TÉCNICA MICROBIOLÓGICA

Guión de las prácticas de

Microbiología

Diplomatura de Nutrición y Dietética

Curso 2007/2008
DISTRIBUCIÓN DE LAS PRÁCTICAS

PRÀCTICA Lunes Martes Miércoles Jueves Viernes

0 Introducción al laboratorio de
Normas básicas Microbiología
1 T. simple (a partir del tubo 8) T. espores (a partir de los
Tinciones [Link] (a partir de las colonias del grampositivos aislados de la
recuento de mesófilos) muestra de agua)
2 Obs. mohos
Observaciones en [Link] bacteria
fresco
3 Siembra de enterobacterias Interpretación de las colonias
Medios de cultivo sobre medios selectivo- desarrolladas sobre los medios
diferenciales selectivo-diferenciales
4 Banco de diluciones y siembra Lectura de mesofilos Lectura recuento hongos
Muestra: por agotamiento en superficie
Leche para el recuento de mesófilos y
hongos
Investigación de Salmonella Salmonella Salmonella ¿Colonias típicas sobre agar Lectura API
(Preenriquecimiento no (Enriquecimiento selectivo: RV- (Aislsmiento sobre medios VBRF o HK?
selectivo: APT) CSC) selectivo-diferenciales: ¿Cultivo puro?
VBRF-HK) ¿Enterobacteria?
Siembra API (tub 17)
5 Aislamiento de microorganismos Siembra de las colonias A partir del gramnegativo: Lectura API
Muestra: (siembra en estría escocesa) aisladas sobre agar ¿Cultivo puro?
Agua inclinado (TSA, siembra en ¿Enterobacteria?
zig-zag) Siembra API

6 Siembra sobre el medio Siembra de las colonias típicas ¿Cultivo puro? T. Gram Lectura tests bioquímicos
Portadores de selectivo-difencial agar de Baird- sobre un tubo de agar inclinado Tests bioquímicos: DNAsa,
S. aureus Parker (TSA, siembra en zig-zag) Coagulasa y crecimiento
sobre agar
sal-manitol
DISCUSIÓN Discusión en grupo
de
RESULTADOS
NORMAS DE TRABAJO EN EL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGÍA

- Protegerse con una bata LIMPIA.

- Usar guantes, gafas y mascarillas ante una muestra sospechosa de contener
microorganismos patógenos
- Lavarse las manos antes y después del trabajo. No salir del laboratorio sin
haberse lavado las manos
- En caso de tener alguna herida o corte, debe ser protegido con un vendaje
resistente al agua
- Las superficies de trabajo deben limpiarse con un desinfectantes antes y
después del trabajo. También deben desinfectarse cada vez que puedan
haberse contaminado con material microbiológico
- Todo el material usado (pipetas, etc) deberá ser depositado en contenedores
adecuados inmediatamente después de su uso. Los contenedores deberán ser
vaciados, descontaminados y rellenados con un desinfectante a diario.
- NO pipetear con la boca
- NO ponerse en la boca nada que esté en el laboratorio (lápices, boligrafos,
cigarros, comida, etc)
- Los tubos que deban centrifugarse, deben llenarse sólo hasta un máximo de
2cm de su borde
- Las asas de Kolle deben estar completamente cerradas, con un bucle de
diámetro máximo de 3 mm y una longitud máxima del hilo metálico de 5 cm
- Evitar las corrientes de aire
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PRÁCTICA 1 TINCIONES

1. Tinción simple a partir del tubo n. 8.

Tinción simple
- Preparar el frotis y fijarlo suavemente mediante el calor de la llama de un
mechero Bunsen.
- Teñir con azul de metileno o con fucsina durante 1 ó 2 minutos
- Lavar con agua
- Observar al microscopio con aceite de inmersión

Manejo del microscopio

- Conectar el sistema de iluminación y seleccionar el objetivo para la
observación
- Con el tornillo macrométrico aproximarse lo más cerca posible de la
preparación sin llegar a tocarla
- Mirando a través del ocular, elevar muy lentamente el objetivo hasta lograr
enfocar. Afinar el enfoque con el tornillo micrométrico.
- En caso de utilizarse el objetivo de inmersión, será necesario colocar una gota
de aceite sobre la preparación. El objetivo deberá bajarse cuidadosamente
hasta tocar el aceite y mirando a través el ocular, proceder a enfocar.
- Desconectar el foco de iluminación inmediatamente después de realizar la
observación.
- Limpiar delicadamente el objetivo de inmersión del microscopio antes de que
se seque el aceite, con la ayuda de un papel de filtro o de celulosa.

2. Tinción de Gram a partir de las colonias de mesófilos desarrolladas a

partir de la muestra de leche

Tinción de Gram
- Preparar el frotis y fijarlo suavemente mediante el calor de la llama de un
mechero Bunsen.
- Teñir con violeta de genciana durante 3 minutos
- Lavar con agua
- Añadir lugol. Dejar actuar durante 2 minutos
- Lavar con agua
- Decolorar con alcohol-acetona
- Teñir con safranina durante 1 minuto
- Lavar con agua
- Secar y observar al microscopio con aceite de inmersión

Lectura: las bacterias grampositivas se tiñen de color violeta y las gramnegativas

de color rojo.
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3. Tinción de esporas a partir de los bacilos Gram positivos aislados a partir

de la muestra de agua

Tinción de Bartolomew o tinción de verde malaquita

- Preparar el frotis y fijarlo suavemente mediante el calor de la llama de un
mechero Bunsen.
- Cubrir la preparación con papel de filtro.
- Añadir verde malaquita.
- Calentar mediante la llama de un hisopo mojado con alcohol hasta la
formación de humos blancos. Dejar enfriar y añadir colorante. Repetir la
operación 5 ó 6 veces.
- Sacar el papel de filtro y lavar con agua.
- Añadir safranina. Dejar actuar durante 2 minutos.
- Lavar con agua.
- Secar y observar al microscopio con aceite de inmersión.

Lectura: las esporas se tiñen de verde, mientras que las células vegetativas se
tiñen de color rojo.
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PRÁCTICA 2 OBSERVACIÓNES EN FRESCO

A. IDENTIFICACIÓN DE HONGOS FILAMENTOSOS A NIVEL DE

GÉNERO

A partir de las cuatro placas de hongos filamentosos 1, 2, 3 y 4, anotar las

características macroscópicas y microscópicas de cada cultivo.

A) Observación de las características macroscópicas de las colonias: tamaño,

color, forma, bordes, pigmentación, olor, micelio sumergido o aéreo,
consistencia...
B) Observar la colonia a bajos aumentos
C) A partir de las placas de hongos filamentosos, realizar una preparación en
fresco y observar al microscopio.
D) Dibuja lo que observas en tus preparaciones ¿A qué género corresponden?

Observación de hongos: preparación en fresco

- Poner una gota de agua en un portaobjetos

- Colocar un fragmento de la colonia
- Poner un cubreobjetos
- Observar al microscopio

B. OBSERVACIÓN DIRECTA DE LA MOVILIDAD BACTERIANA

A partir del cultivo líquido de Pseudomonas fluorescens en TSB (tubo n. 6),

realizar la observación directa de la movilidad

- Poner una gota de la parte superior del cultivo en un portaobjetos

- Poner un cubreobjetos
- Observar al microscopio, enfocando primero el margen del portaobjetos hasta
el objetivo de x40.
- Colocar una gota de aceite de inmersión en el centro de la preparación.
Enfocar con el objetivo de x100
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Diagramas de: A. Mucor, B. Aspergillus, C. Fusarium, D. Penicillium

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PRÁCTICA 3 MEDIOS DE CULTIVO SELECTIVO-

DIFERENCIALES

Para esta práctica, tienes dos especies de enterobacterias que deberás sembrar
en estría sobre una placas de petri que contengan los medios de cultivo
siguientes: TSA, EMB (Levine), agar entérico de Hektoen, agar verde brilante rojo
fenol, agar McConkey y agar Chromocult coliform. La placas deben incubarse a
37ºC durante 24 horas.

Transcurrido el tiempo de incubación, anota las características macroscópicas de

las colonias desarrolladas en cada uno de los medios. A partir de los resultados
obtenidos, indica a qué género o especie puede pertenecer cada cepa.

TSA (TRIPTIC SOY AGAR)

Uso: Medio de cultivo general, libre de inhibidores y de indicadores.

EMB (Levine) (AGAR EOSINA, AZUL DE METILENO)

Uso: Para el aislamiento y difernciación de E. coli y Enterobacter

Modo de acción: El medio contiene eosina y azul de metileno, colorantes que

inhiben el desarrollo de la flora grampositiva. El medio contiene lactosa.

Apariencia de las colonias:

E. coli Colonias de 2-3 mm de diámetro, con el anverso verde brillante al

reflejarse la luz. Reverso oscuro e incluso negro a la luz transmitida.

Salmonella Colonias transparentes-ámbar

HK (AGAR ENTÉRICO DE HEKTOEN)

Uso: Para la detección y aislamiento de patógenos intestinales como Salmonella

Modo de acción: Las colonias lactosa-positivas se distinguen de las lactosa-

negativas por la presencia de dos indicadores: el azul de bromotimol y la fucsina
ácida. La combinación del tiosulfato del medio con una sal de hierro provoca
colonias negras que indican la presencia de colonias H2S-positivas. El medio
contiene sales biliares que inhibe el crecimiento de bacterias no entéricas.

Apariencia de las colonias:

E. coli Colonias de coloración naranja-rojo rodeadas de una zona de

precipitado.
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Salmonella Colonias azul-verdosas, con o sin el centro negro

VB (AGAR VERDE BRILLANTE ROJO FENOL)

Uso: Para el aislamiento selectivo de Salmonella

Modo de acción: El medio contiene verde brillante como inhibidor de la flora

acompañante. Contiene lactosa y rojo fenol como indicador.

Apariencia de las colonias:

E. coli Colonias amarillas rodeadas de una zona amarilla.

Salmonella Colonias rojas rodeadas de una zona brillante.

CC (AGAR COLIFORM CHROMOCULT)

Uso: Agar selectivo para la detección simultánea de coliformes y E. coli

Modo de acción: El medio contiene peptonas seleccionadas, piruvato, sorbitol y

tampón fosfato para garantizar la recuperación de los coliformes dañados
subletalmente. El crecimiento de los grampositivos y de muchos gramnegativos
está inhibido por la presencia de Tergitol. Incluye productos cromogénicos par la
diferenciación de E. coli del resto de coliformes

Apariencia de las colonias:

E. coli Colonias violetas.

Coliformes Colonias rosadas

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PRÁCTICA 4 ANÁLISIS DE UNA MUESTRA DE LECHE

A. Recuento de microorganismos viables mediante siembra por

agotamiento en superficie

A partir de la muestra de leche, proceder a determinar el número de

microorganismos mesófilos revivificables.

Diluyente: Solución salina estéril (NaCl 0,85 %)

Medios de cultivo:
Bacterias: TSA (T)
Hongos: Agar Sabouraud glucosado al 2 % (S) adicionado con 30 ppm de un
antibiótico de amplio espectro
Incubación:
Bacterias: en aerobiosis a 37  1 ºC durante 24  2 horas
Hongos: en aerobiosis a 28  1 ºC durante 72  4 horas

Recuento de microorganismos viables presentes en una muestra

- A partir de una muestra homogeneizada preparar la suspensión madre (10 -1)

en solución salina estéril u otro diluyente apropiado. Preparar un banco de
diluciones decimales hasta 10-5.
- Realizar una siembra en superficie (0.1 ml de inóculo) sobre los medios de
cultivo adecuados (realizarlo para cada dilución y por triplicado)
- Incubar las placas en posición invertida en las condiciones necesarias.

Lectura: Transcurrido el tiempo de incubación, contar el número de colonias

desarrollado en cada placa, seleccionando las de la dilución en la que el número
de Unidades Formadoras de Colonia (UFC) esté comprendido entre 30 y 300 en
el caso de las bacterias y entre 10 y 100 para hongos.
Teniendo en cuenta el factor de dilución y el volumen del inóculo, calcular el
número de microorganismos viables por unidad de muestra, que expresaremos
como UFC/g o UFC/mL.

Siembra en superficie

1.- Abrir el tubo donde está la dilución.

2.- Pipetear 0.1 ml.
4.- Flamear y tapar el tubo.
5.- Coger la placa en la mano y abrir la tapa con los dedos índice y pulgar, sólo el
espacio suficiente para realizar la siembra.
6.- Sembrar depositando el inóculo en la superficie del agar.
7.- Esterilizar el asa de Digralsky: mojarla en alcohol, flamearla y dejarla enfriar.
8.- Repartir el inóculo por la superficie de la placa.
9.- Esterilizar el asa de Digralsky.
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B. Investigación de la PRESENCIA/AUSENCIA de Salmonella

1. Preenriquecimiento en medio líquido no selectivo

 Inocular 25 mL de muestra en un erlenmeyer con 225ml de agua de peptona
tamponada estéril.
 Mezclar e incubar a 37  1 ºC durante 16-20 horas.

2. Enriquecimiento en medio líquido selectivo

 Agitar bien el cultivo de preenriquecimiento.
 Sembrar 0,1 ml del cultivo en agua de peptona tamponada sobre 10 ml del
medio Rappaport-Vassiliadis.
 Incubar a 43  1 ºC durante 18-24 horas.
 Sembrar 10 ml del cultivo en agua de peptona tamponada sobre 100 ml de
caldo selenito cistina.
 Incubar a 37  1 ºC durante 18-24 horas.

3. Aislamiento
 Sembrar por duplicado, sin recargar el asa en la segunda placa, partiendo de
cada uno de los dos medios líquidos selectivos de enriquecimiento, sobre:
Agar verde brillante rojo fenol.
Agar Hektoen.
 Incubar todas las placas a 37  1 ºC durante 24-48 horas.

4. Lectura:
 Salmonella en agar verde brillante rojo fenol produce colonias rojo-rosadas,
transparentes, rodeadas de un halo rojo brillante.
 Salmonella en agar Hektoen produce colonias verde azuladas con o sin el
centro negro.

5. Confirmación:
 A partir de alguna de las colonias sospechosas desarrolladas sobre los medios
selectivos, realizar un aislamiento en un tubo con agar inclinado TSA.
 Comprobar su pureza mediante una tinción de gram (Salmonella es
gramnegativa)
 Identificar la cepa mediante el micrométodo api 20 E ®, tras comprobar que es
catalasa positiva y oxidasa negativa.

Detección de enzimas respiratorios o sustancias relacionadas

Oxidasa

Fundamento: Detectar la existencia de oxidasa bacteriana al poner las bacterias

en contacto con un reactivo fácilmente oxidable, el cual se colorea de forma
visible.
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Método: A partir de un cultivo desarrollado en un medio general, con una asa de

siembra tomar dos o tres colonias. Depositarlas sobre un papel de filtro, ráscando
el papel con el asa. Añadir unas gotas del reactivo de la oxidasa.

Reactivo: Di ó tetrametil-p-fenilen diamida en solución acuosa al 1 %.

Lectura: Las bacterias productoras de oxidasa oxidan el reactivo y la colonia se

colorea rápidamente de color PÚRPURA (en los primeros 60 segundos) que va
oscureciendo rápidamente para pasar a VIOLÁCEO y finalmente a NEGRO (5 a
10 minutos). Las colonias negativas no varían el color.

Catalasa

Fundamento: Detectar la presencia de la catalasa (peróxido de hidrógeno

oxidorreductasa) la cual cataliza la descomposición del peróxido de hidrógeno en
agua y oxígeno gaseoso.

Esta prueba se utiliza para diferenciar los microorganismos anaerobios estrictos y

aerotolerantes que carecen del enzima, de los aerobios y anaerobios facultativos,
que lo poseen para evitar los efectos tóxicos secundarios del metabolismo del
oxígeno.

Método: A partir de un cultivo desarrollado en un medio general, con una asa de

siembra tomar dos o tres colonias. Depositarlas sobre un portaobjetos. Añadir
unas gotas del reactivo de la catalasa.

Reactivo: Agua oxigenada

Lectura: Si se producen burbujas el microorganismo es catalasa positivo.

Nota: Nunca debe realizarse esta prueba sobre placas de agar sangre, ya que la
sangre contiene catalasa.

Identificación de Enterobacterias mediante el micrométodo API 20 E

1. Preparar una cámara de incubación con su tapa correspondiente y repartir

aprox. 5 mL de agua desionizada en los alveolos para proporcionar una
atmósfera húmeda.
2. Anotar la referencia de la cepa en la lengüeta lateral.
3. Sacar la galería de su embalage.
4. Colocar la galería en la cámara de incubación.
5. Preparar una suspensión de la bacteria a identificar en solución salina estéril.
6. Con ayuda de una pipeta, llenar tubos y cúpulas de los tests CIT, VP y GEL
con la suspensión bacteriana.
7. Llenar los tubos, pero no las cúpulas de los tests restantes.
8. Llenar la cúpula de los test ADH, LCD, ODC, H2S y URE con aceite de
parafina para obtener anaerobiosis.
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9. Cerrar la cámara de incubación.

10. Incubar a 37 ºC durante 18-24 horas.

LECTURA:
Si la glucosa es postiva y/o 3 o más tests son positivos, efectuar el revelado de
los tests que requieren reactivos (consultar la tabla de lectura).
 Test TDA: añadir una gota de reactivo TDA. Un color marrón oscuro indica
una reacción positiva.
 Test IND: añadir una gota del reactivo de Kovacs (prueba del indol). La
aparición de un anillo rojo indica una reacción positiva.
 Test VP: añadir una gota de cada uno de los reactivos para Voges-Proskauer.
Un color rojo o rosa indican resultados positivos. La aparición de una
coloración rosa-pálido en 10 ó 12 minutos, debe ser considerada como
negativo.
 Test NO2: añadir una gota de cada uno de los reactivos de Griess-Illosvay en
el tubo GLU. Un color rojo indica resultado positivo. Si la reacción es
negativa, añadir de 2 a 3 mg de zinc. Si después de 5 minutos el tubo
permanece amarillo indica una reacción positiva. Si la reacción da un color
rosa o rojo, la reacción es negativa.
Realizar la identificación con ayuda de las llaves de identificación.
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TABLA DE LECTURA

TESTS SUBSTRATOS REACCIONES/ RESULTADOS

ENZIMAS NEGATIVO POSITIVO
ONPG Orto-nitro-fenol--D- beta-galactosidasa Incoloro Amarillo o amarillo
galactopiranósido pálido
ADH Arginina Arginina dehidrolasa Amarillo Rojo/naranja
LDC Lisina Lisina descarboxilasa Amarillo Naranja
ODC Ornitina Ornitina descarboxilasa Amarillo Rojo/naranja
CIT Citrato sódico Utilización del citrato Verde Azul-verde/azul
pálido/amarillo (cúpula)
H2S Tiosulfato sódico Producción de H2S Incoloro/grisáceo Depósito
negro/línea sutil
URE Urea Ureasa Amarillo Rojo/naranja
TDA Triptófano Triptófano desaminasa Amarillo Marrón oscuro
IND Triptófano Producción del indol Incoloro/amarillo Anillo roja
VP Piruvato sódico Producción de acetoína incoloro Rosa/rojo
GEL Gelatina de Kohn Gelatinasa No difusión de Difusión de
pigmento negro pigmento negro
GLU Glucosa Fermentación/oxidación Azul/azul Amarillo/amarillo-
verdoso gris
MAN Manitol Fermentación/oxidación Azul/azul Amarillo/amarillo-
verdoso gris
INO Inositol Fermentación/oxidación Azul/azul Amarillo/amarillo-
verdoso gris
SOR Sorbitol Fermentación/oxidación Azul/azul Amarillo/amarillo-
verdoso gris
RHA Ramnosa Fermentación/oxidación Azul/azul Amarillo/amarillo-
verdoso gris
SAC Sacarosa Fermentación/oxidación Azul/azul Amarillo/amarillo-
verdoso gris
MEL Melibiosa Fermentación/oxidación Azul/azul Amarillo/amarillo-
verdoso gris
AMY Amigdalina Fermentación/oxidación Azul/azul Amarillo/amarillo-
verdoso gris
ARA Arabinosa Fermentación/oxidación Azul/azul Amarillo/amarillo-
verdoso gris
En negrita: tests que requieren reactivos reveladores para realizar la lectura
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PRÁCTICA AISLAMIENTO
5: E IDENTIFICACIÓN DE
MICROORGANISMOS A PARTIR DE UNA MUESTRA DE AGUA

A partir de la muestra de agua, conseguir aislar los microorganismos presentes.

Identificar la Enterobacteria mediante una galería API 20 E.

Aislamiento por agotamiento en placa mediante estría escocesa

1.- Flamear el asa de Kolle y dejarla enfriar.

2.- Abrir el tubo donde está la muestra y flamear la boca del tubo.
3.- Coger una alícuota con el asa.
4.- Flamear y tapar el tubo.
5.- Coger la placa en la mano y abrir la tapa con los dedos índice y pulgar, sólo el
espacio suficiente para introducir el asa.
6.- Sembrar mediante el asa de Kolle, dibujando líneas paralelas en una zona de
la placa.
7.- Esterilizar el asa.
8.- Girar la placa 90 º y, sin cargar el asa, dibujar varias líneas paralelas que se
crucen con las anteriores. Repetir de nuevo el proceso girando la placa 90º y 180º
más.
9.- Esterilizar el asa de Kolle.

A partir de las colonias desarrolladas, realizar una resiembra en un tubo con agar
TSA. Incubar el tubo a 37 ºC durante 24 horas.

Siembra en tubos con agar inclinado o “slant”

1.- Esterilizar el asa de Kolle y dejarla enfriar.

2.- Abrir la placa.
3.- Coger una parte de la colonia con el asa.
4.- Flamear y tapar el tubo.
5.- Abrir el tubo donde quiere realizarse la siembra. Flamear la boca.
6.- Sembrar desde el fondo del tubo, ascendiendo suavemente por la superficie
en forma de zig-zag.*
7.- Flamear la boca y tapar el tubo.
8.- Esterilizar el asa de Kolle.

*NOTA: En caso de realizarse la siembra de un hongo filamentoso, el punto 6

deberá ser llevado a cabo de la siguiente forma: realizar una siembra en punto,
depositando suavemente el asa sobre la superficie del centro del slant.
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Transcurrido el período de incubación, realizar una tinción de gram para

comprobar la pureza del cultivo. Si el cultivo es puro, ya podríamos proceder a
realizar las pruebas bioquímicas necesarias para llegar a su identificación.

Para esta práctica, usted deberá identificar la enterobacteria presente en la

muestra (bacilos gramnegativos, oxidasa negativos, catalasa positivos). Para
esto, dispone de una galería API 20E.
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PRÁCTICA 6:INVESTIGACIÓN DE PORTADORES DE

Staphylococcus aureus

1. Mediante un hisopo, recoger una muestra de los orificios de la nariz. Realizar

una siembra en estría escocesa sobre agar Baird-Parker. Incubar la placa a
37ºC durante 24 horas.
2. Aplicar cada mano sobre una placa de agar de Baird-Parker con el fin de
evaluar si se es portados de S. aureus. Incubar las placas a 37ºC durante 24
horas.
3. En caso de desarrollarse colonias típicas de S. aureus, proceder a confirmar
la identidad del microorganismos, realizando los test necesarios
(recomendamos: respuesta a la tinción de gram, catalasa, actividad DNAsa,
actividad coagulasa y crecimiento sobre agar sal manitol).
S. aureus son cocos grampositivos, catalasa positivos, son moderadamente
halófilos y manitol positivos. Las cepas enterotoxigénicas suelen asociarse a
tener actividad coagulasa y DNAsa.

Crecimiento sobre agar Baird-Parker:

Fundamento: Este medio contiene cloruro de lítio y telurito para la inhibición de la

flora acompañante. El piruvato y la glicocola favorecen el crecimiento de los
estafilococos.
El medio de cultivo es opaco debido a que contiene yema de huevo. Sobre él, las
colonias desarrolladas pueden mostrar halos de clarificación si tienen
capacidades lipolíticas. Si el microorganismo reduce el telurito a teluro, las
colonias son negras.

Siembra: en estría ligera.

Lectura: S. aureus produce colonias negras, lustrosas, convexas y puntiformes.

Las colonias están rodeadas por un halo claro de 2 a 5 mm de anchura.
S. epidermidis presenta colonias negras de forma irregular, sin halo de
clarificación.

A partir de las colonias desarrolladas, realizar una resiembra en un tubo con agar
TSA. Incubar el tubo a 37 ºC durante 24 horas.

Actividad coagulasa:

Fundamento: Según Fairbrother (1940), sólo los estafilococos patógenos son

capaces de coagular el plasma gracias a poseer el enzima coagulasa. Así pues,
este test es útil para diferenciar los estafilococos patógenos de los no patógenos.
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Siembra: Preparar una suspensió densa del microorganismo en solución salina

estéril. Añadir 100 µL en un tubo que contenga plasma de conejo. Incubar los
tubos a 37ºC.

Lectura: Examinar los tubos periódicamente. Cualquier inicio de coagulación en

3 ó 4 horas debe considerarse como resultado positivo. Algunas cepas, sólo
producen cosagulación después de ser incubadas durante 18 horas.

Desoxirribonucleasa

Fundamento: Detectar DNAasas extracelulares

Medio de cultivo: Agar DNAasa

Reactivo: HCl 1N

Siembra: por estría

Incubación: a 37 ºC durante 24 horas

Lectura: colocar unas gotas de HCl 1 N que cubran la superficie de la placa. El

ácido hará precipitar el ADN en forma de precipitado blanco. Si ha sido
degradado, se observa una zona transparente alrededor de la estría.

Crecimiento sobre agar sal manitol

Fundamento: Detectar estafilococos patógenos. Solamente los microorganismso

halotolerantes serán capaces de desarrollarse sobre este medio (contiene 75 g
NaCl/L). La degradación de manitol, con la correspondiente producción de ácido,
se correlaciona con S. aureus.

Medio de cultivo: agar [Link] (con rojo fenol como indicador de pH)

Siembra: por estría

Incubación: a 37 ºC durante 24 horas

Lectura: S. aureus crece abundantemente en el medio. Las colonias son amarillas

y rodeadas de zonas amarillas brillantes. Las bacterias manitol negativas, como
S. epidermidis, no producen cambio de la coloración del medio (el medio conserva
la coloración roja característica).