un
requisito tan estricto de complementariedad en el extremo 5' de la imprimación.
Se pueden agregar extensiones o colas no complementarias al extremo 5' de las
secuencias de cebadores para introducir adiciones útiles al producto de PCR final,
como sitios de enzimas de restricción, promotores o sitios de unión para otros
cebadores. Estos cebadores de cola están diseñados para agregar o alterar
secuencias a uno o ambos extremos del producto de PCR ( Fig. 6.8 ).
Plantilla de ADN
La automatización del procedimiento de PCR se vio facilitada en gran medida por el
descubrimiento de la enzima termoestable Taq polimerasa. Cuando Kary Mullis
realizó por primera vez la PCR, utilizó la ADN polimerasa aislada de E. coli. Sin
embargo, con cada paso de desnaturalización, la alta temperatura inactivaba la
enzima. Por lo tanto, después de cada ronda de denaturación, se tuvo que agregar
ADN polimerasa adicional de E. coli al tubo. Esto requería mucha mano de obra,
reducía la eficiencia de la reacción y proporcionaba oportunidades adicionales para
la introducción de contaminantes en el tubo de reacción.
La polimerasa Taq se aisló de la bacteria termófila Thermus aquaticus. El uso de
una enzima derivada de una bacteria termófila significaba que la ADN polimerasa
podía añadirse una vez al comienzo del procedimiento y mantendría su actividad
durante todos los ciclos de calentamiento y enfriamiento. Otras enzimas, como la
Tth polimerasa, de Thermus thermophilus, fueron posteriormente explotadas para
uso en laboratorio. La Tth polimerasa también tiene actividad de transcriptasa
inversa, por lo que se puede utilizar en la PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR)
en la que el material de partida es un molde de ARN. La adición de enzimas de
corrección, por ejemplo, la polimerasa Vent, permite que la polimerasa Taq o Tth
genere productos grandes de más de 30.000 bases de longitud.
La nomenclatura de las polimerasas se deriva del organismo del que proviene cada
enzima, similar a la nomenclatura de las enzimas de restricción. Por ejemplo, para
la polimerasa Taq, la T proviene del nombre del género, Thermus, y la aq proviene
del nombre de la especie, aquaticus.
La clonación de los genes que codifican para estas polimerasas ha dado lugar a
versiones modificadas de las enzimas polimerasas, como el fragmento de Stoffel
que carece de los 289 aminoácidos N-terminales de la polimerasa Taq y su actividad
exonucleasa inherente de 3 a 5 pulgadas. 5 La vida media del fragmento de Stoffel
a altas temperaturas es aproximadamente el doble que la de la polimerasa Taq, y
tiene un rango más amplio de concentraciones óptimas de MgCl 2 (2 a 10 mM) que
Taq. Esta enzima se recomienda para la PCR específi ca alélica y para la amplifi
cación de regiones con alto contenido de GC. Se utilizan versiones modificadas
adicionales de las enzimas Taq que conservan una actividad de exonucleasa de 3'
a 5', pero no de 5' a 3' exonucleasa, donde es importante una alta fidelidad (copia
precisa de la plantilla). Otras variantes de la polimerasa Taq, la termosequenasa y
la sequanasa T7, incorporan de manera efi ciente trifosfatos de nucleósidos didesoxi
(NTP) para su aplicación en la secuenciación de terminaciones de cadenas. Una
versión truncada de la polimerasa Taq tiene mutaciones que la hacen resistente a
los inhibidores presentes en la sangre total, una característica aplicable a los
análisis clínicos.
A pesar de su estabilidad térmica, la enzima polimerasa Taq todavía está sujeta a
pérdida de actividad en condiciones adversas. Por ejemplo, aunque la mezcla es
importante para los tampones y otras soluciones, especialmente después de la
descongelación, no se recomienda una agitación vigorosa de las enzimas
polimerasas. Esto puede dar lugar a un cizallamiento mecánico, a la alteración de
las estructuras secundaria y terciaria de enzimas complejas como las polimerasas
y a una desnaturalización irreversible. La mezcla también introduce aire en el
líquido, infundiendo burbujas en la interfaz aire-líquido, lo que también puede causar
daños. La mayoría de las enzimas utilizadas en biología molecular tienen
estructuras terciarias complejas (con múltiples subunidades) y perderán actividad
enzimática con una mezcla vigorosa. Por el contrario, las proteínas diminutas como
la RNasa pueden renagarse y, por lo tanto, son resistentes a este tipo de
tratamiento.
Tampones de PCR
Los tampones de PCR proporcionan las condiciones óptimas para la actividad
enzimática. El cloruro de potasio (20 a 100 mM), el sulfato de amonio (15 a 30 mM)
u otras fuentes de cationes monovalentes son componentes tampón importantes.
Estas sales afectan las temperaturas de desnaturalización y recocido del ADN y la
actividad enzimática. Un aumento en la concentración de sal hace que los productos
de ADN más largos se desnaturalicen más lentamente que los productos de ADN
más cortos durante el proceso de amplificación, por lo que las moléculas más cortas
se amplificarán preferentemente. La infl uencia de las condiciones tampón/sal varía
según los diferentes cebadores y plantillas.
Los cationes divalentes, proporcionados por el cloruro de magnesio, también
afectan al recocido del cebador y son muy importantes para la actividad enzimática.
Los requisitos de magnesio variarán en función de otros componentes de la mezcla
de reacción; por ejemplo, cada NTP ocupará un átomo de magnesio. Además, la
presencia de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) u otros quelantes disminuirá la
cantidad de magnesio disponible para la enzima. Muy pocos iones Mg 2 +
disminuirán la eficiencia de la enzima, lo que resultará en un bajo rendimiento del
producto PCR. Las concentraciones demasiado altas de Mg 2 + promueven la
incorporación incorrecta y, por lo tanto, aumentan el rendimiento de los productos
no específi cos. Concentraciones más bajas de Mg 2 + son deseables cuando la
fidelidad de la PCR es crítica. El rango recomendado de concentración de MgCl 2
es de 1 a 4 mM en condiciones de reacción estándar. Si las muestras de ADN
contienen EDTA u otros quelantes, la concentración de MgCl 2 en la mezcla de
reacción debe ajustarse en consecuencia. El tampón Tris y los componentes tampón
adicionales también son importantes para una actividad enzimática óptima y una
amplificación precisa del producto previsto; 10 mM de Tris-HCl mantiene el pH
adecuado del tampón, normalmente entre pH 8 y pH 9,5. Al igual que con otros
componentes de la PCR, las condiciones óptimas se establecen empíricamente.
A veces se utilizan componentes accesorios para optimizar las reacciones. La
albúmina sérica bovina (10 a 100 μ g/mL) se une a los inhibidores y estabiliza la
enzima. El ditioth reitol (0,01 mM) proporciona condiciones reductoras que pueden
mejorar la actividad enzimática. La formamida (1% a 10%) añadida a la mezcla de
reacción disminuirá la temperatura de desnaturalización del ADN con una estructura
secundaria alta, aumentando así la disponibilidad para la unión del cebador. Los
agentes caotrópicos (detergentes), como Triton X-100, glicerol y dimetilsulfóxido,
añadidos en concentraciones de 1% a 10%, también pueden reducir la estructura
secundaria para permitir la extensión de la polimerasa a través de áreas difíciles.
Estos agentes también contribuyen a la estabilidad de la enzima.
Las enzimas suelen suministrarse con tampones optimizados por el fabricante.
También se pueden comprar potenciadores comerciales de tampones de PCR de
composición patentada para optimizar las reacciones difíciles. A menudo, el tampón
y sus ingredientes se mezclan con las bases de nucleótidos y se almacenan como
alícuotas de una mezcla maestra. A continuación, se añaden la enzima, el objetivo
y los cebadores cuando es necesario. Las mezclas maestras dedicadas también
incluirán los cebadores, por lo que solo se deben agregar las secuencias objetivo a
estas mezclas.
Termocicladores
Las primeras PCR se realizaron utilizando múltiples baños de agua o bloques de
calor ajustados a las temperaturas requeridas para cada una de las etapas del ciclo
de PCR. Los tubos se movían manualmente de una temperatura a otra. Además,
antes del descubrimiento de las enzimas termoestables, había que añadir nuevas
enzimas después de cada paso de desnaturalización, lo que ralentizaba aún más el
procedimiento y aumentaba las posibilidades de error y contaminación.
La automatización de este tedioso proceso se vio facilitada en gran medida por la
disponibilidad de las enzimas termoestables. Por lo tanto, para lograr la PCR, un
instrumento solo debe manejar la temperatura de acuerdo con un programa de
amplificación programado. Por lo tanto, los termocicladores, o termocicladores,
fueron diseñados para aumentar (cambiar) rápida y automáticamente a las
temperaturas de incubación requeridas, manteniéndose en cada una de ellas
durante los períodos designados.
Las primeras versiones de los termocicladores se diseñaron como
calentadores/enfriadores con memoria programable para registrar las condiciones
de reacción adecuadas. En comparación con los modelos modernos, la memoria
disponible para registrar las condiciones de reacción y la muestra era limitada.
Había que añadir cera o aceite (barreras de vapor) a las reacciones para evitar la
condensación de la muestra en la parte superior de los tubos durante los cambios
de temperatura. La capa de cera o aceite dificultaba la manipulación posterior de la
muestra. Más tarde, se diseñaron modelos de termocicladores con tapas calentadas
que eliminaban la necesidad de barreras de vapor.
Las diversas versiones disponibles de termocicladores difieren en los sistemas de
calefacción y/o refrigeración, así como en el software programable dentro de las
unidades. Algunos contienen muestras en cámaras abiertas para calentar y enfriar
el aire; otros contienen muestras en bloques diseñados para acomodar tubos de 0,2
mL, generalmente en un formato de 96 pocillos. Algunos modelos tienen bloques
intercambiables para acomodar la amp cación en diferentes tamaños y números de
tubos o la amp cación in situ de dianas de ácido nucleico en tejido en portaobjetos.
Un ciclador puede ejecutar más de un bloque de forma independiente, de modo que
se puedan realizar diferentes programas de PCR simultáneamente. Los sistemas
de PCR rápida trabajan con pequeños volúmenes de muestra en cámaras que se
pueden calentar y enfriar rápidamente cambiando el aire o la temperatura del bloque
especialmente diseñado que rodea las muestras. 6 Los sistemas de PCR en tiempo
real están equipados con detectores fl uorescentes para medir el producto de PCR
a medida que avanza la reacción. La PCR también se puede realizar en un
dispositivo de microchip en el que las muestras de 1 a 2 μ L se fuerzan a través de
pequeños canales grabados en un chip de vidrio, pasando a través de zonas de
temperatura a medida que el chip descansa sobre un bloque de calor especialmente
adaptado o un sistema de calentamiento por microondas.
La reacción en la PCR
Para la PCR de rutina, una cantidad adecuada de ADN que se ha aislado de una
muestra de prueba se mezcla con los otros componentes de la PCR, ya sea por
separado o como una mezcla maestra. El volumen final de la mezcla de reacción
varía de 1 a 50 μ L para la mayoría de los procedimientos de PCR. Los
termocicladores toman tubos de paredes delgadas, tiras de tubos o placas de 96 o
384 pocillos con una capacidad de volumen de 0,04 a 0,2 mL. La preparación de la
muestra para la PCR se clasifica como un procedimiento pre-PCR. Para evitar la
contaminación (véase la siguiente discusión), se recomienda que el trabajo previo
a la PCR se realice en una zona designada que esté limpia y libre de productos
amplificados u otros ADN extraños. A continuación, los tubos de muestra se cargan
en el termociclador con las temperaturas y los tiempos de cada paso del ciclo de
PCR, el número de ciclos que deben completarse (normalmente de 30 a 50), las
condiciones para pasar de un paso a otro y la temperatura a la que se deben
mantener los tubos una vez que se han completado todos los ciclos. Debido a que
los productos de PCR son estables a la temperatura de retención, el técnico no tiene
que recuperar las muestras del termociclador inmediatamente después de que se
concluye el programa de PCR.
Después de la PCR, se pueden utilizar una variedad de métodos para analizar el
producto. Lo más habitual es que el producto de PCR se analice mediante
electroforesis en gel o capilar. Dependiendo de la aplicación, el tamaño, la presencia
o la intensidad de los productos de PCR se observan después de la electroforesis.
En la Figura 6.9 se muestra un ejemplo de los resultados de una PCR.
Controles para PCR
Al igual que con cualquier ensayo de diagnóstico, la ejecución de los controles
correctos durante cada prueba de PCR es esencial para garantizar y mantener la
precisión del ensayo. Los controles positivos garantizan que la enzima esté activa,
que el tampón sea óptimo, que los cebadores ceben las secuencias correctas y que
el termociclador realice el ciclo adecuado. Un control negativo sin ADN (también
llamado control de contaminación o blanco de reactivo) garantiza que la mezcla de
reacción no esté contaminada con ADN molde o productos amplificados de una
ejecución anterior. Un control negativo con ADN que carece de la secuencia objetivo
(control de molde negativo) garantiza que los cebadores no se recocen en
secuencias de ADN no objetivo. En algunas aplicaciones de PCR, se incluye un
control de amplificación interno que contiene un segundo conjunto de cebadores y
un objetivo no relacionado añadido a la mezcla de reacción. Alternativamente, el
control de amp cación puede ser una plantilla sintética que contenga los sitios de
unión del cebador objetivo, pero que produzca un producto más grande que el
analito objetivo. Estos controles demuestran que la reacción está funcionando
incluso si la muestra de prueba no está amplificada. Los controles de amp cación
se amplifican preferiblemente en el mismo tubo que la reacción de ensayo, aunque
es aceptable realizar el control de amp cación en una mezcla de reacción duplicada
si el control no puede distinguirse fácilmente del producto objetivo en la misma
reacción. Este tipo de control es más importante cuando los resultados de la PCR
se informan como positivos o negativos, "negativos" significa que las secuencias
objetivo no están presentes. El control de amp cación es fundamental para distinguir
entre un verdadero negativo para la muestra y una falla de amp ración (falso
negativo).
Control de la contaminación por PCR
La contaminación es un problema importante en los métodos de "tubo abierto" que
implican la amplificación y manipulación del producto de PCR. La naturaleza del
procedimiento de amplificación es tal que, en teoría, una sola molécula dará lugar a
un producto. Esto es muy preocupante en el laboratorio médico o forense, donde
los resultados pueden interpretarse en función de la presencia, ausencia, tamaño o
cantidad de un producto de PCR. Con los modernos sistemas de reactivos
diseñados para la amplifi cación robusta de especímenes difíciles, como tejidos
incrustados en parafina o muestras con un bajo número de células, el equilibrio entre
la amplificación agresiva del objetivo previsto y la evitación de una plantilla
contaminante es delicado. Por esta razón, el control de la contaminación es de suma
importancia en el diseño de un procedimiento de PCR y una configuración de
laboratorio.
Aunque el ADN genómico (por ejemplo, del cabello, la piel o los microorganismos
ambientales) es una fuente de objetivos de PCR espurios, la principal causa de
contaminación es la presencia de productos de PCR de amplificaciones anteriores.
A diferencia del ADN genómico relativamente grande y escaso, el ADN del producto
de PCR, pequeño y altamente concentrado, puede aerosolizarse cuando los tubos
están destapados y cuando el ADN amplificado se pipetea. Este producto de PCR
es una plantilla perfecta para la unión y amplificación de cebadores en una PCR
posterior utilizando los mismos cebadores. Por lo tanto, los procedimientos de
control de la contaminación se dirigen principalmente a eliminar el producto de PCR
de la reacción de configuración.
La contaminación se controla tanto física como químicamente. Físicamente, la mejor
manera de evitar el arrastre de PCR es separar físicamente las áreas de análisis
pre-PCR de las áreas de análisis post-PCR. Los laboratorios de alto rendimiento
que procesan un gran número de muestras y analizan un número limitado de
objetivos de amplificación adoptan el flujo de aire positivo, las esclusas de aire y
otras medidas más amplias. La mayoría de los laboratorios pueden separar estas
áreas asignando habitaciones separadas o usando gabinetes de aislamiento. El
equipo, incluidas las batas y los guantes de laboratorio, y los reactivos deben
dedicarse a la pre o post-PCR. Los guantes deben cambiarse si se tocan áreas
contaminadas antes de continuar con la configuración de PCR. Los artículos pueden
fluir desde el área previa a la post-PCR, pero no en la dirección opuesta al sitio, sin
descontaminación.
La luz ultravioleta (UV) se ha utilizado para descontaminar y mantener las áreas
previas a la PCR. 9 La luz ultravioleta cataliza roturas de cadena simple y doble en
el ADN que luego interferirán con la replicación. Los armarios de aislamiento están
equipados con fuentes de luz ultravioleta que se encienden durante unos 20 minutos
después de utilizar la caja. La eficacia de la luz ultravioleta puede incrementarse
mediante la adición de pso ralenas a los productos de amplificación después del
análisis. Los psoralenos se intercalan entre las bases del ADN bicatenario y, en
presencia de luz ultravioleta de onda larga, se unen lentamente a las timidinas,
uracilos y citidinas de la cadena de ADN. Los aductos voluminosos de los
psoralenos previenen la desnaturalización y la amplificación del ADN tratado.
Aunque es conveniente y eficaz para la descontaminación antimicrobiana, el
tratamiento con 10 UV puede no ser el descontaminante más eficaz para la
contaminación de ácidos nucleicos. 11-13 La eficacia del tratamiento con luz
ultravioleta para la descontaminación depende de la longitud de onda, la energía y
la distancia de la fuente de luz. El tecnólogo debe evitar la exposición de la piel o
los ojos a la luz ultravioleta, ya que la luz ultravioleta también dañará el plexiglás y
algunos plásticos, por lo que los equipos de laboratorio, incluidas las pipetas,
pueden verse afectados por la exposición prolongada. Además, el uso de luces UV
de techo para la descontaminación no es muy efi ciente para la descontaminación
del ADN de la superficie debido a la peligrosa alta intensidad (4.000 microvatios-
segundos/cm2) necesaria para dañar el ADN a las distancias que la luz tiene que
viajar desde el techo hasta la superficie del banco.
Un método eficaz para la descontaminación y preparación del espacio de trabajo es
la lejía al 10% (hipoclorito de sodio 7 mM). Limpiar con frecuencia las encimeras,
las campanas o cualquier superficie que entre en contacto con el material de la
muestra con lejía diluida o alcohol elimina la mayor parte de la contaminación del
ADN. Como práctica en el trabajo forense, antes de manipular evidencia o artículos
que entran en contacto con evidencia, los guantes se limpian con lejía y se dejan
secar al aire.
Un método enzimático de control de la contaminación es el sistema dUTP-UNG,
que implica la sustitución de dUTP por dTTP en la mezcla maestra de reactivos de
PCR, lo que resulta en la incorporación de dUTP en lugar de dTTP en el producto
de PCR. Aunque algunas enzimas polimerasas pueden ser más o menos eficientes
en la incorporación del nucleotido, la dUTP no afecta al producto de PCR en la
mayoría de las aplicaciones. Al comienzo de cada PCR, la enzima uracil-N-
glicosilasa (UNG) se añade a la mezcla de reacción. Esta enzima degradará
cualquier ácido nucleico que contenga uracilo, como el producto de PCR
contaminante de reacciones anteriores. Al comienzo del programa de amplificación
de la PCR se añade un breve período de incubación, normalmente a 50 °C durante
2 a 15 minutos, para permitir que la enzima UNG funcione. El paso inicial de
desnaturalización en el ciclo de PCR degradará el UNG antes de la síntesis de los
nuevos productos. Tenga en cuenta que este sistema no funcionará con algunos
tipos de PCR, como la PCR anidada (que se analiza más adelante en el capítulo),
porque una segunda ronda de ampli f i cación requiere la presencia del producto de
la primera ronda. El sistema dUTP-UNG se utiliza de forma rutinaria en
procedimientos de PCR cuantitativos en los que el control de la contaminación es
esencial porque el contaminante afectará a la interpretación de la cantidad de
producto.
En algunos laboratorios se realizan pruebas de toallitas como control rutinario o para
garantizar el éxito de la descontaminación. El papel de filtro se pasa por las
superficies expuestas o tocadas en las áreas de configuración, extracción y
amplificación previas a la PCR. A continuación, el papel se coloca en un robusto
tampón de PCR con cebadores adecuados y se somete a amplificación. Cualquier
producción de amplicón indica la presencia de contaminación.

Mal cebado
Cuando se analiza el tamaño y la pureza de los productos de PCR mediante
electroforesis, el tamaño del amplicón debe coincidir con el tamaño determinado por
la colocación del cebador. Por ejemplo, si se diseñaron dos cebadores de 20 bases
para hibridar con secuencias que arrojan un objetivo de 100 pares de bases (pb), el
amplicón debería tener un tamaño de 140 pb. Cualquier amplicón más grande o
más pequeño se debería a un mal cebado, dímeros de cebador u otros artefactos
de la reacción. Para algunos procedimientos, estos artefactos no afectan a la
interpretación de los resultados y pueden ignorarse siempre que no comprometan
la efi ciencia de la reacción. Sin embargo, para otros fines, deben evitarse o
eliminarse los productos de PCR superfluos.
Los errores de cebado se evitan inicialmente mediante un buen diseño de la
imprimación y unas condiciones óptimas de amplificación. Sin embargo, incluso en
las mejores condiciones, pueden producirse errores de cebado durante la
preparación de la mezcla de reacción. Esto se debe a que la polimerasa Taq tiene
cierta actividad a temperatura ambiente. Mientras las mezclas se preparan y
transportan al termociclador, los cebadores y la plantilla están en contacto a una
temperatura de 22 °C a 25 °C, una condición de muy baja rigurosidad. En estas
condiciones, los cebadores pueden unirse a secuencias distintas de sus
complementos exactos en el objetivo, y la actividad de bajo nivel de Taq los
extenderá. Por lo tanto, estos productos mal cebados ya están presentes antes de
que comience el programa de amplificación. La PCR de arranque en caliente se
puede utilizar para evitar este tipo de cebado incorrecto
La PCR de arranque en caliente se puede realizar de tres maneras diferentes. En
un enfoque, las mezclas de reacción se preparan en hielo y se colocan en el
termociclador después de que se haya precalentado a la temperatura de
desnaturalización. Una segunda forma de realizar la PCR de arranque en caliente
se utilizó con termocicladores de modelos más antiguos que no tenían tapas
calentadas y requerían una barrera de vapor sobre cada reacción. Se colocó una
gota de cera en cada tubo de reacción que contenía todos los componentes de la
mezcla de reacción, excepto la enzima y la plantilla. Los tubos se calentaron a 100
°C para derretir la cera y luego se enfriaron a temperatura ambiente. La cera
derretida se deslizaría hasta la parte superior de la mezcla de reacción y se
congelaría en una barrera física a medida que se enfriara. A continuación, se añadió
el resto de la mezcla de reacción que contenía la plantilla y la enzima encima de la
barrera de cera. Cuando los tubos se colocaron en el termociclador, la cera se
derritió a la temperatura de desnaturalización, y los cebadores y la plantilla entraron
en contacto por primera vez a la temperatura de recocido adecuada. La cera flotante
servía entonces como barrera de evaporación a medida que avanzaba la reacción.
El tercer método, y el más utilizado, de arranque en caliente utiliza enzimas
secuestradas. Estas enzimas se suministran en forma inactiva, secuestradas e
inactificadas por anticuerpos monoclonales u otros métodos patentados. La enzima
no extenderá los cebadores hasta que se active por calor en el primer paso de
desnaturalización del programa de PCR, evitando así cualquier extensión del
cebador durante la preparación de la mezcla de reactivos.
La PCR de contacto es una modificación del programa de PCR que se utiliza para
mejorar la amplificación del producto de PCR deseado. En este método, el programa
de PCR comienza con temperaturas de recocido superiores a la temperatura
objetivo óptima de unión del cebador. La temperatura de recocido se reduce en 1
°C cada ciclo o cada dos ciclos hasta que se alcanza la temperatura óptima de
recocido. Los ciclos subsiguientes se llevan a cabo en la temperatura óptima.
Cualquier diferencia en la temperatura de recocido se traducirá en una ventaja
exponencial para la unión correcta frente a la no coincidente del cebador
Limpieza de productos PCR
Es posible que las limitaciones de secuencia en el diseño del cebador o en las
condiciones de reacción no impidan por completo la aparición de dímeros de
cebadores u otros productos superfluos. Estos amplicones no intencionados son
inaceptables para los procedimientos analíticos que exigen un producto puro, como
la secuenciación o el análisis de ciertas mutaciones. Una forma directa de obtener
un producto de PCR limpio es resolver los productos de amp cación mediante
electróforo de gel, cortar trozos del gel que contienen las bandas deseadas y eluir
el producto de PCR. Las rodajas de gel de agarosa pueden digerirse con enzimas,
como la β-agarasa, o por incubación con yodo, liberando el ADN del producto ( Fig.
6.10 )
Los componentes residuales de la mezcla de reacción, como los cebadores
sobrantes y los nucleótidos no utilizados, también interfieren con algunas
aplicaciones posteriores a la PCR. Además, los tampones utilizados para la PCR
pueden no ser compatibles con los procedimientos posteriores a la PCR. Los
amplicones libres de componentes de PCR se preparan convenientemente
utilizando columnas de centrifugación ( Fig. 6.11 ) o perlas de sílice. El ADN se une
a la columna y el resto de los componentes de la reacción se enjuagan por
centrifugación. A continuación, el ADN puede ser eluido de la columna. A pesar de
que las columnas o perlas proporcionan una mejor recuperación que la elución en
gel, es posible que no eliminen por completo las imprimaciones residuales o los
productos mal imprimados.
La adición de fosfatasa alcalina (AP) en combinación con exonucleasa I (ExoI) es
un método enzimático para eliminar nucleótidos y cebadores de los productos de
PCR antes de la secuenciación o los análisis mutacionales. Durante una incubación
de 15 a 30 minutos a 37 °C, AP desfosforila nucleótidos no incorporados y ExoI
degrada los cebadores monocatenarios. A continuación, las enzimas deben
eliminarse por extracción o inactivarse calentando a 95 °C durante 5 minutos. Este
método es conveniente porque se realiza en el mismo tubo que la PCR. Sin
embargo, no elimina otros componentes del búfer.
En algunos métodos posteriores a la PCR, se añade una cantidad tan pequeña de
producto de PCR a la siguiente reacción que los componentes residuales de la ampr
cación no tienen consecuencia, por lo que no es necesario limpiar más el producto
de PCR. La elección del procedimiento de limpieza o si la limpieza es necesaria
dependerá de la aplicación posterior a la PCR.
Modificaciones de PCR
La PCR se ha adaptado para diversas aplicaciones, varias de las cuales se utilizan
en el laboratorio médico. Entre el gran y creciente número de modificaciones de la
PCR se encuentran los siguientes métodos que se pueden encontrar en el
laboratorio clínico molecular. Estos métodos son capaces de detectar múltiples
dianas en una sola ejecución (PCR multiplex) utilizando plantillas de ARN (PCR con
transcriptasa inversa) o productos amplificados como plantillas (PCR anidada) y
cuantificar la plantilla de partida (PCR cuantitativa).
PCR multiplexada
Se puede añadir más de un par de cebadores a una PCR para que se ceben
simultáneamente varias amplificaciones, lo que da lugar a la formación de múltiples
productos. La PCR multiplex es especialmente útil en la tipificación o identificación
de anales. Los organismos individuales, desde los virus hasta los seres humanos,
pueden identificarse o tipificarse observando un conjunto de varios productos de
PCR a la vez. Los kits de tipificación de patógenos e identificación forense contienen
múltiples conjuntos de cebadores que amplifican las regiones polimórficas del ADN.
El patrón de tamaños de productos será específi co para un tipo o individuo
determinado.
Múltiples organismos han sido objeto de PCR multiplex en laboratorios de
microbiología clínica. 16,17 Una muestra respiratoria, por ejemplo, puede utilizarse
para detectar la presencia de más de un virus respiratorio. 18 En un enfoque
ligeramente diferente de las pruebas para múltiples objetivos, un conjunto de
cebadores puede detectar un organismo infeccioso, y un segundo conjunto puede
detectar la presencia de un gen que hace que ese organismo sea resistente a un
agente antimicrobiano en particular. Los reactivos y las condiciones de PCR
multiplex requieren una optimización más compleja. Es posible que las secuencias
diana no se amplifiquen con la misma eficiencia, y que los cebadores interfieran
entre sí en la unión a las secuencias diana. Las condiciones para la PCR deben
ajustarse para la amplificación óptima de todos los productos en la reacción. La
multiplexación de cebadores es útil no solo para detectar múltiples objetivos, sino
también para confi rmar una detección precisa de un solo objetivo. Los controles de
amplificación interna a menudo se multiplexan con reacciones de prueba que se
interpretan por la presencia o ausencia de producto. Los cebadores y objetivos de
control deben elegirse de manera que no interfieran ni compitan con la amplificación
de la región de prueba. Los controles de amp cación interna son ideales para las
pruebas de PCR cualitativas positivas/negativas.
PCR específica de secuencia
El estricto requisito de complementariedad del extremo 3' de los cebadores se
puede utilizar para identificar cambios de una sola base en el ADN objetivo. Al
diseñar el cebador directo o inverso para que termine con una base complementaria
de 3 pies a la secuencia mutante, la presencia del cambio de base se detecta
mediante una amplificación exitosa. Aunque este método se utiliza con frecuencia
en el laboratorio médico para detectar cambios en la base del ADN del paciente, su
alta sensibilidad corre el riesgo de detectar mutaciones a niveles muy bajos que
pueden no ser clínicamente significativos. 19 La PCR específi ca en secuencia es
uno de los métodos de análisis de alelos de antígenos leucocitarios humanos en la
tipificación de tejidos.
PCR con transcriptasa inversa
Si el material de partida para un procedimiento es ARN, el ARN puede convertirse
primero en ADN bicatenario, que es un mejor molde para la amplificación que el
ARN monocatenario. La conversión se lleva a cabo a través de la acción de la
transcriptasa inversa (RT), una enzima aislada de los virus de ARN. Esta enzima
primero copia la cadena única de ARN en un híbrido ARN:ADN y luego utiliza una
formación de horquilla en el extremo de la hebra de ADN recién sintetizada para
cebar la síntesis de la hebra de ADN complementaria, reemplazando el ARN original
en el híbrido. El ADN bicatenario resultante es ADN copiado o complementario
(ADNc).
Al igual que otras ADN polimerasas, la transcriptasa inversa requiere cebado. Los
cebadores dirigidos a genes (cebadores de oligo dT o hexámeros aleatorios) se
utilizan con mayor frecuencia para cebar la síntesis de la cadena de ADN inicial. El
rendimiento de ADNc será relativamente bajo utilizando cebadores dirigidos a
genes, pero muy específi co para el objetivo de interés. Los cebadores específi cos
cebarán la síntesis de ADNc solo a partir de transcripciones complementarias a las
secuencias de cebadores. Los cebadores Oligo dT son secuencias de poliT
monocatenaria de 18 bases de largo que prepararán la síntesis de ADNc solo a
partir de ARN con colas de poliA (ARNm y algunos ARN no codificantes). El
rendimiento de ADNc será mayor con los cebadores oligo dT que con los cebadores
específi cos objetivo, ya que potencialmente todo el ARN poliA podría incluirse en la
muestra. El mayor rendimiento de ADNc se logra con hexámeros o decámeros
aleatorios. Se trata de oligonucleótidos sinhebrados de 6 o 10 bases de longitud con
secuencias aleatorias. Las 6 o 10 bases coincidirán e hibridarán en sitios aleatorios
en el ARN objetivo con cierta frecuencia, preparando la síntesis de ADN. El cebado
aleatorio generará ADNc a partir de todo el ARN de la muestra.
La RT PCR se utiliza para medir los perfiles de expresión de ARN, para detectar
ARNr, para analizar regiones génicas interrumpidas por intrones largos y para
detectar microorganismos con genomas de ARN. Para el análisis de la expresión
génica, la cantidad de ADNc refl eja la cantidad de transcripción en la preparación.
En otras aplicaciones, los genes que son interrumpidos por intrones largos pueden
estar más disponibles para una amplificación consistente utilizando versiones de
ADNc que carecen de las secuencias interconectadas. El ADNc se utiliza a menudo
para secuenciar porque la secuencia de la región codificante puede determinarse
sin largos tramos de intrones que puedan complicar el análisis. Originalmente, la RT
PCR se realizaba en dos etapas: síntesis de ADNc y luego PCR. La ADN polimerasa
Tth, que tiene actividad RT, y las mezclas propietarias de RT y ADN polimerasa
secuestrada (de arranque en caliente) son componentes de los procedimientos de
PCR RT de un solo paso. 20 Estos métodos son más convenientes que el
procedimiento de dos pasos porque el ARN se agrega directamente a la PCR. El
programa de amplificación se modifica para incluir una incubación inicial de 45 °C a
50 °C durante 30 a 60 minutos, durante los cuales RT produce ADNc a partir del
ARN de la muestra. A continuación, se inactivará la actividad RT y se activará la
ADN polimerasa en el primer paso de desnaturalización del procedimiento de PCR.
Aunque la RT PCR es un complemento importante y ampliamente utilizado para el
análisis molecular, está sujeto a las capacidades vulnerables de la degradación del
ARN. Al igual que con otros procedimientos que se dirigen al ARN, el manejo de la
muestra es importante para obtener resultados precisos. 21 Se han descrito
métodos para la amplificación de RT PCR de especímenes difíciles, como tejidos
incrustados en parafina; Sin embargo, los especímenes fi jados son difíciles de
analizar de manera consistente.
PCR anidada
El aumento de la sensibilidad que ofrece la PCR es muy útil en aplicaciones clínicas,
ya que las muestras clínicas suelen ser limitadas en cantidad y calidad. Los bajos
niveles de diana y la presencia de secuencias interferentes pueden impedir que una
PCR regular funcione con la fiabilidad necesaria para las aplicaciones clínicas. La
PCR anidada es una modificación que aumenta la sensibilidad y la especificidad de
la reacción.
En la PCR anidada, se utilizan dos pares de cebadores para amplificar un solo
objetivo en dos ejecuciones de PCR separadas. El segundo par de cebadores,
diseñados para unirse ligeramente dentro de los sitios de unión del primer par,
amplificará el producto de la primera PCR en una segunda ronda de amplificación.
La segunda amp cación aumentará específi camente la cantidad del producto
previsto. En la PCR semianidada, uno de los cebadores de segunda ronda es el
mismo que el cebador de primera ronda ( Fig. 6.12 ).
Se han ideado varias variaciones de PCR anidada y semianidada. Por ejemplo,
como se muestra en la Figura 6.12, los cebadores de primera ronda pueden tener
secuencias de 5' añadidas (5' colas) complementarias a las secuencias utilizadas
para los cebadores de segunda ronda. Este método de cebadores con cola es
valioso para procedimientos multiplex en los que varios cebadores de primera ronda
pueden diferir en sus efi cinas de unión. Con los cebadores de cola, se añaden
secuencias complementarias a un solo conjunto de cebadores de segunda ronda a
todos los productos de primera ronda. En la segunda ronda, entonces, todos los
productos se amplificarán con los mismos cebadores. Aunque este procedimiento
de cebador con cola aumenta la sensibilidad en las reacciones multiplex, no
aumenta la especificidad.
PCR cuantitativa en tiempo real
Los procedimientos estándar de PCR indicarán si una secuencia diana concreta
está presente en una muestra clínica. Sin embargo, en algunas situaciones, el
clínico también está interesado en la cantidad de la secuencia diana que está
presente. Inicialmente, hubo varios enfoques para estimar la cantidad de plantilla
inicial a través de PCR. Sin embargo, la naturaleza de la amp cación hacía complejo
el cálculo de cantidades directas de material de partida. Las estrategias para
cuantificar el material de partida mediante la cuantificación de los productos finales
de las PCR utilizaron controles internos especializados, es decir, cantidades
conocidas de material de partida que se coamplificaron con la plantilla de prueba.
Sin embargo, estos tipos de ensayos adolecían de incompatibilidades de cebadores
y resultados inconsistentes. Otro enfoque consistió en añadir placas de temperatura
de la competencia en varios niveles conocidos para evaluar la cantidad de material
de prueba mediante una amplificación preferencial sobre una cantidad conocida de
competidores. 25 Estos ensayos también eran poco fiables e inconsistentes cuando
las placas de prueba y de control interno diferían en más de 10 veces. Fueron más
precisos con una proporción de 1:1 de prueba y control interno, lo que requirió el
análisis de múltiples diluciones de controles para obtener resultados óptimos.
Una modificación muy útil del proceso de PCR es la PCR en tiempo real o
cuantitativa (qPCR). 26,27 Este método se realizó por primera vez mediante la
adición de bromuro de etidio (EtBr) a una PCR estándar. Debido a que EtBr se
intercala en ADN bicatenario y fl uoresces, rastrea la acumulación de productos de
PCR durante la PCR en tiempo real, es decir, a medida que se produce. La fl
uorescencia detectable en ciclos anteriores del programa de amp cación indica
cantidades más altas de plantilla inicial, mientras que la fl uorescencia que aparece
en ciclos posteriores indica cantidades más bajas de plantilla inicial. Este método
refl eja con mayor precisión la cantidad de plantilla inicial. Además, las mediciones
cuantitativas se realizan con la facilidad y rapidez de una PCR estándar sin la
adición de plantillas de la competencia o múltiples controles internos. La justificación
de la qPCR se ilustra en la figura 6.13 . La representación gráfica de los ciclos de
PCR (desnaturalización, recocido, extensión) en el eje x frente a la frecuencia
generada (eje y) produce una curva exponencial en la que el número de copias = 2
N , siendo N el número de ciclos de PCR. La curva se parece a una curva de
crecimiento bacteriano, con una fase de retraso, una fase exponencial (logarítmica),
una fase lineal y una fase estacionaria.
El agotamiento de los componentes de la reacción y la competencia entre el
producto de PCR y los cebadores durante la etapa de recocido ralentizan la
acumulación del producto de PCR después de la fase exponencial de crecimiento
hasta que finalmente se estabiliza. A diferencia de la qPCR, el análisis del producto
de PCR por el método estándar se produce al final de la fase de la estación de PCR
(análisis de punto final). En el análisis de punto final, se prueban productos de
cantidades muy diferentes de placa de temperatura de partida en la meseta donde
todos son iguales (observe los extremos de las curvas de amplificación que se
muestran en la Fig. 6.13A). Utilizando la señal fl uorescente para detectar el
creciente número de copias objetivo durante el proceso de amplificación, el análisis
en qPCR se realiza en la fase expositivo de crecimiento. Debido a que la duración
de la fase de retraso es inversamente proporcional a la cantidad de plantilla inicial,
la fl uorescencia alcanzará un crecimiento exponencial en los primeros ciclos
cuando hay una gran cantidad de objetivo presente; Cuando hay menos objetivos,
la fl uorescencia no alcanzará un crecimiento exponencial hasta ciclos posteriores.
Con diluciones de plegamiento en serie de patrones positivos conocidos, se puede
establecer una relación entre la copia objetivo inicial o el número de celda y el
número de ciclo en el que la fl uorescencia cruza una cantidad umbral de fl
uorescencia.
El ciclo de PCR en el que la fl uorescencia de la muestra cruza el umbral es el ciclo
umbral, o C T . Al trazar el número de copias objetivo de los patrones diluidos con
respecto a C T para cada estándar, se genera el gráfico que se muestra en la Figura
6.13B. Una vez establecida esta relación, la cantidad inicial de un espécimen
desconocido puede determinarse por el número de ciclo en el que el desconocido
cruza el umbral de fl uorescencia. Este método se aplica a la cuantificación de
dianas de ADN (qPCR) y dianas de ARN en qPCR con transcriptasa inversa (RT-
qPCR). La plantilla para RT-qPCR es el ADNc.
El primer enfoque de la qPCR utilizó EtBr, que es específi co para el ADN
bicatenario. El colorante todavía se usa para la qPCR de rutina, excepto que EtBr
ha sido reemplazado por SYBR green, otro colorante específi co para el ADN
bicatenario. La ventaja de SYBR green es su especificidad y robusta fl uorescencia
comparable a la del EtBr y su reducida toxicidad. Ambos colorantes se unen y brillan
específicamente en el producto de ADN bicatenario de la PCR ( Fig. 6.14 ).
El uso de colorantes no específi cos para medir la acumulación de producto requiere
una PCR limpia, libre de dímeros de imprimación y cebadores inadecuados, ya que
estos productos artefactos también generarán fl uorescencia. Se han ideado
sistemas más específi cos, de los que se describen ejemplos más adelante en el
capítulo, que utilizan sondas diseñadas para generar fl uorescencia. Las sondas
aumentan la especificidad al producir fl uorescencia solo cuando se hibridan con las
secuencias objetivo.
TaqMan se desarrolló a partir de uno de los primeros sistemas basados en sondas
para cuantificar el ADNc mediante qPCR. 28 Este método explota la actividad
natural de la exonucleasa de 5' a 3' de la polimerasa Taq para generar una señal.
Una versión temprana del método reportada por Holland et al. utilizó una sonda
marcada radiactivamente y midió la actividad mediante la liberación de fragmentos
de escisión radiactiva. 29 El procedimiento TaqMan mide la señal fl uorescente
generada por la separación del colorante fl uorescente y el extintor, un sistema
desarrollado por Lee et al. que utilizaba una sonda compuesta por un
oligonucleótido de ADN monocatenario complementario a una secuencia específi ca
en la región objetivo de la plantilla de PCR. 30 La sonda está presente en la mezcla
de reacción, además de los cebadores específi cos que preparan la reacción de
síntesis de ADN. La sonda se modifica químicamente en su extremo de 3 pies para
que no pueda ser extendida por la polimerasa. La sonda TaqMan de ADN
monocatenario se une covalentemente a un tinte fl uorescente en el extremo 5 ′ y a
otro tinte o molécula no fl uorescente que extrae la energía centenal del tinte 5′
(extinguidor) en el extremo 3 ′ 31 ( Fig. 6.15 ).
A medida que la polimerasa procede a sintetizar ADN en la plantilla con la que se
hibrida la sonda, la actividad natural de la exonucleasa de la polimerasa Taq
degradará la sonda en mononucleótidos y oligonucleótidos, eliminando así el
nucleótido marcado de las proximidades del extinguidor y permitiendo que fluya (
Fig. 6.16 ). El exceso de sonda está presente, de modo que con cada duplicación
de las secuencias objetivo, más sonda se une y se digiere, y se genera más f l
uorescencia. El diseño de la sonda, al igual que el diseño del cebador, es importante
para el éxito de la amplificación de la qPCR, al igual que las características de la
enzima polimerasa
El extremo de 5 ′ de una sonda TaqMan está marcado con uno de una serie de tintes
con diferentes "colores" o longitudes de onda de emisión máxima, de fl uorescencia,
por ejemplo, FAM (6-carboxifl uoresceína), TET (6-tetracloroofl u oresceína), HEX
(6-hexaclorofeluescea), JOE (4 ′ , 5 ′ -dicloro-2′ , 7 ′ -dimetoxi-flu uoresceína), Cy3 y
Cy5 (indocarbocianina). La sonda se une covalentemente en el extremo 3 'con un
extintor, como DABCYL (ácido 4-dimetilaminofenilazobenzoico) o TAMRA ([56]-
carboxitetrametilrodamina), o extintores de ciento no flotantes, como BHQ1, BHQ2
(extintores de agujeros negros) y Eclipse. En el sistema TaqMan, el extintor evita la
fl uorescencia del tinte de 5' hasta que se separan durante la reacción de síntesis.
A medida que se acumulan más copias de la plantilla, se acumula más del tinte de
5 'en todo el programa de reacción.
Otro sistema de detección basado en sondas, Molecu lar Beacons, mide la
acumulación de producto en la etapa de recocido en el ciclo de PCR. 33 La señal
de las balizas moleculares es detectable solo cuando las sondas se unen a la
plantilla antes de ser desplazadas por la polimerasa. En este caso, la sonda se
modifica químicamente para que no se degrade durante el paso de extensión. Las
balizas molec ulares están diseñadas con una secuencia de unión específi ca
objetivo de aproximadamente 25 bases fl anadas por una repetición invertida corta
de aproximadamente 5 bases de largo que formará una estructura de vástago y
bucle cuando la sonda no esté unida a la plantilla. Hay un fl uróforo reportero (tinte)
en el extremo 5' del oligómero y un extintor, en el extremo 3'. Hasta que el producto
específi co esté presente, la sonda formará una estructura de horquilla que acercará
el flotador al extinguidor ( Fig. 6.17 ). Se producirá fluorescencia en la unión de la
sonda a la plantilla desnaturalizada durante el paso de recocido ( Fig. 6.18 ). Cuando
los cebadores se extienden en la PCR, el desplazamiento de la sonda por Taq
restaurará la estructura de horquilla (no fl uorescente). El exceso de sonda en la
mezcla de reacción asegurará la unión a la cantidad creciente de objetivo. Por lo
tanto, la cantidad de fl uorescencia será directamente proporcional a la cantidad de
plantilla disponible para la encuadernación e inversamente proporcional al C T .
Los cebadores de tipo Escorpión son una variación de las balizas moleculares.
34,35 A diferencia de las sondas marcadas libremente, el producto de PCR se unirá
covalentemente al tinte. En este sistema, los cebadores específi cos de objetivo se
sitúan en el extremo de 5 ′ con una secuencia complementaria a parte de la
secuencia de cebadores internos, un enfriador, una estructura de bucle de vástago
y un flotador de 5 ′ (Fig. 6.19). El fl uróforo y el extintorador están colocados de
manera que se yuxtaponen cuando la horquilla de la imprimación está intacta.
Después de la polimerización, la estructura secundaria del cebador se supera
mediante la hibridación de la secuencia del cebador con la secuencia objetivo,
eliminando el fl uróforo del extintor. Este sistema intramolecular genera una señal
más rápida que la estrategia de baliza molecular intermolecular y puede ser
preferido para métodos que requieren condiciones de ciclo rápido. 36 Los
escorpiones también producen un producto de PCR que se marca covalentemente
con el fl uróforo y que puede analizarse más a fondo mediante electroforesis capilar.
Otro sistema utilizado con frecuencia, la transferencia de energía de reso nanancia
fl uorescente (FRET), utiliza dos sondas específi cas, una con un flot de 3′ (aceptor)
y la otra con un catalizador de 5′ para la fl uorescencia (donante), que se unen a
objetivos adyacentes. 37 Ejemplos de pares donante-aceptor de uso frecuente son
fl uoresceína-rodamina, f l uoresceína-(2 aminopurina) y fl uoresceína-Cy5. Cuando
el donante y el aceptor se acercan a 1 a 10 nm (1 a 5 bases) a través de la unión
específica del ADN, la energía de excitación se transfiere del donante al aceptor
(Fig. 6.20). A continuación, el aceptor pierde la energía en forma de calor o emisión
de fl uorescencia. Al igual que con las balizas moleculares, cuanta más plantilla esté
disponible para la unión de las sondas, más fl uorescencia se generará. La PCR
cuantitativa se presta a varias variaciones de la técnica, como se ha ejemplificado
anteriormente. Estas técnicas pueden modificarse aún más, por ejemplo, utilizando
sondas FRET con diferentes secuencias para distinguir tipos de organismos o para
detectar mutaciones. Las sondas FRET también forman parte de métodos que
utilizan curvas de fusión para detectar mutaciones genéticas. Al igual que con la
PCR estándar, muchos de estos métodos se han ideado para una variedad de
aplicaciones.
Sistemas de amplificación basados en transcripción
En un sistema de amplificación (TAS) basado en transcripción, el ARN es el objetivo
habitual en lugar del ADN. Se sintetiza una copia de ADN a partir del ARN objetivo,
y luego la transcripción del ADN produce millones de copias de ARN. Hay una serie
de variaciones de nombres comerciales de este proceso: amplificación mediada por
transcripción (TMA), amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos
(NASBA) y replicación de secuencias autosostenidas (3SR).
Kwoh y sus colegas desarrollaron el primer TAS en 1989. 40 El TAS difiere de otros
procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos en que el ARN es tanto el
objetivo como el producto primario. En el método original de TAS, se agrega a una
muestra de ARN objetivo un cebador que lleva el sitio de unión para la ARN
polimerasa en su extremo 5 'y complementario a las secuencias en el ARN objetivo.
El cebador se recoce y la transcriptasa inversa produce una copia de ADN del ARN
diana. El calor se utiliza para desnaturalizar el híbrido de ARN y ADN, y un segundo
cebador se une al ADNc y se extiende mediante transcriptasa inversa, produciendo
ADN bicatenario. La ARN polimerasa derivada del bacteriófago T7 transcribe a
continuación, el ADNc, produciendo cientos de miles de copias de ARN. El ARN tran
scrito puede servir como ARN diana al que se unen los cebadores y sintetizan más
ADNc.
El procedimiento TAS original, tal como se acaba de describir, tenía la desventaja
de que se requería un paso de calentamiento para desnaturalizar el producto híbrido
intermedio ARN:ADN. El calor también desnaturalizaba las enzimas, de modo que
había que añadir una enzima fresca después de cada paso de desnaturalización. El
proceso se simplificó con la adición de RNasa H derivada de E. coli ( Fig. 6.21 ). La
RNasa H degrada el ARN del híbrido intermedio, eliminando el paso de
calentamiento. Por lo tanto, después de la síntesis de la copia de ADN por
transcripción inversa, la cadena de ARN es degradada por la ARNasa H. La unión
del segundo cebador y la extensión del cebador, produciendo ADN bicatenario por
transcriptasa inversa, es seguida por la transcripción del ADNc con la ARN
polimerasa T7 ( Fig. 6.22 ).
Una modificación y simplificación adicional del procedimiento se produjo con el
descubrimiento de que la transcriptasa inversa derivada del virus de la
mieloblastosis aviar (AMV) tiene una actividad inherente de la RNasa H. Por lo tanto,
TAS se puede ejecutar con solo dos enzimas, la tran scriptasa inversa AMV y la
ARN polimerasa T7.
La TAS tiene algunas ventajas sobre la PCR y otros procedimientos de ampli f i
cación. En primer lugar, a diferencia de la PCR, el TAS es un proceso isotérmico,
que anula la necesidad de ciclos térmicos y enzimas termoestables para impulsar
las reacciones. En segundo lugar, la focalización del ARN permite la detección
directa de virus de ARN, por ejemplo, el virus de la hepatitis C y el virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH). Incluso dirigirse al ARN de organismos con
genomas de ADN, como Mycobacte rium tuberculosis, es más sensible que dirigirse
al ADN porque cada bacteria, por ejemplo, tiene múltiples copias de ARN, mientras
que solo tiene una copia de ADN.
La TMA, al igual que la NASBA, también puede comenzar con un objetivo de ADN.
41 Para el ADN, la muestra se calienta para desnaturalizar el ADN, y el primer
cebador se recocía y se extiende mediante transcriptasa inversa (que también tiene
actividad de ADN polimerasa dependiente de ADN, además de tener actividad de
ADN polimerasa dependiente de ARN). Se retira la hebra de ARN y el segundo
cebador se une y se extiende. El producto de ADN también ha incorporado el sitio
de unión de la ARN polimerasa T7, que se encuentra en el extremo 5 'del primer
cebador. Por lo tanto, la ARN polimerasa T7 transcribe el ADN recién replicado en
cientos de miles de copias de ARN. La detección de M. tuberculosis en muestras
respiratorias con baciloscopia positiva, Chlamydia trachomatis en muestras
genitales y la citación de la cantidad de VIH y citomegalovirus (CMV) en sangre son
algunas de las primeras aplicaciones de la TAS.
Métodos de amplificación genómica
Además de la amplificación de genes individuales o transcripciones, se han ideado
métodos para amplificar todas las regiones del ADN de entrada, o genomas
completos. Los métodos de amplificación del genoma completo (WGA, por sus
siglas en inglés) están diseñados para estudiar todos los genes o transcripciones
de un organismo con el fin de tipificar microorganismos o detectar lesiones
genéticas particulares a partir de muestras limitantes. La ampr cación genómica
difiere de los métodos de amp cación estándar en que los cebadores utilizados no
son complementarios a regiones genéticas específi cas; más bien, la replicación se
inicia en sitios aleatorios a lo largo del ácido nucleico de entrada ( Fig. 6.23 ).
La amplificación genómica proporciona la capacidad de generar una gran cantidad
de información a partir de una cantidad muy pequeña de material de partida.
Especialmente en las muestras biológicas, el ácido nucleico objetivo no siempre
está limpio, accesible o en cantidades óptimas para análisis complejos, como los
métodos de secuenciación o microarrays. Los siguientes métodos son enfoques de
la amplificación genómica aplicados a la tipificación de microorganismos y la
generación de múltiples copias genómicas para estudios genéticos.
Amplificación del genoma completo
La WGA se puede realizar utilizando cebadores degenerativos que preparan la
síntesis aleatoria en todo el genoma objetivo o por traducción de nicks. Los
cebadores degenerativos son secuencias sintéticas de ADN monocatenario que
varían con cierta frecuencia en cada posición en la que N = A, T, G o C. En la
preamplificación de extensión de cebador (PEP), esta variación ocurre a lo largo del
cebador: N 15-16 . En la amplificación degenerativa del cebador de oligonucleótidos
(DOP), las secuencias variables son fl anadas por una secuencia muy repetida en
el ADN fuente, por ejemplo, para el ADN humano: CCGACTCGAGN 6 ATGTGG. En
la PCR marcada (T-PCR), los cebadores tienen una secuencia de 5'
complementaria al ADN repetitivo seguida de una secuencia aleatoria de longitud
variable: CTCACTCTCAN X.
Alternativamente, la amplificación del genoma completo se puede lograr mediante
la introducción de roturas o muescas de una sola cadena en el ADN genómico, con
la amplificación cebada por secuencias aleatorias cortas (hexámeros) o los
extremos 3' de las roturas. 43 Se trata de una amp cación de desplazamiento
múltiple porque se produce la eliminación o desnaturalización del ADN bicatenario
a medida que avanza la extensión. La amplificación se realiza utilizando la ADN
polimerasa Phi29, una enzima altamente procesiva, que puede desplazar y copiar
miles de bases sin perder el contacto con la plantilla.
WGA tiene múltiples aplicaciones, incluyendo matrices genómicas comparativas,
detección de polimorfismos de un solo nucleótido y análisis de material de partida
mínimo, como el ADN en plasma, el análisis de una sola célula y muestras de ADN
antiguo.
Emulsión PCR
La PCR en emulsión está diseñada para amplificar simultáneamente miles de
plantillas específi cas en una sola reacción, produciendo un conjunto de productos
específi cos o biblioteca. 44 En este método, los extremos del ADN molde
fragmentado se ligan a secuencias de cebadores universales y, junto con los demás
componentes de la reacción de PCR (tampón, enzima polimerasa, cebadores
directos e inversos, dNTP), se añaden a una mezcla de surfactante de aceite (Span
80, Tween 80, Triton X-100 y aceite mineral; Figura 6.24 ). Con el anillo de agitación,
una emulsión se forma de 1 a 10 mil millones de gotas, cada una de las cuales
puede contener una sola plantilla en un pequeño volumen de tampón de reacción.
Cuando la emulsión se somete a un programa de amplificación, las gotas actuarán
como cámaras de reacción únicas produciendo muchas copias de una secuencia
específi ca. Después de la amplificación, la emulsión se rompe. Los productos
agrupados se utilizan para una variedad de aplicaciones de estudio genómico, como
secuenciación, estudios de matrices, haplotipado o detección de mutaciones raras.
La PCR en emulsión en fase sólida se desarrolló para la secuenciación de próxima
generación y otras tecnologías de alto rendimiento que han impulsado el desarrollo
de tecnologías de PCR de igual alto rendimiento. En este método, las plantillas
ligadas a una secuencia de cebadores universal se mezclan con cebadores
inmovilizados con perlas y otros componentes de reacción en la emulsión de agua
en aceite ( Fig. 6.25 ). Lo ideal sería que las gotas acuosas en el aceite capturaran
una sola plantilla y una sola gota acoplada al cebador. Durante la reacción de PCR,
los cebadores se extienden, produciendo una copia de doble cadena a partir de la
plantilla adherida al cordón. Cuando se rompe la emulsión, los productos de PCR
se desnaturalizan, lavando la hebra complementaria y dejando las plantillas de
secuenciación monocatenaria unidas a las cuentas. A continuación, estas plantillas
pueden someterse a tecnologías de secuenciación paralela masiva (de próxima
generación).
Amplificación de superficie (PCR puente)
La amplificación de superficie es un método de PCR isotérmico y genómico utilizado
en tecnologías de secuenciación de alto rendimiento. En este método, los
cebadores directos e inversos se inmovilizan sobre un soporte sólido en una celda
de flujo ( Fig. 6.26 ). La plantilla fragmentada o preamplificada se desnaturaliza, y
las hebras individuales complementarias a los cebadores inmovilizados se recocen
bajo condiciones de tampón no desnaturalizantes. Después de la extensión del
cebador, se introducen condiciones desnaturalizantes mediante la adición de
formamida a la mezcla de reacción. A continuación, la plantilla y los componentes
de reacción se retiran mediante lavado, y las condiciones de recocido se restablecen
químicamente, permitiendo que la copia adjunta de la plantilla se recoche en la
imprimación inversa inmobilizada. El cebador inverso se extiende, formando un
puente entre los dos cebadores inmovilizados. El proceso se repite durante 35
ciclos, produciendo aproximadamente 1.000 copias de la secuencia de plantillas en
una pequeña región de la superficie. A continuación, los puentes bicatenarios se
desnaturalizan, dando lugar a un clon localizado o polonía de moléculas
complementarias monocatenarias. Para evitar el recocido, un sitio escindible
ubicado en un cebador (ya sea hacia adelante o hacia atrás) permite la eliminación
de uno de los complementos ( Fig. 6.27 ). Para las aplicaciones de secuencias de
ADN, la hebra restante se bloquea químicamente en el extremo libre 3' utilizando
ADN transferasa terminal y una molécula de didesoxinucleótido que no se puede
extender. A continuación, el cebador de secuenciación se recocía en la plantilla para
su secuenciación.
PCR con cebado arbritraly
En la PCR cebada arbitrariamente, también conocida como ADN polimórfico
amplificado aleatoriamente o amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD), se
utilizan cebadores cortos (de 10 a 15 bases) con secuencias aleatorias para
amplificar regiones arbitrariales en el ADN genómico en condiciones de baja
rigurosidad. 45,46 Con este método, los productos de PCR se generan sin conocer
la secuencia de la diana o se dirigen a un gen específi co. A diferencia de la PCR
estándar, en la que sólo se generan uno o unos pocos productos conocidos, se
generan múltiples productos en función del número de veces que aparece una
secuencia corta en el genoma ( Fig. 6.27 ). La PCR precebada arbitrariamente se
ha utilizado principalmente en la tipificación epidemiológica de microorganismos.
Los patrones de bandas similares obtenidos al realizar PCR con los mismos
cebadores arbitrarios indican que dos organismos son iguales o similares. Una
desventaja de este método, sin embargo, es que la reproducibilidad entre tiradas no
es muy buena, de modo que dos organismos que tenían el mismo patrón de
producto de PCR en un día podrían tener dos patrones diferentes y parecer dos
organismos diferentes cuando se amplifican en otro día. Otros métodos, como la
espectrometría de masas y la secuenciación de ARNr, proporcionan resultados de
tipificación más reproducibles; sin embargo, RAPD ofrece una alternativa
relativamente económica.
Amplificación de la sonda
En los procedimientos de amplificación de sondas, el número de secuencias de
ácido nucleico objetivo en una muestra no cambia. Más bien, las sondas sintéticas
que son específi cas para las secuencias objetivo se unen al objetivo donde se
amplifican las sondas. Hay tres procedimientos principales que implican la
amplificación de las secuencias de la sonda: la reacción en cadena de la ligasa
(LCR), la amplificación del desplazamiento de la hebra (SDA) y la replicación de la
β Q.
Reacción en cadena de la ligasa
LCR fue un método para amplificar cebadores/sondas sintéticas complementarios
al ácido nucleico objetivo. Al igual que en la PCR, había que conocer toda la
secuencia diana para preparar los cebadores de oligonucleótidos para la LCR. En
la PCR, existe una distancia entre los cebadores de cientos a miles de bases que
forman parte de la secuencia amplificada. En LCR, por el contrario, los cebadores
están unidos inmediatamente adyacentes entre sí. En lugar de que la ADN
polimerasa sintetizara el ADN complementario extendiendo los cebadores como
ocurre en la PCR, la ADN ligasa se utilizó en la LCR para ligar los cebadores
adyacentes. Los cebadores ligados sirvieron como plantilla para el recocido y la
ligadura de cebadores adicionales. Debido a que el producto de LCR era un cebador
ligado, LCR era un método de ampr cación de sonda en lugar de amplificación de
diana porque el número de copias de las moléculas diana no cambiaba.
LCR requería un termociclador para cambiar la temperatura y provocar las
diferentes reacciones. En LCR, la reacción se calentó para desnaturalizar la
plantilla. Cuando se enfrió la temperatura, los cebadores se recocieron si la
secuencia complementaria estaba presente, y una ligasa termoestable unió los dos
cebadores ( Fig. 6.28 ). Incluso un desajuste de 1 pb en el punto de ligadura impidió
la ligadura de los cebadores. El LCR se utilizó para detectar mutaciones puntuales
en una secuencia diana. La mutación del ADN que se produce en la beta globulina
de los pacientes con anemia de células falciformes, en comparación con la beta
globulina normal, fue una de las primeras aplicaciones de la LCR. 47 El LCR en el
laboratorio clínico ha sido reemplazado en su mayoría por otros métodos; sin
embargo, se han propuesto nuevas aplicaciones de la tecnología utilizando FRET
para la detección de cambios en el ADN de un solo nucleótido, 48 cuantificación de
ARN, 49 y análisis de metilación del ADN.
Amplificación de desplazamiento de hebra
La amplifi cación por desplazamiento de hebra (SDA) es un proceso de amp cación
de isotermas; es decir, después de una etapa inicial de dena turación, la reacción
se produce a una temperatura En SDA, los principales productos de amp cación son
las sondas. Hay dos etapas en el proceso de SDA. En la primera etapa (generación
de objetivos), el ADN objetivo se desnaturaliza calentándolo a 95 °C. En cada
extremo de la secuencia objetivo, dos cebadores se unen entre sí, un cebador
exterior y otro interior ( Fig. 6.29 ). Los cebadores internos tienen una cola de 5 'que
contiene una secuencia de reconocimiento para la enzima endonucleasa retricción,
Hinc II. La ADN polimerasa defi ciente con exonucleasa derivada de la ADN
polimerasa I de E. coli extiende todos los cebadores, incorporando un nucleótido
modificado, 2 ′ -desoxiadenosina 5 ′ -O-(1-tiotrifosfato) (dATPaS), en la mezcla de
nucleótidos. A medida que se extienden las imprimaciones exteriores, desplazan los
productos formados por la extensión de las imprimaciones interiores. A
continuación, un segundo conjunto de cebadores exterior e interior se une a los
productos de cebadores internos desplazados, y la ADN polimerasa extiende los
cebadores completos, produciendo cuatro productos bicatenarios (sondas). Estas
sondas son el ADN objetivo para la siguiente etapa del proceso.
La segunda etapa de la reacción es la fase de amplificación exponencial de la sonda
utilizando Hinc II ( Fig. 6.30 ). Cuando la enzima de restricción se agrega al ADN de
la sonda de doble cadena, solo se cortará una hebra de la sonda debido al dATP α
S introducido en la reacción de extensión. Esto forma una muesca en el ADN que
es extendida por la ADN polimerasa, desplazando simultáneamente las hebras
opuestas. La muesca y la extensión forman sondas monocatenarias y regeneran el
sitio de restricción. La reacción de melladura/extensión puede repetirse en la sonda
inicial, así como en las sondas generadas en la reacción. Con la reacción de corte
enzimático, el desplazamiento de la hebra no requiere la desnaturalización de las
sondas de doble cadena. Por lo tanto, el proceso iterativo tiene lugar a unos 52 °C
sin ciclos de temperatura. La adición de una sonda fl orogénica a la reacción
produce una señal fl uorescente que corresponde a la cantidad de objetivo
amplificado.
El proceso SDA se aplicó ampliamente por primera vez a la detección de M.
tuberculosis. Se han diseñado 52 métodos para detectar M. tuberculosis, C.
trachomatis y Neisseria gonorrhoeae.
QB Replicase
Q β replicase es otro método para amplificar sondeos que tienen una ciudad
específica para una secuencia objetivo. El método lleva el nombre de la enzima
principal que se utiliza para amplificar las secuencias de la sonda. La replicasa Q β
es una ARN polimerasa dependiente del bacteriófago Q β . 53 El ácido nucleico
objetivo en este ensayo puede ser ADN (que primero debe ser desnaturalizado) o
ARN.
El ácido nucleico objetivo se añade a una mezcla de reacción que contiene sondas
reporteras, que son moléculas de ARN (ARN midivariante) que tienen una
especificidad para la secuencia diana y también contienen una secuencia promotora
que es reconocida por la Q β replicasa. Los sondeos reporteros pueden hibridarse
con la plantilla. La plantilla con sondas unidas se inmoviliza utilizando sondas de
captura de cola polyG ( Fig. 6.31 , sonda de captura A) y perlas magnéticas unidas
covalentemente a secuencias de polyC. Con un imán aplicado en el exterior de los
pocillos, las moléculas reporteras no unidas se eliminan. Los complejos plantilla-
sonda se liberan de la perla magnética de poliC por desnaturalización y se hibridan
en una sonda de captura de poliA (sonda de captura B). A continuación, el complejo
se hibrida en una cuenta paramagnética polyT. Después de una serie de lavados
para eliminar la sonda reportera no unida, el complejo plantilla-sonda se libera
nuevamente del cordón magnético.
Para el paso de amplificación, la plantilla unida a la sonda de ARN midivariante se
mezcla con la replicasa Q β, que replica las moléculas de ARN midivariante. Esta
replicación es muy efi ciente; genera 10 6 a 10 9 moléculas de ARN (sondas) en
menos de 15 minutos. Debido a que se producen tantas moléculas de ARN, la
detección del producto se puede lograr mediante métodos colorimétricos y
radiogénicos en tiempo real. La replicasa Q β ha sido reemplazada por otros
métodos para la mayoría de las aplicaciones de laboratorio médico. Se utilizó
principalmente para amplificar el ácido nucleico asociado con organismos
infecciosos, particularmente micobacterias, clamidia, VIH y CMV.
Amplificación de señal
En los procedimientos de amplificación de señales, no hay cambios en el número
de secuencias de dianas o sondas; En su lugar, grandes cantidades de señal se
unen a las secuencias objetivo que están presentes en la muestra. Los
procedimientos de ampr cación de señal son intrínsecamente mejores para
cuantificar la cantidad de secuencias diana presentes en la muestra clínica. En el
mercado existen varios métodos de amplificación de señales.
Amplificación de ADN ramificado
En la amplificación del ADN ramificado (ADNb), se utiliza una serie de sondas de
oligómero cortas para capturar una sola molécula de ácido nucleico objetivo. Las
sondas extensoras adicionales se unen al ácido nucleico objetivo y, a continuación,
a múltiples moléculas reporteras, cargando el ácido nucleico objetivo con señal.
Para el procedimiento de amplificación de la señal de ADNb, el ácido nucleico
objetivo liberado por las células se desnaturaliza (si el ADN es el objetivo; este
método también funciona con ARN). El ácido nucleico objetivo se une para capturar
las sondas que se fijan en el pocillo de la placa ( Fig. 6.32 ). A continuación, las
sondas extensoras o preamplificadoras se unen al objetivo capturado. Las sondas
extensoras tienen secuencias que son complementarias a las secuencias de las
moléculas objetivo, así como a las secuencias de las sondas amplificadoras.
En el ensayo de primera generación, las sondas extensoras se unen a una sonda
amplificadora de ADNb en forma de árbol, que a su vez se une a múltiples
nucleótidos marcados con fosfatasa alcalina. Ocho multímeros o amplificadores,
cada uno con 15 ramas, se unen a cada sonda extensora unida al objetivo. En los
ensayos de segunda y tercera generación, las sondas extensoras se unen a
preamplificadores, que a su vez se unen a 14 a 15 amplificadores, cada uno con la
capacidad de unirse a múltiples oligonucleótidos marcados con fosfatasa alcalina
(Fig. 6.33). Se añade dioxetano como sustrato para la fosfatasa alcalina, y la
luminiscencia del chemi se mide en un luminómetro. Este sistema tiene un límite de
detección de aproximadamente 50 mol/mL objetivo.
El método del ADNb tiene varias ventajas. En primer lugar, en el ensayo de ADNb
hay menos riesgo de que la contaminación por arrastre dé lugar a una prueba
positiva que en la PCR. 56 En segundo lugar, se pueden incorporar múltiples sondas
de captura y extensión que detectan secuencias diana ligeramente diferentes, como
ocurre con diferentes aislamientos del virus de la hepatitis C y el VIH. Al incorporar
diferentes sondas que reconocen secuencias ligeramente diferentes, el mismo
sistema básico puede detectar múltiples tipos genéticos del mismo virus. Por último,
el requisito de que las sondas se unan a varias secuencias en el mismo objetivo
aumenta la especificidad del sistema. Es muy poco probable que todas las sondas
requeridas se unan de manera no especificada a un objetivo no relacionado y
produzcan una señal. El ensayo de amplificación de señales de ADNb se ha
aplicado a la detección cualitativa y cuantitativa del virus de la hepatitis B, el virus
de la hepatitis C y el VIH-1. Al reemplazar el soporte de la placa con perlas, el
ensayo se ha combinado con la tecnología de matriz de perlas para proporcionar un
sistema multiplexado que puede detectar 100 objetivos diferentes en una sola
muestra.
Ensayos de captura híbridos
Los ensayos de captura híbridos se comercializaron principalmente para la
detección y caracterización molecular del virus del papiloma humano (VPH) en
muestras genitourinarias. 58,59 También se utilizan para la detección del virus de la
hepatitis B y el CMV. Para estos ensayos, el ADN diana liberado por las células se
une a sondas de ARN monocatenario ( Fig. 6.34 ). El híbrido ADN:ARN tiene una
estructura única que es reconocida por los anticuerpos. Los anticuerpos unidos a la
superficie de un pocillo de microtitulación capturan los híbridos ADN:ARN. El ADN
bicatenario o el ARN monocatenario no se unirán a estos anticuerpos. Los híbridos
capturados se detectan mediante la unión de anticuerpos secundarios conjugados
con fosfatasa alcalina a los anticuerpos híbridos ADN:ARN en un ensayo sándwich
típico. Se añade un sustrato productor de luz para la fosfatasa alcalina y se mide la
quimioluminiscencia. El ensayo de captura híbrida se considera un ensayo de
amplificación de señal porque la cantidad de ADN objetivo no se amplifica; más bien,
el ADN se aísla unido al ARN y es reconocido por múltiples anticuerpos contra la
molécula híbrida objetivo/sonda.
Amplificación basada en escisión
El amplatión basado en escisión detecta los ácidos nucleicos objetivo mediante el
uso de una serie de sondas superpuestas que se unen al ADN objetivo. La cleavase
es una enzima bacteriana que reconoce secuencias superpuestas de ADN y hace
un corte (hendiduras) en la región superpuesta. In vivo, esta actividad es
probablemente importante en la reparación del ADN. Las aplicaciones de esta forma
de amplificación incluyen polimorfismos de ADN, como la detección de mutaciones
del factor V Leiden, 60,61 y enfermedades infecciosas, como el virus de la hepatitis
C (VHC) y el genotipado del VPH.
Para iniciar la amplificación, el ácido nucleico objetivo se mezcla con sondas
invasoras y de señal ( Fig. 6.35 ). La sonda invasora y las sondas de señal se unen
al objetivo, con el extremo de 5' de la sonda de señal superpuesto con la sonda
invasora. Cleavase reconoce esta superposición de lix triple he y corta la sonda de
señal, que puede actuar como una sonda invasora en el siguiente paso de la
reacción. En el segundo paso, se agrega una sonda FRET que tiene secuencias
complementarias a la sonda de señal escindida. El extremo de 5 'de la sonda FRET
tiene una molécula reportera que se encuentra cerca de una molécula extinguidora.
Como resultado, la sonda FRET intacta no produce señal. La sonda de señal (ahora
una sonda invasora) se une a la sonda FRET, produciendo una región superpuesta
que es reconocida por Cleavase. Cuando Cleavase corta la sonda FRET en la
región superpuesta, libera la molécula reportera del extinguidor, lo que resulta en la
producción de señal. La cantidad de señal puede cuantificarse y relacionarse
directamente con la cantidad de moléculas objetivo en la muestra. Estas reacciones
se llevan a cabo en un formato de placa de 96 pocillos, y la señal se detecta en un
lector de placas.
Sonda de ciclismo
En el método de amplificación de la sonda cíclica, las secuencias diana se detectan
utilizando una sonda sintética que consta de secuencias de ADN y ARN dispuestas
en una secuencia sándwich de ARN-ADN de ADN, que lleva un colorante indicador
en un extremo y un colorante extinguidor en el otro. Después de que la sonda se
une al ácido nucleico objetivo ( Fig. 6.36 ), la RNasa H escinde el ARN desde el
centro de la sonda. La pérdida de las secuencias de ARN disminuye la temperatura
de hibridación de la sonda y las partes de ADN de las sondas salen de la plantilla.
Cuando se libera la sonda, el reportero y el tinte extinguidor se separan, lo que
permite que la f uorescencia escape del reportero. La plantilla sigue estando
disponible para la hibridación adicional de la sonda. Debido a que la
desnaturalización cíclica de la sonda depende de la digestión de la porción de ARN,
el método es de otro tipo. La cantidad de fl uorescencia del colorante indicador
(producida cuando el objetivo está presente) se mide como indicación de la
presencia de moléculas objetivo. Alternativamente, también se puede medir la
presencia de sondas quiméricas que permanecen cuando las secuencias objetivo
no están presentes. Este método se ha utilizado para detectar genes asociados con
la resistencia a los antimicrobianos en bacterias, como la resistencia a la meticillina
(mecA) en Staphylococcus aureus y la resistencia a la vancomicina (vanA y vanB)
en Enterococ cus64-66 y en la detección de otros organismos, como el herpesvirus
y el Histoplasma capsulatum