ASIGNATURA BIOQUÍMICA CLÍNICA TERCERO DE CARRERA

TEMA 1. HISTORIA
Biotecnología enzimática: altera a la estructura y función de una enzima, para
modificar la actividad catalítica, con el fin de desarrollar nuevos metabolitos que
pueden ser nuevos en la naturaleza o no.

1. Aplicaciones industriales de las enzimas

1.1 historia

Las enzimas se llevan utilizando desde hace mucho tiempo. 5 mil años AC.

• 1913: Otto en Alemania empezó a usar extracto pancreático obtenido de

corderos para ablandar las pieles (bating), En los anuncios de detergentes
ponen que eliminan las manchas de sangre.

El bating se sigue haciendo en el norte de Africa utilizando excrementos de

palomas y de perros
• 1917: Boidin yE[ront utilizaron la amilasa bacteriana para degradar el
almidón, eliminar sus restos y su rigidez. Apresto es dar consistencia a una
prenda textil. Montaron la compañía Societe rapidase

• 1926: Waksman y Davison → "La vida no es nada más que una reacción
enzimática tras otra

• 1939-41: se evolucionó en la producción de enzimas.

• 1945: dos hermanos Harald y Throvald, diseñaron a la primera jeringuilla de

la insulina. Compraron NORDISK y realizaron la amilasa bacteriana usando
la fermentación de Bacillus subtilis.

• 1951: los de NOVO comercializaron Termozym à enzima termoestable

→lavados con alta temperatura.

• 1953: Aquazyme →primera formula química de la amilasa.

• 1959: introducen en los detergentes las proteasas bacterianas.

• 1960: tanto NOVO como Gist ya están disponibles las proteasas

bacterianas para introducirlas en los detergentes

• 1962: se introduce la proteasa alcalina en el detergente Biotex →varias

enzimas para mejorar el lavado.

• 1969: el 80% del mercado alemán de detergentes ya contenía proteasas

bacterianas.
 • 1970: sensibilizar al público de que las proteasas bacterianas pueden dar
alergia.
Se utilizó el Prilling→ envolvían alas enzimas en una partícula de cera que se
disolvía en medio acuoso y así no generaba alergias. Con a la vibración se hacen
gotas más grandes o más pequeñas, yc omo llevan al cera, conforme van cayendo
se endurece. Esas ceras son alcalófilas →se encuentran en minas, zonas de
volcanes.

Todas las enzimas son pH mayor o igual a 9, termoestables ya bajas temperaturas

es donde más actividad catalítica presentan. Termoestable quiere decir que no
necesito condiciones de almacenamiento muy finas para que perdure. En los
detergentes tenemos varias enzimas por lo que hay que tener en cuenta cuando
se degrada cada una de ellas y que no se degraden mutuamente, por eso
encontramos detergentes en perla.

• 1973: la amilasa ya se introduce en Mustang, y puede ser utilizada a baja y

alta temperatura. Estas enzimas funcionan muy bien a 30° y a 60º,
normalmente su termo estabilidad llega a 90°C

• 1979: LION lanza TOP donde las enzimas van en cápsulas.

• 1980: los mismos de LION comercializan al versión libre de fosfatos (estos

antes se utilizaban para que no se apelmazaran, pero provocan la
eutrofización).

• 1988: introducen las lipasas →disuelve al suciedad grasienta yal

proteasa→disuelve proteínas.

• 1988-1989: tanto Hist como NOVO lanzan las primeras proteasas

resistentes a la legía. Sobre todo, para los de sanidad.

• 1990: las enzimas ya estaban asumidas, pero se volvieron a meter nuevas

enzimas como:
Celulasas:
-Incrementan la limpieza y blanqueado de los tejidos.
-Intensifican el color que eliminan las pelusillas.
-Eliminan las microfibras yquitan partículas de suciedad.
Manasas:
- Qitan las machas resistentesà chocolate, café y helado (se hace con la
goma de guar, tara y carob) la alfa amilasa hidoliza el almidon
- Devuelve el color blanco a las prendas
Pectinasas
- Eliminan las manchas de vino y frutos rojos
- Su estructura está compuesta de dos pentosas y un grupo carboxilo
metilado
1.2 Aplicaciones

A. DETERGENTES
- Proteasas: quita los restos de proteínas ( como por ejemplo sangre)
- Amilasas: quita los restos de almidón
- Lipasas: quita los restos de grasas
- Mananasa quita las manchas de comida como café,choco...
- Pectinas: homogalacturonanos unidos a ácido galacturónico (manchas de
frutas)
- Celulasa: más brillo y quita las pelusillas de los jerseys

B. INDUSTRIA Y COMBUSTIBLES
- Alfa- amilasa: rompe los enlaces alfa (1à4), manosas terminales.
Licuefacción y sacarificación del almidón
- Beta-amilasa: rompe los enlaces beta (1à4) del extremo no reductor
- Gama- amilasa: rompe los enlaces glucosídicos alfa (1à6) sacarificación.
- Pululanasa 1: rompe alfa (1à6) en oligosacáridos . sacarificación enzima
desramificante.
- Pululanasa 2: rompe alfa (1à4) y alfa (1à6)
- Glucosa isomerasa: isomeriza la glucosa de la fructosa
- Glucosiltransferasas (GT): modifica el almidón.
- Ciclodextrintranferasas (CGT): formación de ciclodextrinas → La usan los
bacilos para quitar el alimento a los vecinos.
- Xilanasa: reduce viscosidad del almidón → biocombustibles. De los restos
vegetales del xilano, obtenemos glucosa, que fermentan las bacterias y
levaduras a alcohol pudiendo vender bioetanol.
- Proteasa: nutrición de levaduras y fermentación del bioetanol.

C. ALIMENTACIÓN.
El flavor es la suma del aroma y el sabor. Muchos péptidos potencian este flavor
- Proteasa
- Lipasas: mejoran el flavor de los quesos.
- Lactasa: quita lactosa de la leche.
- Pectin metilesterasa: aumenta la consistencia de la fruta. Hacen que se
potencie la formación de puentes de hidrógeno entre los OH y carboxilos
de los grupos metil éster.
- Pectinasa: degrada pectina → clarificación del zumo.
- Transglutaminasa: une por enlaces peptídicos restos de lisina con
glutamina → entrecruzar proteínas → propiedades viscoelásticas (bocas de
mar). Glutamato sabor umami, hace que tengas más ganas de comerese
producto. Además, es un potenciador de la textura en el queso, pan y
humus.
D. PANADERIA
- Amilasa: aumentar la textura, suavidad y volumen del pan y ajuste de
harina.
- Xilanasa: acondicionamiento de la masa.
- Lipasa y fosfolipasa: emulsificadores in situ → eliminan los triacilglicéridos
y fosfatidilcolina.
- Glucosa oxidasa: oxida la glucosa con oxígeno molecular, que da peróxido y
genera radicales libres que entrecruza los enlaces que hay en la masa.
- Lipooxigenasa: consistencia a la masa, oxida ácidos grasos en presencia
de oxígeno molecular y da hidroperóxidos (radicales libres que entrecruzan
los radicales que hay en la masa dando fuerza). Además, da blancor.
- Proteasas: hidrolizan el gluten de las galletas, aportando consistencia
- Transglutaminasa: entrecruza los enlaces y da consistencia a la masa (en
láminas).

E. ALIMENTO ANIMAL
- Fitasa: digestión del fitato que es un polifosfatos de inositol, con sus OH
esterificados con fosforo. Es importante hidrolizarlo porque va a quelatar
iones y va a interaccionar con las proteínas, por lo que el pienso del animal
que no ha sido tratado con fitasa, el alimento va ser menor y deja de
incorporar iones de los quevalentes y tampoco absorbe una gran cantidad
de proteínas.
- Xilanasas; aumenta la digestibilidad.
- Glutanasa: aumenta la digestibilidad. El glucano es un polímero complejo
formado por glucosas unidas por enlace B (1-4) y hay enlaces B (1-3).

F. BEBIDAS Y ZUMOS
- Pectinasa: eliminación de pectinas y maceración de bebidas alcohólicas.
- Amilasa: hidroliza almidón. Permite el tratamiento de determinados zumos
y para hacer la cerveza baja en calorías, hidroliza el almidón para que se dé
la fermentación, pero no tanto como si le echamos glucosa.
- B-glucanasa; maceración de bebidas alcohólicas.
- Acetolactato descarboxilasa: produce con intermedio → a-acetolactato,
que descompone el diacetilo que e da a la cerveza el sabor a mantequillas,
por lo que este de forma espontánea da al acetoino que no tieneningún
sabor.
- Lacasa: se usa para la clarificación de los zumos y da sabor a la cerveza.

G. TEXTILES
- Celulosa: los vaqueros son algodón que se tiñe con índigo y, las celulasas,
las fibras de algodón donde se fija el color. La celulosa elimina esas fibras
por lo que quita la capa del colorante. También, ablandan el algodón por lo
que le dan al vaquero una textura suave.

La celulasa puede ser ácida o neutra, dependiendo de cual utilicemos el

blanqueamiento será más o menos intenso
 - Amilasa: desencolado.
- Pectinato liasa: limpia de impurezas el tejido.
- Lacasa: con 02 molecular genera sobre compuestos fenólicos radicales
libres que sirven para el bleaching o el lavado con lejía.
- Peroxidasa: en presencia de peróxido de hidrogeno, elimina el exceso de
colorante en el tejido.
- Catalasa: blanqueador

H. PULPA Y PAPEL
- Lipasas: eliminar restos de resina en las astillas para hacer la pulpa de
papel y controlan la contaminación en los ríos.
- Proteasa: eliminan las biofilms.
Celulasa: quita color y favorece la salida de los restos de la industria a los
ríos.
- Pulpa Kraft: refinada por las lipasas → mejora las propiedades de la pulpa y
el refinado de forma más barata.
- Amilasa: mejora la reactividad de la actividad de la celulosa para que la
tinta se pegue mejor, la viscosidad, pureza, eficiencia de la celulasa y
mejora las propiedades de la pulpa. Elimina restos de papel
- Xilanasa: blanquea la pulpa y disminuye sus costes. Además, reduce la
formación de orgánicos absorbibles.

I. ACEITES Y GRASAS
- Lipasas: transesterificación y sustituto de manteca de cacao → cubre la
gran demanda que hay.
- Fosfolipasas: desengomado y en la fabricación de aceite de oliva. Los
lípidos que quedan de los fosfolípidos son por las fosfolipasas. La
isolecitina también la forman. Sirven para las emulsiones, cuando hay algo
que tiene huevo, al echar la fosfolipasa no deja gotas flotando, sino que da
una disolución homogénea.

J. COSMÉTICA
- Amiloglucosidasa: desintegra el almidón de las pastas de dientes para no
se formen biofilms en la dentadura y no tengamos placa bacteriana.
- Glucosa oxidasa: blanqueamiento y antimicrobiana → oxida la glucosa
generando peróxido que desinfecta.
- Peroxidasa: en presencia de peróxido de hidrógeno genera radicales libres
que tienen actividad antimicrobiana
- Pilling enzimático: las cremas que se usan para tener la piel más suave.
Utiliza la bromelanina que es una proteasa que está en la piña.

K. PIEL
Bating se hacía con los excrementos de palomas o de perro → ablandar cuero
(romper estructura del colágeno).
Actualmente se hace con proteasas, así como la eliminación del pelo de las
pieles.
- Lipasas: ablandamiento y mejor textura (eliminar las grasas)
 L. BIOCOMBUSTIBLES : enzimas que darán lugar a combustibles con huella
de carbono 0.
• Primera generación:Vienen de la alimentación.
- Bioetanol: almidón que da lugar a fructosa.
- Biodiesel (aceite usado): triacilglicéridos que se ionizan con lipasas y dan lugar a
glicerol + aceite → biodiesel.

• Segunda generación: se obtienen de fuentes distintas de la alimentación

(material lignocelulósico). Para ello, necesitamos enzimas que degraden la
celulosa, otras la lignina y otras la hemicelulosa. Pero, producir todas estas
enzimas lleva un gran coste económico, por lo que no nos renta. Por esta razón, lo
que se hace es utilizar hongos que degradan restos vegetales cuando lo ponemos
en contacto con el material lignocelulósico echan todas estas enzimas de un tirón
y el sobrenadante da lugar al bioetano.
- Fraking, restos de petróleo que se quedan en las capas del suelo, que no
son utilizables. Les sale muy entable, por eso, los países como Dubai son
muy ricos y pioneros en este ámbito.

TEMA 2

1. BIOCATALISIS Y OBTENCIÓN DE ENZIMAS

2. Selección del biocatalizador

Primero tenemos que bucar los reactivos para obtener el producto que estamos
buscando. Para poder encontrar esa enzima catalizadora tenemos que hacer un
proceso de cribado (screening) y, para ello, hay limitaciones como el ph, la
temperatura (mesófila, termófila) que sean capaces de actuar sobre el punto de
partida (natural o artificialà biodiversidad). Siempre tengo que acotar mi medio
de reacción la hora de hacer este cribado

3. Caracterización del biocatalizador

• Cinética:
Vmáx = Rcat [E]. Rcat → cuántas enzimas transformo.
Rcat/Km = Eficiencia catalítica, cuanto mayor sea el valor, más eficiente será la
enzima, mejor catalizador.
Km → afinidad de la enzima → cuanto más milimolar o micromolar sea, más
aumentará la Rcat y mejor será la enzima.
- Ingeniería del medio: ajusto la enzima a las condiciones de la reacción
(purificación, secuencia, estructura, modelado)
- Información estructural: cristalizar la enzima para rediseñar su centro
activo, con el fin de que el nuevo sustrato que quiero utilizar entre más
fácilmente → más compatible con el centro activo.
 4. Ingeniería del biocatalizador → posibilidades de mejorar la reacción
• Ingeniería celular
- Mejorar la expresión del gen: buscar la célula idónea para expresar el gen que
hemos clonado, u optimizar el gen para que sea expresado de la mejor forma
posible en el huésped que hemos elegido.
• Ingeniería de procesos: la enzima seleccionada va a producir un metabolito
tóxico para la célula, por lo que necesitamos es poner un gen que nos lo
detoxifique.
Mejorar la producción de la enzima: fuente de carbono económicamente rentable
que permita crecer a la
• Ingeniería de la enzima: purificarla para que el producto sea mejor. Y unas
condiciones de almacenamiento adaptadas a cada enzima (glicerol) ( se prese
costalizar también)

5. Aplicación
Necesita estabilidad, que esté inmovilizada, la posibilidad de regenera el cofactor
de manera que no interfiera en el resultado final del producto (formiato). También
podemos usar sistemas multifase → equilibrio entre la fase orgánica y la fase
acuosa, Cada vez que la enzima coja el sustrato de la fase acuosa, el equilibrio
químico se tiene que cumplir, por lo tanto, una molécula de la fase orgánica
pasará a la fase acuosa.

6. Recuperar el producto
Cuando ya tenemos el producto, tenemos que purificarlo y recupera in situ → al
sistema de biocatálisis le acoplamos una columna la cual se une el producto,
volviendo así la enzima al reactor que la vuelve o a poner accesible. Esto se hace
cuando el producto es inhibidor de la enzima que lo

Proceso finalizado
- Lidiar con la economía del proceso.
- Tenemos que integrarlo en la línea de
producción del producto.
- Hacer que el proceso sea sostenible
ambientalmente.
- Si la reacción es muy nueva la
patentaremos.
- Producto cumpla la legislación
- Producto sea asumido por los
consumidores
Finalmente, todo este ciclo es lo que
hay que tener en cuenta para que un
producto biocatalítico tenga éxito en el
mercado.
 2. FUENTES DE OBTENCIÓN DE ENZIMAS

ENZIMAS ANIMALES
- Catalasa: hígado → alimentación intracelular
- Quimiotripsina: obtenida del páncreas → cultivo de la piel
- Lipasa: páncreas → alimentación (quesos), abomaso (estómago de
rumiantes) cuajo del queso → corta las colas de la caseína de la leche +
fosfato + calcio → quelato que se agrega y se cuaja, y esta cola cargada
negativamente nos queda abajo.
- Tripsina: páncreas → cultivo de la piel

ENZIMAS VEGETALES
- Actinidina: látex de la papaya → alimentación
- Alfa y beta- amilasas: malta → cerveza
- Bromelaína: látex de la piña → cerveza
- Glucanasa: cebada malteada → cerveza
- Ficina: látex de los higos → quesos hipo alergénicos y cuajo de la leche
- Lipooxigenasa: semillas de soja → blanqueamiento del pan
- Papaína: látex de papaya → ablandar la carne

ENZIMAS BACTERIANAS: 80% del mercado de enzimas

- Alfa y beta amilasa: Bacillus
- Asparaginasa: [Link] → fármaco (desamina la asparagina) → inhibe la
síntesis de proteínas en células cancerígenas, combate la leucemia en
niños). Además, se usa en tecnología de los alimentos para evitar que las
patatas fritas y productos horneados produzcan acrilamida tóxica,
- Glucosa isomerasa: bacillusà jarabe de fructosa
- Proteasa: Bacillus → detergentes
- Pululanasa: Klebsiella → almidón

ENZIMAS FÚNGICAS
Aspergilus, Rhizopus, Penicilium → Organismo GRAS: ningún inconveniente ni
patología para el hombre.

- afa -amilasa: panadería

- Glucoamilasa: almidón y jarabes ricos en fructosa
- Catalasa: rompe peróxido de hidrógeno → alimentación
- Celulasa: biocombustibles de 2° generación. Además, Trichoderma:
bosques (degrada la madera con celulasas).
- Dextranasa: Penicillium → hidroliza el dextrano: cosméticos (consistencia),
colirios, radiografías (contraste),
- Glucosa oxidasa: glucosa + 02 → peróxido de hidrógeno (blanqueamiento
del pan de molde).
- Lactasa: leche sin lactosa. Mediante B-galactosidasa se hidroliza en
glucosa y galactosa → estos disacáridos impiden la cristalización de
helados y disminuye el tiempo de producción de yogures y quesos
 - Pectinasa y pectin liasa: clarifican zumos.
- Proteasa: consistencia de masas → entra más 02 → agujeros (mejor
fermentación, más dura).
- Rafinasa: trisacárido formado por galactosa y glucosa (lactosa) + fructosa
(lactosa) → Coles de Bruselas, espárragos y soja, si comemos mucha
rafinasaà flatulencias debido a la poca digestión

ENZIMAS QUE PROVIENEN DE LAS LEVADURAS

Saccharomyces, kluyveromyces, Candida → Organismos GRAS

- Invertasa: única enzima que se mantiene en alimento final, pues las demás
se usan en el proceso. Azúcar invertido: convierten la sacarosa en una
mezcla de glucosa y fructosa
- Lactasa
- Lipasaà comida
- Re[inasaà comidan

A la hora de decidir una fuente de enzimas, debemos tener en cuenta 4 criterios:

- Economía: rentable
- Eficiencia: del proceso con los costos, así como de la energía y medioambiental
- Seguridad: organismos GRAS*
- Percepción del consumidor como productor: para no tener problemas, ponemos
"estabilizador" en vez de "enzima" en los ingredientes, pues esta sustancia l
asociamos con algo malo.

2.1 Beneficios de la producción con microorganismos

- Gran diversidad → gran variedad de enzimas.
- Fácil de incrementar la producción cuando la demanda aumenta.
- Enzimas económicas.
- Fácil crecimiento e n laboratorio.

3.2 Comparación de los enfoques de cultivo y metagenoma para obtener una

nueva biocatálisis

Dependiendo del microorganismo que utilicemos, el medio de cultivo será

diferente
• Cultivable: vector de ligación → transformación en huésped → enzima
• No cultivable: extraemos muestras de suelo → fragmentos de DNA → muchos
vectores de ligación (librería metagenómica, clones) → cribado → ver cuál de todos
me da la enzima de interés, pero no sabre de que microorganismo proviene.

3 .3 Cultivo de bacterias en cuanto a la biodiversidad conocida

La mayor parte de la biodiversidad de las enzimas está inexplorada, salvo en
animales, plantas, y briofitos.
Ejemplo: en el suelo hay 10 (elevado a 10)/g bacterias vs 10 (elevado a 6) ufc/g.
Por lo que quedan 10 (elevado a 4)/g sin cultivar (sin conocer). Es decir, sólo 0,1%
de la microflora del suelo está cultivada
3. 4. Enfoques moleculares independientes de cultivo
Cogemos una muestra → creamos librerías metagenómicas, hacemos el cribado
de estas librerías y una vez identificado el clon, lo secuenciamos para saber los
genes que contiene, expresamos el clon independientemente para saber si se
expresa la proteína de interés y medimos la actividad enzimática, para ver si la
actividad que ha aparecido es resultado de la enzima que estamos buscando

Aunque hayamos encontrado la enzima, industrialmente, el sustrato A no es

natural, por lo que la evolución no ha hecho la enzima que quiero si no la ajustada
al medio en el que estaba. Si queremos hacerla activa sobre un sustrato no
natural, tenemos que adaptar la enzima al medio mediante mutaciones aleatorias
(distintas actividades enzimáticas), hasta que encontramos la enzima que
resuelve los problemas en el organismo.
En el laboratorio simulamos en un tubo de ensayo lo que ocurre en la naturaleza,
una evolución dirigida in vitro, que conlleva semanas, meses o años, como la
evolución natural in vivo

PCR propensa a error

Se parte de un gen parental y le introducimos una mutación
aleatoria (polimerasa con baja fidelidad), insertamos un vector e
introducimos E. coli por trasformación para posteriormente
cultivarlo en agar. Después, transferimos a una placa con pocillos
las colonias individuales y cultivamos colones independientes
(cribad) par lisarlo, centrifugarlo y con el sobrenadante medir la
actividad por el color de cada uno de los clones. Finalmente,
vemos cual tiene más actividad por el sustrato utilizado y el clon
lisiado lo sometemos a una nueva ronda de mutagénesis,
ampliando así la mejora sobre el sustrato artificial.
Barajado de genes
Entrecruzamiento de genes e introducimos la mutación, repetimos el proceso
anterior con la finalidad de buscar un sistema de cribado que nos permita cribar
un gran número de clones

Cepa de [Link] propensa a error

A la cepa le introducimos el gen que queremos mutar, y mediante las
modificaciones que tiene la enzima y el gen, esta tiene una propensión a no
repararlos, errores que permiten la evolución, pero no tan grandes como para
producir la extinción.
La velocidad de mutación de la cepa es mayor que el silvestre, hay una librería in
situ, sembramos en una placa de agar y hacemos un cribado de réplica con
nitrocelulosa (se transfieren las colonias al papel), rompemos las membranas con
cloroformo y sacamos el contenido de cada clon, análizandolo por color
(añadimos sustrato). Buscamos colonias que tengan el color correspondiente al
sustrato que estamos buscando y. a continuación, gracias a mi enzima
estereoespecífica (discierne entre los estereoisómeros S y R), vemos cuál
de los clones son activos sobre S o R. Los activos, los cultivamos en una placa con
pocillos, los lisamos (lisozima en cada pocillo) y vemos clones positivos (color).

Siguiendo con el proceso, entre los positivos, los purificamos en micro columna
en electroforesis → mejor expresión (debido a que la mutación ha mejorado el
codón de expresión en [Link]), pero no ha mejorado la eficiencia catalítica, es
decir, sólo tengo más enzima pero no una mejor (no actúa mejor sobre el sustrato
que yo quiero. En cambio, los que menos se expresan, tienen una mejor eficiencia
catalítica → nueva variante.
No nos dejemos engañar por el mejor color.
Todas estas técnicas se realizan con el fin de encontrar más diversidad de genes.
 3. CICLO DE EVOLUCION DIRIGIDA DE ENZIMAS
- Generación de librerías de mutantes: al gen parental se le introduce la
mutación aleatoria → PCR → librería de mutantes → transformación en E.
coli.
Evaluación de librería:
- Selección de vida o muerte; Permite cribar gran cantidad de mutantes
- Colorimetría, fluorescencia: 10 (elevado a 6), pero se necesitan enzimas
cuyos sustratos no se pueden echar al medio, por ello permiten el análisis de
menos mutantes.
- Sistemas de alta procesabilidad: manejar muchos clones con sistemas
robotizados → simplificar su manejo y eliminar el error experimental.

1. PCR mutagénica
2. Librería de clones
3. Transformación de [Link]
4. Pocillos
5. Incubación
6. Distribución del sustrato
7. Análisis
8. Visualización de ganadores

El primer robot tiene 2 torres (alimentadores de las placas). Las placas usadas son
cuadradas y permiten la siembra de gran cantidad de bacterias con perlitas de
vidrio → distribución homogénea. A continuación, el robot detecta con una punta
las colonias del tamaño que buscamos.
Este sistema tiene que cumplir la normativa GLP (good lab practice), sobre todo
en las farmaceútica

El segundo robot es más versátil. Cultivamos, separamos el medio de las células

con lisozima y centrifugamos.
Quitamos el sobrenadante y le volvemos a echar lisozima para romper la pared de
[Link] con el fin de liberar su contenido. Para poder medir bien la enzima,
centrifugamos el tubo para que los restos se caigan al fondo y me quedo con el
sobrenadante que es donde se encuentra la enzima.
Aspiramos el sobrenadante y lo echamos en una cubeta de un espectrofotómetro
→ incremento de absorbancia
(sustrato con color) o descenso (si
pierde color) → curva de
absorbancia. Finalmente, leemos
las placas.

Para ello, tenemos un cabezal de

96 puntas que nos permite
sembrar todos los pocillos y
realizar el proceso al mismo
tiempo.
Resumen de Ciclo de evolución dirigida

[Link]ón de mutantes
[Link]ías que introducimos en microorganismos, células de Insectos, levaduras
o mamíferos (CHO: ovarios o HEK: fibroblastos de embrión).
Pichia pastoris nos permite hacer cultivos de alta densidad de células y que no
necesiten una gran glicosilación.
Una ventaja es que tienen sistemas de expresión de enzimas celulares. Por otro
lado, con [Link] necesitamos niveles muy bajos de glucosa, ya que si hay mucha,
aparece el ácido acético en el medio, lo que
hace que cesen su crecimiento.

3. Cribado y selección. La evolución dirigida

se hace para poder usar las enzimas con
nuevos sustratos que la industria química
utiliza para convertirlos en productos con
biointeres industrial→ biocombustibles
renovables y nuevos fármacos que no
dañen el medio ambiente.
Gevo: compañía que fabrica combustibles a
partir de restos lignocelulósicos para la
navegación aérea.

4. INTELIGENCIA ARTIFICIAL
Mediante las redes neuronales se puede predecir la estructura en 3D de una
proteína a partir de una secuencia de aminoácidos que le pongas.
Alfafol (Google) coge todas las secuencias de proteínas conocidas, las mezcla con
todas las estructuras en 3D y crea una red. yo meto una secuencia lineal al
programa y este crea un mapa de distancias borroso, que sirve para retroalimentar
la red. Lo puedo ir modificando hasta que se vaya pareciendo a la estructura
deseada, de esta manera, puedo generar secuencias que no existen en la
naturaleza, pero cumplen funciones que yo quiero.
Volviendo de nuevo a la producción de enzimas, una vez realizados todos los
pasos, lo que necesitamos es producir y purificar la enzima

5. FERMENTACIONES MICROBIANAS
Cualquier fermentación comienza por un
cultivo en agar y las colonias se pasan a una
placa, que se rasca y se pasa a un cultivo de
100ml en vaso de Erlenmeyer. Este contiene
unas hendiduras en la base que hace que se
introduzca más oxígeno en el cultivo → más
densidad óptica.
A continuación, pasamos el cultivo a uno de
1 litro, que también llevan hendiduras para
mejorar la oxigenación. Después, lo
pasamos a fermentadores de 20 litros,50.....
 6. FILTRACION DE ENZIMAS

Existen 2 tipos de filtración:

- Filtración sin salida (filtración ortogonal): filtro se conecta a una jeringa
para esterilizar sustancias. Conforme vamos filtrando, cada vez hacemos
más presión sobre el filtro porque las sustancias lo van colapsando
paulatinamente, ya que las sustancias grandes van taponando los agujeros
y tenemos que presionar más para filtrar lo que queda.
- Filtración tangencial: el propio flujo de la disolución limpia los poros,
aumentando así, la velocidad del permeado.

Dependiendo del tamaño del poro podemos hacer la ósmosis inversa (sales,
detergentes), nanofiltración (aislar moléculas de bajo peso, flavonoides,
antibióticos), ultrafiltración (purificar proteínas, virus o polipéptidos) y
nitrafiltración (purificar bacterias). Todas las técnicas son membranas con
filtración tangencial que lo único que cambia en cada caso es el tamaño del poro.

6.1 Funcionamiento del sistema

Tengo el producto y, por una bomba peristáltica, hago pasar el producto a un vaso
principal que, mediante otra bomba, va a estar conectado a la membrana de
filtración tangencial, y según la bomba va movilizando el líquido del reservorio
principal se van separando los contenidos.
Las partículas que sean más pequeñas que el poro pasarán al vaso de permeado y
las que sean más grandes serán devueltas al vaso principal. Este proceso se repite
hasta que todas las partículas están filtradas. El retenido es el agua que llevan las
proteínas (los puentes de H de sus enlaces)

Si quiero lavar bien las células lo hago a través de diafiltración, poniendo en

marcha un segundo vaso con tampón y rellenando el vaso que contiene el
retenido con el tampón, eliminándose así los restos del medio por permeado.

7. PURIFICACIÓN DE ENZIMAS

Enzimas extracelulares
1.) filtramos las enzimas.
2.) En el segundo tubo separamos por carga a las proteínas y las eludimos con
sales (Naci) → dilución del volumen,
3.) Ultra filtramos de nuevo para volver a concentrar el extracto y, también,
podemos cambiar el tampón.
4.) Filtración en gel (proteínas terapéuticas), donde separamos por tamaño las
proteínas y de ahí las pasamos por un filtro para quitar los restos de virus.
5.) Ponemos en un medio que conserve la enzima
6.) La esterilizamos y
7.) Hacemos la formulación y llenado del extracto
Cuanto más purifiquemos las enzimas, más caro será su coste. Por ejemplo, si se
la vamos a inyectar a un paciente (fines terapéuticos), es necesario que esta pase
por varios procesos de purificación.

Para purificarlas, en primer lugar, en el fermentador se cultiva el microorganismo y

se separan las células del medio. Después, se pasan por un colador con palas
rotatorias, donde el líquido entra y gracias a un cepillo interior hace que no se
colapse el colador. A continuación, pasamos la muestra a la centrifuga donde se
separan las células. Tras esto, se revelan las células para que puedan entrar las
enzimas enriqueciendo el medio intracelular o limpiando bien las células. Una vez
hecho esto, la pasamos por una segunda centrífuga para limpiar bien las
células y aumentar el rendimiento.

Enzimas intracelulares
1.) Se cultivan los microorganismos y se separan las células del medio en el
fermentador
2.) Pasan por un colador de palas rotatorias
3.) Se pone la muestra en la centrífuga donde se separan las células
4.) Se mete en el rompedor de células de alta presión, donde las células pasan
por un poro y estallan.
5.) Se centrifugan y da un sobrenadante
6.) Todo va al filtro ejerciendo una mayor presión perpendicular

Existen 2 mecanismos para separar células

- No mecánicos a nivel de laboratorio
àfísicos: choque osmótico por
presión o por microondas en
presencia de metanol
àquímicos: detergentes
àenzimáticos: lisozima
- Mecánicos a nivel industrial
à perlas de cristal: rompen las células
mediante movimientos circulares
à ultrasonidos: sonicación por pulsos

8. ESTABILIZACIÓN DE ENZIMAS
Métodos que ocultan las empresas

•ADITIVOS
o Fuerza iónica: se aumenta la concentración de sales ya que se retiene el
agua libre de las proteínas que usan para formar puentes de H, por lo que
estas pierden flexibilidad (congelan), y el agua es usada para formar sales.
Pueden ser estabilizadoras o desestabilizadoras.
o Cationes: la enzima los retiene en su centro activo.
o Polioles: reducen la actividad del agua. Sorbitol y glicerol → todos sus OH
forman puentes de H con el agua con más facilidad que las proteínas, por
lo que también contribuyen a su congelación.
 o Sustratos:
- Tioles: evita la ruptura de los puentes disulfuro.
- Ácido benzoico: conservantes → no crezcan microorganismos.
- Inhibidores de enzimas contaminantes
- Agentes tratantes: inhibe la actuación de las metaloproteasas.

• MODIFICACIÓN COVALENTE
Se modifica la lisina de las proteasas para que estas no se digieran a sí mismas
(autolisis).

• INMOVILIZACIÓN
- Ventajas: se puede usar más veces, es más estable en disolución acuosa
(cuanta más facilidad de movimiento tenga una enzima, más fácil que se
desnaturalice), se puede parar la reacción de forma inmediata, los
productos más limpios y separados más fácilmente por la enzima y
sistemas multienzimáticos.

- Desventajas: el soporte supone un coste, no todas se pueden inmovilizar,

cuando el sustrato es insoluble este proceso no se puede llevar a cabo (se
sepulta el catalizador) y hay problemas difusionales

Siempre debemos tener un control de calidad de los lotes, una seguridad y

cumplir las normas GLP

9.1. Técnicas para inmovilizar enzimas

• Unión a un soporte
- Físicas la podemos complementar con un entrecruzado, que es un reactivo
disfuncional (2 brazos), que forma un entramado → malla alrededor del
soporte.
- Unión tónica
- Covalente: Irreversible, unión fuerte, muy estable. Coste alto e inactiva a la
enzima.
- Unión por la quelación de un metal
- Por afinidad: Unión irreversible de las enzimas. Podemos elegir la
orientación de la enzima. Alta selectividad (colas específicas) y alta
sensibilidad. Los inmovilizadores de afinidad son muy caros, así como el
etiquetado y el reciclado del soporte y la molécula a usar.

• Unión en entrecruzado: Irreversible, fuerte unión, muy estable y

económico, pero pérdida de actividad, ya que el entrecruzador suele ser
tóxico para las enzimas.

• Unión por atrapamiento: irreversible, dependiendo del porcentaje de

alginato, se puede aumentar el tamaño del poro. Posible pérdida de
actividad, baja reproducibilidad, poco tiempo de uso y sensible a la fuerza
iónica y pH de la disolución. Puede ser por microcápsulas o por fibras
Ejemplos de inmovilización

INMOVILIZACION EN GRUPOS EPOXI: eupergit es una cadena lineal que vamos a

decorar con grupos epoxi (unión de grupos amino a la enzima). Para que esto
forme una malla utilizaremos una bismetacrilamida (entrecruzado)
La inmovilización covalente de la enzima se efectúa cuando sus grupos amino se
unen a los grupos epoxi a un ph de 8,2
Las resinas epoxi también pueden reaccionar con los tioles y grupos OH, pero
tienen más afinidad con los aminos
Ya que hay una unión multipunto de la enzima (todos los grupos amino), pero
algunos de los epoxi se quedan sin usar. Para evitar que reaccionen con el
producto y bajen el rendimiento de la reacción, echamos un aminoácido como la
glicina para que bloquee los epoxi que no han reaccionado con la enzima →
catalizador no interacciona con
sustrato ni con producto.
- Espaciadores: permite que
la enzima no este
directamente en contacto
con el soporte
(inmovilización indirecta)
Cuanto más pequeñas las perlas,
mayor será la relación superficie
volumen y, por tanto, más eficaz

INMOVILIZAICON CON ALGINATO

Polímero producido por algas marrones formado
por 2 ácidos: gluronato (G) y el maldonato (M).
Cuando se pone en contacto con el calcio → genera
cajas que queratán el calcio (cajas GG) con forma
de cajas donde se guardan los huevos) →
entrecruzamiento entre las cajas forma una malla
molecular en cuyos huecos se pueden atrapar las
enzimas

Proceso: una disolución de alginato +

biocatalizador, la pasamos por presión y echamos
las gotas en una disolución de cloruro cálcico
(CaCI2) → gotas gelificadas → gel de alginato dónde
estará la enzima capturada.
Si queremos hacer varias perlas, lo que utilizamos
es un sistema con una membrana y un soporte
piezoeléctrico, donde el soporte sube y baja, lo que
hace que se tape el capilar y se formen gotas de
manera mas eficiente.
TEMA 3: APLICACIONES INDUSTRIALES DE ENZIMAS SOBRE AZÚCARES
1. Dulzor de los alimentos
- Monosacáridos: glucosa y galactosa son menos dulces que el azúcar de
caña (azúcar natural). Mientras que la fructosa es un 30% más dulce que el
azúcar de caña.
- Disacáridos: si lo compramos con los monosacáridos, el dulzor disminuye
en un 80%.
Si hidrolizamos la sacarosa: rompemos la unión de glucosa + fructosa → libera
fructosa → aumentamos dulzor.
Hidrolizamos lactosa: glucosa + galactosa → e l dulzor final no supera e l dulzor
de 0,7, no dan más que 0,7
- DE: equivalente de dextrosa (es lo mismo que glucosa). Nos indica la
cantidad de glucosa libre en el producto.
Cuanto más complejo sea el polisacárido → menor será el DE → menor dulzor.

- Jarabes de alta conversión: 1 o 2 moléculas de glucosa → muy poco dulzor (no

llega a 0,7).
- Jarabes ricos en fructosa (HFCS de fructosa 42%) mismo dulzor wue el azúcar
de caña pero enriquecida con fructosa. Jarabas ricos del 55% → 10% más de
dulzor que el azúcar de caña.

Aspartamo es un edulcorante
• Proceso: sacar el almidón del maíz convertirlo a glucosa → convertirlo a
fructosa → coca cola. La coca cola tiene ácido fosfórico: que nos sirve para
quitar el óxido al hierro, pues tiene un pH de 3.
• Origen: estos jarabes surgen con la primera crisis el petróleo en 1973. Esto
coincidió con un aumento del precio del azúcar → enzima xilosa isomerasa →
capaz de convertir la glucosa en fructosa, pero no al 100%. Se rompe cuando
llega al equilibrio (42%) → sabe igual que el azúcar de caña.

2. XILOSA ISOMERASA
2.1. Métodos de inmovilización para la
explotación comercial de la glucosa
isomerasa.
- Las células las perforo con tolueno y
las entrecruzo con un glutaraldehído, se
forma un gel de bacterias perforadas que
pasamos por un tamiz tamaño partícula
pequeña → buena relación superficie-
volumen → inmovilizador
barato.
- Las enzimas que utilizo son
termoestables (90°C), duran más, mayor uso. Necesitan magnesio para
funcionar y son inhibidas por iones divalentes (Ca2+)
- A la hora de escoger la enzima, tenemos que buscar la más productiva →
constante catalítica mayor (más moléculas de sustrato convierte por
segundo).
 3. ALMIDÓN Y GLUCOSA
3.1. Componentes del maíz
- Endospermo: rico en almidón, gluten y fibra.
- Pericarpo: rodea a la semilla (fibra).
- Germen: aceite, proteínas y fibra.
- Punta del grano: junto con el pericarpo
forman el salvado.
A partir del germen, se pueden fabricar jabones,
aceites, gominolas, explosivos, salsas y darles
textura a los productos de cosmética. Para mantener el precio estable del azúcar,
tengo que extraer todo lo que pueda del grano del maíz y valorizarle.
Cada alimento que compremos llevará jarabes ricos en fructosa o glucosa →
dulzor y textura.

3.2. Proceso para extraer el almidón y convertirlo en glucosa + fructosa (jarabe rico
al 42%):
El almidón está compuesto por amilosa (cadenas lináles helicoidales) y
amilopectina (cadenas ramificadas).
A partir de almidón sin modificar (pH 3,5-4,2), lo que hacemos es subir el pH para
ajustarlo a la a-amilasa (primera enzima del proceso) que hidroliza los enlaces a
1,4 de las cadenas lineales, pero se para cuándo llega a las ramificaciones. A
continuación, necesito un ph de 6 y lo subimos con sosa (Na OH) y, además, la
enzima necesita ca2+ para funcionar. Este proceso se llama licuefacción (
extraemos el almidon por alfa amilasas) y se produce en dos reactores, en el
primero se solubiliza al almidón a 105ºC y se activa a la enzima termoestable, y
posteriormente, se baja la temperatura a 95°C en el segundo reactor. Esta fase se
encarga de subir el DE (de 0 a 10-20)

El segundo proceso es la sacarificación: la glucoamilasa hidroliza a-1,4 y, además,

la enzima clave, pululanasa hidroliza enlaces a 1,6 de las ramificaciones a ph 4,5;
por lo tanto, tengo que bajar el pH con HCl y utilizar una amilasa distinta que sea
activa a pH 4-5 (glucoamilasa). En estas condiciones se produce la hidrólisis
completa del almidón en glucosa (DE 100).

Si ya tengo la glucosa, necesito isomerizarla mediante la glucosa isomerasa (ph

7,8). Subimos el pH con sosa (NaOH) y requiere magnesio, pero es inhibida por
calcio. La isomerización da una mezcla de glucosa al 58% y fructosa al 42% →
jarabe rico en fructosa al 42%.

Resumiendo, en la primera etapa tenemos Na+, Ca+, en la segunda Cl- y en la

tercera Na+ y mg+
1: Licuefacción. 2: Sacarificación. 3: Equipos intermedios → necesito dejar la
reacción fundamental en sus condiciones óptimas. Primero elimino los restos de
almidón, y después quitamos las partículas y colores del azúcar que hayan podido
quedar, por lo que decolorizamos la glucosa con una columna de carbón activo. A
continuación, desmineralizamos el azúcar (quitamos mezcla de iones) → en una
columna se intercambian los cationes y en la otra los iones para limpiar
perfectamente el sistema.
Este proceso lo hago con un sistema de 3 columnas
llenas de resina → La primera
recibe caldo contaminado con iones, y lo que se
haya podido escapar de esta
se va a la segunda, que pule (deja que no salga
ningún ión), y, por último, la tercera hay que
limpiarla porque está envenenada (regeneración).
Las columnas no son específicas de un proceso,
van rotando, cada una va a realizar una acción
dependiendo de la fase en la que esté la mezcla.

Tras cada proceso se realiza una cromatografía y una posterior dilución del
producto. Para ajustar la concentración del sustrato para la siguiente enzima, lo
pasamos por un evaporador en film: dejamos caer una película de agua muy fina
sobre un reactor, evaporamos el agua a menos de 100°C y concentramos la
dextrosa hasta un 50%
Una vez obtenida, la isomerizamos y se forma jarabe rico en fructosa al 42%
A continuación, volvemos a decolorizarlo con carbón activo, después la
evaporizamos para concentrarla a 60% DS, y finalmente, desmineralizamos para
quitar los iones y una nueva evaporación, para que nos quede el jarabe rico en
fructosa a 71% DS
Necesitamos someter a la cromatografía el azúcar para llevar la fructosa a una co
de 55%. Para ello, mezclo la fructosa del 90% con un jarabe del 42% → mezcla del
55% de fructosa. Desmineralizo de nuevo los iones de la cromatografía
(intercambio de aniones y cationes en la misma columna pero en diferentes
partes). Por último, evaporación e n film para concentrar el jarabe rico en fructosa
al 55% (cada fabricante lo quiere a una concentración diferente).

3.3. Evolución de la producción de jarabes ricos en fructosa

De 1997 a 2004 aumentó, sin embargo, de 2001 a 2004, disminuyó. Esto quiere
decir que este jarabe ha llegado a su límite, los refrescos de cola ya no se
consumen más. Además, con las redes sociales hay una vuelta a lo "natural", se
consume menos un refresco de cola hecho con enzimas que uno hecho con
fructosa o sacarosa. Por lo que las
refinadoras de maíz han ido cerrando
varias plantas, y han ido buscando
otros productos para sacar la gran
cantidad de almidón que producen sus
factorías → bioetanol, fructosa y
ciclodextrinas → polímeros cíclicos de
glucosa unidos por enlaces alfa 1,4.
Estas ciclodextrinas las produce la
ciclodextrin-glicosil-tranferasa
(CGTasa) que corta las cadenas
helicoidales de la amilosa y las
convierte en unidades cíclicas.

Su importancia reside en que son estructuras troncocónicas (COH de la posición

6 es flexible y gira), que tienen una parte externa hidrofílica (OH y H) y una interna
hidrofóbica (H y C). la cavidad alfa, beta y gamma son mas grandes al tener mas
moléculas y las más solubles son las beta porque solo permiten disolverse muy
poco cada 100 ml, por lo que modificamos las ciclodextrinas y aumentamos la
solubilidad hasta 80 veces con respecto a lo natural.

Interacción "hospedador" "huésped" → las sustancias insolubles en agua, como el

fenol, desplaza las moléculas de agua y las introduce en la cavidad hidrofóbica,
impidiendo que el agua forme con él un puente de hidrógeno.

3.4. Usos y aplicaciones de las ciclodextrinas

• Solubilización: aumenta solubilidad en agua → aumenta la concentración total
de ese compuesto en la disolución → sustrato + ciclodextrina → CD-S → el sustrato
es libre en el medio, pero si miro la disolución, tengo una parte libre (Sl) y otra
incluida en la disolución (CD-S), por tanto, no aumenta la solubilidad intrínseca
de un compuesto (no aumenta SI), pero si la CD-S. Por ello, evita uso de
disolventes orgánicos, y cambian las propiedades reológicas (evita
cristalizaciones y precipitaciones).
• Reducen olores desagradables y enmascaran el mal sabor → si se captura el
volátil dentro de la ciclodextrina.
• Extracción selectiva: separación de los enantiómeros y efecto secuestrante →
dentro de las ciclodextrinas.
• Estabilización: frente a la luz, temperatura, oxidación e hidrólisis.
• Liberación controlada: modula fármaco-aditivo → puedo administrar dos
compuestos incompatibles.
• Aumenta biodisponibilidad: aumenta solubilidad y la interacción con
membranas → captura sustancias como el colesterol o entrega sustancias de l a
ciclodextrina a la membrana (liberación controlada).
• Simplifica manejo de determinadas sustancias reduciendo su volatibilidad y
convierte aceites en polvo.

Se utilizan en farmacia (omeprazol), alimentación (flavorizantes y eliminan el

colesterol de las membranas), cosmética (reduce arrugas → vit A,
acondicionadores → vit A y E, toallitas húmedas con perfume), textil (reducen olor
corporal y de tabaco, y evitan desteñimiento), agroquímica (solubiliza pesticidas),
analítica (columnas quirales HPLC) y biotecnología (enzimas artificiales → simulan
un centro activo en la ciclodextrina, y biocatálisis → convertir un producto
insoluble en agua aumentando la concentración final de sustrato, y cada vez que
la enzima se coma un sustrato, la ciclodextrina le va a añadir uno nuevo).
TEMA 3: USO DE ENZIMAS EN AMINOÁCIDOS

1. PREPARACIÓN DE AMONOÁCIDOS (no aprender fórmulas, sólo

compuestos)

• Reacción de Strecker: aldehído + cianuro → amino nitrilo → racémico

- Mezclamos acetaldehído con cianuro potásico y cloruro de amonio → imina
inestable → amino nitrilo + calor → aminoácido.

A partir del amino nitrilo lo ponemos pH ácido sin calentar , se forma un

aminoácido amida racémico. Este es sustrato de enzimas como la L-amidasa que
actúa sobre la L-amida, rompiéndola y dando lugar al L-aminoácido + D-
aminoácido amida. Estos dos compuestos ya se pueden separar con facilidad.
Además, el D-aminoácido, mediante D-amidasas, puede ser separado.

- Interés: estos D-aminoácidos no se

metabolizan, por lo que, su
aclaramiento plasmático es más
lento y su tiempo de actuación es
más largo, por esta razón, podemos
hacer que las dosis de un fármaco se
puedan distanciar más en el tiempo →
compañía francesa DSM.

2. PRODUCCIÓN DE AMINOÁCIDOS
Forma derivada de la reacción de Strecker: N-acil-DL- aminoácido mediante la
aminoacilasa → L-aminoácido+ acético + N-acil-D-aminoácido. Estas sustancias
las puedo separar con facilidad.
Proceso: empezamos con el N-acil-DL-aminoácido, lo calentamos y ajustamos el
pH a 7 y le echamos 0,5 milimolar de cobalto, para que la enzima aminoacilasa
funcione. Esta la inmovilizamos en un reactor. Ahora la pasamos con un
evaporador en film, aumentando así la concentración de los productores de la
reacción → cristalizador (tanque que se agita → cristales). Obtenemos el L
aminoácido cristalizado y el N-acil no lo hace, por lo que los tendremos
completamente separados. Este ultimo, lo racémico a 60 ºC con ácido acético y
vuelvo al tanque inicial para repetir la reacción. Rendimiento enzimático del 91% y
el rendimiento racémico del 94%
 3. PRODUCCION DE D- AMONOÁCIDOS ACTIVOS INMOVILIZADOS CON
HIDANTONIDASAS
Baeyer en 1891: ve que juntando glyoxal y urea se forma racémico hidantoina

3.1. Sistema hidantoinasa/carbamoilasa

Gracias a la hidantoinasa producimos un L-aminoácido, y si bajamos el pH por
debajo de 8, nos da un carbamoilo, donde actúa la L-carbamoilasa, que lo rompe
a L-aminoácido + CO2 + NH3 → aminoácido purificado.
Si, por el contrario, lo que quiero hacer es un D-aminoácido, lo que hago es
desplazar el equilibrio hacia la derecha subiendo el pH por encima de 8, D-idantoil
+ D-hidantoinasa, nos da D-carbamoilo, que con la D-carbamoilasa nos la un D-
aminoácido → útiles en fármaco

3.2. Ruta de síntesis de la D-citrulina

D-valina: sintón (molécula que actúa como intermediario en una síntesis
orgánica). Esta sirve para hacer insecticidas piretoides como el fluvalinato que
combate ácaros varroa, que se come el hígado de las abejas.

D-citrulina: convertimos la L-arginina con la L-arginasa → L-glutina + urea. Si hay

un aminoácido, esta nos da lugar a la L-cit-hidantoina. Ahora subimos el pH y con
la hidantoidasa y carbamoilasa nos da la D-citulina.

La D-citrulina se encuentra dentro de un polipéptido que contiene varios

aminoácidos. Este se usa como antagonista de la hormona liberizante de la
hormona luturizante, con el fin de que no se liberen los embriones que se han
implantado en la inseminación artificial. Fármaco.
También se usa para la obtención de D-hidroxi-fenilglicina → decorar el núcleo de
las penicilinas → penicilinas semisintéticas → ampicilina y amoxicilina

3.3. Sintesis de D-fenilalicina

Benzaldehído + cianuro sódico+ carbamato amónicoà fenilhidatoina, si le

añadimos hidantoinasa se forma D-N-carbamoil-fenilglicinaà D- fenilglicina

Los aminoácidos tienen un valor en el mercado muy grande y se venden en

grandes cantidades. La tirosina fenol liasa se encarga de unir el catecol con
pirúvico y amonio → L-DOPA)(anti-Parkinson). El problema, es que la enzima usa
un cofactor que es muy caro, el fosfato de piridoxal, y se hace en células
completas. En un reactor de lote alimentado (fed-batch) → lleno el fermentador →
células crecen, y conforme les falte alimento, les voy echando más → 250
toneladas al año
para que sea efectivo, se ha modificado en una compañía el microorganismo de
donde se saca el catecol para que no necesite la tirosina de inductor.

4. AMINACIÓN REDUCTIVA DE CETOÁCIDOS

L-tert-Leucina se produce enzimáticamente por aminación reductiva → un

cetoácido lo voy a convertir en el correspondiente aminoácido.
El trimetilpiruvato mediante la leuclia deshidrogenasa lo convierto en L-tert-
leucina, lo que hago es reducir un grupo ceto a un
grupo amino a costa de oxidar el NADH a NAD. Pero
como este es un cofactor caro, tengo que reciclarlo
con la enzima FDH (formiato deshidrogenasa), que
tiene como sustrato el formiato amónico, que me da
como producto el CO2, y que al ser un gas no nos
interviene en la reacción → reciclado de NADH Para
llevar a cabo este proceso, necesito un reactor de
membrana, donde ambas enzimas funcionan al
mismo
tiempo, y para que le NAD no se escape por la
membrana, lo modifico con polietilenglicol
hidrofóbico por lo que no atraviesa
los metilos que llevan los aminoácidos se usan para
antivirales, antinflamatorios, antitumorales y
sintones para producir otros fármacos
 5. DESAMINACIÓN OXIDATIVA

Convertimos el grupo amino en grupo ceto mediante la D-aminoácido oxidasa,

que lleva el cofactor FAD en su centro activo, y utilizando el oxígeno molecular,
oxida el grupo amino a ceto a expensas de que el FAD se reduzca a FADH2. Este
oxígeno volverá a oxidar el FADH2 a FAD → peróxido de hidrógeno. Esta enzima se
usa para hacer acetoácidos de mezclas racémicas de aminoácidos, que se usan
para nutrición parenteral (muy enfermo) y molasas (subproducto de hacer azúcar
de caña) como pienso para animales.

6. SÍNTESIS ENZIMÁTICA DE ASPARTAMO

El aspartamo (fenilalanina) es edulcorante de los refrescos de cola. Aspartamo-

fenilalanina-metiléster → edulcorante → sustancia más duice que existe. Por lo que
solo hace falta un 1% de aspartamo para igualar el dulzor de la sacarosa →
refrescos de cola sin azúcar.
Una compañía japonesa descubrió un método enzimático para hacer aspartamo:
fumárico se une al amonio gracias a la aspartasa → aspártico → bloqueo el N del
aspártico por el benciloxicarbonilo (Z, cloruro de ácido), y los dos grupos carboxilo
del aspártico (a y B).

Este compuesto lo unimos con fenilalanina, y para bloquearle el grupo carboxilo le

introduzco un metiléster → DL-fenilalanina metilester es un racémico, porque la
proteasa termolisina es una enzima estereoespecífica (actúa sobre el isómero L) y
region especifica (une la fenilalanina en uno de los dos carbonos en una posición
específica, en el carbono alfa y no en el beta, ya que el aspartamo sería amargo,
en cambio, cuando se une al alfa es dulce). Además, esta enzima no es capaz de
hidrolizar este metilester, ya que si lo hace dejaría de ser dulce el aspartamo.
Distingue la posición, la región y no lisa.

Lo que nos queda es hidrogenizar el Z-aspartamo → aspartamo. Esto se hace en un

reactor de membrana con enzima libre porque cuando se condensan ambos
aminoácidos para dar el Z-aspartamo es insoluble y precipita, entonces si la
enzima estuviese inmovilizada, el
aspartamo atacaría a la enzima y
perdería solubilidad. El 2- aspartamo,
si lo racemizamos lo podemos volver a
introducir en el sistema con el fin de
reducir los costos.

El edulcorante más potente que hay en

la naturaleza es la taumatina, que es
una proteína, que es 100000 veces
más dulce que la sacarosa, y el
aspartamo es 180 más dulce que la
sacarosa.
TEMA 5: APLICACIONES INDUSTRIALES DE ENZIMAS EN LA PRODUCCIÓN DE
ANTIBIÓTICOS

1.3PENICILINA G AMIDASA

Descubrimiento de la penicilina por Fleming accidentalmente en 1928. Pero este

no sabía purificarla, entonces,
Florey junto con Boris Chain pudieron purificarla y producirla industrialmente.
Al producirla empezaron a aparecer resistencias a ella, por ello, en 1961, se
descubrió la primera penicilina semisintética → utilizamos el núcleo de 6
miembros de la penicilina para decorar su posición 6 con distintas cadenas
laterales. Esto fue hecho por la compañía Beecham, y de aquí surgió la Ampicilina.

Para realizar este proceso se necesitan unas condiciones específicas, pues el

anillo -lactámico es muy sensible, temperaturas de -80°C, disolventes orgánicos y
sin agua
La penicilina G amidasa era capaz de hidrolizar la cadena lateral de la posición 6 →
6-APA y ácido fenilacético a temperatura ambiente/ a un pH de 7,5 a 8. La ventaja
era que el ácido fenilacético que se producia se podía reinyectar en la
fermentación, haciendo que el microorganismo no la tuviese que realizar → más
concentración de penicilina G en el medio.

1.1. Producción de 7-ADCA

La cefalosporina G fue obtenida a partir de penicilina G → expandir el anillo de 5

miembros a otro de 6 miembros.
Esta reacción se le denomina black box, ya que no se sabe cómo discurre
internamente. Esta cefalosporina es sustrato de la PGA → antibióticos ß-
lactámicos.
El 7-ADCA se usa como intermedio para hacer antibióticos cefalosporínicos de
segunda generación (PAA). La reacción se hace por toneladas en un reactor
bioenzimático con Eupergit C (inmovilizador industrial). Si lo utilizamos junto con
la PGA de [Link] enzima muy resistente y reutilizable hasta 1000 veces.
El ácido fenilacético al tener un pH muy
ácido, por lo que tenemos que
contrarrestarlo (tiene 3 y la reacción se
produce a 7,5), usando un pH-stat (va
echando sosa o ácido para que el pH se
mantenga constante). Se va a utilizar
el amonio para que cuando caiga dentro
del reactor no mate a la enzima. Este se
echa en el cilindro junto con una gota de
ph 12 → homogeneizar → conseguimos
que se mantenga a un pH de 7,5-8.
Además, se usan unas palas especiales
para que mantengan a la enzima, pues el
objetivo es mantener al máximo la vida
de la enzima.

2 . SÍNTESIS ENZIMÁTICA
La PGA es capaz de sintetizar antibióticos. El fenilacético lo une al núcleo beta
lactámico (6APA) para darnos penicilina G de nuevo, no interés
Si pongo nucleófilo en lugar de agua se producen antibióticos.
Si usando el 6 APA le pongo un donador de acilo activado (metil éster en este caso)
de fenilglicina o parahidroxi feniglicina → dos antibióticos → ampicilina (D-
fenillicina metil éster) y amoxicilina (para hidroxifenillicina metil éster).
Si por el contrario, uso el 7 ADCA → cefalexin v cefadroxil.

PROCESO
Controlado termodinámicamente (controlando la cte de equilibrio): para que las
cadenas se hidrolicen, tenemos que bajar el ph a 4,5 pero la enzima no le viene
bien pues su ph óptimo es de 7,5 entonces, fusionamos el ph óptimo de la enzima
y el pk del donador de acilo (COOH) para ello, echamos disolventes orgánicos al
pk y hacemos que la enzima trabaje a ph 6 (trabaja pero a menos actividad). Para
que vaya en la dirección de síntesis (derecha) echamos una gran cantidad de
nucleófilo → cuanto más nucleófilo más producto obtengo. En este proceso
tenemos ENZIMA.

Controlado cinéticamente (actuando sobre las propiedades de la enzima): la

misma enzima tiene 3 actividades funcionando al mismo tiempo dinámicamente:
capacidad de coger nuestro donador de acil activado (metiléster) que con el
nucleófilo va a actuar como sintetasa, que va a dar lugar a nuestro antibiótico
semisintético. Pero la enzima también va a actuar como amidasa sobre el grupo
amida hidrolizándolo. Al mismo tiempo, esta es una esterasa que va a hidrolizar el
metilester.
En este proceso tenemos ACIL ENZIMA, y depende de la concentración de enzima.
del pH (6-8), de la temperatura (menos de 10°C) → inhibimos la actividad amidasa
(25°C: hidrolisis, <10°C: hidrolisis). El nucleófilo (6 APA) lo tenemos a
concentración de 0,1 molar y el donador de acilo a 3-5 molar, y para que tenga
suficiente éster, siempre tiene que estar la enzima activada como acil enzima. Por
último, también depende de la fuerza iónica y de la solubilidad del producto.
Este sistema es mejor que el termodinámico.

¿Como hacemos que esto haga síntesis del compuesto? Mediante ingeniería del
medio favorecemos la sintetasa con la actividad amidasa.

2. PRODUCCIÓN ENZIMÁTICA DEL ÁCIDO 7-AMINOCEFALOSPORÁNICO (7-

ACA)

Necesitamos dos enzimas para eliminar la cadena lateral

de la
cefalosporina, que es un D-aminoácido, y utilizamos la D-
aminoácido
oxidasa → desaminaciones oxidativas. Es una flavoenzima
que necesita
oxígeno para reciclar su FAD
El intermedio lo descarboxila y nos da el glutaril 7-ACA.
Este lo hacemos pasar por una segunda enzima donde la
cadena lateral se quita por una glutaril 7-ACA acilasa, que
nos da lugar al intermedio avanzado 7-ACA → a partir de
este se hacen las 4 generaciones de cefalosporinas que
existen. El peróxido es altamente reactivo y puede fastidiar
el centro activo de la enzima.
4. ENFOQUES SINTÉTICOS DE LA CEFUROXIMA
Para hacer la cefuroxima, partimos de la cefalosporina C y cambiamos la posición
7 y la posición 3. Dos formas:
- 3 → 7: primero quitamos el acetilo de la posición 3 con la acetilsiran
esterasa y nos queda un OH libre. Ahora carbamoilamos la posición 3
químicamente y hacemos reaccionar la posición Z con un grupo amino →
cefuroxima.
- 7 → 3: reaccionamos con cloruro de ácido la Z. Después, la acetilxilan
esterasa reconoce solo la posición 3,y se nos queda el OH libre dando lugar
a la cefuroxina.
TEMA 6 : APLICACIONES INDUSTRIALES DE LAS ENZIMAS SOBRE LÍPIDOS Y
OTROS COMPUESTOS DE ALTO VALOR AÑADIDO

1. PRODUCCIÓN DE ACRILAMIDA
Se va a produje a partir de sustancias que tienen
2 nitrilos por dos vías
- Directa: el nitrilo más dos de agua dan
ácido nítrico más amonio a través de la
nitrilasa
- Indirecta: en dos etapas, en la primera el
nitrilo se transforma en amida mediante
la nitril hidratasa y esta amida es
hidrolizada por la amidasa para
convertirse en ácido nítrico y amonio
La nitrato hidratasa también se usa para
convertir acrilonitrilo en acrilamida

PROCESOS:
- Químico: más pasos. Necesitamos temperaturas 80-140°C. Cobre como
catalizador y necesitamos realizar un par de pasos para recuperarlo. El
rendimiento no es completo y sólo llega a un 60-70%, por lo que queda
acrilonitrilo sin reaccionar → reciclarlo. Además, se genera una acrilamida
de peor calidad porque se producen reacciones y productos no deseados →
purificar la acrilamida, y genera cianhídrico (gas muy tóxico). Por lo que
solo se puede dar en vías de industrialización o en países cuyas medidas
ambientales no sean muy estrictas

Los microorganismos que la producen son las bacterias Rhodococcus

- Enzimático/biotecnológicos: temperaturas de 10°C Conversión al 100% del

ácido nitrilo, no da productos secundarios y los pasos de purificación son
más cortos → reducción del costo. La acrilamida que nos da es altamente
pura, y es la que utilizaremos en el laboratorio.

Los microorganismos que la

producen necesitan la presencia
de sales de cobalto y nos
produce dos tipos de nitrilo
hidratasa dependiendo del
inductor que le echemos al mco
(microorganismo). Inductores:
- Urea → nitrilo hidratasa
de alto peso molecular,
específica de nitrilo
alifáticos.
 - Ciclohexano carboxiamida → nitrilo hidratasa de bajo peso molecular y es
específica para actuar sobre nitrilo aromáticos
- Crotonamida → se van a inducirlos dos nitrilos hidratasas.

Lo bueno que tiene esta enzima es que es activa sobre otros sustratos, no solo
sobre el acrilonitrilo. Sobre el nicotinonitrilo e s activa y produce → nicotinamida
(metabolismo de NAD) → usada e n cosmética (niacinamida). Compañías que la
fabrican: dow, nitto (japonesa que aporta un 15% del mercado global de la
acrilamida enzimática), american cinamida

2 . PRODUCCIÓN DE HERBICIDAS DERIVADOS DEL R-FENOXIPROPIÓN

R-dehalogenasa: actúa sólo sobre el isómero R del racémicos ácido R,S-2
cloropropiónico → S-2-cloropropión + Ácido L-láctico.
Este cloro es altamente reactivo y en presencia de un anillo aromático va a realizar
una sustitución nucleofílica binuclear (SN2), que trae como consecuencia la
inversión de la configuración → invierte el isómero y nos da así el R-fenoxipropión.
Y dependiendo de los radicales R, tendremos los distintos herbicidas con el
isómero R que son los que necesitamos, pues son los herbicidas activos.
Uno de los más utilizados es el Fluazifop (fusilade es el nombre comercial). Con
este proceso, se producen en Inglaterra 2000 toneladas al año.

3. USO DE LAS LIPASAS EN PROCESOS ENZIMÁTICOS

Usos en manteca de cacao:
No hay suficiente manteca de cacao obtenida naturalmente para abastecer el
gran requerimiento. Por lo que se utiliza el aceite de palma, que a temperatura
ambiente es un líquido, por lo que mediante una transferificación realizada por
una lipasa, va a cambiarme los ácidos grasos saturados del aceite de palma por
otros.
Nos da un 20% del ácido original (palmítico, POP), 50% (pOST) y 30% (StOSt) de
otros ácidos grasos. Y esto hace que se funda a 372C, lo que hace que nos
encante la sensación de fundido.

C3 Sintons
R,S glucidil butirato, mediante una lipasa del páncreas de cerdo, nos da R-glucidil
butirato + S-glicidol.
Estos dos productos se usan para fabricar fármacos.
Ejemplos: betabloqueante que regula la presión oftálmica y tratar los glaucoma
TEMA 7: ANÁLISIS DE EXPRESION GÉNICA. CHIPS ADN

1. ANÁLISIS DE EXPRESIÓN GÉNICA

El análisis de expresión génica es fundamental para entender cómo se regulan los

genes en diferentes condiciones celulares. Utiliza técnicas como la hibridación,
PCR en tiempo real y el uso de microarrays para cuantificar la expresión de miles
de genes simultáneamente. Estas herramientas permiten identificar qué genes
están activados o desactivados bajo diferentes condiciones, proporcionando un
panorama detallado de las funciones celulares.

2. DNA CHIPS (MICROARRAYS DE ADN)

Los DNA chips, o microarrays, son matrices que contienen miles de sondas de
ADN que se utilizan para detectar la expresión génica en una muestra. Estas
matrices permiten el análisis masivo de genes, proporcionando información clave
sobre cómo los genes están regulados. Los microarrays han sido cruciales en la
investigación del cáncer, ya que permiten identificar patrones de expresión
aberrantes característicos de tumores malignos.

3. SECUENCIACIÓN MASIVA DE GENES (NGS)

La secuenciación masiva ha transformado la biología molecular, permitiendo la

lectura simultánea de millones de fragmentos de ADN. Esto ha hecho posible
secuenciar genomas completos de forma rápida y asequible. Esta técnica ha sido
fundamental para descubrir mutaciones en genes asociados con enfermedades
hereditarias y para estudiar la biodiversidad genética en poblaciones humanas.

4. APLICACIONES CLÍNICAS

El uso de análisis de expresión génica y secuenciación masiva tiene aplicaciones

directas en la medicina personalizada, donde los tratamientos se ajustan al perfil
genético del paciente. Por ejemplo, en oncología, la secuenciación de genes
tumorales permite seleccionar terapias dirigidas que actúan específicamente
sobre las mutaciones que impulsan el crecimiento del tumor. Además, estas
tecnologías permiten un diagnóstico más preciso y la identificación de
biomarcadores para la detección temprana de enfermedades.
 1. Microchip con micro-pozos:
El Ion Torrent utiliza un chip que contiene una serie de micro-pozos, cada
uno de ellos con una pequeña cuenta o perla (bead) que tiene múltiples
copias idénticas de fragmentos de ADN que provienen de una biblioteca de
secuencias. Estos fragmentos de ADN se hibridan en estas cuentas.
2. Incorporación de nucleótidos y liberación de iones de hidrógeno:
Cada vez que un nucleótido se incorpora al ADN en la perla (es decir,
cuando el nucleótido se une a la cadena de ADN en crecimiento), se libera
un ion de hidrógeno (H⁺). La liberación de este ion provoca un cambio en el
pH del medio que rodea el micro-pozo.
3. Detección del cambio de pH:
El cambio en el pH se detecta mediante un sensor situado en el fondo del
micro-pozo. El sensor detecta la presencia de los iones de hidrógeno
liberados por la incorporación de nucleótidos. Este cambio de pH se
convierte en una señal de voltaje.
4. Generación de señal de voltaje:
La señal de voltaje generada es proporcional al número de nucleótidos que
se han incorporado. Si un nucleótido se incorpora, se detecta un pequeño
cambio de voltaje; si se incorporan varios nucleótidos de forma continua,
la señal será mayor.
5. Secuenciación basada en tiempo:
El proceso de incorporación de nucleótidos se repite de manera cíclica,
cambiando el nucleótido suministrado cada 15 segundos. Así, el sistema
puede ir determinando la secuencia de bases del ADN según el orden en
que se incorporan.

Importancia en Bioquímica Analítica:

• Detección precisa: Esta técnica permite la secuenciación masiva de ADN

de manera muy precisa y rápida, ya que puede procesar múltiples
fragmentos simultáneamente. Es clave para el estudio de genomas
completos.
• Secuenciación sin fluorescencia: Ion Torrent no utiliza marcadores
fluorescentes,
sino que mide
cambios en el pH,
lo que reduce el
costo y el tiempo
del proceso.
• Aplicaciones
clínicas.
 6. MEDICINA PERSONALIZADA
La medicina personalizada se basa en la idea de que cada individuo tiene un perfil
genético único, y que los tratamientos médicos deben adaptarse a estas
diferencias. La secuenciación masiva y el análisis de la expresión génica han
permitido el desarrollo de terapias dirigidas que ofrecen una mayor eficacia y
menos efectos secundarios en comparación con los tratamientos tradicionales.