8.1.
SECUENCIACIÓN ÁCIDOS NUCLEICOS
La secuencia de los ácidos nucleicos es el proceso para determinar la secuencia de
nucleótidos que componen una molécula de ADN o ARN.
Se representan con las iniciales de las bases nitrogenadas, en dirección 5’ → 3’ en el ADN.
8.1.1. MÉTODO MAXAM Y GILBERT: Las bases nitrogenadas se modifican químicamente
para poder identificarlas.
Marcaje de uno de los extremos de la molécula con
el isótopo radioactivo 32P: Marcar extremo 5´,
eliminando primero el fosfato, mediante una fosfatasa
alcalina (enzima que elimina) y Colocándole un fosfato
de nuevo mediante un polinucleótido quinasa y ATP
marcado con 32P. [GPS para localizar la molécula]
Reacciones de modificación química de las bases
nitrogenadas: La concentración y condiciones
determinan el núm de bases en cada molécula. 4
alícuotas:
Tubo 1: Modificación de Guaninas con DMS (dimetil-
sulfato).
Tubo 2: Modificación de purinas (A-G) con ácido fórmico.
Tubo 3: Modificación de pirimidinas (C-T) con hidracina.
Tubo 4: Modificación de citosina con hidracina + sales
(NaCl 2M)
Finalizada la modificación, se le añade piperidina que
rompe la cadena a nivel de bases modificadas. En cada
tubo habrá fragmentos marcados y sin marcar, con
diferentes tamaños.
Electroforesis en gel de poliacrilamida: En
condiciones desnaturalizantes, sirven para separar por
tamaños los fragmentos de cada tubo. Los prods se
mueven en paralelo en calles adyacentes del mismo gel.
Autorradiografía del gel: Bandas oscuras en cada una, correspondientes a fragmentos
marcados de cada tubo.
Análisis de la Autorradiografía: La lectura se inicia desde el extremo inferior (5`) de la
molécula secuenciada.
8.1.2. MÉTODOS ENZIMÁTICOS DE TERMINACIÓN DE CADENA.
Los métodos de terminación de cadena son métodos que utilizan enzimas, para leer el
ADN. Estas enzimas ayudan a construir cadenas nuevas que son complementarias al ADN que
queremos analizar. De esta manera, se pueden copiar partes específicas del ADN.
Para leer fragmentos de ADN usa "bloqueadores" llamados ddNTP (moléculas que no dejan
que el ADN siga creciendo). Estos ddNTP se meten en la cadena que estás copiando y actúan
como si dijeran "¡Alto aquí!" deteniendo la copia. Así, puedes analizar hasta dónde llegó la
copia y descubrir la secuencia de las letras del ADN paso a paso.
I. REACCIÓN POLIMERIZACIÓN: El ADN que queremos estudiar se divide en 4 tubos de
prueba (uno para cada base del ADN: A, T, C, G). En cada tubo se realiza una reacción que
ayuda a copiar la secuencia del ADN.
La hebra de ADN que queremos copiar (el molde).
Un cebador, que es como un "punto de inicio" marcado con radiactividad (32P).
Una enzima llamada ADN polimerasa (la que copia el ADN).
Las bases normales del ADN (dNTP).
Una base especial (ddNTP) que funciona como "bloqueador" y detiene la copia. Esta base
está en baja concentración.
La ADN polimerasa empieza a copiar la hebra molde desde el cebador, creando una nueva
cadena.
Cuando por casualidad incorpora un ddNTP, la copia se detiene porque los ddNTP no permiten
continuar.
Esto genera muchas copias de diferentes longitudes, dependiendo de dónde se haya detenido
la reacción.
Cada tubo tiene fragmentos de ADN de diferentes tamaños, todos marcados radiactivamente
para identificarlos y conocer la secuencia original del ADN.
Electroforesis gel
Se calienta el ADN para separarlo en cadenas simples.
Las cadenas recién creadas se pasan por un gel especial que ordena los fragmentos según su
tamaño (los más cortos bajan más rápido).
Se hacen 4 "carriles" en el gel, uno para cada base (A, T, C, G), para trabajar en paralelo.
Autorradiografía
Como los fragmentos tienen marcadores radiactivos, al poner una película especial sobre el
gel, las bandas aparecen como líneas oscuras.
Cada línea representa un fragmento de ADN de un tamaño específico.
Lectura de los resultados
Se leen las bandas del gel de abajo hacia arriba (los más cortos primero).
Cada banda termina con una base específica (A, T, C o G), que se identifica según el carril
correspondiente.
Esto permite "reconstruir" la secuencia del ADN copia. La cadena molde será la
complementaria y en dirección opuesta.
VARIACIONES MÉTODO SANGER
Forma de marcar los fragmentos de ADN
En lugar de marcar el cebador, se pueden marcar los dNTP (bases normales) o los ddNTP
(bloqueadores).
Los marcajes pueden ser:
Radiactivos (por ejemplo, con 32P).
Fluorescentes, que son más modernos y prácticos.
Marcadores fluorescentes
Simplifican y aceleran el proceso porque no necesitas realizar autorradiografías.
Basta con iluminar el gel con luz UV y tomar una foto.
Ventajas de los marcadores fluorescentes:
Permiten automatizar varios pasos del proceso.
Facilitan la lectura de la secuencia usando programas informáticos.
Dieron origen a la primera generación de secuenciadores automáticos
PRIMERA GENERACIÓN
Base del método
Se basa en la terminación de cadena, que utiliza nucleótidos modificados (dideoxinucleótidos)
para interrumpir la síntesis de ADN.
El ADN resultante tiene fragmentos de diferentes longitudes, terminados con fluoróforos que
se usan como marcadores fluorescentes.
Secuenciadores automáticos
Los instrumentos automatizan las siguientes fases:
Electroforesis capilar o en gel: Separa los fragmentos de ADN según su tamaño.
Detección fluorescente: Identifica la señal emitida por los fluoróforos para leer la secuencia.
Análisis computarizado: Procesa los datos para reconstruir la secuencia de ADN.
Limitaciones originales del método
La etapa más lenta es la **reacción de polimerización**, donde se sintetizan los fragmentos
de ADN.
Antes de los avances tecnológicos, era necesario obtener cantidades relativamente grandes
de ADN puro.
Incorporación de la técnica de PCR
La PCR
Permite amplificar el ADN antes de la secuenciación.
Ha revolucionado la secuenciación al:
Reducir la cantidad de ADN necesaria.
Facilitar la secuenciación de muestras complejas de ADN bicatenario.
Proceso mejorado con PCR acoplada
Primera PCR (Convencional):
Se utiliza un par de cebadores específicos para amplificar el fragmento deseado de ADN.
Produce una gran cantidad de copias del fragmento objetivo.
Segunda PCR (De secuenciación)
Se utiliza un único cebador (de los usados previamente).
El ADN generado en la primera PCR sirve como molde para esta etapa.
Permite obtener fragmentos terminados con los marcadores necesarios para el análisis.
Ventajas del método mejorado:
Mayor eficiencia y sensibilidad:Requiere menos ADN que los métodos convencionales
originales.
Flexibilidad: Permite trabajar con muestras pequeñas o degradadas.
Automatización: Reduce errores humanos y acelera el análisis.
Secuenciación por terminador fluorescente
1. Proceso:
Se realiza una única PCR en un solo tubo.
Los cuatro ddNTP se marcan con diferentes fluoróforos (el cebador no se marca).
Se añaden también dNTP sin marcar, en proporción adecuada.
Al finalizar, se obtiene una mezcla de fragmentos marcados en el extremo 3’ según el ddNTP
incorporado.
Los productos se cargan directamente en el secuenciador.
Secuenciación con cebador fluorescente
Proceso:
Se realizan cuatro PCR independientes (en tubos separados).
Se usa el mismo cebador, marcado con un fluoróforo diferente en cada tubo.
En cada tubo, se añade un ddNTP específico para asociar un color a cada terminación.
Los productos resultantes se mezclan en un solo tubo y se cargan en el secuenciador.
Aplicación:
Es ideal para secuenciar bibliotecas de ADN (miles de clones con diferentes inserciones).
Requiere un cebador complementario a una región específica del vector.
Fases automatizadas en secuenciadores de 1.ª generación
Electroforesis:
Tipos de sistemas:
En gel: Usa geles planos de poliacrilamida ultrafinos (200 µm); puede cargar hasta 96
muestras.
Velocidad: ~200 bases/h/muestra.
Capilar: Usa capilares de sílice fundida (10-200 µm de diámetro) con polímeros como soporte.
Velocidad: ~500 bases/h con 96 capilares.
Detección:
Se realiza al final de la electroforesis.
Usa un láser que excita el fluoróforo. Un sistema de varios canales detecta diferentes colores.
Genera un electroferograma, donde los colores se asocian con las bases:
A: Verde.
T: Rojo.
G: Negro.
C: Azul.
Interpretación de resultados:
Los datos del electroferograma se traducen automáticamente en la secuencia de ADN.
La lectura depende del tipo de cebador empleado.
Secuenciación a gran escala
Objetivo:
Secuenciar fragmentos mayores a 1.000 bases.
Incluso secuenciar genomas completos.
Método:
Combina las técnicas de secuenciación y clonación.
Estrategias más usadas:
Paseo cromosómico:
El genoma se digiere parcialmente con enzimas de restricción.
Los fragmentos generados se clonan en bacterias, formando una biblioteca genómica.
Una vez secuenciado un clon, se utiliza un extremo de su secuencia para fabricar una sonda.
La sonda identifica otro clon cuyo inserto se solape con el anterior.
Se repite el proceso hasta secuenciar toda la biblioteca.
MÉTODO SHOTGUM
El genoma se fragmenta aleatoriamente por métodos mecánicos en fragmentos cortos.
Los fragmentos se clonan en bacterias para crear una biblioteca genómica.
En la segunda fase:
Se secuencian todos los clones de forma independiente.
Un software informático ensambla las secuencias basándose en los solapamientos de los
fragmentos.
OTROS ANÁLISIS REALIZADOS CON EL SECUENCIADOR: ANÁLISIS DE FRAGMENTOS Y MLPA.
El análisis de fragmentos permite estudiar mezclas de fragmentos de ADN de diferentes
tamaños usando marcadores fluorescentes. Se usa para detectar mutaciones, estudiar
paternidad y evaluar trasplantes de médula ósea.
La MLPA es una técnica más específica y compleja. Sirve para analizar muchas secuencias
genéticas al mismo tiempo y medir la cantidad de copias de ciertas secuencias de ADN. Se
usa para estudiar enfermedades genéticas y detectar cambios en el número de copias de
genes.
SEGUNDA GENERACIÓN
Secuenciación masiva (NGS)
Objetivo:
Diseñada para superar las limitaciones de la secuenciación de 1.ª generación.
Permite secuenciar genomas completos de múltiples individuos de forma rápida y económica.
Fase 1: Preparación del ADN molde
Inmovilización del ADN molde:
Los fragmentos de ADN se separan físicamente sobre una superficie sólida o soporte,
permitiendo millones de reacciones simultáneas.
Pasos clave del proceso:
Fragmentación al azar del genoma:
Mediante métodos físicos (como sonicación o nebulización) o enzimáticos.
Enriquecimiento (opcional):
Selección de regiones de interés mediante:
Captura por hibridación en fase sólida: Uso de microarrays con oligonucleótidos específicos.
PCR multiplex: Uso de cebadores específicos.
Unión de adaptadores universales:
Se añaden adaptadores a los extremos de cada fragmento para formar una biblioteca de
fragmentos, que puede ser amplificada con un único juego de cebadores.
Selección del tamaño adecuado (200-500 pb):
Los fragmentos seleccionados se amplifican clonalmente para mejorar el rendimiento de la
secuenciación.
Métodos de amplificación clonal:
PCR en emulsión (emPCR).
PCR en fase sólida o PCR puente.
emPCR (PCR en emulsión)
Captura del ADN molde:
Se utilizan microesferas recubiertas con uno de los cebadores universales.
Los fragmentos de ADN de la biblioteca, previamente desnaturalizados, se capturan,
mediante hibridación cebador/adaptador en las microesferas.
Cada microesfera captura un único fragmento de ADN molde.
Preparación de la mezcla:
Las microesferas con ADN molde se colocan en un tubo Eppendorf con una mezcla de PCR
que contiene el segundo cebador universal (fase acuosa).
La mezcla se cubre con aceite.
Emulsión:
Se emulsionan las fases acuosa y oleosa, formando microrreactores (pequeñas gotas acuosas
rodeadas de aceite).
Cada microrreactores contiene una microesfera con un único fragmento de ADN molde.
Reacción de PCR:
En cada micro reactor se realiza una PCR convencional.
Al final, cada microesfera está recubierta con múltiples copias idénticas del fragmento de
ADN molde en su superficie.
Finalización:
Se rompe la emulsión y las microesferas se fijan sobre:
Una superficie sólida.
Micropocillos individuales en una placa picotiter.
PCR en fase sólida (PCR puente)
Superficie sólida:
Se realiza sobre una superficie recubierta con ambos cebadores universales fijados con alta
densidad.
Reacción de PCR:
Cada fragmento de ADN molde se amplifica localmente en la superficie sólida.
Se forman múltiples copias clónicas del ADN molde, conectadas como “puentes” entre los
cebadores anclados.
PCR en fase sólida (PCR puente)
Inicio del proceso:
Los fragmentos de ADN de la biblioteca se desnaturalizan (se separan en cadenas
individuales).
Estas cadenas se anclan a la superficie sólida, quedando distanciadas entre sí y rodeadas de
múltiples cebadores universales fijados.
Mezcla de PCR:
Se inunda la superficie con una mezcla de PCR sin primers libres (los cebadores están fijados
en la superficie).
Ciclos de PCR:
Hibridación: El extremo libre del fragmento de ADN molde híbrida con el cebador
complementario más cercano, formando un "puente".
Extensión: Se sintetiza una nueva cadena complementaria.
Desnaturalización: Las cadenas recién formadas se separan pero permanecen ancladas cerca,
facilitando la amplificación local.
Resultado final:
Se generan clusters o clones (grupos compactos de copias idénticas) de cada fragmento de
ADN molde.
Cada cluster contiene miles de copias idénticas en un espacio menor a 1 µm de diámetro.
Se pueden formar hasta 10⁷ clusters por cm² en la superficie.
Reacción de secuenciación y análisis de datos
Métodos principales:
Terminación reversible cíclica:
Usa dNTP marcados con fluoróforos y bloqueados para impedir la incorporación de
nucleótidos adicionales (actúan como terminadores de cadena).
Pirosecuenciación:
Mide la liberación de pirofosfato durante la incorporación de nucleótidos. Secuenciación Ion
Torrent:
Detecta cambios en el pH asociados a la incorporación de nucleótidos.
Terminación reversible cíclica:
Características principales:
Los dNTP están marcados con diferentes fluoróforos y bloqueados para evitar la incorporación
continua.
Las uniones del fluoróforo y el bloqueante son reversibles, lo que permite la incorporación de
nuevos nucleótidos en ciclos sucesivos.
Ciclos de reacción:
Incorporación:
El soporte se inunda con ADN polimerasa y los cuatro dNTP marcados.
La ADN polimerasa incorpora el primer nucleótido bloqueado.
Lectura de fluorescencia:
Tras lavar los nucleótidos no incorporados, un láser excita los fluoróforos y registra la
fluorescencia emitida.
Se genera una matriz de puntos que indica qué nucleótido fue incorporado en cada clúster.
Eliminación de bloqueantes:
Se eliminan el fluoróforo y el agente bloqueante mediante reacciones químicas para permitir
la incorporación del siguiente nucleótido.
Análisis de datos:
El software reconstruye las secuencias en base a la lectura de colores durante los ciclos.
Pirosecuenciación:
Método:
Basado en la producción de bioluminiscencia mediante reacciones enzimáticas.
Ideal para usar con PCR en emulsión y placas picotiter.
Ciclos de secuenciación:
Incorporación de nucleótidos:
Se añade un único dNTP a la placa, y la ADN polimerasa incorpora nucleótidos
complementarios.
Producción de bioluminiscencia:
Durante la incorporación, se libera pirofosfato (PPi), iniciando una reacción enzimática que
produce luz.
La intensidad de la luz refleja el número de nucleótidos incorporados en un ciclo.
Eliminación:
Se eliminan los dNTP sobrantes antes de añadir los siguientes.
Resultados:
Se genera un programa, donde la altura de las líneas verticales indica el número de
nucleótidos incorporados consecutivamente.
Secuenciación Ion Torrent:
Principio:
Basado en la detección de micro variaciones de pH durante la reacción de polimerización.
Proceso:
El ADN molde, unido a un cebador y una ADN polimerasa, se inmoviliza en micropocillos con
sensores de pH.
Los pocillos son inundados secuencialmente con un flujo continuo de dNTPs (sin marcar).
Cuando un dNTP se incorpora, se libera un ión hidrógeno (H⁺), generando un cambio en el pH
detectado por el sensor.
Ventajas:
El proceso es continuo, lo que lo hace más rápido al no requerir eliminación de marcadores ni
bloqueantes.
El software reconstruye las secuencias basándose en las variaciones de pH.
¿Qué hace la secuenciación de 3.ª geneiación?
Objetivo: Leer el ADN directamente, molécula por molécula, sin necesidad de multiplicar (o
amplificar) el ADN antes de leerlo.
Ventaja: Es más precisa porque trabaja directamente con ADN original.
Pasos básicos de la secuenciación:
Preparar una biblioteca de fragmentos de ADN.
Se cortan las moléculas de ADN en pedazos más pequeños, añadiendo “etiquetas”
universales a los extremos.
Fijar los fragmentos de ADN a una superficie sólida.
Opción 1: Fijar los cebadores(etiquetas universales) en la superficie, luego los fragmentos de
ADN se “pegan” a ellos.
Opción 2: Fijar directamente los fragmentos de ADN en la superficie, y después los cebadores
se unen a los fragmentos.
Secuenciar el ADN.
Un enzima especial (ADN polimerasa) comienza a copiar el ADN desde el cebador.
El proceso usa un método llamado terminación reversible cíclica, que consiste en leer las
bases del ADN (A, T, C, G) paso a paso.
Resumen súper básico:
Es como hacer un puzzle:
Cortamos las piezas (fragmentos de ADN).
Pegamos las piezas en una mesa (superficie sólida).
Usamos una herramienta (enzima) para leer y copiar las piezas una por una.
¿Qué es la secuenciación por nanoporos?
Es una técnica para leer el ADN en tiempo real mientras pasa por un "agujero" (nanoporo).
¿Qué la hace única? No necesita marcajes ni usar enzimas para copiar el ADN, como otros
métodos.
Cómo funciona paso a paso:
El biosensor:
Tiene una membrana con un pequeño agujero (el nanoporo) y un electrodo conectado.
Fluye una corriente eléctrica a través del nanoporo.
¿Qué pasa cuando entra ADN?
Una cadena de ADN atraviesa el nanoporo, base por base (A, T, C, G).
Cada base modifica la corriente eléctrica de una manera única.
Detectar las bases:
El cambio en la corriente eléctrica es detectado.
Esos cambios sirven para identificar cada base (como un escáner).
Resultado:
El ADN se lee en tiempo real, base por base.
Ventajas destacadas:
Súper rápido:¡Se lee directamente mientras pasa por el nanoporo!
Compacto: Puede encogimiento, lo que permite secuenciadores portátiles.
¿Qué es la secuenciación de ARN?
Es un proceso para leer la información contenida en las moléculas de ARN, similar a cómo se
hace con el ADN, pero adaptado a las características únicas del ARN.
Métodos de secuenciación de ARN:
Métodos enzimáticos directos:
¿Cómo funcionan?
Se usa el ARN como molde: Una enzima llamada retrotranscriptasa copia el ARN a una
molécula complementaria de ADNc.
En el proceso, se añaden moléculas llamadas terminadores de cadena para controlar dónde
termina cada fragmento.
Los fragmentos resultantes son marcados, ya sea:
Radiactivamente (usando isótopos).
Fluorescentemente(usando colores).
Los fragmentos marcados se separan en un gel especial y se analizan con herramientas como
luz UV.
¿Resultado?
Al leer el ADNc, puedes obtener la secuencia complementaria del ARN original.
Métodos indirectos
¿Cómo funcionan?
El ARN primero se convierte en ADN complementario (**ADNc**), usando una
retrotranscriptasa.
Después, este ADNc se secuencia como si fuera ADN normal, usando otros métodos
estándares.
Finalmente, se deduce la secuencia del ARN a partir de la del ADNc.
Vocabulario/Definiciones:
