Tema 15: Ingeniería genética
La Ingeniería genética es el conjunto de procedimientos y técnicas que permiten
manipular las moléculas relacionadas con la herencia para obtener nuevos
productos y servicios.
1. Técnicas de manipulación del ADN
En 1985, Kary Mullis desarrolló una técnica de amplificación del ADN denominada
“reacción en cadena de la polimerasa” o PCR. Esta técnica permite obtener un
número elevado de copias de un fragmento de ADN en el laboratorio.
Para llevar a cabo la PCR es necesario:
• Disponer del fragmento de ADN que se quiere amplificar.
• Una ADN polimerasa purificada (taq polimerasa procedente de
bacterias termófilas) • Cebadores específicos diseñados y sintetizados
para el fragmento problema. • Una mezcla de nucleótidos trifosfato con
las cuatro bases que forman el ADN.
1.1. Procedimiento básico de la PCR
• Calentamiento y desnaturalización. Se induce la separación de las dos hebras
del segmento ADN bicatenario complementarias con un aumento de
temperatura.
• Enfriamiento. Durante esta fase, los cebadores se hibridarán con cada una de
las hebras del fragmento de ADN.
• Ciclos de amplificación. En cada ciclo se sintetizan las cadenas
complementarias de cada una de las hebras que se han separado
previamente. Después del primer ciclo, se repiten los pasos anteriores:
calentamiento, enfriamiento y fases de síntesis de las hebras
complementarias.
El proceso se repite durante varios ciclos, así el ADN se amplifica y se obtiene un
número elevado de copias del molde inicial. Por ejemplo, después de veinte ciclos
de síntesis se consiguen del orden de un millón de copias de la hebra original.
Actualmente, la PCR es un proceso totalmente automatizado.
Las aplicaciones de la PCR, combinada con otras técnicas son múltiples: detección
de especies de organismos de interés, estudios forenses, relaciones evolutivas,
detección de enfermedades genéticas y otras aplicaciones sanitarias, estudios de
la expresión génica, biotecnología, etc.
2. Tecnología del ADN recombinante
Se denomina ADN recombinante a las moléculas de ADN en las que se han
introducido genes exógenos, que se expresan en un hospedador diferente del
organismo del que proceden. Las fases principales de la clonación son las
siguientes:
1. Aislamiento y obtención del gen de interés.
2. Selección del vector de clonación y formación de ADN recombinante.
3. Inclusión del ADN recombinante en un hospedador.
4. Selección de las células clonadas y expresión de los genes exógenos en el
hospedador.
2.1. Generación de fragmentos de ADN
Los fragmentos de ADN exógeno que se pretenden clonar se consiguen utilizando
enzimas de restricción específicas, o a partir de un molde de ARN sobre el que se
utiliza una transcriptasa inversa, o bien empleando un ADN sintético.
Endonucleasas de restricción
Son enzimas presentes en las bacterias, que reconocen puntos específicos y cortan
secuencias determinadas del ADN,
Las enzimas de restricción de tipo II tienen la capacidad de reconocer secuencias
específicas del ADN y producir cortes dentro de las mismas. Las bacterias
presentan diversas endonucleasas de restricción y cada una de ellas corta el ADN
por determinadas secuencias. Mientras que otros tipos de endonucleasas cortan
las dos hebras en el mismo punto originando extremos romos, las endonucleasas
de tipo II lo hacen en lugares diferentes, originando extremos cohesivos que poseen
secuencias complementarias.
También se puede partir de ARN y sintetizar un ADN complementario (ADNc)
utilizando la transcriptasa inversa. La ventaja de este tipo de moléculas es que el
ADNc no contiene intrones y, por lo tanto, toda la secuencia es codificante.
Separación de los fragmentos de ADN
Una vez que se fragmenta el ADN para obtener el gen de interés, estos fragmentos
se amplifican por PCR y se separan utilizando técnicas de electroforesis. Esta
técnica se basa en la aplicación de un campo eléctrico sobre una muestra
depositada sobre el polo negativo: los distintos fragmentos de ADN se desplazan
por el interior del gel hacia el polo positivo alcanzando distintas posiciones en
función del tamaño de cada fragmento.
Para encontrar el gen deseado se utilizan sondas. Las sondas son fragmentos de
ADN o ARN de cadena simple y de secuencia complementaria a la del gen que se
quiere seleccionar. Contienen alguna “marca” que permite revelar su unión a la
secuencia elegida. Esa marca puede ser nucleótidos marcados radiactivamente
mediante fluorescencia.
2.2. Unión del gen seleccionado al vectores de clonación
Los vectores de clonación son moléculas de ADN de pequeño tamaño que tienen
la capacidad de autorreplicarse en las células hospedadoras y es donde se
introduce el gen seleccionado.
Los vectores deben tener las siguientes características:
• Tener un origen de replicación.
• Secuencias de reconocimiento para las enzimas de restricción.
• Genes de resistencia a antibióticos para permitir su selección.
• Tamaño pequeño para facilitar su entrada en la célula.
Se utilizan dos tipos de vectores de clonación: plásmidos y genomas de algunos
virus.
Tipos de vectores de clonación
• Plásmidos. Son moléculas de ADN circular, presentes en algunas bacterias, con
un menor tamaño que el cromosoma. Los plásmidos se replican con
independencia del cromosoma bacteriano, ya que tienen su propio origen de
replicación. Se introducen en la célula hospedadora por transformación.
• Genomas víricos. Se suele emplear el genoma del fago lambda o el del
bacteriófago M13 porque no provocan lisis en las bacterias hospedadoras.
Se introducen en la célula mediante la infección por virus.
Los vectores de clonación se tratan con la misma endonucleasa de restricción que
el gen seleccionado. Cuando se combinan, tanto el fragmento exógeno como el
vector presentan extremos cohesivos, que pueden unirse mediante la enzima ADN
ligasa.
2.3. Introducción en un hospedador
Una vez obtenida la molécula de ADN recombinante se introduce en la célula
hospedadora. La introducción se realiza de forma diferente si es una célula
procariota o bien eucariota.
2.4. Selección de las células clonadas y expresión de los genes
exógenos en el hospedador.
Clonación en células procariotas
Cuando un vector portador de un gen exógeno se introduce en una población de
bacterias, no todas lo incorporan durante el proceso de clonación, por eso es
necesario seleccionar aquellas que lo portan y, además, lo expresan. Es decir, hay
que seleccionar las bacterias que llevan el ADN recombinante.
Para ello se utilizan los genes marcadores del vector, como la resistencia a
antibióticos. Normalmente los vectores llevan dos genes de resistencia a
antibióticos, uno de ellos se rompe al introducir el ADN exógeno y el otro
permanece.
Las bacterias se cultivan en medios que contengan esos antibióticos para poder
seleccionarlas. Solo las bacterias que sean resistentes a uno de los antibióticos
serán las que han incorporado el vector con el ADN exógeno.
Clonación en células eucariotas
La clonación en células eucariotas difieren en algunos aspectos de la que se lleva a
cabo en células procariotas, puesto que sus mecanismos de expresión son más
complejos y contiene intrones.
Cuando se quiere clonar un gen en organismos eucariotas, se debe insertar el ADN
clonado en algún cromosoma de modo que pueda ser expresado en la célula, es
decir, que se transcriba y se traduzca a proteínas. Los vectores de clonación para
estos organismos deben tener la capacidad de insertar el fragmento en alguno de
los cromosomas de la célula.
3. El sistema CRISPR-Cas
El sistema CRISPR son una serie de regiones altamente repetitivas que se
encuentran presentes en el genoma de diferentes especies de bacterias. Están
formadas por dos partes diferenciadas, el operón cas y la región CRISPR. El operón
cas contiene la información genética para codificar las endonucleasas Cas. Por el
otro lado, la región CRISPR está formada por secuencias repetidas intercaladas con
pequeñas secuencias espaciadoras, de origen exógeno, que se corresponden con
ADN de virus que han infectado a las bacterias. Es como un sistema inmune.
Cuando un virus entra en la bacteria, este sistema es capaz de identificar el ADN
exógeno e incluirlo en su “batería” de espaciadores. En primer lugar, las proteínas
Cas son capaces de identificar las secuencia de ADN exógeno, lo cortan generando
un “protoespaciador”, que posteriormente será modificado e insertado en una
secuencia CRISPR.
En segundo lugar, el sistema CRISPR es capaz de identificar el ADN de un virus que
ya ha infectado previamente un organismo unicelular y cortarlo mediante una
endonucleasa Cas, para evitar una nueva infección.
Basado en este sistema, se ha diseñado un sistema de manipulación y edición de
genes. Las proteínas Cas, dirigidas por ARN pueden cortar en sitios específicos y
puede utilizarse para corregir mutaciones, suprimir e insertar secuencias de ADN e
incluso para inactivar genes concretos.
4. Conceptos
Organismos modificados genéticamente OMG: son aquellos microorganismos,
plantas o animales cuyo material hereditario ha sido manipulado mediante
técnicas de biotecnología que resultan ajenas a los métodos naturales de
multiplicación o de combinación.
Microorganismos recombinantes: son bacterias, hongos, levaduras o virus cuyos
genomas han sido modificados para incluir material genético de otros organismos.
Este proceso se realiza con el objetivo de otorgarles nuevas capacidades o mejorar
las que ya poseen
Plantas transgénicas: plantas en las que se ha hecho alguna alteración o cambio
en el material hereditario, bien sea añadiéndole algún gen o por medio de una
modificación del mismo, con el fin de añadir o suprimir una característica por
medio de la aplicación de técnicas de la ingeniería genética.
Animales transgénicos: animales en los que se ha hecho alguna alteración o
cambio en el material hereditario, bien sea añadiéndole algún gen o por medio de
una modificación del mismo, con el fin de añadir o suprimir una característica por
medio de la aplicación de técnicas de la ingeniería genética.
Terapia génica: son un conjunto de técnicas mediante las que se manipulan uno o
varios genes para tratar o prevenir un trastorno genético o una enfermedad. A
menudo, la terapia génica consiste en introducir copias del gen “sanas”, o
reemplazar un gen anómalo o no presente en las células del individuo.
Biorremedación: es un tipo de biotecnología cuyo objetivo es la prevención y/o
solución de los problemas ambientales surgidos de la contaminación. Se basan en
el uso principalmente de microorganismos para que lleven a cabo este proceso de
descontaminación.
