UNIVERSIDAD EVANGÉLICA BOLIVIANA

FACULTAD DE AGROPECUARIA Y VETERINARIA

INGENIERIA AGROPECUARIA

Informe: Reacción en cadena de polimerasa (RT) (PCR-RT)

Materia: Genética General

Docente: M.S Garandillas Gutiérrez Orlando
Estudiante: Galindo Cruz Adriana Natalia 202500122

Santa Cruz-Bolivia

2025
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Indice

Indice ………………………………………………………………………………1

1.​ Introducción ………………………………………………………………. 2

2.​ Desarrollo ………………………………………………………………….3
2.1Definición de la RT
2.1.2 Como se realiza el RT
2.1.3 Equipamiento para la ejecución de la RT
2.2 Definición de la PCR-RT
2.2.1 Método de uso
2.2.2 Como se realiza
2.2.3 Equipamiento para la ejecución de la PCR-RT

3.​ Conclusión
Bibliografía
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1.​ Introducción

Toda historia tiene un comienzo, y este es el caso del descubrimiento del PCR; empezó con
los descubrimientos fundamentales: Watson y Crick desentrañando la estructura del ADN en
los años 50, y Arthur Kornberg descubriendo la ADN polimerasa poco después. Pero hubo un
científico menos conocido, Kjell Kleppe, quien en 1969 ya había imaginado algo muy
parecido a la PCR mientras trabajaba con el premio Nobel Khorana. El problema era que en
esa época sintetizar los pequeños fragmentos de ADN (los cebadores) era un trabajo tan
artesanal como tejer un suéter con agujas, y las enzimas disponibles eran más delicadas que
porcelana fina.
Décadas después llegó Kary Mullis, un tipo excéntrico que decía haber tenido la revelación
durante un viaje de camping con su novia. Pero incluso su genio necesitó de los avances
tecnológicos de los 80, como las máquinas que podían sintetizar ADN automáticamente, lo
cual nos permitió diagnosticar el COVID-19 y estudiar las antiguas momias que
anteriormente guardaban sus secretos dentro de su DNA (Kaunitz 2015).
Desde su descubrimiento hasta la fecha el PCR revolucionó en muchos campos , desde la
identificación de genes en medicina hasta las resoluciones de crímenes tanto actuales como
de antaño que se creían imposibles de resolver, nos ayuda a rastrear ADN antiguo en
antropología, y detectar patógenos en alimentos demostrando así ser una herramienta muy
útil e indispensable en la ciencia moderna (Chen & Janes, 2002).
Coffin y Fan (2016) destacan que en 1970, Howard Temin y David Baltimore realizaron de
manera independiente el descubrimiento de la transcriptasa inversa en retrovirus, un hallazgo
que transformó la biología molecular. Temin, partiendo de su hipótesis del provirus, demostró
que los viriones del virus del sarcoma de Rous (RSV) contenían una enzima capaz de
sintetizar ADN a partir de ARN. Por su parte, Baltimore, estudiando virus como el de la
leucemia murina (MLV), identificó la misma actividad enzimática. Este descubrimiento no
solo validó la controvertida hipótesis de Temin, sino que también sentó las bases para
entender la replicación de los retrovirus, el origen de los oncogenes y el desarrollo de
herramientas clave en biotecnología, como la clonación molecular. Por sus contribuciones,
ambos científicos compartieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1975 (Coffin &
Fan, 2016, pp. 29-51).
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1.​ Desarrollo

2.1Definición de la RT
Las transcriptasas inversas (RT), como las derivadas del virus de la mieloblastosis
aviar (AMV) o de la leucemia murina de Moloney (MuLV), son enzimas clave que
sintetizan ADN complementario (cDNA) a partir de ARN, permitiendo así su
posterior amplificación y análisis (Primrose y Twyman, 2006, p. 28).
La transcripción inversa (RT) es un proceso esencial en biología molecular que
convierte ARN en ADN complementario (cDNA) utilizando enzimas como la
transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar (AMV) o del virus de la
leucemia murina de Moloney (MuLV). Este paso es fundamental para técnicas como
la RT-PCR, ya que las ADN polimerasas termoestables requieren un molde de ADN
para amplificar secuencias (Primrose & Twyman, 2006).

2.1.1 Método de uso de la RT

El método de RT (transcripción inversa) consiste en la síntesis de ADN
complementario (cDNA) a partir de ARN utilizando la enzima transcriptasa inversa.
Este proceso es esencial para técnicas como la RT-PCR, donde el cDNA generado se
amplifica posteriormente mediante PCR (Green & Sambrook, 2012, Cap. 7, Protocolo
8).
En el manual, se describe su aplicación en la cuantificación de ARN mediante
RT-PCR en tiempo real**, destacando la importancia de utilizar transcriptasas
inversas eficientes y condiciones óptimas para garantizar resultados precisos (Green
& Sambrook, 2012, Cap. 9).
El método de RT (transcripción inversa) es como un "traductor molecular" que
convierte el ARN, frágil y efímero, en ADN complementario (cDNA), más estable y
fácil de manipular en el laboratorio. Gracias a esta técnica, podemos estudiar genes
activos, cuantificar expresión génica e incluso diagnosticar enfermedades virales
(como en las pruebas de PCR para COVID-19).
Es fascinante cómo una enzima (la transcriptasa inversa, originalmente descubierta en
virus) se convirtió en una herramienta clave para la biología molecular. Eso sí, como
bien señala el manual de Green y Sambrook, hay que optimizar bien el protocolo para
evitar errores y obtener resultados confiables.
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2.1.2 Como se realiza el RT

La RT puede liberarse fácilmente de los viriones aislados mediante la
permeabilización suave de las envolturas viriónicas con detergente. El ADN viral
completo puede sintetizarse, aunque de forma ineficiente, en viriones purificados
mediante la denominada «reacción endógena», en la que los viriones purificados se
permeabilizan con un detergente suave y se incuban en una mezcla de reacción que
contiene desoxirribonucleótidos. Las condiciones requeridas para producir
transcripciones inversas completas en la reacción endógena son exquisitamente
sensibles a la concentración de detergente (usualmente Nonidet P-40, NP-40) que está
presente en tales reacciones in vitro (Rothenberg y Baltimore, 1976; Rothenberg et al.,
1977; Boone y Skalka, 1981a)" (Telesnitsky & Goff, 1997, pp. 130-131).
Los detalles del protocolo para la ejecución del RT son los siguientes:
●​ Permeabilización de viriones: Uso de detergente suave (ej.: Nonidet P-40)
para liberar la RT.
●​ Reacción endógena: Incubación de viriones permeabilizados con:
○​ Desoxirribonucleótidos (dNTPs).
○​ Tampón adecuado (iones Mg²⁺, pH óptimo).
●​ Control de condiciones: Concentración crítica de detergente para evitar
inhibición.

2.1.3 Equipamiento para la ejecución de la RT

En el fascinante mundo de la biología molecular, cada experimento es como una
cocina de precisión donde los ingredientes deben medirse al milímetro y los
instrumentos funcionar en perfecta sincronía.
Green, M. R., & Sambrook, J. (2012) describe que la transcriptasa inversa es una de
esas herramientas clave, capaz de transformar el ARN —ese mensajero efímero de la
célula— en ADN complementario (ADNc), mucho más estable y manejable. Pero
para que esta "receta" científica salga bien, no basta con tener los reactivos
adecuados; también necesitamos equipos confiables que garanticen exactitud y
reproducibilidad. La transcriptasa inversa es como un traductor molecular que
convierte el frágil ARN en ADNc, más estable y fácil de estudiar. Pero para que este
proceso funcione sin problemas, necesitamos herramientas confiables:
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●​ Termociclador que actúe como director de orquesta controlando las

temperaturas
●​ Micropipetas de precisión que manejen volúmenes diminutos con cuidado,
●​ Tubos estériles que protejan las muestras de enemigos invisibles como las
RNasas.
●​ Termobloque o baño de agua se encarga de mantener el calor justo, como un
nido acogedor para que la enzima haga su trabajo
●​ Centrífuga que mezcla y sedimenta los ingredientes con suaves giros. Juntos,
estos equipos hacen posible descifrar los mensajes ocultos en el ARN, paso a
paso, con paciencia y precisión(Capítulo 13, Protocolo 6).

2.2 Definición de la PCR-RT

La PCR en tiempo real con transcriptasa inversa (PCR-RT o qRT-PCR) es una técnica
molecular que combina la retrotranscripción (RT) de ARN a ADN complementario
(cDNA) con la amplificación y cuantificación simultánea de este último mediante
PCR en tiempo real. Utiliza fluoróforos para monitorear la producción de productos
de amplificación en cada ciclo, lo que permite una medición precisa y en tiempo real
de la cantidad inicial de ARN objetivo. Esta metodología destaca por su alta
sensibilidad, amplio rango dinámico y capacidad para evitar pasos posteriores de
procesamiento (Bustin & Mueller, 2005). Este procedimiento es aplicable y útil en
los siguientes campos:
●​ Diagnóstico clínico:
- Detección y cuantificación de patógenos virales (ej. SARS-CoV-2, VIH, influenza)
en muestras respiratorias o sanguíneas.
- Monitoreo de carga viral para evaluar la eficacia de tratamientos antivirales.
●​ Oncología:
- Identificación de transcritos asociados a cáncer (ej. BCR-ABL en leucemia) para
diagnóstico y seguimiento de enfermedad residual mínima.
●​ Investigación biomédica:
- Cuantificación de expresión génica en estudios de mecanismos moleculares o
respuesta a fármacos.
●​ Epidemiología:
- Vigilancia de brotes mediante la detección rápida de virus ARN (ej. rotavirus,
norovirus) en muestras ambientales o clínicas.
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"La PCR-RT es como un 'termómetro molecular' que no solo detecta la presencia de

un virus en un paciente, sino que también mide con precisión cuánto está presente,
ayudando a los médicos a ajustar tratamientos o predecir riesgos de recaída en
enfermedades como la leucemia" (Bustin & Mueller, 2005).

2.2.1 Método de uso

La PCR en tiempo real (RT-PCR o qPCR) revolucionó la cuantificación de ácidos
nucleicos al permitir medir la expresión génica con una sensibilidad sin precedentes.
A diferencia de los métodos tradicionales, esta técnica combina la amplificación y la
detección en un solo paso, utilizando señales fluorescentes para monitorear la
acumulación de ADN en tiempo real. Su aplicabilidad abarca desde la investigación
básica hasta el diagnóstico clínico, pero su éxito depende de una comprensión
profunda de sus fundamentos y protocolos.
Según Wong y Medrano (2005), la PCR-RT cuantitativa (qPCR) es un método que
permite medir la expresión génica mediante la detección de fluorescencia durante la
amplificación del ADN, eliminando la necesidad de procesamiento posterior. Los
autores destacan que esta técnica ofrece un amplio rango dinámico (hasta 7–8 órdenes
de magnitud), alta sensibilidad (capaz de detectar una única copia de ARN) y
especificidad para distinguir entre secuencias similares (p. 75). Además, enfatizan que
la qPCR supera a métodos tradicionales como los dot blots o ensayos de protección
contra RNasa en precisión y reproducibilidad, aunque requiere equipos costosos y un
diseño experimental riguroso para evitar sesgos (Wong & Medrano, 2005,
"Introduction").
Wong y Medrano (2005) también explican que el ciclo umbral, punto clave en la
qPCR, refleja la cantidad inicial de ADN diana: a menor , mayor cantidad de material
genético en la muestra. Este parámetro se calcula cuando la fluorescencia supera el
ruido de fondo, durante la fase exponencial de la amplificación (p. 76).

2.2.2 Como se realiza

La RT-PCR cuantitativa (qPCR) es una técnica fundamental en laboratorios de
investigación y diagnóstico, ya que permite medir con precisión la expresión génica o
detectar material genético, incluso en cantidades mínimas. Su versatilidad la ha
convertido en una herramienta clave durante la pandemia de COVID-19 para
identificar el virus SARS-CoV-2. Sin embargo, su éxito depende de protocolos
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rigurosos, desde la preparación de muestras hasta el análisis de datos (Bustin, 2004).

A continuación veremos cuales son los protocolos requeridos para su empleo:
●​ Preparación de la muestra y calidad del ARN: Bustin y Nolan (2004) destacan
que la obtención de resultados confiables en qPCR comienza con una
adecuada adquisición y preparación de la muestra. Es crucial evaluar la pureza
y concentración del ARN mediante espectrofotometría o electroforesis,
especialmente en muestras complejas como tejidos fijados en formol (Lewis &
Maughan, 2004, cap. 4).
●​ Diseño de primers y sondas: Según Bustin (2004), los primers y sondas deben
diseñarse para evitar dimeros y garantizar especificidad. Las sondas TaqMan o
SYBR Green son las más utilizadas, aunque requieren optimización de
concentraciones y temperaturas de annealing (cap. 4).
●​ Transcripción inversa (RT) y amplificación: El proceso de RT convierte el
ARN en ADN complementario (ADNc) usando transcriptasa inversa.
Posteriormente, la qPCR amplifica el ADNc mientras se monitorea la
fluorescencia en tiempo real. Nolan (2004) enfatiza la importancia de incluir
controles negativos y estándares para validar la reacción (cap. 6 y 7).
●​ Análisis de datos y estandarización: Mueller, Padmabandu y Taylor (2004)
proponen protocolos para normalizar los datos usando genes de referencia y
estándares internos, lo que minimiza errores técnicos (cap. 3). La curva de
amplificación y los valores de Ct (threshold cycle) son críticos para la
cuantificación (Bustin & Nolan, 2004, cap. 8).
●​ Aplicaciones específicas:
- Diagnóstico clínico: Pinzani et al. (2004) describen el uso de qPCR para
cuantificar ARN de factores de crecimiento en cáncer de mama (cap. 7).
- Genotipado: Afonina et al. (2004) detallan métodos para detectar
polimorfismos de nucleótido único (SNPs) usando sondas fluorescentes (cap.
11).

2.2.3 Equipamiento para la ejecución de la PCR-RT

Bustin et al. (2025) destacan que la ejecución de RT-PCR cuantitativa (qPCR)requiere
equipos específicos y enzimas de alta calidad para garantizar resultados confiables y
reproducibles. Entre los equipos esenciales se incluyen:
●​ Equipos principales: Termociclador en tiempo real (qPCR):
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Plataformas como:
- Applied Biosystems (Series 7500, StepOnePlus™).
- Bio-Rad (CFX96™, CFX384™).
- Roche (LightCycler® 480).
- Thermo Fisher Scientific (QuantStudio™).
Deben permitir monitoreo de fluorescencia en múltiples canales (para sondas
TaqMan o SYBR Green) y exportar datos brutos en formatos estandarizados (RDML
o RDES).
●​ Sistema de extracción de ácidos nucleicos:
- Equipos automatizados (ej.: QIAcube de Qiagen, KingFisher de Thermo Fisher) o
kits manuales (ej.: TRIzol®, columnas de sílica).
- Requisito clave: Minimizar contaminación por inhibidores (como fenol o heparina)
que afecten la eficiencia de PCR.
- *Espectrofotómetro/Nanodrop o fluorómetro:
- Para cuantificar concentración y pureza de ARN/ADN (ratios 260/280 y 260/230).
- Alternativas: Qubit® (Thermo Fisher) para mayor precisión en muestras diluidas.
- Electroforesis o analizador de fragmentos (ej.: Bioanalyzer de Agilent):
- Evaluar integridad del ARN (RIN > 7 para estudios de expresión génica).
●​ Equipos auxiliares
- Pipetas de precisión (ajustables y calibradas): Rangos desde 0.1 µL hasta 1000 µL,
preferiblemente con filtros para evitar contaminación cruzada.
- Centrífuga para microtubos y placas: Para sedimentar muestras y mezclar reactivos.
- Cabina de seguridad biológica (flujo laminar): Manipulación de ARN para evitar
degradación por RNasas.
- Termobloques o baños termostatizados: Para incubaciones controladas (ej.: 65°C
para desnaturalizar ARN o 42°C para transcripción inversa).
- Ultracongelador (-80°C) y criocontenedores: Almacenamiento a largo plazo de
muestras y reactivos.
●​ Reactivos y consumibles críticos
- Enzimas:
- Transcriptasa inversa (ej.: SuperScript™ IV, M-MLV) para síntesis de ADNc.
- ADN polimerasa termoestable (ej.: Taq polimerasa, Hot Start) con actividad 5’→3’
y proofreading (para alta fidelidad).
- Sondas y colorantes:
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- Sondas TaqMan (específicas para cada gen) o SYBR Green I (para detección
inespecífica).
- Oligonucleótidos (primers) diseñados con herramientas como Primer-BLAST o
Primer3Plus.
- Controles:
- Controles positivos/negativos (ARN sintético o muestras certificadas).
- Controles sin plantilla (NTC) y sin transcriptasa inversa (no-RT) para detectar
contaminación.
- Placas/tubos ópticos: Compatibles con el termociclador (ej.: placas de 96/384 pozos,
tubos individuales).

Además, los autores enfatizan la importancia de validar lotes de enzimas y reactivos,

así como de reportar detalles como concentraciones y números de lote en las
publicaciones, siguiendo las directrices MIQE 2.0 (Bustin et al., 2025, tablas 1 y
sección "qPCR Protocol").

1.​ Conclusión
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Bibliografía

Kaunitz J.D (2015). El descubrimiento de la PCR: obtención de poder divino. Digestive

Diseases and Sciences , 60 (8), 2230–2231. https://doi.org/10.1007/s10620-015-3747-0 Chen,
B., & Janes, H. W. (2002). PCR cloning protocols. In Humana Press eBooks.
https://doi.org/10.1385/1592591779
Coffin, J. M., & Fan, H. (2016). The discovery of reverse transcriptase. *Annual Review of
Virology, 3*, 29–51. https://doi.org/10.1146/annurev-virology-110615-035556
Primrose, S. B., y Twyman, R. M. (2006). Principles of Gene Manipulation and
Genomics (7a ed.). Blackwell Publishing
Green, M. R., & Sambrook, J. (2012). *Molecular cloning: A laboratory manual* (4th ed.).
Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Telesnitsky, A., & Goff, S. P. (1997). Reverse transcriptase and the generation of retroviral
DNA. En J. M. Coffin, S. H. Hughes, & H. E. Varmus (Eds.), *Retroviruses* (Cap. 4, pp.
121-160). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19424/
Green, M. R., & Sambrook, J. (2012). *Molecular Cloning: A Laboratory Manual* (4th ed.).
Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Bustin, S. A. (Ed.). (2004). *A-Z of quantitative PCR*. International University Line.
Bustin, S. A., Ruijter, J. M., van den Hoff, M. J. B., Kubista, M., Pfaffl, M. W., Shipley, G.
L., ... & Wittwer, C. T. (2025). MIQE 2.0: Revision of the Minimum Information for
Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments Guidelines. *Clinical Chemistry*,
*00*(0), 1–18. https://doi.org/10.1093/clinchem/hvad043
Wong, M. L., & Medrano, J. F. (2005). Real-time PCR for mRNA quantitation.
*BioTechniques*, *39*(1), 75–85.
Bustin, S. A., & Mueller, R. (2005). Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its
potential use in clinical diagnosis. *Clinical Science*, *109*(4), 365–379.
https://doi.org/10.1042/CS20050086