Tema 6.

Métodos de transformación genética

1. Agrobacterium tumefaciens (Rhizobium radiobacter)
A. tumefaciens es una bacteria patógena del suelo que provoca tumores en dicotiledóneas,
monocotiledóneas y algunas gimnospermas. Infecta a la planta por heridas e induce la proliferación del
tejido formando una agalla que limita el rendimiento del cultivo.
a) Ciclo de vida de Agrobacterium (cíclico)
Hay una planta y la bacteria está en el suelo, que entra por heridas en la raíz o tallo y comienza la
infección.
La bacteria se adhiere a las células heridas y le transfiere el ADN-T, que se integra en el cromosoma
vegetal y se transforma, empezando a dividirse rápidamente.
La hiperplasia e hipertrofia celular provoca la formación de la agalla. Las agallas más viejas tienen
varios centro de actividad
Las bacterias de la superficie de la agalla se mueven al suelo e hibernan para producir una nueva
infección en el futuro.
2. Características del plásmido Ti
Cepas de A. tumefaciens tienen plásmidos Ti que codifican opinas
(octopina o nolopina).
- Genes de virulencia (región vir)
- Genes para el catabolismo de opinas y agropinas (tipo de aa y
azúcares bacterianos)
- Genes para la transferencia de ADN
- ADN-T, región del plásmido que se transfiere al genoma
vegetal. Transferencia dirigida
a) Características del ADN-T

El ADN-T tiene 8 genes (en cepas de octopina) con características eucariotas:

- auxA (iaaM) y auxB (iaaH)→Proliferación: Codifican enzimas (son bacterianas) de la biosíntesis de auxinas

- Gen ipt → Proliferación: Codifica la isopentenil transferasa de la biosíntesis de citoquinas

- Otros genes: producción de opinas (ocs), …
- Los extremos (LB y RB) tienen repeticiones imperfectas de 25 pb para su integración en el genoma.
El ADN-T (AIA y CK) produce un tumor silvestre, si muta ipt produce tumor en raíz (AIA) y si muta iaaH
produce tumor en tallos (CK)
3. Etapas en la transferencia de genes con Agrobacterium
- Reconocimiento de la señal inductora
- Unión de Agrobacterium a las células vegetales
- Expresión de los genes de virulencia
- Procesamiento del ADN-T
- Transferencia del ADN-T a la célula vegetal
- Integración del ADN-T en el genoma vegetal

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 a) Etapas iniciales de la infección con Agrobacterium
La célula vegetal herida libera compuestos fenólicos (acetosiringona) y
azúcares que son quimioatrayentes (señal inductora). La bacteria se adhiere
a la pared celular de la célula dañada por la síntesis de fibras de celulosa
Las monocotiledóneas no sintetizan acetosiringona, lo que limita la
infección.
Con un sistema de 2 componentes (VirA y VirG), las señales inductoras
activan la expresión de los genes de virulencia (vir). VirA se autofosforila y
fosforila a VirG, pasando de inactivo a activo.
b) Procesamiento del ADN-T
El complejo endonucleasa VirD1-VirD2 produce una hebra monocatenaria del
ADN-T y VirD2 se une covalentemente al extremo 5´de la hebra monocatenaria del
ADN-T.
1º corta VirD2 en RB y se queda unido y luego corta VirD1 en LB
c) Transferencia del ADN-T a la célula vegetal
La transferencia se hace por los piliT formados por VirB
En el citoplasma, la proteína VirE2 recubre la hebra de ADN-T + VirD2 para protegerlo de las nucleasas.
El complejo maduro del ADN-T entra al núcleo por el nucleoporo.
d) Integración del ADN-T en el genoma vegetal
Se degrada VirE2 para liberar el ADN-T, que se integra por recombinación ilegítima en el genoma, es
decir, se integra al azar porque no hay un sitio homólogo. El mecanismo de reparación de errores reconoce
la hebra de ADN-T y la integra. Pasos:
- 1,3: Hay una digestión de las cadenas desplazadas de ADN de
la planta por endonucleasas
- 2: Se digiere el extremo no apareado del ADN-T por
exo/endonucleasas
- 4,5: Se corta en la cadena desapareada del ADN de la planta
4. Uso del plásmido Ti en ingeniería genética
a) Introducción
Los genes inductores de tumores y los de biosíntesis se pueden cambiar por un gen/es de interés y un
marcador de selección
El ADN-T y los genes vir pueden estar en dos plásmidos distintos (facilita la construcción) con
marcadores de selección y hay vectores binarios para E. coli y A. tumefaciens. El vector binario tiene el
ADN-T y el plásmido Ti los genes vir
b) Tipos de transformación con A. tumefaciens
i. Transformación mediante co-cultivo
De un explante inicial (hoja) se coge un disco foliar (trozo) que simula la herida sobre un medio sólido
de A. tumefaciens sin antibiótico y luego se pasa a un medios sólido con antibióticos y agente de selección
(mata A. tumefaciens y células no transformadas). Las células transformadas se llevan a un medio de
inducción de brotes con antibiótico y agente de selección y finalmente se llevan a un medio de
enraizamiento con o sin agente de selección y ya se tiene la planta transgénica.
ii. Transformación mediante agroinfiltración
Se infiltra en tejidos (hojas) un cultivo de A. tumefaciens con el gen de interés. Para tener la expresión
de forma transitoria del gen sin tener un transformante estable.

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 iii. Transformación mediante infiltración floral
A una planta se le añade A. tumefaciens 20´´ y se cultiva tapada 24h, luego se pasa a un cultivo de
tierra donde crece durante 1 mes. Se recogen las semillas T1 y se selecciona con un antibiótico las
hemicigotas (A_) para la inserción.
c) Factores a tener en cuenta en la transformación con A. tumefaciens
- La especie y tejido usado, ya que el explanto debe regenerar la planta completa.
- Tipo de vector: Marcador de selección, tamaño
- Estirpe de A. tumefaciens: Debe infectar la especie diana y tener un genotipo que transforme
(seleccionar con los antibióticos apropiados)
- Solo algunas monocotiledóneas se transforman con A. tumefaciens: maíz, arroz, trigo y sorgo
- Como la integración del ADN-T en el genoma es al azar no se puede predecir la expresión del
transgén y puede haber silenciamiento génico por epigenética.
Como la estirpe más eficaz de A. tumefaciens se patentó es muy caro, por lo que se están haciendo
protocolos de transformación genética con Rhizobium (+ barato)
5. Transformación con Agrobacterium rhizogenes
La infección con A. rhizogenes provoca la proliferación excesiva de raíces (sin necesidad de hormonas
exógenas) por la incorporación del plásmido Ri.
No se conoce la función de los genes oncogénicos del ADN-T del plásmido Ri, y los genes rolBV y rolC
aumentan la sensibilidad a auxinas endógenas (proliferación de la raíz)
Se usan como modelo en estudios bioquímicos y genético (crecen rápido) y son una alternativa al
cultivo de células vegetales para la producción de metabolitos 2º sin la necesidad de añadir hormonas
6. Sistemas de transferencia directa de genes
VENTAJAS DESVENTAJAS
Como no dependen de vectores pueden usarse a cualquier especie Necesitan la integración de muchas copias del transgén en distintos
sitios del genoma
Construcciones simples y pequeñas Alta frecuencia de reordenación genómica y silenciamiento del
transgén
Rápidos y sencillos para estudios de expresión transitoria

a) Transformación por bombardeo con micropartículas

Se usan partículas de oro/tungsteno cubiertas de ADN desnudo que debe llegar al núcleo. Así se
consiguieron la 1ª planta transgénica comercial.
Ventajas: Se puede usar en distintos tejidos y transformar orgánulos (cloroplastos y mitocondrias)
Desventaja: La integración es poco frecuencia (necesita muchas copias) y hay reordenamiento
i. Equipo
Acelerador de micropartículas.
Necesita: Flujo de He, soporte del disco de ruptura, lanzador de micropoyectiles y muestra vegetal.
ii. Montaje y funcionamiento
Insertar el disco de ruptura (permite aumentar la presión de He hasta que supera el umbral, se rompe
y dispara) y cargar la muestra de micropartículas cubiertas de ADN en el micropoyectil y juntarlos todos en
un macroproyectil (balín) en el lanzador, que al disparar los microproyectiles chocan contra la muestra
vegetal y el balín se queda en la malla de retención.
iii. Pistola de genes Helios (Alternativa)
Es como lo anterior pero de uso manual que permite la transformación in vivo y analizar la expresión
transitoria del gen uidA sobre un tejido diana (embriones inmaduros, callos y meristemos apicales) y luego
se selecciona las transformadas. Se usa en maíz, arroz, trigo, soja, …

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 Usos:
- Transferencia de genes a células, tejidos y órganos
- Transferencia de genes a MO y orgánulos (cloroplastos)
- Estudio de expresión transitoria
- Analizar promotores y deleción de genes
- Estudiar mecanismos de expresión y regulación génica
- Transferencia de ARN viral
b) Transferencia de genes por electroporación
La electroporación de protoplastos (célula sin pared) tratados con PEG permite incorporar ADN
plasmídico desnudo con eficacia y hacer estudios de expresión transitoria.
Se pasa corrientes eléctricas que cambian la carga de la membrana y es más susceptible de
transformar, luego se selecciona.
El problema es encontrar un protocolo para regenerar la planta a partir de protoplastos porque habría
que restaurar la pared celular para que viva y generar un tallo. Por lo que se recomienda para estudios de
expresión y no para conseguir plantas transgénicas.
Ejemplo:
Se hace una cotransformación con 2 plásmidos, un es el gen de interés y otro con el gen testigo y se
selecciona los protoplastos que tienen el gen de interés pero no el marcador de selección.
También se ha hecho electroporación directa de embriones en tabaco, trigo, arroz, …
c) Transferencia de genes por microinyección
Se introduce el ADN de interés de forma específica en el núcleo o cloroplastos con pipetas
microcapilares de vidrio con control microscópico
Desventajas: Equipo caro y baja eficacia de transformación
d) Otros métodos de transformación
Son alternativos porque son drásticos:
- Transformación con fibras de carburo de silicio: Provoca fisuras en la pared celular y penetra el
ADN plasmídico. Problema: Baja eficacia, toxicidad y puede perforar los pulmones.
- Transformación con vectores virales: Para el silenciamiento génico. El virus está desactivado.
- Transformación con otras bacterias: Bacterias simbiontes inducen nódulos con vectores de ADN-T
para la transformación
7. Ingeniería genética en los cloroplastos
a) Características de los cloroplastos
Su origen es procariota (teoría endosimbiótica). Codifica 150 genes que codifica proteínas de la
fotosíntesis, replicación, transcripción y traducción, y algunas proteínas tienen origen nuclear.
El genoma está conservado entre especies
b) Ingeniería genética de cloroplastos
El genoma se puede transformar con recombinación homóloga al hacer:
- Bombardeo con micropartículas
- Microinyección
- Selección con espectinomicina (aadA)

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 c) Proceso de la recombinación homóloga
Tras la infección solo se transforman algunos cloroplastos de cada célula (heteroplastia) y la
homoplasia (todos los cloroplastos de la célula tienen el transgén) se obtiene por la regeneración de
plántulas en medio selectivo (antibiótico)
Ventajas: Los genes del cloroplasto se organiza en operones, que tiene expresión coordinada, por lo
que se pueden transfectar varios genes que se expresen con un único promotor que active el operón.
GENOMAS
PLASTÍDICO NUCLEAR
Nº de copias Muchas copias Pocas copias
Nivel de expresión Alto Bajo
Genes y expresión Operones Monocistrónicos
Efecto de posición Inserción en sitio conocido Inserción al azar (expresión variable)
Silenciamiento génico No Si
Transferencia horizontal Herencia materna Si
Plegamiento y formación de SS Bien Bien (pasa por RE)
Glicosilación No Si

i. Aplicaciones del sistema

- Expresión de varios genes: operón Bt, operón PHB, operón Mer, Genes VitA, anticuerpos
monoclonales.
- Expresión de un gen: Mejora vegetal (genes de resistencia a insectos, patógenos, herbicidas,
tolerancia, eficiencia) y desarrollo de vacunas y biofármacos.
8. Caracterización de las plantas transgénicas
a) Identificación de los eventos de transformación
- Marcadores de selección: Resistencia a antibióticos o herbicidas
Desventaja: Puede dar falsos positivos y a veces el transgén de resistencia se silencia
- Genes testigo: GFP, uidA, para identificar las células transformantes
Interesa saber cuántas copias se incorporan al genoma, la posición y si cambia las características de la
planta.
Se puede analizar el:
- ADN:
o PCR
o Southern: Confirma la integridad del ADN-T y estimar el nº de copias en el genoma
- ARN:
o Northern: Detectar los niveles de expresión del transgén
o qRT-PCR: Transcripción inversa del ARNm y su amplificación por PCR cuantitativa
o FISH: Nº de inserciones
- Proteína:
o Western o ELISA: Con anticuerpos específicos se detecta los niveles de proteína.
- Planta:
o Analizar los metabolitos