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Aitor PastorENSAYOS MICROBIOLÓGICOS
Recuento microbiológico en
muestra de agua mediante
filtración por membrana
Aitor Pastor Pastor
1º LACC B
6/3/2025 - 13/3/2025
ÍNDICE
1. Objetivos 2
2. Marco teórico 2
3. Cálculos previos 3
4. Procedimiento experimental 4
5. Resultados 10
6. Tratamiento de los residuos 12
7. Conclusiones 12
8. Bibliografía 12
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1. Objetivos
El objetivo de esta práctica es llevar a cabo el recuento de coliformes en una
muestra de agua estancada del IES Virgen del Remedio por medio de la filtración
por membrana y el posterior cultivo, crecimiento y recuento sobre el medio agar
Chapman TTC.
2. Marco teórico
En primer lugar, los microorganismos coliformes agrupan diversos géneros
de bacilos intestinales Gram - negativos, como Escherichia, Enterobacter, Klebsiella
y Citrobacter. Son aerobias o anaerobias facultativas y oxidasa negativas y pueden
fermentar la lactosa con producción de gas y ácido láctico.
Todos ellos son componentes de la microbiota comensal del intestino de los
animales homeotermos y los humanos y, por tanto, son utilizados como indicadores
de la contaminación fecal de las aguas. Además, son capaces de provocar
infecciones en niños y mayores.
El medio empleado para la incubación de los coliformes es el agar
Chapman - TTC. Este es un medio diferencial y selectivo.
Por una parte, es selectivo porque pone de manifiesto las propiedades de un
determinado tipo de microorganismo. Esto es debido a que el heptadecil sulfato
sódico (tergitol 7) inhibe el crecimiento de bacterias Gram - positivas.
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Por otra parte, es diferencial porque pone de manifiesto propiedades de los
coliformes. Por ejemplo, la fermentación de la lactosa presente en el medio es
detectada por un cambio de color del indicador ácido - base azul de bromotimol.
De este modo, antes de inocular el medio con el filtro sobre el que han
quedado retenidos los coliformes, este es de color verde. Cuando se produce la
fermentación de la lactosa, se produce ácido láctico. De este modo, el pH del medio
se ve alterado y, por tanto, el color de este cambia.
El suplemento añadido posteriormente, TTC (cloruro de trifeniltetrazol) tiene
una función similar.
El TTC actúa como indicador del crecimiento bacteriano: algunos coliformes
reducen esta molécula a 1,3,5 - trifenilformazán, originando colonias rojas con zonas
azules. Sin embargo, la Escherichia Coli y el Enterobacter aerogenes no reducen el
TTC, originando de este modo colonias amarillas con zonas amarillas.
3. Cálculos previos
Para preparar el medio de cultivo de agar Chapman TTC, se deben disolver
56.15 g de medio en 1 L de agua desionizada. Para 140 mL de agua desionizada:
140 𝑚𝐿
56. 15 𝑔 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜· 1000 𝑚𝐿
= 7. 86 𝑔 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜
Se prepararon 2 botellas Pyrex de medio. En ambas se pesaron 7.94 g de
medio, disueltos en 140 mL de agua desionizada.
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4. Procedimiento experimental
Material
- Botellas Pyrex de 500 mL
- Probeta de 500 mL
- Placas Petri estériles
- Cinta indicadora de esterilización
- Vasos de precipitados
- Papel de aluminio
- Bolsas de autoclave
- Espátula
- Puntas estériles de micropipeta
- Propipeta
- Jeringuilla de 5 mL
- Pinzas
- Filtro de nitrocelulosa de tamaño de poro de 0.45 µm (estéril)
- Papel de filtro (estéril)
- Pinzas de sujeción
- Bolsas de autoclave
- Soporte
- Nuez y llave
Equipos
- Balanza granataria
- Autoclave
- Mechero Bunsen
- Micropipeta de 1 mL
- Estufa de 37 ºC
- Contador de colonias
- Rampa de filtración
- Nevera
Reactivos
- Agua desionizada y estéril
- Agar TTC - Chapman
- Suplemento (TTC al 1 %)
- Alcohol
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ESQUEMA DEL PROCESO
● Preparación del medio de cultivo
En la preparación de medios es necesario trabajar siempre lo más cerca posible de
la llama para asegurar la esterilidad del proceso. Además, se deberá flamear la boca de la
botella Pyrex sobre el mechero y colocar su tapón hacia arriba.
Por otra parte, antes de usar el autoclave se deberá cubrir su resistencia con agua
desionizada, y es necesario que el color de la cinta indicadora de autoclave cambie de color
(esto indica que se ha completado un ciclo de esterilización).
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● Acondicionamiento de la muestra. Preparación del equipo de filtrado
- Prefiltración
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La función del tiosulfato sódico es neutralizar la acción de los compuestos
clorados que puedan estar presentes en la muestra de agua. El cloro es un agente
desinfectante, por lo que interfiere en el recuento microbiológico.
Además, se debe evitar que el embudo Buchner esté en contacto con el aire.
Por ello, una vez se ha vertido la muestra, se tapa con el papel de aluminio que
llevaba el embudo al ser esterilizado. Tanto en la prefiltración como en la filtración se
trabajará dentro del halo de esterilidad.
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- Filtración e incubación
Es importante tener en cuenta que se debe colocar el filtro de nitrocelulosa
con la cara cuadriculada hacia arriba. Sobre esta cara se irán depositando los
coliformes, y de este modo se facilitará su recuento. Además, también se podría
utilizar la rampa de filtración. En este caso, se debe flamear la rejilla con etanol.
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Para el recuento de coliformes se puede emplear un contador de colonias.
5. Resultados
El crecimiento bacteriano sobre el medio cultivo indica que existen coliformes
en la muestra de agua. Sin embargo, los resultados han variado entre las distintas
placas Petri incubadas. Por ejemplo, el color del medio en algunas placas es
amarillo; en otras, azul verdoso o bien amarillas y azul verdoso a la vez.
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Un medio azul indica que en la placa hay coliformes que no fermentan la
lactosa. Un medio amarillo indica la presencia de coliformes que sí la fermentan.
En la mayor parte de las placas han crecido colonias rojas. En algunas (como
la nuestra) son amarillas.
También hay que señalar la variabilidad en el número de colonias en cada
placa, como se puede observar en la siguiente fotografía.
Dado que las colonias son rojas y el medio es parcial o totalmente azulado,
no se trata de Escherichia coli o Enterobacter aerogenes; si las colonias fuesen
amarillas, sí. En nuestro caso las colonias han sido amarillas.
A continuación se calculará la concentración microbiana por 100 mL de
muestra de agua.
𝑛º 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠 𝑒𝑛 𝑒𝑙 𝑓𝑖𝑙𝑡𝑟𝑜 24 𝑈𝐹𝐶
𝑈𝐹𝐶/ 100 𝑚𝐿 = 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑓𝑖𝑙𝑡𝑟𝑎𝑑𝑎 (𝑚𝐿)
→ 𝑈𝐹𝐶/ 100 𝑚𝐿 = 100 𝑚𝐿
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Se han hallado 24 UFC/ 100 mL de muestra. Este resultado es una
aproximación, dada la disparidad de resultados obtenidos en una misma sesión de
prácticas.
6. Tratamiento de los residuos
Las placas Petri fueron esterilizadas en el autoclave. Previamente fueron
introducidas en una bolsa de plástico adecuada para tal fin.
7. Conclusiones
La variabilidad en los resultados indica que el número hallado de
UFC/ 100 mL debe ser tomado como una aproximación, y que existen diferentes
especies de coliformes en el mismo ambiente.
8. Bibliografía
● http://www.oxoid.com/UK/blue/prod_detail/prod_detail.asp?pr=CM0793
● https://de.wikipedia.org/wiki/TTC-Test
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