UNMSM – FQIQ – Dpto. Quím.
Orgánica Guía de Laboratorio Microbiología General
PRACTICA N° 2
UTILIDAD Y PREPARACION DE MATERIALES USADOS EN MICROBIOLOGIA.
RECONOCIMIENTO DE EQUIPOS
OBJETIVOS:
- Familiarizar al alumno con el material de vidrio y de otra naturaleza de uso frecuente en
Microbiología.
- Adiestrar al alumno en la limpieza y preparación del material para su esterilización.
- Reconocimiento de equipos utilizados en microbiología.
I. MATERIAL DE VIDRIO
Aparte del instrumental y variado equipo que se requiere en todo laboratorio de Microbiología, el
MATERIAL DE VIDRIO constituye una de las principales herramientas de esta disciplina.
Como requisito general, el MATERIAL DE VIDRIO debe ser: de vidrio neutro, resistente a cambios de
temperatura, transparente, de superficie lisa, sin rajaduras, que contenga una mínima calidad de
álcali libre y de bajo coeficiente de dilatación. Actualmente existen marcas con estas propiedades.
Como: PIREX, KIMAX, KIMBLE, GENA, GLASS, ASSISTENT y otros. Se describe el material
indispensable para el funcionamiento de un Laboratorio de Microbiología.
1.- TUBOS DE PRUEBA: Condiciones. - que sean de paredes gruesas, bien equilibrados, de
preferencia sin reborde para facilitar el taponamiento. Medidas. - de 16 x 150 mm y 15 x 125 mm
para cultivos microbianos puros y para diluciones de análisis cuantitativos. Para efectuar estudios
de fermentación, hemólisis y utilización de sustratos se recomienda usar tubos de 13x 100 mm y
para estudios serológicos de 10 x 75 mm.
Tubos de centrífuga. -
De vidrio. - Pueden ser de varias medidas, desde 10mL hasta 25 mL, graduados en cc o en mm.
Pueden ser de fondo cónico o redondo y siempre de paredes gruesas.
De polietileno: De idénticas medidas a las anteriores, se utilizan para centrifugaciones a altas
revoluciones (p.e. en ultracentrífugas).
Tubos Leishton, de las medidas antes indicadas para cultivos de células.
2.- CAPSULAS O PLACAS DE PETRI: Compuestas de dos cristalizadores, de los cuales el más
grande hace de tapa. Las más usadas son de 10, 12 ó 20 mm x 100 mm y se emplean para el cultivo
y aislamiento de microorganismos. La tapa puede ser reemplazada por material de porcelana o
metal sin esmalte en la superficie interna.
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3.- PLACA DE BREWER: Para el cultivo y aislamiento de microorganismos anaerobios. Son
idénticos a los anteriores, con excepción de las tapas, que además de pesadas tienen una depresión
central que impide la acumulación de aire, ayudando a mantener la anaerobiosis.
4.- PIPETAS: Las primeras son terminales y con capacidad de 0.1 a 25mL. Las mejor aforadas, son
las de las marcas PIREX Y EXAX. Las de mayor uso son:
- Para medidas de líquidos en pequeños volúmenes:
- Pipetas de 10 mL
“ “ 5 mL
“ “ 1 mL
“ “ 0.1 mL
5.- PIPETAS PASTEUR: Confeccionadas de varillas de vidrio de 4mm de diámetro y de 20 ó 30 cm
de longitud. La calidad del vidrio debe facilitar reblandecimientos a la acción directa de la llama del
mechero, para conseguir por estiramiento la capilaridad deseada; es decir, es una pipeta con
porción capilar. Se las emplea para la toma de pequeños inóculos de siembra.
NOTA: La técnica de preparación se especifica en el procedimiento respectivo.
6.- MATRACES Y BALONES: Recipientes volumétricos de gran utilidad para la preparación y
almacenamiento de soluciones, colorantes, reactivos, medios de cultivo, etc. La calidad debe ser la
misma, recomendada en los requisitos generales.
Los balones se diferencian de los matraces por tener una base esférica con fondo plano. En ambos
los cuellos terminan en un discreto reborde los que les confiere resistencia.
Los más comunes son: 100, 250, 500, 1000 y 2000 mL. Hay de menores medidas a las de 100mL.
7.- ESPATULAS DRIGALSKY: Se confeccionan a partir de varillas de vidrio macizo, la fracción recta y
horizontal facilita la siembra y aislamiento de bacterias por diseminación.
NOTA: La técnica de preparación se especifica en el procedimiento respectivo.
8.- FIOLAS: Idénticas a los balones, están calibradas a medidas exactas mediante un aforo en la
parte media del cuello del recipiente en el que se indica la medida. Se emplea exclusivamente para
la preparación de soluciones molares y normales.
9.- KITASATO: Es un matraz que además de la boca tiene una salida lateral corta para unirla a la
bomba de vacío. Se utiliza como parte del equipo de filtración (esterilización en frío).
Las medidas son las mismas que la de los matraces comunes.
10.- PROBETAS: Recipientes cilíndricos con base para la estabilidad, sus paredes son más gruesas
que el material antes indicado. Pueden estar o no graduadas; las primeras para medidas de líquidos
en la preparación de cualquier solución y las segundas, como depósito de desinfectantes para
pipetas, baguetas, etc. Las hay de diferentes capacidades; las de 100, 250, 500 y 1000 son las de
mayor uso en el laboratorio.
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11.- VARILLAS DE VIDRIO MACIZO: fragmentos de 30 a 60 cm, que sirven la confección de
agitadores o baguetas y espátulas de Drigalsky; los más cortos son empleados regularmente como
mangos para asas de siembra.
12.- BEAKER o VASOS DE PRECIPITACION: Recipientes cilíndricos de amplia utilidad en la
preparación de soluciones y medios de cultivo. Se fabrican en varias medidas. El vidrio debe ser
necesariamente resistente al calor.
13.- FRASCOS VIALES PARA HEMOCULTIVOS, VACUNAS, CULTIVOS DE TEJIDOS: Son de vidrio
neutro, resistentes al calor, transparentes y con tapa de rosca. Con capacidad de 50, 100 y 150 mL.
Los frascos de vidrio neutro de 50 y 100 mL, blancos o de color ámbar pueden ser aprovechados
para la reserva de soluciones y medios de cultivo en stock, previamente taponados con algodón
esterilizado.
OBSERVACION: El material de vidrio restante por ser muy conocido en variedad y usos en todo
laboratorio microbiológico, solo lo mencionaremos:
MORTEROS, con PILON DE VIDRIO o PORCELANA; PORTAOBJETOS Y CUBREOBJETOS; LUNAS DE
RELOJ de diversos diámetros; TERMOMETROS CLINICOS y de AMBIENTE; ampolletas para
almacenar cultivos, sueros y vacunas en líquido o liofilizado; CAPSULAS DE PORCELANA con fondo
redondo o plano; CAMARA y PIPETAS CUENTAGLOBULOS, etc.
II. MATERIAL DE OTRA NATURALEZA
La lista también es enorme; mencionaremos los que más se utilizan:
1.- MANGOS DE KOHLE: Vástagos de metal con su cubierta de ebonita aislante del calor y en el
extremo proximal una tuerca para insertar el alambre de platino o nicrom en el asa de siembra.
Pueden ser reemplazados por mangos de vidrio, ya descritos anteriormente.
2.- ESPATULAS DE METAL CON MANGOS DE MADERA: de preferencia de material inoxidable, su
uso es muy conocido.
3.- TRIPOIDES: son de metal, de preferencia de fierro, muy buenos soportes de recipientes
sometidos al calentamiento. Hay de varias alturas y diámetros.
4.- ESTUCHES CILINDRICOS O CUBICULARES: De cobre estañado, para esterilizar pipetas. Los hay
cilíndricos, solamente para la esterilización de Placas Petri.
5.- MECHEROS DE BUNSEN: Imprescindibles en Microbiología. Son de metal con una tuerca
movediza para medir la intensidad de la llama. Algunos modelos llevan una llave de control ad-hoc.
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6.- CANASTILLAS O CESTOS DE METAL: Las mejores son de aluminio. Favorecen el mejor
almacenamiento de tubos de prueba en medidas conocidas. Sin riesgos de rotura.
7.- SOPORTES UNIVERSALES: Con tenazas y aros de metal, para asegurar cuellos y bases de
matraces, balones, beakers, etc.
8.- RECIPIENTES DE POLIETILENO O DE METAL: Cilíndricos con bases circulares o cuadrangulares,
para lavado de pipetas. Puede ser de manejo manual o automático.
9.- ADEMAS: Gradillas de madera o metal para tubos de prueba de varios tamaños y para frascos,
goteros, rejillas de asbesto, hilos de platino, aplicadores o vástagos de metal o madera para
confección de hisopos, tapones de jebe o corcho para tubos, algodón, papel filtro, papel kraft
envolvente, papel engomado en tiras, papel platina, lápiz graso para escribir en frío o plumones de
tinta indeleble, mangueras de jebe de 10 ó 20 cm. De diámetro, bandejas de fierro enlozado,
instrumental quirúrgico, hilo de sutura, papel indicador de pH, etc.
PREPARACION DEL MATERIAL PARA SU ESTERILIZACION - LIMPIEZA
El material de vidrio nuevo o usado debe limpiarse en forma tal que elimine toda huella de
suciedad original. Se evita así la precipitación y depósito de los agentes que ejercen poder
limpiador. El cristal de borosilicato (PYREX) o los instrumentos de vidrio sódico lavados en fábrica,
no requieren tratamiento alguno antes de su utilización, salvo el lavado normal. El material de
vidrio sódico nuevo debe sumergirse en HCI durante una noche, para neutralizar el álcali contenido
en el vidrio.
Es importante:
a.- Conocer el grado de dureza del agua (exceso de Ca, Fe, Mg, Cu).
b.- Usar detergentes que no contengan álcalis, que ablanden el agua, que sean fácilmente soluble
en agua tibia y no precipiten en agua fría, tibia o caliente.
c.- Eliminar los residuos más tenaces: proteínas y grasas con facilidad y por completo.
d.- No producir deterioro alguno en los materiales de los instrumentos ni en la piel.
e.- No usar jabón ni detergentes no garantizados.
NOTA: En caso de material de vidrio usado, la limpieza debe hacerse tan pronto como sea
posible.
RECOMENDACIONES GENERALES
Elegir la mesa de trabajo, de preferencia cercana al equipo de esterilización.
Colocar sobre la mesa y en forma ordenada todo el equipo a prepararse: matraces, tubos de
prueba, pipetas, etc. trozos de papel engomado y de pabilo, lápiz grazo.
Rotular los materiales con datos de: medidas, fecha y nombre del grupo o persona a quien
pertenecen.
No manipular bruscamente el material a fin de evitar posibles roturas.
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Nunca taponar o envolver los recipientes sin un previo y total secado de los mismos. Caso
contrario aparecerán manchas negras después de la esterilización, sobre las zonas donde
quedó humedad.
A. PREPARACIÓN DEL MATERIAL CONTAMINADO PARA SU ESTERILIZACIÓN
Se recomienda el uso de guantes de jebe de tamaño adecuado a las manos del alumno. Los pasos a
seguir son:
1.- Borrar con algodón empapado con alcohol de 96º, el rotulado de las placas Petri y de los tubos
de ensayo.
2.- Recipientes con cultivos descartados o contaminados, deben descontaminarse en autoclave,
quitando luego tapones y contenido en caliente. Los restos de agar deben ser removidos de las
placas Petri o tubos de ensayo y colocados en bolsas para su eliminación. Las pipetas u otros
dispositivos se deben desinfectar en las probetas cilíndricas sin graduar conteniendo solución
bactericida sulfocrómica o detergentes más 1% de fenol, durante 24 horas.
3.- Remojar en una solución de agua con detergente todos los materiales de vidrio. Limpiar el
material por dentro frotando con escobilla a la medida. Cuando la escobilla por el uso queda en
alambre en su extremo distal, se recomienda desechar para evitar roturas.
4.- Enjuagar con agua de caño a chorro continuo hasta eliminar el detergente o agente bactericida.
Continuar el enjuague con 2 ó 3 cambios de agua destilada.
5.- Escurrir el agua del material colocándolos sobre soportes sin rajaduras con la boca hacia
abajo y esperar que sequen por si solos. De ninguna manera se deben usar lienzos para el secado,
por los restos de hilachas que quedarían sobre la superficie del material. En caso de porta y cubre
objetos, como paso final se pasan por alcohol de 70 para su desengrase.
Las láminas portaobjeto, se deben:
- Frotar con papel toalla para retirar el aceite en caso el portaobjeto este cubierto con residuos
de aceite de inmersión.
- Retirar el cubreobjeto de los portaobjetos con una pinza.
- Remojar los porta y cubreobjetos en una solución de agua con detergente durante 24 horas.
- Frotar las láminas con una esponja en la misma solución de detergente.
- Enjuagar las láminas por separado en abundante agua a chorro continúo en la grifería.
- Enjaguar las láminas con agua destilada, retirarlas y dejarlas secar.
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B. PREPARACIÓN DEL MATERIAL LIMPIO PARA SU ESTERILIZACIÓN
Material. -
1.- Trozos de algodón de varias dimensiones.
2.- Papel Kraft en tiras y trozos rectangulares y cuadrados.
3.- Pabilo
4.- 10 a 12 tubos de prueba de 16 x 150 mm.
10 a 12 tubos de prueba de 13 x 100 mm.
10 a 12 tubos de prueba de 10 x 75 mm.
5.- Matraces Erlenmeyer y Kitasato de 1000, 500 y 250 mL. Uno de cada uno.
6.- Probetas de 1000, 500 y 100 mL, dos de cada una.
7.- Pipetas graduadas de 10, 5, y 1 mL, dos de cada una. Pipeta volumétrica de 100
ó 50 mL.
8.- 4 ó 5 placas Petri de 10 x 100 mm/
9.- Jeringas hipodérmicas de 10, 5 y 2 cc.
10.- Varillas de vidrio hueco de 20 a 30 cm. De longitud por 4 a 6 cm de calibre.
11.- Varillas de vidrio macizo de 40 a 60 cm.
12.- Alambre de platino o nicrom
13.- Lápiz graso o plumón de tinta indeleble (marcador)
PROCEDIMIENTO. -
I. CONFECCION DE TAPONES DE ALGODÓN
Método Nº 1
a.- Tomar un trozo rectangular de tamaño adecuado para adaptar al diámetro de la boca del
recipiente a taponar.
b.- Practicar un doblez en tres a lo largo de la fibra.
c.- Hacer una torsión de 90 en el primer tercio, doblar sobre el tercio medio y plegar el
último tercio sobre el primero.
d.- Rotar con los dedos el trozo confeccionando para darle forma y diámetro a la medida de
los tubos y matraces.
Método Nº 2
Tomar un trozo rectangular, practicar a lo largo el doblez en tres y enrollarlo transversalmente a su
eje longitudinal hasta darle la medida y diámetro deseado. Para mejor duración del tapón, amoldar
un trozo de gasa que lo cubra totalmente. El tapón en los tubos, matraces u otro recipiente debe
quedar introducido en sus dos terceras partes; no muy ajustado ni muy flojo, para evitar
contaminaciones y dificultades en su manipulación.
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II. PREPARACION DE TUBOS DE PRUEBA
Hacer manojos de tubos taponados (10 a 12) sujetos con pabilo y cubrir por sus bordes con el papel
envolvente asegurando el paquete con pabilo o papel engomado. Los paquetes deben
corresponder a tubos de iguales medidas. Se colocan en latitas o canastillas para facilitar su
esterilización.
III. PARA LOS MATRACES, KITASATOS, FRASCOS Y PROBETAS
Después de su taponamiento, cubrirlos aisladamente con un capuchón de papel. Para la confección
seguir instrucciones del profesor. Se puede prescindir de los tapones y del papel Kraft, cubriendo
las bocas de los recipientes con trozos de papel platina ajustados íntimamente a su superficie.
PREPARACION DE MATRAZ KITASATO
La técnica es idéntica a la de los matraces. En este caso, se tapona además la tubuladura lateral y se
cubre con un papel. Aparte se envuelve el tapón de jebe correspondiente, que después de
esterilizarse se adaptará al Kitasato para la filtración.
IV. PREPARACION DE PIPETAS SEROLOGICAS Y VOLUMETRICAS
a.- Colocar tapones de algodón a manera de filtros moderadamente ajustados, en las boquillas
de las pipetas.
b.- Colocar oblicuamente la pipeta serológica a una tira de papel y hacer un doblez de éste
en un extremo, cubrir el extremo proximal (punta de la pipeta). El extremo donde se coloca la
punta de la pipeta debe tener un doblez para evitar la exposición del material por roturas
accidentales del papel.
c.- Deslizar el papel en espiral sobre la longitud de la pipeta hasta la boquilla.
Hacer torsión de la tira de papel para permitir la protección completa. Evitar queden vacíos.
Preparación de la Pipeta Volumétrica:
Seguir la misma técnica con dos tiras de papel para cubrir las partes delgadas de la pipeta. Se
aseguran los extremos proximales, con trozos de papel engomado. Queda sin cubrir la porción
bulbosa de la pipeta.
Mediante otra técnica, se protege toda la pipeta con tiras de papel (más anchas y largas) en tal
forma que el papel envolvente la cubra como estuche. Se hace torsión del papel a la altura de las
regiones delgadas de la pipeta, hasta el remate a ambos extremos.
V. PREPARACION DE LAS PLACAS PETRI
Se pueden envolver aisladamente o en número de 2, con los trozos rectangulares de papel Kraft.
a.- Colocar las placas sobre el papel en posición invertida y doblar los márgenes uno sobre otro, a
manera de cubrirla.
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b.- Completar el doblez con los extremos del papel sobrante asegurándolos con papel
engomado. Los bordes de las placas deben quedar íntimamente adheridos al papel que los
cubre, para evitar vacíos.
VI. PREPARACION DE PIPETAS PASTEUR
a.- Lisar los extremos de la varilla de vidrio hueco a la llama del mechero. Introducir los
taponcitos de algodón en 2/3 quemándose el excedente.
b.- Calentar el centro de la varilla en forma continuada, rotando a la vez ambos extremos para
evitar el cierre de la luz interna del tubo reblandecido.
c.- Retirar de la llama la región calentada y reblandecida de la varilla y tirar de los extremos para
obtener la capilaridad. El calibre varía con el tiempo de estiramiento
d.- Separar las dos pipetas por estiramiento brusco después del calentamiento y refrendar el
cierre a la llama de la porción distal capilar.
ESTERILIZACIÓN
Ordenar el material a esterilizar dentro del autoclave, de manera que haya el suficiente espacio
para que el aire caliente circule alrededor de todos los materiales.
Es recomendable el uso de estufa para la esterilización del material de vidrio, si en caso no se
cuenta con este equipo se puede utilizar el autoclave para lo cual las placas Petri y pipetas deben
colocarse dentro de bolsas plásticas de polipropileno para evitar que estas se humedezcan. Al final,
el material debe secarse de un día para otro dentro de espacios limpios.
III.- EQUIPO DE LABORATORIO
1. CABINA DE FLUJO LAMINAR: Emplea un ventilador para forzar el paso de aire a través de un
filtro HEPA o ULPA y proporcionar aire limpio a la zona de trabajo libre de partículas de hasta 0.1
micras. Este tipo de equipo presenta una única cara libre (la frontal) que da acceso al interior,
donde se localiza la superficie de trabajo, que normalmente permanece limpia y estéril. La
esterilidad de la superficie de trabajo se logra por la acción germicida de la luz ultravioleta emitida
desde un fluorescente presente en el interior del equipo. Dentro de estas cabinas o campanas se
trabaja con medios de cultivo para el crecimiento de microorganismos o cultivos celulares y en el
cual es vital evitar la contaminación con partículas minúsculas. Estas cabinas están diseñadas para
proporcionar un aire limpio y constante a una velocidad de paso de aire de 0.30 a 0.50 metros por
segundo para así barrer la superficie de la zona de trabajo y evitar la suspensión de partículas así
como una posible contaminación de las muestras. El aire es inyectado a la zona de trabajo a través
del filtro HEPA o ULPA e insuflado en forma de un flujo laminar o flujo unidireccional, muy suave,
hacia el usuario. La superficie de trabajo de la cabina se construye generalmente de acero
inoxidable grado 304 o superior para facilitar su limpieza y aumentar su durabilidad por el uso, con
acabados sanitarios, sin espacios o juntas donde las esporas pueden llegar a acumularse. Dentro del
laboratorio, la cabina de flujo laminar debe instalarse lo más lejos posible de las rejillas de aire
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acondicionado, campanas de gases, puertas y zonas de tránsito intensivo de personal, que pueda
interferir en el flujo de aire en la cabina.
El adecuado manejo de la cabina de flujo laminar consiste en:
- Poner en marcha la cabina durante 5 minutos antes de empezar a trabajar, de esta forma se
forma un barrido de partículas de la zona de trabajo.
- Limpiar la superficie de trabajo y las paredes laterales con un paño estéril (que no desprenda
partículas ni fibras) o de un solo uso, embebido en alcohol de 70º.
- Encender la luz ultravioleta y mantenerla durante por 10 minutos para esterilizar el interior del
equipo.
- Encender la luz fluorescente de la cabina.
- Antes y después de realizar el trabajo en la cabina de flujo laminar se realiza el lavado de
manos y uñas con jabón germicida. Evitar tocarse la boca, así como los ojos.
- Es recomendable usar guantes de látex para minimizar el desplazamiento de contaminantes
cutáneos hacia el interior del área de trabajo y la vez proteger el operador.
- Usar mascarillas descartables evitando dejar descubierta la boca y nariz, debido a que este tipo
de cabina solo protege a la muestra.
- Colocar el material a utilizar en la zona de trabajo antes de empezar, situando el material
contaminado en un extremo de la superficie de trabajo y el no contaminado en el extremo
opuesto de la misma.
- Es recomendable trabajar a unos 5 a 10 cm alejado de los bordes de la superficie de trabajo,
procure no obstruir las rejillas de aire con materiales o residuos.
- No use nunca la cabina de flujo laminar cuando este sonando algunas de sus alarmas.
- Al finalizar el trabajo, retire el material e instrumentos contaminados.
- Limpiar y descontaminar la superficie de trabajo retirando cualquier materia orgánica que se
haya adherido a la superficie y que sirve de sustrato a los microorganismos. Utilizar un paño
embebido con alcohol de 70º.
- Apagar.
2. AUTOCLAVE: Recipiente de presión metálico de paredes gruesas con un cierre hermético que
permite trabajar a alta presión para realizar la esterilización con vapor de agua. Su construcción
permite su resistencia a presión y temperatura elevada desarrollada en su interior. Las autoclaves
funcionan permitiendo la entrada o generación de vapor de agua pero restringiendo su salida,
hasta obtener una presión interna de 1 atmósfera, lo cual provoca que el vapor alcance una
temperatura de 121 grados Celsius, condiciones típicas de esterilización en tiempo de 15-20
minutos. La presión elevada permite que el agua alcance temperaturas superiores a los 100 °C. La
acción conjunta de la temperatura y el vapor produce la coagulación de las proteínas de los
microorganismos, entre ellas las esenciales para la vida y la reproducción de éstos, cosa que lleva a
su destrucción. Para esterilizar se aplica los siguientes pasos:
- Cerrar la llave del agua y del vapor.
- Llenar con agua el fondo del autoclave hasta el soporte de la canasta evitando el contacto con
el agua.
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- Colocar la canasta de malla metálica con los materiales que se van a esterilizar dejando el
espacio adecuado para que el vapor tenga libre acceso.
- Cerrar la puerta del autoclave con presión leve.
- Encender el autoclave
- Calibrar el control de presión a 15 lb o 1 atm en el manómetro.
- Cuando la temperatura llegue a 121º C, mantenerlo por 30 minutos.
- El autoclave disminuye la presión después del tiempo requerido por el material a esterilizar.
- Apagar el autoclave.
- Una vez que la presión haya bajado totalmente a cero, abrir lentamente la llave del vapor
hasta que el vapor haya escapado por completo.
- Abrir lentamente la compuerta y dejarla entreabierta para dejar que los materiales enfríen
ligeramente, evitándose la rotura de la cristalería y peligros para el operador por cambios
bruscos de temperatura.
3.- CONTADOR DE COLONIAS: Instrumento utilizado para contar colonias de bacterias o de otros
microorganismos que crecen en una placa de medio de cultivo. Cuenta con una superficie
iluminada sobre la que se coloca la placa permitiendo marcar las colonias con un rotulador en la
superficie externa de la placa, de tal manera que cada vez que se marca una colonia el instrumento
emite una señal audible y en la pantalla numérica.
4.- POTENCIOMETRO: Requerido para las mediciones del pH de las soluciones buffer y medios de
cultivo. Constituido por un par de electrodos sensibles a concentraciones de hidrogeniones,
conectado a un circuito eléctrico que mide las fuerzas electromagnéticas y a un potenciómetro que
indica las mediciones.
Los potenciómetros emplean un electrodo de vidrio, unido a un electrodo de calomel como
standard. El electrodo de vidrio es una delgada membrana de vidrio especial colocado entre una
media celda de Plata-Cloruro de Plata y la solución cuyo pH se quiere conocer, el electrodo de
calomel está formado por HgCl sólido sobre Mercurio metálico. Dentro de la celda de vidrio que
contiene el electrodo Ag-AgCl, se encuentra HCl 0.1 M lo que establece en uno de los lados de la
membrana de vidrio un pH constante y conocido con exactitud. La solución de pH desconocido y la
media celda están unidas por un “puente de KCl”. El electrodo de vidrio varía con los cambios de
pH de la solución problema, este potencial es una función lineal de pH.
Debe tenerse extremado cuidado en el manejo de electrodos, especialmente con la membrana del
electrodo de vidrio que es muy delicada y se rompe al primer contacto con punzo-cortantes. El
electrodo de calomel debe estar siempre lleno con solución adecuada de sal, usualmente cloruro
potásico saturado.
5.- CENTRIFUGACION: Aceleración del proceso de sedimentación, donde la célula o partícula a
sedimentar se ve sujeta a dos fuerzas de sentido opuesto: una dirigida al centro del tubo y la otra
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que se opone debido a la viscosidad del medio. La primera responde a la fórmula: f 1=my, donde y es
la aceleració debido al peso, y = 1g (unidad de gravitación); m es la masa de la partícula.
La segunda es donada por la fórmula de Stockes: f 2 =6 nrv y depende del radio (r) de la partícula,
de la viscosidad del medio (n) y de la velocidad de migración (v). Cuando se acelera el valor de y
utilizando la fuerza centrífuga, sólidas suspendidas en líquidos. La velocidad de la cual
sedimentarán las partículas en un líquido depende de varios factores:
_ Tamaño de la partícula.
_ Peso de la partícula.
_ Viscosidad del líquido.
_ Fuerza gravitacional
La fuerza gravitacional es incrementada mecánicamente. El grado de incremento de la fuerza
gravitacional se mide por comparación con una fuerza centrífuga relativa (FCR expresada en G) del
siguiente modo:
F C R = 1.118 x 10-5 x R x rpm2
Donde R es el radio de la centrífuga en cm; rpm es la relación del número de revoluciones por
minuto.
El radio corresponde a la distancia del tubo al eje de rotación.
Factores que influyen en la centrifugación eficiente:
TIEMPO: El desplazamiento de una partícula en el tubo está en función de la duración de la
centrifugación.
TEMPERATURA: Las centrífugas refrigeradas se emplean para aquellos productos que se deterioran
fácilmente por el calor desprendido por la fricción de los tubos.
ULTRACENTRIFUGACION. - Para obtener aceleraciones elevadas (mayores o iguales a 50,000 G) se
necesitan motores que establezcan un vacío a fin de evitar el calentamiento del rotor por fricción
con el aire. Existen dos tipos:
- Ultracentrifugación Analítica: Para determinación de características físicas de proteínas o de
ácidos nucleicos. La migración de estas moléculas es seguida gracias a un estroboscopio.
- Ultracentrifugación Preparativa: Permite la separación de organelas (mitocondrias,
microsomas). La separación de macromoléculas se debe efectuar en gradiente de densidad.
6.- INCUBADORAS Y HORNOS: Se basan en el mismo principio. Son gabinetes provistos de un
calentador interconstruído. La temperatura requerida puede controlarse mediante un termostato.
El termostato se compone de una tira bimetálica que opera como un conmutador o interruptor
eléctrico conectado a un aparato de calentamiento. Si se sueldan entre sí dos metales con índices
de expansión diferentes, uno de ellos se dilatará más rápidamente que el otro, haciendo que toda
la tira se doble; esta tira está conectada a un interruptor eléctrico; se interrumpirá el circuito y el
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calentador dejará de funcionar hasta que la temperatura descienda o suficiente para que la tira
metálica vuelva a su posición original.
La diferencia entre los hornos y las incubadoras radica simplemente en la temperatura que puede
obtenerse en el interior. Un aparato capaz de soportar temperaturas de 100º C o mayores se
denomina usualmente HORNO.
Hay dos tipos básicos de incubadoras: en el tipo de convección por gravedad, se hace calcular el
aire por medio de las corrientes de convección, son inadecuadas para circular aire caliente a través
de toda la cámara, cuando debe elevarse la temperatura sólo muy ligeramente sobre la del
exterior. Cuando la incubadora es más grande, más serio es el problema. En los tipos de corriente
mecánica de convección, el aire circula por acción de un ventilador.
Un punto importante que con frecuencia se descuida, es la carga de las incubadoras. Si se colocan
los paquetes que van a esterilizarse o los cultivos para su incubación, en recipientes que no
permiten un precalentamiento adecuado disminuye la eficacia del instrumento.
Las incubadoras más costosas vienen provistas de un humedecedor, pues los microorganismos
desarrollan mejor en una atmósfera húmeda.
7.- BAÑOS DE AGUA: Están constituidos por una bandeja que posee un dispositivo enrollable
que puede sumergirse en ella para calentarlo. Estos dispositivos están protegidos por una rejilla
que impide el contacto directo entre enrollamiento y los objetos que van a incubarse, además de
promover una distribución más uniforme en las corrientes de convección formadas. Un buen baño
de agua es la incubadora más sensible que pueda tenerse.
Bajo condiciones óptimas puede regularse la temperatura dentro de límites. La cubierta o tapa de
la incubadora tiene la finalidad doble de mantener la temperatura requerida en el interior del
aparato y reducir el índice de evaporación. El agua de condensación se acumulará en la parte
interior de la tapa, para impedir que esta agua gotee a los tubos de ensayo, debe tener una
tapadera que permita un adecuado drenaje.
Para evitar la formación de precipitados o costras debe emplearse siempre agua destilada; para
impedir la contaminación con algas y bacterias puede agregarse 1 mL al 10% de Zafiran por cada
galón (3.785 lt) de agua. Se debe comprobar a diario la temperatura y nivel de agua.
8.- REFRIGERADORAS Y CONGELADORAS: Son incubadoras de temperatura fría. Se requiere
para almacenar medios de cultivo, sueros y reactivos perecederos. Las congeladoras se requieren
para almacenamiento más prolongado de sueros, enzimas, etc. Debe localizarse lejos de los
hornos de aire caliente, de radiadores, de tuberías de agua caliente.
9.- FILTRACION.- La filtración bacteriológica generalmente libera los líquidos de partículas no
deseadas. Se ve favorecida por la aplicación de presión a través del filtro, bien sea presión positiva
sobre el líquido no filtrado. Se emplean para líquidos y soluciones que resultarían alterados por el
calor.
En la actualidad su utilizan generalmente tres tipos de filtros para la esterilización:
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- Filtros de Membrana: Discos de elevada porosidad de ésteres de celulosa (acetato de
celulosa), con gama de formas, diámetros y poros. Retienen en su superficie aquellas partículas
que sobrepasan el tamaño dado. El tamaño del poro más grande es menor que las pequeñas
partículas retenidas. La retención de partículas se efectúa por medio de poros y no por atracción
o adsorción electrostática.
Ejm. Millipore grado 08, diámetro de poro 0.22-0.02 u, 0.45 u para bacterias. Las membranas de
nitrato de celulosa se conocían con el nombre de Oradocel, diámetro 3-10 u son usadas para
determinar el tamaño de muchos virus.
ULTRAFILTRACION.- La ultrafiltración bajo membrana de permeabilidad selectiva permite la
separación de sustancias según su tamaño molecular, las membranas juegan un papel de filtros a
nivel molecular.
Las membranas más utilizadas son de Digflo (Amicon), fuerza que permite la ultrafiltración, es una
presión ejercida sobre el líquido a filtrar por el nitrógeno. La ultrafiltración puede ser utilizada con
centrifugación, la fuerza motriz de la ultrafiltración será entonces la fuerza centrífuga.
APLICACIONES:
1.- Concentración de macromoléculas
2.-Eliminación de sustancias de bajo peso molecular
3.-Separación de virus, con utilización de membranas especiales cuyos límites alcanzan pesos
moleculares de 300,000.
10.- LIOFILIZADOR: Procedimiento de conservación que es acompañado de una transformación de
la sustancia a conservar, la que contiene al principio una concentración elevada.
El principio de liofilización consiste en congelar bruscamente a bajas temperaturas. El
procedimiento comprende varias etapas: Congelación, eliminación del agua (directamente del
estado sólido al vapor, sin pasar por líquido). Este procedimiento permite conservar al estado seco
un número de productos que pueden reconstituirse por hidratación. Para la congelación es
necesario que el solvente sea acuoso, ya que la mayor parte de solventes disminuyen el punto de
congelación bajo el riesgo de desnaturalización, sobre todo si el material es proteico.
El liofilizador comprende una o dos bombas de vacío (la segunda bomba permite obtener
presiones residuales inferiores a 0.1 mm Hg y un sistema que permite obtener el vapor de agua).
11.- ESPECTROFOTOMETRO.- Es un instrumento que permite medir la intensidad de la luz
transmitida; se utiliza mucho en análisis bioquímicos. Comprende un espectrómetro y un
fotómetro. Mediante una fuente de luz y un dispositivo de monocromía el espectrómetro puede
emitir frecuencias luminosas conocidas que varían según el tipo de aparato empleado pero que
corresponden a la región del espectro visible entre 400 y 700 nm. El fotómetro es una célula
fotoeléctrica sensible a la gama de longitudes de onda de la luz emitida y un galvanómetro que
registra las potenciales originados por la célula fotoeléctrica. Estos potenciales son transcritos a una
escala donde figuran lecturas por 100 de transmitancia o de absorbancia.
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Las sustancias disueltas tienen determinados colores porque absorben ciertas longitudes de onda
de la luz y dejan pasar otras. Cada sustancia absorbe energía radiante de una u otra longitud de
onda.
Ejm. La hemoglobina tiene color rojo porque absorbe los colores complementarios del rojo, es
decir las longitudes de onda más cortas del azul y del verde.
IV. CONFECCION DE ESPATULAS DE DRIGALSKY
Se preparan a partir de la pipeta Pasteur.
a.- Calentar en un punto del tercio anterior de la zona capilar doblando en ángulo el resto de la
fracción capilar.
b.- Mediante dos calentamientos sucesivos en dos puntos equidistantes del tercio medio, formar
una varilla capilar horizontal, de manera que los bordes de la espátula formen un triángulo abierto,
entre la fracción capilar distal y el ángulo del tercio anterior.
V. CONFECCION DE AGITADORES O BAGUETAS
a.- Lisar los bordes cortantes de la varilla de vidrio macizo a la llama del mechero.
b.- Calentar uno de los extremos al rojo vivo y con una pinza de extremos romos, presionar
fuertemente sin retirar de la llama. Este quedará aplanado y corresponderá al extremo distal de la
bagueta.
VI. CONFECCION DE ASAS DE SIEMBRA
a.- Fijar el fragmento de alambre nicrom o platino de 6 a 8 cm en el extremo proximal del mango
de Kolhe, mediante la tuerca.
b.- Doblar en círculo, ángulo o rombo al extremo libre del alambre mediante una pinza. El
conjunto constituye el ASA DE SIEMBRA.
Puede quedar simplemente en aguja. El asa en círculo se puede moldear en una varilla de vidrio. El
diámetro varía de 2 a 8 mm según el tipo de inóculo a sembrar.
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Informe de Laboratorio
Mencionar los equipos (Mínimo 10 equipos) que se utilizan en el laboratorio de Microbiología.
Colocar imágenes o dibujar a mano o utilizando algún software de dibujo de la estructura de los
equipos y/o el ensamblaje de las partes que lo componen, mencionar el nombre de las partes y
explicar cómo funciona cada una. Así también, explicar la función que desempeñan los equipos
dentro del trabajo de Microbiología y los cuidados en la manipulación de los mismos para evitar
dañarlos (mencionar 2 ejemplos).
CUESTIONARIO. -
1. Dibujar todos los materiales de vidrio vistos en práctica y mencionar brevemente el uso de
cada uno.
2. ¿Por qué es necesario preparar el material de vidrio antes de hacer los cultivos?
3. ¿Por qué no se pueden usar tubos con tapones de jebe?
4. ¿Qué efecto tendría el algodón quemado sobre el crecimiento de los microorganismos?
5. ¿Por qué no se puede utilizar material de vidrio roto con rayaduras?
6. ¿Cuál es la longitud de onda de la luz ultravioleta con efecto germicida y en que consiste este
efecto?
7. Mencione otros tipos de esterilización adicionales al uso del calor húmedo o seco utilizados
en los laboratorios de Microbiología. Explique el fundamento de cada técnica.
Defina:
- Esterilización
- Asepsia
- Solución sulfocrómica
- Propágulos
- Inóculo
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