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Caracterimai

La tesis de Isabel Cristina Vélez Bermúdez se centra en la caracterización funcional del factor de transcripción ZmZIM91 en maíz, abordando aspectos como su localización subcelular, degradación en presencia de metil jasmonato y regulación por la proteína quinasa CK2. Se presentan resultados sobre la obtención del cDNA completo de ZmZIM91 y su interacción con otras proteínas. Este trabajo contribuye al entendimiento de la regulación transcripcional en respuesta a señales ambientales en plantas.

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Caracterización funcional del factor de

transcripción ZmZIM91 de maíz

Isabel Cristina Vélez Bermúdez

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FACULTAD DE FARMACIA

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR

CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DEL FACTOR DE

TRANSCRIPCIÓN ZmZIM91 DE MAÍZ

Isabel Cristina Vélez Bermúdez

Barcelona, Abril 2013
UNIVERSITAD DE BARCELONA

FACULTAD DE FARMACIA

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR

PROGRAMA DE DOCTORADO EN BIOTECNOLOGÍA

AVANZADA

CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DEL FACTOR DE

TRANSCRIPCIÓN ZmZIM91 DE MAÍZ

Memoria presentada por Isabel Cristina Vélez Bermúdez para optar al grado de Doctor por la
Universidad de Barcelona.

Trabajo realizado en el Departamento de Genética Molecular del Centre de Recerca en

Agrigenòmica (CRAG)

Directoras de tesis Tutor de tesis Doctoranda

Dra. Montserrat Pagès Torrens Dr. Albert Ferrer Isabel Cristina Vélez Bermúdez

Dra. Marta Riera

A mis padres
A mis hermanas
A Jorge
Si siempre intentas ser
normal nunca descubrirás
lo extraordinario que puedes
llegar a ser

- Maya Angelou
Agradecimientos

Y como dijo Newton…“si he logrado ver más lejos, ha sido porque he subido a
hombros de gigantes”…y por eso quiero aprovechar este espacio para agradecer a todos
aquellos gigantes que me han acompañado durante el desarrollo de esta tesis doctoral.

En primer lugar quiero agradecer a mi directora de tesis la Dra. Montserrat Pagès.

Gracias Montse, no solo por haberme dado la oportunidad de hacer esta tesis doctoral
sino por haberme apoyado en los momentos más difíciles y por ayudarme a finalizar
esta tesis.

A mi co-directora de tesis Marta Riera. Gracias Marta, por haberme iniciado en la vida
de laboratorio, por orientarme y por haberme permitido desarrollar mis ideas, además
por apoyarme, aconsejarme y entenderme durante todos estos años.

Quiero también dar las gracias a la Dra. Josefa Badía, por toda la ayuda que me ha
brindado, ya que con esto ha hecho de mi paso por la Universidad de Barcelona una
grata experiencia.

Gracias a la gente del servicio de invernaderos, de proteómica, genómica,

secuenciación, imágenes y microscopia del CRAG, en especial a la Dra. Montse
Amenós…gracias Montse por haber sido mi profesora de microscopia, por todo lo que
has compartido conmigo durante todos estos años y por tu amistad, te echaré mucho de
menos.

Agradezco también al Ministerio de Ciencia e Innovación de España por la beca FPI

con la cual realicé esta tesis doctoral.

Gracias a mis compañeros de laboratorio. Agnese tan única, gracias por hacer que mis
últimos días en el lab fueran tan divertidos. A Elena tan tierna y dulce, gracias Elen por
todo el cariño y el apoyo que me has brindado. A Mic y Tommi, les doy gracias por
hacer mis tardes divertidas en el lab, por los consejos, por ayudarme y tolerarme con
paciencia durante todos estos años. Y a los que ya no están…Cris gracias por toda la
ayuda que me brindaste al comienzo de esta tesis y Sami gracias por compartir conmigo
tus conocimientos de proteómica, eres un hombre admirable, un luchador. A Eva, a
Vicky, Adela y Lola muchas gracias por su apoyo durante todos estos años, aprendí
mucho de cada una.

También quiero agradecer al Doctor Roberto Solano y a los chicos de su laboratorio.

Gracias Roberto por haberme permitido trabajar contigo, fue muy corto pero lo
necesario para darme cuenta de la gran calidad que tienes como científico y como
persona. Quiero además agradecer en especial a los Doctores Andrea Chini y José
Manuel Franco. Gracias Andrea por estar siempre dispuesto a compartir conmigo tus
conocimientos y por ayudarme en lo que he necesitado y muchas gracias José Manuel
por haber orientado mi trabajo durante mi estancia en Madrid.

Extiendo mi agradecimiento al Doctor Erich Grotewold y a los miembros de su

laboratorio. Muchas gracias Erich, eres un gran científico y un excelente ejemplo a
seguir, gracias por la paciencia que me tuviste y por todos los aportes científicos y
personales que me diste, puedo decir que soy una persona e investigadora antes y otra
después de ti. I would also like to thank the members in the Erich lab!. I wish to express
special thanks to Dr. Kengo Morohashi…thank you Kengo for always being there, to
guide me and teach me many things, you are a good scientist and I consider myself
fortunate to have been your student. Also thanks, to the Dr. Nobutaka Mitsuda…thank
you so much Nobu for all your help during my stay in the Erich lab!. También quiero
agradecer muy especialmente a Isa, Kathe, Andrés y Dani por toda la ayuda científica,
el apoyo emocional y por las cálidas cenas con los otros miembros de la “gran familia
Colombiana” en Columbus.

Quiero agradecer también al Doctor David Caparrós. Gracias David por el apoyo y los
consejos. También a Silvia, Joan y Pedro por el aporte que hicieron a este trabajo.

Muchas gracias a los Doctores Jesús Herney Moreno y Oscar Arango. Gracias Dr.
Moreno por todo el cariño, el soporte emocional y por compartir conmigo tu familia y
las cenas en Topanga en mis visitas a Colombia. Oscar, te debo mucho, gracias por el
apoyo institucional y emocional con el que me has respaldado durante todos estos años
porque con esto me has ayudado a llegar hasta este punto.

A mis hermanos, no de sangre pero de vida… Belmiro, Anahit, Beatriz, Imen y Ana
Isabel…tengo tanto que decirles a cada uno, son lo mejor de todo este final…un tesoro
invaluable para mí… Bel, no te diré que eres un gran científico, o que eres muy listo o
que tienes un corazón de oro porque todo eso ya lo sabes!...lo que si te diré es gracias
por enseñarme que compartir es importante, que tener gustos diferentes o particulares
no hace a las personas anormales sino únicas y especiales, que Pesoa no era un poeta,
sino un gran poeta, que en Portugal no solo nacen portugueses sino grandes amigos.
Anahit, my Lady…eres única en tu “especie”, mi amiga…mi hermana, te debo tanto
que no tengo palabras suficientes para expresar todo mi agradecimiento, que suerte
tengo por haberte conocido, gracias por estar siempre a mi lado en las buenas y en las
malas, te quiero muchísimo. Bea, mi chuli tierna y encantadora, eres para mí un ser muy
importante, muchas gracias por haber hecho de mi vida algo especial, por haberme
ayudado y enseñado tantas cosas…agradezco la oportunidad de ser tu amiga. Imen, mi
dulce e incondicional amiga, no sé por dónde empezar…gracias por existir!, eres una
excelente persona, mi ángel…gracias por enseñarme, ayudarme y orientarme en el
laboratorio, pero sobre todo gracias por ser mi amiga…mi hermana!, por compartir
conmigo a tu familia y toda tu vida. Anita, tú ya sabes que eres parte de mi vida, nos
conocemos hace tanto que da igual que estemos lejos físicamente, porque nunca lo
estaremos espiritualmente. Gracias por estar conmigo en los momentos más importantes
y por apoyarme y regañarme cuando lo he merecido.

A Inecita y María…mis amigas hermosas, qué haría yo sin ustedes chicas?, gracias por
escucharme, animarme, cuidar de mi en tiempos difíciles, espero conservarlas en mi
vida siempre porque las dos son muy valiosas para mí.

Gracias a los demás miembros de mi familia en Barcelona… A Mary Paz, muchas

gracias Mary!...por tus consejos, ánimos y por ayudarme cuando más lo he necesitado.
A Mina, mi mamá en Barcelona…Gracias por cuidar de mi durante todos estos años,
eres estupenda y que conste que te quiero muchísimo y que espero siempre tenerte
presente en mi vida. A Nuri, Maite, María José Alarcón, Thilia, Nata, Ester, Helen,
Adrian, Nahuel, Juan Cruz, Ana, Merce, Pep, Norma, Kostas, Irina, Reinhard, Guio,
Jud, Briardo, Nina, Eli, Águila, Rosa, Cata, Pablo Pulido, Jordi heavy”, Silvia, Asier,
Abe, Laura, Albert, Mariana, Matt, Luis, Pablo Bufalo”, Wei, Jin, Lucio, Cris, Nico,
Marçal y a todos los demás…gracias…por haber hecho de Barcelona mi segundo
hogar…con un excelente reparto de amigos!.

A la familia de Jorge…mi segunda familia…gracias a Amanda, Margarita, y Bellita por

ser parte importante de mi vida, por llenar mis días de cariño y entusiasmo y en especial
a Myriam, por todo el cuidado que me ha brindado durante tantos años, por la
comprensión y por ser más que mi suegra, mi amiga. También quiero agradecer a Doña
Trinidad (q.e.d), que aunque no alcanzo a estar presente en la finalización de este gran
objetivo, siempre le voy a estar agradecida por haber cuidado de mi como si fuera su
nieta, por sus rezos por mi bienestar y sus palabras de aliento.

A mis hermanas…Gloria y Paty…Gloris gracias por ser mi segunda mamá, por

cuidarme, quererme incondicionalmente y velar por mi siempre en cada momento de mi
vida. Paty, siempre fuiste mi ejemplo a seguir, te debo todo lo que soy y más, gracias
por hacerme tan feliz con mi sobrino y por compartir conmigo este gran momento de tu
vida, siempre seremos una en dos. Las amo demasiado a las dos!. Gracias también a
Dani y a Fabi por cuidar de mis hermanas en mi ausencia y por ayudarme siempre en lo
que he necesitado.

A mis papás…mami, gracias por enseñarme que emprender es más que una palabra, que
amor es igual a incondicional, que las mujeres duras existen, que tesón se escribe con
esfuerzo y sobre todo por demostrarme con tu ejemplo que cada día podemos ser
mejores. Papi, siempre dicen que el alumno supera al maestro, pero en mi caso no es
así, siempre serás mi maestro, agradezco a la vida cada día que me permite compartir
contigo, así sea desde la distancia. Gracias a los dos por confiar en mí, por apoyar mis
proyectos y mis locuras, por cuidar de mis perros, por estar siempre presentes durante
todas las etapas de mi vida, por inculcarme valores y por motivarme cada instante a ser
una mejor persona. Me siento muy orgullosa de ser su hija y nunca me cansaré de darles
las gracias a los dos por todo lo que hacen cada día por mí, solo me resta decirles que
los amo mucho.

…Y eran una… y eran una… y eran una sola sombra larga… y eran una sola sombra
larga… y eran una sola sombra larga…como decía nuestro poeta José Asunción
Silva…eso somos nosotros Jorge… eres mi complemento, parte de mi, hemos crecido
juntos y aprendido muchas cosas juntos, además no puedes negar que somos un gran
equipo!. Gracias por emprender conmigo este reto, por cuidarme, por amarme
incondicionalmente, por ser mi amigo leal, por sacar siempre lo mejor de mí, en pocas
palabras por hacer de mi mundo un lugar mejor.

En fin…a todos aquellos que han hecho de mi vida durante estos años en Barcelona un
lugar de aprendizaje…de cosas buenas y malas, que han enriquecido mi vida personal y
laboral…MUCHAS GRACIAS!!
Tabla de contenido

1. Introducción.................................................................................................................26
1.1 Percepción y señalización por jasmonato ............................................................. 30
1.2 La familia TIFY en plantas ................................................................................... 32
1.3 Regulación de factores de transcripción mediante fosforilación .......................... 43
1.4 Regulación transcripcional.................................................................................... 47
2. Objetivos .....................................................................................................................50
Capítulo I .........................................................................................................................52
3. Caracterización molecular de la proteína ZmZIM91 de maíz .....................................52
3.1 Resultados ............................................................................................................. 52
3.1.1 Obtención del cDNA completo de ZmZIM91 ................................................ 52
3.1.2 Localización subcelular de ZmZIM91 ........................................................... 52
3.1.3 ZmZIM91 pertenece a la subfamilia ZML de maíz ....................................... 54
3.1.4 Dominios proteicos de ZmZIM91 .................................................................. 56
3.1.5 ZmZIM91 se degrada en presencia de metil jasmonato por la vía del
proteasoma 26S ....................................................................................................... 64
3.1.6. Identificación del consenso in vitro de unión a ADN para las proteínas
ZmZIM91 de maíz y AtZIM de Arabidopsis mediante la técnica protein-binding
microarray (PBM11)............................................................................................... 68
3.1.7 Regulación de ZmZIM91 por la proteína quinasa CK2 de maíz ................... 70
3.1.7.1 Interacción de ZmZIM91 con las subunidades reguladoras CK2β1,
CK2β2, CK2β3 y la catalítica CK2α1 ................................................................. 70
3.1.7.2 CK2β1 y CK2β2 son capaces de relocalizar a ZmZIM91 en gránulos en el
núcleo .................................................................................................................. 71
3.1.7.3 La subunidad catalítica CK2α1 no puede relocalizar a la proteína
ZmZIM91 ............................................................................................................ 75
3.1.7.4 El holoenzima CK2α1β1 afecta la localización subcelular de la proteína
ZmZIM91 ............................................................................................................ 75
3.1.7.5 ZmZIM91 es sustrato in vitro de la proteína quinasa CK2 de maíz ........ 78
3.1.7.6 La fosforilación in vivo de ZmZIM91 por la proteína quinasa CK2 de
maíz es afectada mediante tratamientos con MeJA ............................................. 79
3.2 Discusión de resultados ........................................................................................ 82
3.2.1 El dominio ZIM/TIFY en ZmZIM91 ............................................................. 82
3.2.2 La proteína ZmZIM91 se degrada en presencia de MeJA ............................. 83
3.2.3 La variación de la secuencia en el N-teminal del dominio Jas de ZmZIM91
interviene en la interacción con COI1 ..................................................................... 84
3.2.4 Señales de Localización Nuclear (NLS) y de Exportación Nuclear (NES) de la
proteína ZmZIM91 .................................................................................................. 85
3.2.5 La proteína ZmZIM91 puede unir ADN ........................................................ 86
3.2.6 Modelos hipotéticos de regulación por MeJA de ZmZIM91 ......................... 87
3.2.7 La proteína ZmZIM91 interacciona y es fosforilada por la proteína quinasa
CK2 ......................................................................................................................... 88
3.2.8 La fosforilación de ZmZIM91 por la proteína quinasa CK2 es regulada por
estrés biótico y abiótico ........................................................................................... 89
Capítulo II........................................................................................................................92
4. Caracterización funcional de la proteína ZmZIM91 de maíz......................................92
4.1 Resultados ............................................................................................................. 92
4.1.1 ChIP-Seq de ZmZIM91 a partir de protoplastos de maíz transfectados ........ 92
4.1.1.1 Elaboración de ChIP utilizando protoplastos de maíz que sobre-
expresaban 35S::ZmZIM91:GFP y 35S::GFP ..................................................... 92
4.1.1.2 Construcción de librerías a partir del ChIP de protoplastos de maíz
usando la tecnología de ILLUMINA-SOLEXA .................................................... 95
4.1.1.3 Mapeo de datos de lecturas cortas en el genoma de maíz e identificación
de picos. ............................................................................................................... 97
4.1.1.4 Información y localización de sitios de unión obtenidos a partir de los
análisis estadísticos del ChIP-Seq proveniente de protoplastos de maíz............. 98
4.1.1.5 Localización de los picos en el genoma de maíz ................................... 100
4.1.1.6 Clasificación y anotación de genes diana seleccionados ....................... 101
4.1.1.7 Validación de genes diana de ZmZIM91 identificados en el ChIP-Seq
proveniente de protoplastos de maíz ................................................................. 104
4.1.1.8 Construcción de nuevas librerías de ChIP de ZmZIM91 a partir de
protoplastos de maíz .......................................................................................... 113
4.1.2 Identificación de genes diana de ZmZIM91 en el genoma de maíz usando
ChIP-Seq de ZmZIM91 proveniente de hojas de plantas de maíz de 9 días ......... 115
4.1.2.1 Preparación y control de calidad de librerías de ChIP de ZmZIM91 a
partir de hojas de plantas maíz .......................................................................... 115
4.1.2.2 Análisis de datos de ChIP-Seq de ZmZIM91 proveniente de hojas de
plantas de maíz de 9 días ................................................................................... 116
4.1.2.3 Identificación de genes diana in vivo de ZmZIM91 .............................. 117
4.1.2.4 ZmZIM91 interactúa con el promotor del gen ZmCOMT in vivo ......... 119
4.1.2.5 ZmZIM91 reprime al promotor del gen de maíz ZmCOMT in vivo ...... 120
4.1.2.6 ZmZIM91 se une al promotor del gen ZmA1 in vivo ........................... 121
4.1.2.7 ZmZIM91 reprime al promotor del gen de maíz ZmA1 in vivo ............ 122
4.1.2.8 La interacción in vivo entre ZmZIM91 y los promotores de ZmCOMT y
de ZmA1 se reduce en presencia de MeJA ........................................................ 123
4.1.3 Identificación de otras proteínas que interactúan con ZmZIM91 ................ 124
4.2 Discusión de resultados ...................................................................................... 127
4.2.1 Identificación de genes diana de ZmZIM91 mediante la técnica de ChIP-Seq de
protoplastos de maíz ................................................................................................. 127
4.2.2 Identificación de genes diana de ZmZIM91 mediante la técnica de ChIP-Seq de
hojas de maíz ............................................................................................................ 128
4.2.3 Diferencias entre las técnicas de ChIP-Seq empleadas ................................ 135
4.2.4 Hipótesis de la existencia de un módulo regulatorio entre ZmZIM91,
ZmMYB31 y ZmMYB42...................................................................................... 137
5. Conclusiones .............................................................................................................142
6. Materiales y métodos................................................................................................144
6.1 Cepas de bacterias y levaduras ........................................................................... 144
6.1.1 Cepas bacterianas ......................................................................................... 144
6.1.2 Saccharomyces cerevisiae ............................................................................ 144
6.2 Plásmidos y construcciones ................................................................................ 145
6.2.1 Plásmidos ..................................................................................................... 145
6.2.2 Construcciones ............................................................................................. 147
6.2.3 Cebadores. .................................................................................................... 151
6.3 Métodos .............................................................................................................. 154
6.3.1 Técnicas empleadas para el clonaje de ADN. .............................................. 154
6.3.2 Preparación de células competentes ............................................................. 154
6.3.2.1 Obtención de células competentes por choque térmico de Escherichia coli
........................................................................................................................... 154
6.3.2.2 Obtención de células competentes por choque térmico de Agrobacterium
tumefaciens ........................................................................................................ 154
6.3.2.3 Transformación de células competentes de Escherichia Coli por choque
térmico ............................................................................................................... 155
6.3.2.4 Transformación de células competentes de Agrobacterium tumefaciens
por choque térmico ............................................................................................ 155
6.3.3 Obtención de ADN plasmídico .................................................................... 156
6.3.4 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)................................................ 156
6.3.5 Digestión enzimática del ADN plasmídico .................................................. 158
6.3.6 Electroforesis de fragmentos de ADN y ARN en gel de agarosa ................ 158
6.3.7 Extracción y purificación de fragmentos de ADN, reacción de ligación y
recombinaciones .................................................................................................... 159
6.3.8 Cuantificación de ácidos nucleícos .............................................................. 159
6.3.9 Extracción y purificación de ARN de maíz ................................................. 159
6.3.10 Elaboración de cDNA ................................................................................ 160
6.3.11 Transformación transiente en protoplastos de maíz ................................... 160
6.3.12 Transformación transitoria por biolística en epidermis de cebolla ............ 162
6.3.13 Transformación transitoria de hojas de tabaco mediante infiltración de
Agrobacterium ....................................................................................................... 163
6.3.14 Obtención de proteínas recombinantes ...................................................... 163
6.3.14.1 Sobreexpresión de proteínas recombinantes fusionadas a His o GST en
E.Coli BL21 ....................................................................................................... 163
6.3.14.1.1 Extracción y purificación de proteínas recombinantes fusionadas a
His o GST y sobreexpresadas en E.Coli BL21 .............................................. 164
6.3.14.1.2 Obtención de proteínas recombinantes fusionadas a His ............. 164
6.3.14.1.3 Obtención de proteínas recombinantes fusionadas a GST............ 165
6.3.15 Obtención de anticuerpos policlonales contra la proteína ZmZIM91 ........ 166
6.3.16 Purificación de anticuerpos policlonales contra la proteína ZmZIM91 .... 166
6.3.17 Análisis de proteínas mediante western blot .............................................. 167
6.3.17.1 Obtención de extractos proteicos vegetales ......................................... 168
6.3.17.2 Cuantificación de proteínas ................................................................. 168
6.3.17.3 Electroforesis de proteínas en gel SDS-PAGE y tinción de comassie 168
6.3.17.4 Visualización de las proteínas por tinción de coomassie .................... 169
6.3.17.5 Transferencia de proteínas y tinción de ponceau ................................ 169
6.3.17.6 Hibridación e inmunodetección mediante ECL................................... 170
6.3.18 Ensayos de fosforilación ............................................................................ 170
6.3.18.1 Ensayo quinasa in vitro ....................................................................... 171
6.3.18.2 Ensayo quinasa en gel ......................................................................... 171
6.3.18.2.1 Preparación del gel SDS-PAGE copolimerizado con ZmZIM91 . 172
6.3.18.2.2 Renaturalización y reacción de fosforilación................................ 173
6.3.18.2.3 Tratamiento de geles quinasa en gel con DRB ............................. 173
6.3.19 Ensayos de interacción proteína-proteína .................................................. 174
6.3.19.1 Sistema de doble híbrido ..................................................................... 174
6.3.19.2 Complementación Bimolecular ........................................................... 174
6.3.19.3 Ensayo de interacción ‘TnT pull-down’............................................... 174
6.3.20 Determinación de motivos de unión a ADN mediante la técnica unión de
proteínas a un microarray de ADN (PBM11) ....................................................... 176
6.3.21 Experimentos de Inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) ................. 177
6.3.21.1 Inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) a partir de protoplastos
transfectados con 35S::ZmZIM91:GFP y 35S::GFP. Versión 1.0 ................... 177
6.3.21.2 Inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) a partir de protoplastos
transfectados con 35S::ZmZIM91:GFP y 35::GFP. Versión 2.0 ..................... 179
6.3.21.3 Inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) a partir de hojas de plantas
de maíz de 9 días de la variedad B73 ................................................................ 182
6.3.22 Test de enriquecimiento y análisis por PCR semi-cuantitativa y cuantitativa
de ChIP .................................................................................................................. 184
6.3.23 Preparación de ChIP-Seq para la plataforma Solexa-Illumina ................... 186
6.3.24 Ensayo de Luciferasa usando protoplastos de maíz transformados
transientemente...................................................................................................... 191
6.3.25 Captura de imágenes fluorescente mediante Microscopia Confocal ......... 191
6.3.26 Procesamiento y análisis de datos .............................................................. 192
6.3.26.1 Análisis de secuencias de nucleótidos ................................................. 192
6.3.26.2 Árbol filogenético ................................................................................ 192
6.3.26.3 Cuantificación de GFP de las imágenes obtenidas mediante microscopia
confocal ............................................................................................................. 193
6.3.26.4 Procesamiento y análisis de datos de ChIP-Seq .................................. 193
6.3.26.5 Procesamiento de datos de PCR cuantitativa de ChIP de protoplastos de
maíz ................................................................................................................... 194
6.3.26.6 Procesamiento de datos de PCR cuantitativa de ChIP de hojas de plantas
de maíz de 9 días (Fluidigm) ............................................................................. 194
6.3.26.7 Procesamiento de datos de PCR cuantitativa de ChIP de hojas de plantas
de maíz de 9 días tratadas con MeJA ................................................................ 194
6.3.26.8 Procesamiento de datos de Luciferasa ................................................. 195
6.3.26.9 Identificación de cajas GATA y GATC en promotores ...................... 195
6.3.26.10 Procesamiento y análisis de datos de regiones enriquecidas en
elementos reguladores en cis CRERs ................................................................ 196
7. Bibliografía ................................................................................................................198
Anexo I. ChIP-Seq de ZmZIM91 proveniente de protoplastos de maíz
Anexo II. ChIP-Seq de ZmZIM91 proveniente de hojas de plantas de maíz
Anexo III. Publicaciones
Lista de Tablas

Tabla 1-1. Lista del número de genes de la familia TIFY.

Tabla 4-1. Picos que interceptan entre las librerías de ZmZIM91_anti91 y de

ZmZIM91_antiGFP.

Tabla 4-2. Picos que interceptan entre las librerías de ZmZIM91_anti91 y de

ZmZIM91_antiGFP.

Tabla 4-3. Resultados de los ChIP-Seq de tres réplicas biológicas de ZmZIM91

provenientes de hojas de plantas de maíz.

Tabla 4-4. Identificación de genes diana de ZmZIM91 mediante ChIP-Seq.

Tabla 6-1. Plásmidos Usados.

Tabla 6-2. Construcciones utilizadas.

Tabla 6-3. Cebadores de ADN usados para realizar los clones en este estudio.

Tabla 6-4. Cebadores utilizados para la validación por PCR semi-cuantitativa de los
picos identificados en el ChIP-Seq proveniente de protoplastos de maíz.

Tabla 6-5. Cebadores utilizados para la validación por PCR cuantitativa de los picos
identificados en el ChIP-Seq proveniente de protoplastos de maíz.

Tabla 6-6. Cebadores utilizados para la validación por PCR cuantitativa de los picos
identificados en el ChIP-Seq proveniente de hojas de plantas de maíz.

Tabla 6-7. Condiciones generales de PCR.

Tabla 6-8. Condiciones de la reacción de PCR.

Tabla 6-9. Reacción de PCR para validación de muestras de ChIP.

Tabla 6-10. Resultados obtenidos empleando el software DNA-pattern de motivos de

unión a ADN GATA y GATC en los picos 8, 14 y 21 identificados en el ChIP-Seq de
protoplastos de maíz.

Lista de Tablas Anexo I

Tabla SI1. Picos seleccionados para validación del ChIP-Seq de ZmZIM91 proveniente
de protoplastos de maíz.
Lista de Figuras

Figura1-1. El papel de las hormonas de plantas en la regulación de la interacción entre

estrés biótico y abiótico.

Figura 1-2. Representación esquemática de la ruta de los octadecanoides para la

biosíntesis de ácido jasmónico (JA) y conjugados bioactivos de JA.

Figura 1-3. Arquitectura de las proteínas que conforman la familia TIFY.

Figura 1-4. Modelo de la degradación mediada por JA-Ile vía proteasoma 26S.

Figura 1-5A. Modelos de inhibición de respuestas a ácido jasmónico (JA) por

interacción de proteínas JAZ con otras proteínas.

Figura 1-5B. Modelos de actuación del jasmonato en la regulación de los genes MYC.

Figura 1-6. Distribución del núcleo del motivo “TIFYXG”.

Figura 1-7. Modelo de actuación de la proteína quinasa CK2.

Figura 1-8. Identificación de ZmZIM91 por medio de un ensayo de doble híbrido

utilizando la subunidad reguladora β1 de la proteína quinasa CK2 de maíz.

Figura 3-1. Secuencia de ZmZIM91 en aminoácidos y cDNA.

Figura 3-2. Localización subcelular de ZmZIM91 en protoplastos de maíz.

Figura 3-3. Árbol filogenético de la subfamilia ZML en maíz y Arabidopsis.

Figura 3-4. Expresión de las proteínas ZML de maíz en hojas de 9 días de la variedad
B73.

Figura 3-5. Aminoácidos correspondientes a los dominios conservados de ZmZIM91.

Figura 3-6. Alineamiento entre las proteínas ZIM de Arabidopsis y ZML de maíz.

Figura 3-7. Identificación de motivos de represión putativos en el dominio TIFY de las

proteínas ZML de maíz.

Figura 3-8. ZmZIM91 es capaz de formar dímeros.

Figura 3-9. Alineamiento entre los dominios Jas de las proteínas AtJAI3, AtJAZ1,
AtZML2 y ZmZIM91.

Figura 3-10. Estudio de las interacciones entre las proteínas ZML, JAZ1, JAI3, JAZ9 y
COI1 de Arabidopsis.

Figura 3-11. Localización de N-terminal de ZmZIM91 en células de cebolla y tabaco.

Figura 3-25. ZmZIM91 no es capaz de interaccionar con COI1 de Arabidopsis.

Figura 3-26. Diagrama de caja de puntajes (E-scores) de todos los 8-mers posibles
conteniendo los consensos de 6-mer indicados y reconocidos por AtZIM y ZmZIM91.

Figura 3-27. ZmZIM91 es sustrato in vivo de la proteína quinasa CK2 y es regulada por
esta quinasa en sequía.

Figura 4-1. Validación mediante PCR semi-cuantitativa de las condiciones óptimas para
la preparación de ChIP de protoplastos de maíz que sobre-expresaban 35S::GFP.

Figura 4-2. Validación de la técnica de ChIP de protoplastos mediante PCR semi-

cuantitativa.
Figura 4-3. Diagrama representando la construcción de la librería de ChIP de
protoplastos de maíz usando la tecnología Illumina/Solexa.

Figura 4-4. Control de la calidad y cuantificación de las muestras de las librerías de

ChIP de protoplastos de maíz, usando Bioanalyzer.

Figura 4-5. Análisis de los datos de las librerías de protoplastos de maíz usando
BOWTIE y MACS.

Figura 4-6. Gráfico de la intersección entre los picos de ZmZIM91_anti91 y

ZmZIM91_antiGFP.

Figura 4-7. Distribución de picos relativa a la coordenada de inicio de los genes

ubicados en la vecindad y porcentaje de picos localizados en las zonas adyacentes a los
genes cercanos.

Figura 4-8. Localización de picos en cada cromosoma del genoma de maíz.

Figura 4-9. Ejemplo de diseño de cebadores para PCR semi-cuantitativa de picos que
interceptaban entre las librerías de ZmZIM91_antiGFP y las de ZmZIM91_anti91.

Figura 4-10. Genes seleccionados para la validación por PCR cuantitativa de ChIP de
protoplastos de maíz de ZmZIM91.

Figura 4-11. Pico 8 detectado en el ChIP-Seq de ZmZIM91 proveniente de protoplastos

de maíz.

Figura 4-12. Pico 14 detectado en el ChIP-Seq de ZmZIM91 proveniente de

Figura 4-23. ZmZIM91 reprime el promotor del gen de ZmCOMT.

Figura 4-24. Validación por PCR cuantitativa en tiempo real del promotor de ZmA1 en
muestras de ChIP de ZmZIM91 a partir de hojas de plantas de maíz.

Figura 4-25. ZmZIM91 reprime el promotor del gen de ZmA1.

Figura 4-26. La interacción in vivo entre ZmZIM91 y los promotores de ZmCOMT y de

ZmA1 se reduce en presencia de MeJA.

Figura 4-27. Interacción por Complementación Bimolecular entre ZmZIM91 y

ZmMYB31, y entre ZmZIM91 y ZmMYB42.

Figura 4-28. El módulo regulador putativo AC-GATA en el promotor del gen de COMT
está conservado en las gramíneas.

Figura 4-29. Respuesta de ZmZIM91 a tratamiento de herida en hojas de plantas

silvestres de maíz.

Figura 4-30. La represión del promotor de ZmCOMT por ZmZIM91 puede tener un
impacto significativo en la reducción del contenido de lignina en maíz.

Figura 4-31. Modelo propuesto de regulación del promotor de ZmCOMT por el factor
de transcripción ZmZIM91 de maíz.

Figura 4-32. Validación utilizando PCR semi-cuantitativa y PCR cuantitativa de

muestras de ChIP de hojas de plantas de maíz del pico 14.

Figura 4-33. Modelo hipotético de módulo regulatorio entre ZmZIM91 y ZmMYB31 o

ZmMYB42.

Figura 6-1. Puesta a punto de condiciones óptimas de PCR para la obtención del clon de
ZmZIM91.

Figura 6-2. Pasos realizados para la detección de motivos de unión de ADN de factores
de transcripción mediante la técnica Unión de proteínas a un microarreglo de ADN
(PBM11).

Figura 6-3. Procedimiento de elaboración de librerías de ChIP de protoplastos de maíz

sobre expresando 35S::ZmZIM91:GFP y 35S::GFP.
Figura 6-4. Procedimiento de elaboración de librerías de ChIP de hojas de plantas de
maíz de 9 días.

Lista de Figuras Anexo I

Lista de Figuras Anexo II

26
Introducción

Figura1-1. El papel de las hormonas de plantas en la regulación de la interacción

entre estrés biótico y abiótico. El diagrama esquemático muestra la interacción o
“crosstalk” que ocurre entre hormonas, factores de transcripción y otros componentes
reguladores, cuando están presentes tanto el estrés biótico como el abiótico. Esta red
compleja de interacciones le permite a la planta responder de manera específica a
diferentes tipos de estrés. Las flechas grises muestran inducción o regulación positiva,
mientras las barras rojas indican inhibición o represión. Los eventos característicos de
respuesta a estrés abiótico se muestran en rosa y los de respuesta a estrés biótico en
verde. Los factores de transcripción y otros genes reguladores están representados
dentro de dos cuadros de color naranja. Especies reactivas a oxígeno (ROS); ácido
abscísico (ABA); ácido jasmónico (JA); ácido salicílico (SA); relativos a patogénesis
(PR); resistencia sistémica adquirida (SAR), factores de choque térmico (HSF). Dentro
de la figura se muestra la formula química de las fitohormonas ABA, JA y SA
(Adaptado de Atkinson y Urwin, 2012).

27
Introducción

Los jasmonatos se destacan por su papel relevante y universal en la regulación del

metabolismo de la planta, ya que inducen la biosíntesis de metabolitos secundarios
cuando la planta se somete a estreses medioambientales como la herida mecanica, el
ataque de insectos y la infección por patógenos (Pauwels et al., 2009; Zhao et al., 2005;
Browse, 2009; McConn y Browse, 1996; McConn et al., 1997; Staswick et al., 1998;
Vijayan et al., 1998). El trauma por herida infligido por el daño mecánico o los insectos
da lugar a la acumulación rápida de ácido jasmónico (JA) (<30 min) en el lugar de la
herida. Por lo tanto el JA y los compuestos relativos a la señalización (colectivamente
referidos como jasmonatos), son señales ubicuas para el tejido dañado y para la
subsecuente activación de la respuesta a defensa (Howe y Jander, 2008).

Adicionalmente, los jasmonatos regulan aspectos de desarrollo, tales como crecimiento

de la raíz, desarrollo de estambres, polen, y senescencia. En general, la hormona
promueve los procesos reproductivos y la defensa mientras inhibe el crecimiento y la
fotosíntesis de tejidos vegetativos (Devoto y Turner, 2005; Giri et al., 2006).

En plantas superiores, los JAs son fitohormonas derivadas de oxipilinas que son
sintetizados vía la ruta de los octadecanoides (Figura 1-2) (Howe y Jander, 2008).
Originalmente los JAs fueron identificados como metabolitos secundarios presentes en
el perfume de las flores de jazmín (Jasminum spp.). Actualmente, se ha descubierto que
actúan como elicitores de la producción de metabolitos secundarios a través del reino
vegetal, desde las angiospermas hasta las gimnospermas (Wasternack, 2007; Zhao et al.,
2005). Las tres principales clases de metabolitos secundarios pueden ser definidos como
los terpenoides, los alcaloides y los fenilpropanoides; sin embargo, existen más. Los
JAs pueden inducir la síntesis de todas estas clases de metabolitos secundarios (Pauwels
et al., 2009; Zhao et al., 2005).

28
Introducción

Figura 1-2. Representación esquemática de la ruta de los octadecanoides para la

biosíntesis de ácido jasmónico (JA) y conjugados bioactivos de JA. Las enzimas
principales de la biosíntesis de JA están localizadas en dos compartimentos subcelulares
diferentes. La síntesis de JA es iniciado en los cloroplastos, donde el ácido linoleico es
convertido a ácido 12-oxo fitodienoico (OPDA) por la acción secuencial de la
lipoxigenasa (LOX), aleno óxido sintasa (AOS), y aleno óxido ciclasa (AOC). La
segunda parte de la ruta ocurre en los peroxisomas. El OPDA es transportado desde los
cloroplastos a los peroxisomas donde este es reducido por el OPDA reductor (OPR3)
para dar lugar al 3-oxo-2(2’[Z]-pentenil)-ciclopentano-1-ácido octanoico (OPC:8),
seguido por tres rondas de beta oxidación para producir (+)-7-iso-JA.
Subsecuentemente, el JA puede ser metabolizado en el citoplasma para la producción de
diversos derivados biológicamente activos (Flechas rojas). El JA carboxilo
metiltransferasa (JMT) convierte al JA en el compuesto volátil MeJA. La reacción
reversa es catalizada por MeJA esterasa (MJE). La conjugación de JA a Isoleucina (Ile)
por el RESISTENTE A JASMONATO 1 (JAR1) produce JA-Ile, el cual promueve la
interacción del INSENSIBLE A CORONATINA 1 (COI1) con las proteínas represoras
JAZ. El JA-Ile puede ser metilado para producir JA-Ile-Me (Hause et al., 2000). El JA
puede ser conjugado por otras enzimas para producir varios aminoácidos conjugados JA
(JACs) y JA-ACC conjugado por una enzima de JA a ACC (1-aminociclopropano-1-
ácido carboxílico, un intermediario biosintético del etileno) (Adaptado de Howe y
Jander, 2008; Zhang y Turner, 2008).

29
Introducción

1.1 Percepción y señalización por jasmonato

El mutante insensible a coronatina 1 (coronatine insensitive1 - coi1) fue aislado en un

cribado de mutantes de Arabidopsis insensibles a la inhibición del crecimiento de la raíz
por coronatina. El mutante coi1 es también insensible a MeJA (Feys et al., 1994), es
susceptible al ataque de ciertos insectos y patógenos y no expresa genes regulados por
JA (Benedetti et al., 1995; McConn et al., 1997; Thomma et al., 1998). El gen COI1
codifica para una proteína F-box (Xie et al., 1998). COI1 es estructuralmente cercano a
al receptor de auxinas INHIBIDOR DE RESPUESTA A TRANSPORTE 1 (TIR1;
At3g62980) (Kepinski y Leyser, 2005; Dharmasiri et al., 2005), sin embargo, COI1 no
está relacionado con la percepción de auxinas.

La proteína F-box INSENSIBLE A CORONATINA 1 (CORONATINE INSENSITIVE 1 -

COI1) es esencial en el núcleo del módulo de señalización por JA en plantas y forma
parte del complejo tipo E3 ubiquitina ligasa Skp–Culina–F-box (SCFCOI1) (Devoto et
al., 2002; Xu et al., 2002). Por lo tanto, el requerimiento de COI1 en respuestas
dependientes de JA indica que la degradación proteica mediante ubiquitinación está
involucrada en la señalización por JA. Las plantas que eran deficientes en otros
componentes o reguladores del complejo SCF, incluyendo AXR1, COP9 y SGT1b,
también mostraron incapacidad para responder al JA (Feng et al., 2003; Lorenzo y
Solano, 2005; Tiryaki y Staswick, 2002). La existencia de una función COI1 que esta
conservada en otras especies diferentes a Arabidopsis fue demostrada por la
identificación de un homólogo de COI1 en tomate (LeCOI1; Li et al., 2004). COI1 es
un componente específico de la vía de JA, mientras que otras proteínas del complejo
como SGT1b y AXR1 son compartidas por otras rutas de señalización (Gray et al.,
2003; Tiryaki y Staswick, 2002; Xu et al., 2002).

Las mutaciones en SGT1b y AXR1 tienen efectos pleiotrópicos que deterioran las
respuestas de la planta no sólo a JA sino también a auxinas y patógenos, sugiriendo que
las proteína AXR1 y SGT1b son reguladoras del complejo SCF y están involucradas en
diferentes vías de señalización (Austin et al., 2002; Azevedo et al., 2002; Gray et al.,
2003). La proteína AXR1 es también un regulador positivo de respuestas a auxinas y
modula la actividad de SCFTIR1 por modificación de la culina a través de la adición de la
proteína ubiquitin-like Nedd8/Rub1 (del Pozo et al., 2002; Schwechheimer et al., 2002).

30
Introducción

Por otra parte, la función conservada de SGT1 como mediadora del complejo SCF, está
respaldada por un estudio donde se mostró que la mutación del gen sgt1 de levadura
podía ser complementada con dos genes altamente homólogos al gen SGT1 de
Arabidopsis y por una investigación donde se demostró que las proteínas SGT1,
HvSGT1 y NbSGT1 co-inmunoprecipitaban con las subunidades SCF en extractos de
cebada (Hordeum vulgare) y tabaco (Nicotiana benthamiana) respectivamente
(Azevedo et al., 2002; Liu et al., 2002).

Para identificar componentes moleculares de la señal de transducción de jasmonato, se

seleccionaron mutantes que eran insensibles a MeJA o coronatina o que mostraban una
respuesta constitutiva a jasmonato (Lorenzo y Solano, 2005). En el cribado realizado
para mutantes afectados en la inhibición del crecimiento de la raíz inducida por JA en
un fondo insensible a etileno 3 (ethylene insensitive 3 – ein 3) se encontraron 5 grupos
de complementación, identificando 5 loci llamados insensible a JA (JAI) 1-5. El locus
JAI1 corresponde al gen AtMYC2 (Lorenzo et al., 2004). El locus JAI2 corresponde al
gen previamente caracterizado JAR1 (Staswick et al., 1992; Staswick y Tiryaki, 2004).
El locus JAI4 corresponde al gen SGT1b (Lorenzo y Solano, 2005). El locus JAI5
corresponde al gen COI1 (Lorenzo et al., 2004). Finalmente, se identificó el gen JAI3
que codifica para una proteína con un motivo TIFY (Chini et al., 2007).

La proteína JAI3 pertenece a la familia génica llamada TIFY (Vanholme et al., 2007).
Dentro de esta familia, los miembros que son inducidos a nivel de expresión génica por
JA son llamados dominio jasmonato ZIM (Jasmonate ZIM domain - JAZ) (Chini et al.,
2007; Thines et al., 2007). En el mutante jai3 la proteína JAI3 tenía una delección de un
dominio conservado en el C-terminal de las proteínas JAZ. La proteína JAI3 endógena
se degradó rápidamente en respuesta a JA de manera dependiente de COI1, mientras la
proteína del mutante jai3 permaneció estable. La proteína JAI3 interactúa in vitro y en
levadura con COI1 pero solo en presencia de la hormona conjugada JA-Ile. Además,
también interacciona con AtMYC2 y se postula que JAI3 es un represor de AtMYC2, y
que por lo tanto cuando es degradada en respuesta a JA, deja libre a AtMYC2 para
cumplir sus funciones (Chini et al., 2007).

31
Introducción

Los mecanismos implicados en la autorregulación del bucle de JA han sido estudiados

principalmente en Arabidopsis, pero parece ser que este fenómeno se conserva a lo
largo de todas las especies de plantas (De Geyter et al., 2012).

Una inducción fuerte y rápida de metabolitos secundarios estimulada por JA es vital

para la planta durante la respuesta a defensa. La señal de JA debe persistir o incluso
intensificarse durante el tiempo en que la planta está bajo ataque. Como consecuencia,
las plantas han desarrollado un sistema de retroalimentación positiva denominado bucle
autoregulador de JA (‘autoregulatory JA loop’). Este bucle funciona tomando primero
un punto de control que se sitúa en los genes que son inducibles por JA y controlados
por factores de transcripción sensibles a dicha hormona y resulta en la síntesis bioactiva
de JA. Posteriormente, los genes que codifican para factores de transcripción implicados
en la respuesta primaria a JA, se inducen rápidamente, configurando de este modo la
retroalimentación positiva. Adicionalmente, otros conjuntos de reguladores pueden
influir positivamente en la biosíntesis de JA en un contexto de desarrollo (De Geyter et
al., 2012).

Además de los bucles positivos, la retroalimentación negativa también es requerida para

parar las respuestas de defensa y estrés de las plantas cuando no son necesarias.
Múltiples mecanismos de regulación han sido desarrollados para mantener esas
respuestas silenciadas en condiciones normales. Como resultado, los reguladores
negativos son los componentes claves en el control de la expresión de los genes
relacionados con el estrés (De Geyter et al., 2012).

1.2 La familia TIFY en plantas

La familia TIFY ha sido involucrada en respuestas a diversas hormonas como JA y

ABA. Recientemente fueron analizados los perfiles de expresión de 11 genes TIFY de
uva en respuesta a varias condiciones de estrés biótico, abiótico y bajo tratamientos con
hormonas, y se encontró que estos genes al parecer no juegan un papel principal en la
defensa contra patógenos o virus, sin embargo, algunos genes TIFY respondieron a JA
y/o ABA, pero no a SA o etileno. Adicionalmente, también fueron identificados genes
de esta familia que podían potencialmente estar involucrados en la tolerancia a estrés
abiótico (Zhang et al., 2012).

32
Introducción

Las proteínas TIFY están comprendidas dentro de una familia de factores de

transcripción putativos, exclusiva de plantas, de la que se ha descrito que algunos de sus
miembros juegan un papel importante dentro de la vía de señalización del ácido
jasmónico, la respuesta a estrés y la regulación del desarrollo (Vanholme et al., 2007).

Esta familia debe su propio nombre al dominio conservado (TIF[F/Y]XG) localizado

aproximadamente entre los 36 aminoácidos a lo largo del dominio ZIM o TIFY
(Vanholme et al., 2007). El domino ZIM fue originalmente identificado en Arabidopsis
en la proteína Zinc-Finger expresada en Inflorescencia del Meristemo: ZIM
(BAA97679; Zinc-finger protein expressed in Inflorescence Meristem) (Nishii et al.,
2000). Desde entonces se ha encontrado en otras proteínas que están agrupadas dentro
de esta familia (Vanholme et al., 2007).

Debido a la incongruencia de la clasificación en las bases de datos de los genes

pertenecientes a esta familia, Vanholme et al. (2007) propusieron cambiar el nombre
tanto del dominio como el de la familia ZIM por el de TIFY, de acuerdo con los cuatro
aminoácidos conservados dentro del dominio TIFY en los miembros de esta familia.

Mediante un análisis filogenético y estructural de catorce especies que contenían el

dominio TIFY (Tabla 1-1) se definieron cuatro subfamilias que se clasificaron como
TIFY, PPD, JAZ y ZML (dominios que las constituyen, Figura 1-3) (Bai et al., 2011).

33
Introducción

Briófitasª Licopodiofitasª Eudicotiledóneasª Monocotiledóneasª

Subfamilia
Pp Sm Mg At Pt Vv Gm Mtᵇ Os Bd Sb Zm

TIFY 3 2 1 1 3 2 3 2 1 0 0 1

PPD 0 4 2 2 2 2 2 0 0 0 0 0

JAZ 9 8 9 12 12 7 20 14 15 15 16 23

ZML 4 4 1 3 8 4 9 5 4 6 3 3

Tabla 1-1. Lista del número de genes de la familia TIFY. a Fuentes de datos del
genoma: Physcomitrella patens (Pp), Selaginella moellendorffii (Sm), Mimulus guttatus
(Mg), Populus trichocarpa (Pt), Brachypodium distachyon (Bd), Sorghum bicolor (Sb)
desde DOE Joint Genome Institute (LGI, http://genome.jgi-psf.org); Arabidopsis
thaliana (At) desde TAIR (http://www.Arabidopsis.org); Oryza sativa (Os) desde TIGR
(http://rice.plantbiology.msu.edu); Medicago trunculata (Mt) desde
(http://www.medicago.org); Vitis vinifera (Vv) desde Genoscope (http://www.cns.fr);
Glycine max (Gm) desde Phytozome (http://www.phytozome.net); Zea Mays (Zm)
desde (http://www.maizesequence.org). b La anotación del genoma de Medicago
trunculata está incompleta (Bai et al., 2011).

FAMILIA TIFY EN ARABIDOPSIS

A Subfamilia TIFY TIFY

1 miembro

B Subfamilia PPD PPD TIFY JAS

2 miembros

C Subfamilia JAZ TIFY JAS

12 miembros
GATA /
D Subfamilia ZML TIFY JAS CCT ZINC
FINGER
3 miembros

Figura 1-3. Arquitectura de las proteínas que conforman la familia TIFY. En los
esquemas se observa los dominios conservados que conforman cada subfamilia. En rojo
se enmarca el dominio TIFY, en lila el dominio PPD, en amarillo el dominio Jas, en
verde el dominio CCT y en azul el dominio GATA-Zinc Finger, además (A)
corresponde a la estructura de las proteínas de la subfamilia TIFY, (B) a la subfamilia
PPD, (C) a la subfamilia ZML y (D) a la subfamilia JAZ.

34
Introducción

Existe muy poca información acerca de los miembros de la subfamilia TIFY que
poseen un dominio TIFY.

La subfamilia PEAPOD (PPD) la conforman proteínas que poseen 3 dominios: un único

dominio PPD en su N-terminal, un dominio TIFY y un motivo Jas divergente que
carece de un PY conservado en su C-terminal (Chung et al., 2009). Previamente fueron
identificados dos dominios adicionales TIFY contenidos en las proteínas de
Arabidopsis PEAPOD1 y PEAPOD2 (PPD1y PPD2) que codifican para AT4G14713 y
AT4G14720, respectivamente (White, 2006). Las PEAPODs difieren de las proteínas
ZML por la ausencia del dominio GATA (Vanholme et al., 2007). Los genes AtTIFY4a
(PPD1) y AtTIFY4b (PPD2) están involucrados en la coordinación del crecimiento de la
hoja. Ambas proteínas PPD han sido caracterizadas como reguladoras del ciclo celular
(Bai et al., 2011). En una investigación previa, fueron estudiados dos genes PPD en
Vitis vinifera. Se encontró que VvPPD2 respondía a estrés osmótico mientras que
VvPPD1 no lo hacía. Por otra parte, durante un tratamiento con hormonas en cultivos de
células en suspensión, VvPPD1 aumentó su expresión bajo tratamientos con JA y
MeJA, mientras que VvPPD2 solo tuvo un ligero aumento de expresión con
tratamientos de JA y ninguno con MeJA (Zhang et al., 2012).

De los cuatro subgrupos de proteínas contenidas en la familia TIFY, la subfamilia JAZ

de Arabidopsis ha sido la mejor caracterizada hasta el momento. Las proteínas JAZ
presentan dos dominios principales, el TIFY y el Jas. El dominio Jas media la
interacción entre las proteínas represoras transcripcionales JAZ y la proteína receptora
COI1. La interacción directa entre los JAZ y COI1 ha sido demostrada para JAZ1
(At1g19180), JAZ2 (At1g74950), JAZ3 (At3g17860), JAZ6 (At1g72450), JAZ9
(At1g70700), y JAZ10 (At5g13220) (Thines et al., 2007; Melotto et al., 2008; Chini et
al., 2009; Chung y Howe, 2009; Yan et al., 2009; Sheard et al., 2010).

Las proteínas JAZ fueron identificadas como represoras de la vía de señalización del
ácido jasmónico, dependientes de la degradación por JA mediante la vía del proteasoma
26S (Chini et al., 2007; Yan et al., 2007). Las proteínas JAZ son consideradas dianas
del complejo SCFCOI1. Estas proteínas y COI1 interactúan directamente en presencia del
conjugado bioactivo JA-isoleucina (JA–Ile) para formar un complejo correceptor. En

35
Introducción

Arabidopsis, el factor basic helix–loop–helix (bHLH) MYC2 es el gen diana mejor

conocido de las proteínas JAZ (Chini et al., 2007; Thines et al., 2007; Yan et al., 2007).

Se ha demostrado que MYC2 está involucrado directa e indirectamente con la inducción

de metabolitos secundarios y que puede actuar como un activador o como un represor.
Por ejemplo, es un regulador positivo de la inhibición del crecimiento de raíces
primarias, la biosíntesis de antocianinas y la tolerancia a estrés oxidativo mediado por
JA, pero por otra parte, es un regulador negativo de la resistencia a hongos
necrotrópicos y biosíntesis de triptófano (Trp) mediado por JA (Lorenzo et al., 2004;
Dombrecht et al., 2007). Sin embargo, MYC2 no puede funcionar como un activador
transcripcional cuando se une a un promotor diana heterólogo (Pauwels y Goossens,
2008).

El dominio Jas está presente en todas las proteínas JAZ, pero JAZ7 (At2g34600) y
JAZ8 (At1g30135) no poseen los aminoácidos conservados en la posición 205 y 206
como JAZ1, los cuales se demostró que son esenciales para la interacción con COI1. La
secuencia de aminoácidos mínimos suficientes para la unión de la fitotoxina coronatina
(COR) fue localizada en una parte del N-terminal del dominio Jas extendido con dos
aminoácidos no conservados, creando una estructura bipartita consistente de un bucle y
una α-hélice anfifática. El bucle formado por la secuencia ELPIARR en JAZ1, permite
que JAZ se una a JA-Ile y COI1. Mientras el α-hélice une a COI1 cerca del sitio de
unión de JA-Ile, y su interacción es necesaria para la función co-receptora (Sheard et
al., 2010). La hormona probablemente es percibida por un complejo co-receptor que
está conformado por una proteína JAZ y COI1 (Figura 1-4).

Las proteínas F-box pueden formar substratos adaptadores junto con las proteínas Skp1
que son reclutados por culina para completar el complejo SCF E3 ubiquitina ligasa
únicamente cuando se unen a su diana. Es ampliamente aceptado que la unión con
SCFCOI1 está seguido por la poliubiquitinación de JAZ y la degradación por proteasoma
(Pauwels y Goossens, 2011).

36
Introducción

Figura 1-4. Modelo de la degradación mediada por JA-Ile vía proteasoma 26S. En
ausencia de JA-Ile, JAZ está unido a MYC2 y reprime la expresión del gen. En
presencia de JA-Ile, mientras MYC2 queda libre para realizar su función, COI1-SKP
puede formar un substrato adaptador que con JA-Ile e InsP5 como un cofactor, une el
dominio Jas de las proteínas JAZ. Posteriormente cuando se forma el complejo ligasa
SCFCOI1 E3, JAZ es presumiblemente poliubiquitinado, marcado para su degradación
por el proteasoma 26S (Adaptado de Pauwels y Goossens, 2011).

Los JAZ también regulan el complejo WD40/bHLH/MYB involucrado en la biosíntesis

de antocianinas y en el desarrollo de tricomas. GL3, EGL3 y TT8 funcionan en un
complejo, que por una parte está interconectado directamente con la proteína WD40
TESTA TRANSPARENTE GLABRA1 (AT5G24520) y por otra, con diferentes proteínas
MYB R2R3. El complejo GL3/EGL3/TT8 regula múltiples procesos, incluyendo
desarrollo de tricomas y pelos de la raíz, biosíntesis de flavonoides (antocianinas y
proantocianidinas), patrones estomáticos en hipocotilos y biosíntesis de mucílago
(Zhang et al., 2003; Zimmermann et al., 2004; Broun, 2005; Serna y Martin, 2006;
Gonzalez et al., 2008; Ishida et al., 2008; Balkunde et al., 2010; Dubos et al., 2010). La
biosíntesis de antocianina y la iniciación de tricomas son inducibles por JAs (Feys et al.,
1994; Traw y Bergelson, 2003; Maes et al., 2008). Esta inducción requiere el receptor
de JA COI1 y las proteínas bHLH tipo GL3/EGL3/TT8 (Maes et al., 2008; Yoshida et
al., 2009; Qi et al., 2011).

37
Introducción

También se ha demostrado que el complejo MYC2/MYC3/MYC4 está involucrado en

la inducción de la biosíntesis de antocianinas mediada por JA (Lorenzo et al., 2004;
Dombrecht et al., 2007; Niu et al., 2011), sin embargo la inducción de tricomas parece
ser independiente de la presencia de MYC2 (Yoshida et al., 2009).

Muchas proteínas JAZ interactúan directamente con proteínas MYB R2R3 como PAP1
PRODUCCIÓN DE PIGMENTO ANTOCIANINA1 (AT1G56650) y GL1
(AT3G27920), los cuales tienen papeles específicos en la síntesis de antocianinas y la
iniciación de tricomas (Pauwels y Goossens, 2011).

Mediante un análisis de transcriptoma de estambres tratados con JA se identificaron dos

proteínas MYB R2R3 (MYB21: AT3G27810 y MYB24: AT5G40350), que son
reguladores clave de los procesos de maduración de estambres (Mandaokar et al.,
2006). Por otra parte, al menos JAZ1, JAZ3 y JAZ9 puede unir EIN3 y EIL1. La
represión de EIN3/EIL1 media la interacción entre la señalización por etileno y JA que
ocurre en muchos procesos relativos a desarrollo y defensa (Bari y Jones, 2009; Grant y
Jones, 2009; Kuppusamy et al., 2009; Pauwels et al., 2009; Van der Ent et al., 2009;
Robert-Seilaniantz et al., 2011) (Figura 1-5A).

Las proteínas JAZ contienen un motivo conservado TIFY dentro del dominio TIFY
(Vanholme et al., 2007) que media interacciones homo y heterodiméricas entre
diferentes proteínas JAZ y otros factores de transcripción (Melotto et al., 2008; Chung y
Howe, 2009; Chini et al., 2009). El dominio TIFY también tiene como función reclutar
co-represores transcripcionales, tales como TOPLESS (TPL), a través de la proteína
Nuevo Interactor de JAZ (NINJA) mediante el motivo EAR , todo esto ha permitido
realizar un modelo más complejo y con más componentes de la percepción de JA y la
vía de señalización del mismo. NINJA, el cual es un regulador negativo de la síntesis de
JA, ha sido propuesto como un adaptador que media la unión entre las proteínas JAZ y
el complejo represor TPL (Pauwels et al., 2010). (Figura 1-5B).

38
Introducción

Figura 1-5A. Modelos de inhibición de respuestas a ácido jasmónico (JA) por

interacción de proteínas JAZ con otras proteínas. Representación esquemática de
diferentes combinaciones de Factores de transcripción interaccionando con los JAZ,
donde se muestran las respuestas a JA más importantes controladas por los respectivos
factores de transcripción (Adaptado de Pauwels y Goossens, 2011; De Geyter et al.,
2012).

39
Introducción

Figura 1-5B. Modelos de actuación del jasmonato en la regulación de los genes

MYC. En ausencia de JA–isoleucina (JA–Ile), en el primer caso las proteínas JAZ
inhiben la actividad de unión de ADN de MYC, en el segundo caso MYC es reprimido
por el complejo co-represor que contienen el Nuevo Interactor de JAZ (NINJA) y
TOPLESS y en el tercer caso se muestra la represión de MYC por el complejo JAZ (los
que contienen un motivo EAR)/TOPLESS. Cuando hay señales de estrés o desarrollo
los niveles de (+)-7-iso-JAL-Ile aumentan y se une al receptor CORONATINE
INSENSITIVE1 (COI1), el cual forma parte del complejo E3 ubiquitin ligase Skp–
Culina–F-box (SCFCOI1), de este modo recluta las proteínas JAZ, uniéndolas al
complejo para su degradación por el proteasoma 26S, dejando a MYC libre para que
pueda modular la expresión de los genes de respuesta a JA, crecimiento de raíz y
respuesta a herbívoros, mientras NINJA y TOPLESS pueden intervenir en otras
interacciones (Adaptado de Pauwels y Goossens, 2011; De Geyter et al., 2012).

Por último, la subfamilia ZML está formada por tres miembros en Arabidopsis (ZIM,
ZML1, y ZML2) que presentan los dominios TIFY, Jas, CCT y GATA-Zinc Finger. El
primer estudio funcional llevado a cabo para un miembro de esta subfamilia fue
realizado para el gen de Arabidopsis thaliana, AT4G24470, el cual estaba altamente

40
Introducción

expresado en el tejido reproductivo. La correspondiente proteína, se describió como un

factor de transcripción putativo, que contenía un dominio C2C2-GATA-Zinc Finger (C-
X2-C-X20-C-X2-C, donde X representa cualquier aminoácido) y de acuerdo con esto fue
nombrada ZIM, por proteína Zinc Finger expresada en Inflorescencia del Meristemo
(Nishii et al., 2000). Diversos tipos de dominios GATA han sido estudiados en
vertebrados, hongos y plantas. Originalmente en vertebrados fue identificado un motivo
C-X2-C-X17-C-X2-C que permitía a la proteína GATA-Zinc Finger unirse a la secuencia
(A/T)GATA(A/G) (Evans y Felsenfeld, 1989), también fueron encontrados dos motivos
de este subtipo el C-X2-C-X18-C-X2-C y el C-X2-C-X19-C-X2-C en hogos y plantas
(Daniel-Vedele y Caboche, 1993; Teakle y Gilmartin, 1998).

Con el propósito de conocer si la proteína ZIM actuaba como un activador o como un

represor, se efectuaron experimentos de expresión transiente en células de tabaco, en
que los que se empleó como efector el dominio de unión a ADN GAL4 fusionado a la
proteína ZIM o versiones truncadas de la misma y como reportero el gen que codifica
para la luciferasa FIREFLY (LUC) controlado por un promotor que contenía el sitio de
unión del GAL4 (6 x UAS), obteniendo como resultado que el ZIM de Arabidopsis se
comportaba como un activador y que además el dominio que promovía la activación se
encontraba en la región N-terminal de esta proteína (Shikata et al., 2003).

Posteriormente, mediante la caracterización de plantas en Arabidopsis que

sobreexpresaban la proteína ZIM bajo el control del promotor de CaMV 35S, se llevó a
cabo un estudio funcional de la subfamilia ZIM de Arabidopsis. Las líneas
sobreexpresantes ZIM-ox presentaban hipocotilos y peciolos elongados, este fenotipo
no se modificó bajo tratamientos de diferentes tipos de luz (rojo, rojo lejano, luz blanca
y azul), indicando que la sobreexpresión de ZIM afecta la regulación de la elongación y
el posicionamiento de la hoja, así como la regulación de la señalización y respuesta a la
luz. De igual modo, en presencia de brasinosteroides (BRs) o giberelinas (Gas), los
mutantes ZIM-ox no presentaron ningún cambio, lo que sugiere que la elonganción de
la sobreexpresión de ZIM es independiente de BRs y GAs.

Por otra parte, cuando se llevaron a cabo experimentos de microarrays usando los
mutantes de ZIM-ox, fueron identificados genes que estaban sobre-expresados como
por ejemplo XTH33 que se postula que tiene funciones en la modificación de la pared

41
Introducción

celular, lo que podría estar influenciando el fenotipo de elongación. También se

determinó que los genes XTH que presentaban mayor expresión estaban en la punta del
tallo y la hoja, con lo cual se podría sugerir que la regulación transcripcional efectuada
por ZIM y sus efectos están controlados espacialmente (Shikata et al., 2004).

En el genoma de Arabidopsis thaliana han sido identificados otros dos miembros de la

subfamilia ZML (ZIM-like) que son AT3G21175 y AT1G51600, posteriormente
mediante análisis de homología de secuencia han sido identificados miembros de esta
subfamilia en otras especies (Tabla 1-1). Como se había mencionado anteriormente,
además del dominio GATA y un dominio CCT (CONSTANS, CO-like, TOC1), las
proteínas ZIM y ZML se caracterizan por contener un dominio llamado TIFY, que
generalmente tiene el motivo conservado T[I/L]SFXG (pfam06200), sin embargo la
subfamilia ZML no presenta una elevada conservación de este motivo (Figura 1-6) (Bai
et al., 2011).

42
Introducción

Figura 1-6. Distribución del núcleo del motivo “TIFYXG”. El motivo “TIFYXG” es
un núcleo dominante del motivo en el dominio TIFY de la familia de factores de
transcripción TIFY, excepto en la subfamilia ZML en la cual “TLS[F/Y]XG” es más
prevalente (Adaptado de Bai et al., 2011).

1.3 Regulación de factores de transcripción mediante fosforilación

Las redes de señalización de la célula permiten a la planta responder dinámicamente a

cambios ambientales a través de reacciones bioquímicas y adaptaciones fisiológicas. La
fosforilación reversible de proteínas a través de las proteínas quinasas y fosfatasas es
uno de los usos más amplios del mecanismo bioquímico en la señalización celular y la
respuesta enzimática (Tchieu et al., 2003).

Las proteínas quinasas y fosfatasas constituyen cerca de un 5% de los genes en

Arabidopsis, ambas son componentes críticos de muchas vías de señalización de plantas
en respuesta a frío, sequía y concentraciones elevadas de sal (Chinnusamy et al., 2004;
Teige et al., 2004; Zhang et al., 2004), presencia de patógenos (Nurnberger et al., 2004;
Rowland et al., 2005), ABA (Fan et al., 2004), Etileno (Etheridge et al., 2005),

43
Introducción

percepción de luz (Chen et al., 2004), requerimientos del desarrollo (Dievart y Clark,
2003), metabolismo del carbón (Rolland y Sheen, 2005) y ciclo celular (Koroleva et al.,
2004).

Numerosas vías de señalización están influenciadas por la ubicua Ser/Thr proteína

quinasa CK2. En todas las eucariotas, el típico holoenzima es un heterotetrámero
compuesto por dos subunidades catalíticas (CK2α y CK2α') y dos subunidades
reguladoras (CK2β) (Figura 1-7). Una de las características distintivas de la CK2 de
plantas es que presenta un gran número de genes que codifican para las subunidades
CK2α/β a diferencia de animales o levadura donde el número de genes que constituyen
la familia CK2 es reducido. En Arabidopsis y maíz las subunidades CK2α/β pertenecen
a una familia multigénica compuesta por más de cuatro genes (Vélez-Bermúdez et al.,
2011).

La subunidad reguladora CK2β tiene como funciones la estabilidad, actividad y

especificidad del holoenzima CK2αβ, pero también puede realizar funciones
independientes del tetrámero CK2 (Riera et al., 2011). Muchos de los substratos de
CK2 son proteínas conocidas por regular eventos transcripcionales (Lehnert et al.,
2008).

La proteína quinasa CK2 de plantas está involucrada en la respuesta a estrés abiótico y

biótico (Ver Anexo III; Specific Features of Plant CK2, Riera et al., 2013). Uno de los
papeles de la CK2 de plantas en respuesta a estrés por sal fue demostrado usando un
abordaje de complementación en levadura, donde la sobreexpresión de la subunidad
CK2α de la remolacha incrementó la tolerancia a NaCl en S. cerevisiae (Kanhonou et
al., 2001). Además, la sobre expresión de la CK2β1 de maíz en células de levadura que
carecen de una isoforma de CK2β, exhiben un fenotipo de incremento de sensibilidad a
iones de sodio y litio (Riera et al., 2001). Recientemente, el fenotipo del triple mutante
de CK2α1α2α3 de Arabidopsis hiposensitivo a NaCl ha confirmando el papel de CK2
en respuesta a estrés salino en plantas (Mulekar et al., 2012).

44
Introducción

Figura 1-7. Modelo de actuación de la proteína quinasa CK2. Se muestran las

subunidades independientes de la proteína quinasa CK2. Las subunidades catalíticas
CK2α y las subunidades reguladoras CK2β, las cuales forman dímeros. Se puede
observar que las subunidades que componen la CK2 pueden actuar de forma
independiente o juntas formando el holoenzima CK2α2β2. Las subunidades CK2β
pueden estar cumpliendo funciones independientes de CK2 al interactuar con
subunidades catalíticas de otras quinasas. Por otro lado, las subunidades reguladoras
puede estar interactuando con otras proteínas no quinasas y además puede regular la
estabilidad de sus proteínas interactoras. La presencia de las proteínas interactoras o
substratos y las modificaciones post-traduccionales dinámicas, tales como la
fosforilación, puede ser el balance entre las diferentes formas de las subunidades CK2.
CI y CII señalan la formación de complejos macromoleculares y CIII otros complejos
donde el holoenzima es reclutado de manera reversible (Adaptado de Filhol et al., 2004;
Bolanos-Garcia et al., 2006).

45
Introducción

Muchas proteínas relacionadas con la respuesta a estrés son substratos de CK2. Las
proteínas abundantes en embriogénesis tardía (LEA)/Rab/dehidrinas están entre las más
comunes de plantas, además están involucradas en la adaptación a agua o estrés
osmótico. La proteína de maíz Rab17 es inducida por ácido abscísico (ABA) y
fuertemente fosforilada por CK2 (Plana et al., 1991). También fue demostrado que a
través de la interacción y la fosforilación, la CK2 modula funciones del desarrollo de
Rab17 en la germinación de semillas en respuesta a estrés osmótico (Riera et al., 2004).

Adicionalmente, en maíz se determinó que la actividad de unión de los factores de

transcripción bZIP, EmBP-2 y ZmBZ-1 es modulada por la fosforilación por CK2.
Ambos factores son proteínas nucleares que unen a ABRE (Elementos de Respuesta a
ABA) y activan la transcripción del gen inducible por ABA rab28 (Nieva et al., 2005).
Hay pocos datos sobre la activación de CK2 por hormonas en plantas. El ácido salicílico
(SA) es una importante fitohormona involucrada en la activación de las respuestas a
defensa contra estrés biótico. En un trabajo previo, fue reportado que el SA incrementó
la actividad nuclear de CK2 en plantas de tabaco (Hidalgo et al., 2001). En Arabidopsis,
los tratamientos de SA aumentan la fosforilación del factor de transcripción bZIP,
TGA2, influenciando negativamente su habilidad de unión a ADN (Kang y Klessig,
2005). Recientemente, la co-chaperona p23, también involucrada en la señalización por
SA, ha sido identificada como un nuevo substrato para CK2 en Arabidopsis (Tosoni et
al., 2011). Además, se ha mostrado que la actividad de sintasa fitoquelatina (PCS), una
proteína involucrada en estrés biótico y respuesta a metales pesados en plantas, esta
incrementada después de la fosforilación por CK2 (Wang et al.,2009).

La proteína quinasa CK2 también juega un papel importante en la fosforilación de

proteínas involucradas en muchos procesos dependientes de ADN, tales como
replicación de ADN, transcripción, translación, recombinación, reparación o biogénesis
ribosomal (Riera et al., 2013).

Una trabajo previo realizado en nuestro laboratorio permitió la identificación de un clon

parcial de una proteína tipo GATA-Zinc Finger, a través de un cribado mediante doble
híbrido de una librería de cDNA, construida a partir de mRNA de hoja de maíz joven
sometida a tres horas de deshidratación, en el cual se había utilizado como anzuelo la
subunidad reguladora CK2β1 de maíz (Figura 1-8). Este clon fue denominado 91 y

46
Introducción

correspondía a una isoforma parcial, ya que carecía de la región N-terminal, sin

embargo, incluía los dominios TIFY, Jas, CCT y GATA-Zinc Finger.

CK2β1
β β

Proteína
parcial de
ZmZIM91

Figura 1-8. Identificación de ZmZIM91 por medio de un ensayo de doble híbrido

utilizando la subunidad reguladora β1 de la proteína quinasa CK2 de maíz. El
experimento se realizó a partir de una librería de hoja joven de maíz estresada por
sequía. En la parte superior, se observa el resultado total del experimento, en el circulo
negro se encierra el clon correspondiente a la proteína parcial de ZmZIM91. En la parte
inferior se muestra una gráfica de los resultados del ensayo, los cuales fueron que un
53% de los clones correspondían a subunidades tanto reguladoras como catalíticas α/β
de CK2 y un 47% a factores de transcripción y proteínas de procesamiento de ARN.

1.4 Regulación transcripcional

La regulación es un proceso fundamental mediante el que los organismos multicelulares

responden a estrés abiótico y biótico, al igual que modulan procesos de desarrollo. La
maquinaria transcripcional de eucariotas consiste en dos componentes reguladores
complementarios: los elementos en cis y las proteínas actuando en trans. Las secuencias
de ADN en cis comprenden el promotor central proximal que incluye la caja TATA y
elementos iniciadores asi como elementos aguas abajo del promotor proximal y
regiones regulatorias distales incluyendo aumentadores, represores y aisladores (Smale
y Kadonaga, 2003). Las proteínas actuando en trans involucran la ARN polimerasa II,
factores transcripcionales generales, factores transcripcionales de unión a secuencias
específicas, cofactores que usualmente no contienen un dominio de unión a ADN y
factores de modificación de la cromatina (Mannervik et al., 1999).

47
Introducción

A través de la modulación de los patrones de expresión de los genes, la diferenciación y

función celular están altamente controladas. El encendido o apagado de la expresión
específica de genes es uno de los principales mecanismos moduladores y se da
principalmente a través de la asociación y disociación de los factores de transcripción
con los promotores de sus genes diana. Por lo tanto, desvelar el mecanismo que usan los
factores de transcripción para regula sus genes diana es esencial para entender procesos
biológicos importantes. Se han desarrollados diversos métodos para identificar
interacciones entre el factor de transcripción y el gen diana e investigar cómo y cuándo
responden las células a diferentes señales (Wu et al., 2010).

Uno de los métodos empleados es la inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP), en el

que los fragmentos diana de una proteína son enriquecidos mediante la
inmunoprecipitación. Posteriormente, con el fin de conocer el papel de un factor de
transcripción a nivel genómico se desarrollo una técnica en la cual el ChIP es hibridado
con un microarray de ADN, dando lugar a una técnica denominada ChIP-chip. Con este
método solo pueden ser detectados los genes diana incluidos en el microarray.

El avance en los métodos de secuenciación dio lugar a las tecnologías de secuenciación

de nueva generación (NGS). Seguidamente, el ChIP fue fusionado con las NGS,
originando una técnica llamada ChIP-Seq, que combina la inmunoprecipitación de la
cromatina con la secuenciación en paralelo a gran escala. En esta técnica primero se
realiza una inmunoprecipitación de ADN y seguidamente se efectua una secuenciación
masiva de los sitios enriquecidos para conocer a nivel genómico los fragmentos diana
de una proteína o las modificaciones de las histonas. El ChIP-Seq provee una visión
global de los elementos reguladores en cis, la función de factores de transcripción y de
los procesos epigenéticos involucrados en el control de la transcripción génica (Kidder
et al., 2011).

48
Objetivos
Objetivos

2. Objetivos

El objetivo general del presente trabajo es la caracterización funcional de un nuevo

factor de transcripción de maíz el cual ha sido llamado ZmZIM91. La información que
se logre obtener de esta proteína permitirá establecer cuál es el papel que desempeña
dentro de la planta de maíz, definiendo el proceso biológico en el que está implicado y
su importancia dentro del mismo. Para ello, se han propuesto los siguientes objetivos
específicos:

1. Caracterización molecular de ZmZIM91, que conlleva al desarrollo de los siguientes

apartados:

1.1 Aislamiento del clon completo de ZmZIM91.

1.2 Caracterización de la respuesta de ZmZIM91 en presencia de la hormona MeJA.
1.3 Determinación del sitio de unión a ADN de ZmZIM91.
1.4 Estudio de la interacción y regulación de la proteína ZmZIM91 y la proteína quinasa
CK2 de maíz.

2. Caracterización funcional de ZmZIM91, realizando:

2.1 Identificación de genes diana de ZmZIM91 in vivo mediante el uso de ChIP-Seq.

2.2 Análisis de la interacción de ZmZIM91 con otras proteínas que regulan los
promotores de los genes diana de ZmZIM91 identificados mediante ChIP-Seq.

50
Capítulo I
Capítulo I

Capítulo I

3. Caracterización molecular de la proteína ZmZIM91 de maíz

3.1 Resultados

3.1.1 Obtención del cDNA completo de ZmZIM91

Para la obtención del clon completo de ZmZIM91, se diseñaron cebadores basándose en

la secuencia de ADN de un gen de maíz que presentaba alta homología y que fue
hallada en la base de datos MaizeSequence.org (GRMZM2G058479_T01). Como DNA
molde para la reacción de amplificación se utilizó cDNA obtenido por
retrotranscripción a partir de RNA de hoja de maíz. Debido a la dificultad técnica para
amplificar el clon de ZmZIM91, fue necesario realizar un experimento utilizando
diferentes cantidades de Betaína y DMSO, (Henke et al., 1997) y se determinó que con
DMSO al 5% (ver materiales y métodos) se obtenía una banda específica del tamaño
molecular esperado. Tras el clonaje y posterior secuenciación de la banda se comprobó
que correspondía al clon completo. La secuencia obtenida contenía 354 aminoácidos
(Figura 3-1), un peso molecular teórico de 38 kDa y un pI de 5.17.

3.1.2 Localización subcelular de ZmZIM91

Muchos factores de transcripción están principalmente localizados en el núcleo,

mientras otros se mueven del citoplasma al núcleo en respuesta a cascadas de
señalización. Para establecer la localización subcelular de ZmZIM91, se realizó un
ensayo transciente en el que se transformaron protoplastos de maíz uando la
construcción 35S::ZmZIM91:GFP. La proteína ZmZIM91 muestra un patrón específico
de localización nuclear, en contraste con la GFP sola que se encuentra tanto en el núcleo
como en el citoplasma (Figura 3-2). Esto indica que ZmZIM91 posee una localización
subcelular similar a la de otros miembros de la familia TIFY como es el caso de los
JAZ.

52
Capítulo I

1 M
M SS HH HH DD GG SS KK PP YY QQ PP RR RR GG PP EE RR HH PP
1 ATGTCCCACCACGACGGAAGCAAGCCATACCAGCCGCGCCGGGGGCCCGAGCGGCACCCG

21 Q
Q PP AA DD GG II AA AA SS PP PP AA AA VV AA PP SS VV EE HH
61 CAGCCAGCGGATGGGATCGCCGCCTCGCCTCCCGCCGCCGTTGCCCCGTCGGTGGAGCAC

41 L
L VV AA AA AA AA EE AA EE AA LL NN RR FF AA AA EE QQ QQ QQ
121 CTCGTGGCGGCCGCCGCCGAGGCGGAGGCATTGAACCGCTTCGCCGCGGAACAACAGCAG

61 Q
Q LL QQ GG HH EE QQ EE VV GG EE EE EE EE EE EE DD EE QQ EE
181 CAGCTGCAGGGGCACGAGCAGGAGGTTGGGGAGGAAGAGGAGGAGGAGGACGAGCAGGAA

81 DD E
E MM EE EE EE DD EE DD EE HH EE GG QQ HH GG GG II GG GG
241 GACGAGATGGAGGAGGAGGACGAGGATGAGCACGAAGGTCAGCACGGCGGCATCGGTGGG

101 E
E HH VV PP MM DD AA DD AA AA AA AA AA AA AA AA AA VV SS QQ
301 GAGCACGTTCCCATGGACGCGGATGCTGCTGCCGCGGCGGCGGCGGCCGCAGTCTCGCAG

121 M
M DD PP HH SS AA LL VV AA GG TT VV TT PP MM AA TT NN QQ LL
361 ATGGACCCGCACTCGGCGTTGGTGGCTGGGACTGTGACACCCATGGCGACCAACCAGCTC

141 TT L
L SS FF QQ GG EE VV YY VV PF DD SS VV SS PP DD KK VV QQ
421 ACCCTCTCATTCCAGGGCGAGGTCTATGTGTTCGACTCCGTCTCCCCTGATAAGGTCCAA

161 A
A VV LL LL LL LL GG GG RR EE LL SS SS LL GG GG AA SS SS SS
481 GCCGTGCTTTTGCTGCTTGGAGGGAGGGAGCTGAGCAGCCTGGGCGGAGCGTCGTCCTCT

181 A
A PP YY SS KK RR LL NN YY PP HH RR VV AA SS LL MM RR FF RR
541 GCACCTTATAGTAAGAGGTTGAATTATCCACATCGGGTGGCATCTCTGATGAGATTTAGG

201 E K
E K RR KK EE RR NN FF DD KK KK II RR YY SS VV RR KK EE VV
601 GAAAAGCGGAAGGAGCGGAACTTTGATAAGAAGATCCGATACTCTGTCCGGAAGGAAGTT

221 A
A LL RR MM QQ RR NN RR GG QQ FF TT SS SS KK PP KK PP DD EE
661 GCACTTAGGATGCAGCGTAATCGAGGTCAGTTTACATCTTCAAAACCAAAGCCTGATGAA

241 I A
I A AA SS EE MM AA SS AA DD GG SS PP NN WW AA LL VV EE GG
721 ATAGCGGCTTCAGAAATGGCATCCGCAGATGGCTCCCCGAATTGGGCATTAGTTGAAGGC

261 R
R PP PP SS AA AA EE CC HH HH CC GG TT NN AA TT AA TT PP MM
781 CGACCTCCATCTGCTGCCGAATGTCATCACTGTGGTACTAATGCAACAGCTACACCAATG

281 M
M RR RR GG PP DD GG PP RR TT LL CC NN AA CC GG LL MM WW AA
841 ATGCGTCGCGGACCTGATGGACCAAGAACATTATGCAATGCATGTGGCCTCATGTGGGCA

301 N
N KK GG LL LL RR DD VV TT KK SS PP VV PP LL QQ AA TT QQ SS
901 AATAAGGGTCTCCTGAGGGACGTAACAAAATCTCCTGTACCTCTCCAAGCTACGCAATCA

321 A
A PP HH LL DD GG GG NN GG SS AA MM SS AA PP GG SS EE LL EE
961 GCTCCGCATCTAGATGGTGGTAATGGAAGCGCCATGTCTGCGCCTGGCTCTGAGCTAGAG

341 N
N AA AA AA AA MM TT NN GG HH EE SS SS SS SS GG VV VV
1021 AATGCTGCAGCAGCCATGACCAATGGCCACGAGTCATCGAGTAGTGGTGTTTAA

Figura 3-1. Secuencia de ZmZIM91 en aminoácidos y cDNA. En color rojo se

señalan los aminoácidos que componen el N-terminal que fue amplificado y los cuadros
en azul muestran los putativos sitios de fosforilación por la proteína quinasa CK2 que
fueron identificados en la proteína de ZmZIM91.

53
Capítulo I

35S::ZmZIM91:GFP
35S::GFP

Figura 3-2. Localización subcelular de ZmZIM91 en protoplastos de maíz.

35S::ZmZIM91:GFP fue expresado mediante transformación transciente en protoplastos
de maíz por electroporación. En el panel superior se puede observar tanto el campo de la
GFP como en el merge que ZmZIM91 presenta una localización nuclear (60X). En la
parte inferior, se encuentra la GFP, que presenta una localización tanto en el núcleo
como en citoplasma (60X). Para todos los paneles la barra de medida en color amarillo
(Bar) = 10µm.

3.1.3 ZmZIM91 pertenece a la subfamilia ZML de maíz

Para realizar el análisis filogenético de la proteína ZmZIM91, se llevó a cabo una

búsqueda de otros miembros de la subfamilia ZML de maíz utilizando la base de datos
www.maizesequence.org y realizando un alineamiento de la proteína ZmZIM91 contra
el genoma de la línea homocigótica B73, lo anterior permitió la identificación de dos
miembros más en maíz. Posteriormente se recopilaron las secuencias proteicas de los 3
miembros de esta subfamilia en Arabidopsis que ya habían sido previamente
identificados (Nishii et al., 2000), y por último se procedió a comparar la información
con los datos recopilados por Bai et al. (2011). El árbol filogenético de la subfamilia
ZML en maíz y Arabidopsis se construyó con el método unrooted phylogenetic tree (N-
J) del programa ClustalW (http://www.genome.jp/tools/clustalw/) con las condiciones
que se especifican en los materiales y métodos (Figura 3-3). Se observa que las
proteínas de maíz y Arabidopsis de la subfamilia ZML son cercanas filogénicamente.

54
Capítulo I

Figura 3-3. Árbol filogenético de la subfamilia ZML en maíz y Arabidopsis. Los

identificadores para la búsqueda en las bases de datos tanto de Arabidopsis (TAIR)
como de maíz (Maizesequence.org) son: AtZML1 (AT3G21175.1), AtZML2
(AT1G51600.1), AtZIM (AT4G24470.1), ZmZML1 (GRMZM2G065896_T01),
ZmZIM91 (GRMZM2G058479_T01), ZmZML3 (GRMZM2G080509_T01). El círculo
verde señala las proteínas ZML de maíz y el círculo rosa contiene las proteínas ZML de
Arabidopsis.

55
Capítulo I

Por otra parte, de acuerdo a datos de RNA-Seq del trabajo de Li et al., 2010, se observa
que los 3 miembros de la familia ZML en maíz tienen una mayor expresión en la base
de la segunda hoja de maíz de 9 días (Figura 3-4).

Identificador base de datos

Expresiónen hoja de maíz Proteína
de la proteína

ZmZML1 GRMZM2G065896

ZmZIM91 GRMZM2G058479

ZmZML3 GRMZM2G080509

Figura 3-4. Expresión de las proteínas ZML de maíz en hojas de 9 días de la

variedad B73. Se observa la expresión de cada uno de los miembros de la subfamilia
ZML de maíz de acuerdo con datos de RNA-Seq proporcionados por la base de datos de
Maize eFP Browser at Bar.utoronto.ca (Li et al., Nature Genetics, 2010).

3.1.4 Dominios proteicos de ZmZIM91

Con respecto a las otras subfamilias pertenecientes a la familia TIFY, tanto ZmZIM91
como las demás proteínas ZML, contienen además del dominio TIFY y el Jas, un
dominio CCT y un putativo dominio de unión a ADN tipo GATA-Zinc Finger (Figura
3-5). El dominio CCT fue descubierto por primera vez en el factor de transcripción
TOC1 y las proteínas CONSTANS (CO), las cuales son conocidas por estar
involucradas en la señalización fotoperiódica de plantas, además el dominio CCT fue
implicado en la mediación de interacciones proteína-proteína (Robson et al., 2001).

GATA / ZINC
N TIFY JAS CCT
FINGER C
QLTLSFQGEVYVFDSVSPDKVQAVLLLLG SAAECHHCGTNATATPMMRRGPDGPRTLCNACGLMWANKGLLRDVTK

PHRVASLMRFREKRKERFNDKKIRYSVRKEVALRMQRNRGQFTSSKP

Figura 3-5. Aminoácidos correspondientes a los dominios conservados de

ZmZIM91. En el cuadro rojo se encuentra el dominio TIFY y su correspondiente grupo
de aminoácidos, en el amarillo está el dominio Jas y los aminoácidos que lo componen
están subrayados, en el negro se representa el dominio CCT y el grupo de aminoácidos
que lo conforma se señalan en negrilla y finalmente en el cuadro azul se puede ver el
dominio GATA-Zinc Finger con sus respectivos aminoácidos.

56
Capítulo I

El alineamiento entre los miembros de la familia ZML de Arabidopsis y maíz, muestran

que los dominios contenidos en estas proteínas están conservados entre ambas especies
(Figura 3-6). Sin embargo, hay divergencias entre los dominios TIFY y Jas de las
proteínas de la subfamilia ZML y JAZ.

Mientras el dominio TIFY en los JAZ contiene un TIFYAG conservado, en los ZML se
encuentra es el motivo TLSFQ, que además varia en dos aminoácidos en el caso de
AtZIM en Arabidopsis y ZmZML1 en maíz. Se ha demostrado que el dominio TIFY en
los JAZ de Arabidopsis es el responsable además de la dimerización de estas proteínas,
de la represión y de la interacción con NINJA, sin embargo no se ha descrito función
alguna de este dominio para los ZML en ninguna especie. Realizando un análisis de la
secuencia aminoacídica que conforma dicho dominio en ZmZIM91, se encontraron dos
putativos consensos de represión el LXLXFXGXV (LTLSFQGEV; aminoácidos 140-
148) y el XLLLXX (VLLLLG; aminoácidos 162-167) (Figura 3-7). Un motivo similar
a XLLLXX fue identificado únicamente en una proteína MYB-R3 (AtMYBL2) en el
carboxilo terminal, la cual está involucrada en la regulación negativa de la biosíntesis de
antocianinas en Arabidopsis, se trata del motivo TLLLFR (Matsui et al., 2008; Kagale y
Rozwadowski, 2010). Por otra parte, un nuevo motivo activo de represión R/KLFGV
que es similar al LXLXFXGXV fue identificado en al menos 29 factores de
transcripción de Arabidopsis miembros de las familias ABI3/VP1, ARF, HSF y MYB
(Ikeda y Ohme-Takagi, 2009).

57
Capítulo I

AtZML1 -------------------MDDLHGRNGRMHIGVAQNPMHVQYEDHGLHHIDNEN-----
AtZML2 -------------------MDDLHGSNARMHIREAQDPMHVQFEHHALHHIHNGS-----
AtZIM -------------------MFGRHSIIPNNQIGTASASAGEDHVSASATSGHIPY-----
ZmZIM91 --MSHHDGSKPYQPRRGPERHPQPADGIAAPPPAAVAPSVEHLVAAAAEAEALNRFAAEQ
ZmZML3 MSHSHHDGSKPYQPRRGPERPPQPADGIAVPPPAAVAPSVEHLVAAAAEAEALSRLGAEQ
ZmZML1 ---------------------------MAAEPAAADHDLRPPLADGAAAAGVG-------
* .

AtZML1 ---------------------------SMMDDHADGG----MDEGVETDIPSHPGNSADN
AtZML2 ---------------------------GMVDDQADDGNAGGMSEGVETDIPSHPGNVTDN
AtZIM ---------------------------DDMEEIPHPDSIYGAASDLIPDGSQLVAHRSDG
ZmZIM91 QQQLQGHEQEVGEEE-EEEDEQEDEMEEEDEDEHEGQHGGIGGEHVPMDADAAAAAAAAA
ZmZML3 QQLLQGHEQEVGEEEGEDEEEDEMEDDDDDDDEQEGQHGGIGVEHVPMDADAAAAAAVAA
ZmZML1 --------------------------------------------------AASLAAAAGA
.

AtZML1 RGEVVDR---------GIENGDQLTLSFQGQVYVFDRVSPEKVQAVLLLLGGREVPHTLP
AtZML2 RGEVVDR---------GSEQGDQLTLSFQGQVYVFDSVLPEKVQAVLLLLGGRELPQAAP
AtZIM SELLVSR---------PPEGANQLTISFRGQVYVFDAVGADKVDAVLSLLGGSTELAPGP
ZmZIM91 V-SQMDPHSALVAGTVPPMATNQLTLSFQGEVYVFDSVSPDKVQAVLLLLGGRELSS---
ZmZML3 AGAQMDPHSVLVPGTVPPMATNQLTLSFQGEVYVFDSVSPDKVQAVLLLLGGRELSS---
ZmZML1 AEALMS------------ATSEQLTLVYQGDVYVFDPVPPQKVQAVLLVLGGYEVPPGL-
:. :***: ::*:***** * .:**:*** :***
ZIM DOMAIN
AtZML1 TTLGSPHQNNRVLGLSGTPQRLSVPQR-LASLLRFREKRKGRNFDKTIRYTVRKEVALRM
AtZML2 PGLGSPHQNNRVSSLPGTPQRFSIPQR-LASLVRFREKRKGRNFDKKIRYTVRKEVALRM
AtZIM QVMELAQQQNHMP-VVEYQSRCSLPQR-AQSLDRFRKKRNARCFEKKVRYGVRQEVALRM
ZmZIM91 --------LGGASSSAPYSKRLNYPHR-VASLMRFREKRKERNFDKKIRYSVRKEVALRM
ZmZML3 --------LSGASSSAPYSKRLNFPHR-VASLMRFREKRKERNFDKKIRYNVRKEVALRM
ZmZML1 --------VNMAVSSANDEKNTTVAARRVASLMRFREKRKERCFDKRIRYSVRKEVAQKM
. .. . . * ** ***:**: * *:* :** **:*** :*
Jas DOMAIN/CCT DOMAIN
AtZML1 QRKKGQFTSAKSSNDDSGSTGSDWGSNQSWAVEGTETQKPEVLCRHCGTSEKSTPMMRRG
AtZML2 QRNKGQFTSAKSNNDEAASAGSSWGSNQTWAIESSEAQHQEISCRHCGIGEKSTPMMRRG
AtZIM ARNKGQFTSSKMTDG-AYNSGTDQDS-------AQDDAHPEISCTHCGISSKCTPMMRRG
ZmZIM91 QRNRGQFTSSKPKPDEIAASEMASADGSPNWALVEGRPPSAAECHHCGTNATATPMMRRG
ZmZML3 QRNRGQFTSSKPKPDEIAASEMAAADGSLNWALVEGRPPSAAECHHCGINATATPMMRRG
ZmZML1 KRRKGQFAG---RSDFGDGACSSAACGSP--ANGEDDHFRETHCQNCGISSRLTPAMRRG
*.:***:. . : * :** . ** ****
GATA DOMAIN
AtZML1 PDGPRTLCNACGLMWANKGTLRDLSKVPPP-----------QTPQHLSLNKNEDANLEAD
AtZML2 PAGPRTLCNACGLMWANKGAFRDLSKASP------------QTAQNLPLNKNEDANLETD
AtZIM PSGPRTLCNACGLFWANRGTLRDLSKKTEENQLALMKPDDGGSVADAANNLNTEAASVEE
ZmZIM91 PDGPRTLCNACGLMWANKGLLRDVTKSPVPLQATQS-----APHLDGGNGSAMSAPGSEL
ZmZML3 PDGPRTLCNACGLMWANKGLLRDLSKSPVPLHSIQQS----APILNGGNGSAMSALGSEL
ZmZML1 PAGPRSLCNACGLMWANKGTLRSPLNAPKMTQQLLAN----PCNMVDTDDKNSNVLPVEH
* ***:*******:***:* :*. : . . ..

AtZML1 QMMEVTGDISNTQ-------------------
AtZML2 HQIMITVANDISNSQ-----------------
AtZIM HTSMVSLANGDNSNLLGDH-------------
ZmZIM91 ENAAAAMTNGHESSSSGV--------------
ZmZML3 ENAAAAMGNGHEP-------------------
ZmZML1 NQATPKTDSMMPKEEQKLDIRLPTEEDTKAVS

Figura 3-6. Alineamiento entre las proteínas ZIM de Arabidopsis y ZML de maíz.
En color rojo se enmarcan los dominios conservados entre ambas especies. Los
aminoácidos correspondientes al dominio Jas, están inmersos dentro del dominio CCT,
y son señalados en blanco.

58
Capítulo I

Figura 3-7. Identificación de motivos de represión putativos en el dominio TIFY de

las proteínas ZML de maíz. En la imagen se muestra la posición de los dos motivos de
represión putativos que fueron identificados en el dominio TIFY de ZmZIM91, el
motivo LTLSFQGEV y el motivo VLLLLG.

Se ha descrito que el dominio TIFY en los JAZ de Arabidopsis, es el responsable de la

dimerización de estas proteínas (Melotto et al., 2008; Chini et al., 2009). En este trabajo
se llevaron a cabo experimentos de Complementación Bimolecular (BiFC) en
protoplastos de maíz y ensayos de doble híbrido para determinar la capacidad de
ZmZIM91 para dimerizar y con ambos experimentos se confirmó que ZmZIM91 al
igual que los JAZ podía dimerizar (Figura 3-8).

A
YFPN ZmZIM91 + YFPC ZmZIM91

B
YFPN ZmZIM91 + YFPC VECTOR

-LT -LTHA
YFPN VECTOR + YFPC ZmZIM91

Figura 3-8. ZmZIM91 es capaz de formar dímeros. (A) En el primer panel, se

observa la Complementación Bimolecular entre 35S::YFPN-ZmZIM91 y 35S::YFPc-
ZmZIM91 usando protoplastos de maíz, y en los paneles posteriores se muestran los
controles negativos realizados con los vectores vacíos para dicho experimento. En (B)
Se muestra el doble híbrido efectuado para confirmar la dimerización de ZmZIM91
usando las construcciones T7::ZmZIM91:PGADT7 y T7::ZmZIM91:PGBKT7. Para
todos los paneles de imágenes en A, Bar = 10µm.

59
Capítulo I

Para el análisis de la secuencia del dominio Jas de ZmZIM91, se llevó a cabo un

alineamiento con el dominio Jas de las proteínas AtJAI3, AtJAZ1 y AtZML2 de
Arabidopsis y ZmZIM91 de maíz (Figura 3-9). Los resultados mostraron que entre
ambas especies, la región α-hélice está más conservada que la región de bucle o “loop
region” ELPIARR que se ha demostrado que es el consenso responsable de la
interacción de los JAZ con el receptor de hormona COI1, además en el caso de las
proteínas ZmZIM91 y AtZML2 se observa que ambas carece de la secuencia canoníca
del loop region y en cambio los aminoácidos que se encuentran en dicha posición son
YPHRVA para ZmZIM91 y IPQRLA para AtZML2.

Figura 3-9. Alineamiento entre los dominios Jas de las proteínas AtJAI3, AtJAZ1,
AtZML2 y ZmZIM91. La región α-hélice “α-helix region” presenta mayor grado de
conservación que la “loop region”. Esta región cumple un papel fundamental en la
interacción con el receptor E3 ubiquitina ligasa COI1, responsable de la degradación de
las proteínas JAZ en Arabidopsis vía el proteasoma 26S.

Con el fin de estudiar el papel de los ZML en la vía de señalización por ácido
jasmónico, se clonaron AtZIM, AtZML1 y AtZML2 en los vectores de expresión
pGBKT7 y pGADT7, que fueron utilizados para realizar experimentos de doble híbrido
en levadura, en los que se estudió la interacción de las proteínas de la subfamilia ZML
de Arabidopsis con JAI3, JAZ1, JAZ9 y COI1 de Arabidopsis (Figura 3-10). En estos
ensayos se pudo determinar que ZIM no interacciona con JAI3, JAZ1 y JAZ9, que
ZML1 podía interaccionar con JAI3, mientras ZML2 interaccionó con JAZ1, JAI3 y
JAI3fr5C que es una versión truncada de JAI3 que solo tiene el dominio Jas. Por otra
parte, ninguno de los miembros de la subfamilia ZML de Arabidopsis fue capaz de
interaccionar con AtCOI1, ni en presencia de altas concentraciones de CORONATINA.

60
Capítulo I

Figura 3-10. Estudio de las interacciones entre las proteínas ZML, JAZ1, JAI3,
JAZ9 y COI1 de Arabidopsis. En el panel superior se observa las interacciones entre
las proteínas ZML y JAZ1, JAZ9, JAI3 y las versiones truncadas de JAI3: JAI3fr4
(versión que contiene solo el dominio ZIM, en color azul) y JAI3fr5C (versión que
contiene solo el dominio Jas, en color rojo). En el panel inferior, es presentado el
resultado del experimento de doble híbrido, el cual muestra que los ZML de
Arabidopsis no pueden interaccionar con COI1 de Arabidopsis en presencia de 100 µM
de CORONATINA. (En colaboración con el Dr. Andrea Chini, investigador
postdoctoral en el laboratorio del Dr. Roberto Solano, Centro Nacional de
Biotecnología-CSIC, Madrid).

Por otra parte, durante el análisis de los dominios Jas y CCT, fueron identificados
dominios putativos de señales de localización nuclear (Nuclear Localization Signal,
NLS). El primero se encontró entre los aminoácidos 202–204
(PHRVASLMRFREKRKERNFDKKIRYSVRK) y acompañado de un grupo de
residuos básicos antes y después del dominio putativo de la señal de localización
nuclear, este clúster KRK fue identificado por primera vez por Boulikas (1994). La
segunda señal de localización nuclear, fue ubicada entre los aminoácidos 197 y 205

61
Capítulo I

(MRFREKRKE) y clasificada como una NLS altamente básica (Boulikas, 1994),

además este dominio putativo de señal de localización nuclear (XRXRXKRXE) fue
originalmente identificado en el primer Zinc Finger de la proteína humana MBP-1
(Baldwin et. al, 1990). Cabe anotar, que aunque similares NLS han sido identificadas en
el extremo C-terminal en la región Zinc Finger de factores de transcripción de humano,
rata, pollo y levadura, que además ha sido descrito que estas proteínas pueden funcionar
como activadores (Boulikas, 1994), en la proteína ZmZIM91 no se localizan en la
región Zinc Finger.

En el dominio N-terminal de la proteína ZmZIM91 también fue identificado un dominio

putativo de NLS y otro dominio putativo de señal de exportación nuclear (Nuclear
Export Sequence, NES). La NLS que corresponde a la secuencia KPYQPRRGPER, fue
localizado entre los aminoácidos 8 y 18, un dominio similar fue identificado por Chang
et al. (1990), en un factor de transcripción de ratón AGP/EBP. El dominio putativo de
NES en este extremo N-Terminal, se ubicó entre los aminoácidos 41 y 62, el cual
corresponde a la secuencia LVAAAAEAEALNRFAAEQQQQL (Cressman et al.,
2001).

Con el fin de determinar si el motivo putativo de NES era funcional, el N-terminal de

ZmZIM91 fue clonado en los vectores pCambia 1303 (GUS-GFP) y pCambia 1302
(GFP).

Se realizó un ensayo de bombardeo de células de cebolla utilizando las construcciones

35S::N-terZmZIM91:GFP-GUS y 35S::GFP-GUS. Como resultado se obtuvo que el N-
terminal de ZmZIM91 podía estar tanto en núcleo como en citoplasma (Figura 3-11 A),
mientras que el vector vacío (35S::GFP-GUS) presentaba una localización
citoplasmática propio del vector pCambia 1303. Este experimento permitió confirmar
los resultados obtenidos en un experimento preliminar de transfección de hojas de
tabaco con el N-terminal de ZmZIM91 clonado en el vector pCambia 1302 (GFP)
donde se había detectado que el N-terminal de ZmZIM91 se localizaba tanto en núcleo
como en citoplasma (Figura 3-11 B) al igual que el vector vacío pCambia 1302.

62
Capítulo I

GFP GUS

Pcambia 1303 Vector solo

a b

N-Ter
ZmZIM91 GFP GUS

N-Terminal
ZmZIM91_Pcambia
1303 c d
B

GFP

Pcambia 1302 Vector solo

a b

N-Ter
ZmZIM91 GFP

c d
N-Terminal
ZmZIM91_Pcambia
1302

e f

Figura 3-11. Localización de N-terminal de ZmZIM91 en células de cebolla y

tabaco. En (A) se observa el experimento llevado a cabo en células de cebolla. En el
panel superior (a) se puede observar la localización del vector pCambia 1303 (GUS-
GFP), la GFP está localizada solo en el citoplasma; en b se muestra la célula. En el
panel inferior (c), se encuentra la imagen del N-terminal de ZmZIM91, localizado tanto
en el núcleo como en el citoplasma; en d se enseña la célula. En (B) se muestra el
experimento realizado inicialmente en hojas de tabaco. En el panel superior (a y b) se
puede observar la localización del vector pCambia 1302 (GFP), la GFP está localizada
tanto en núcleo como en el citoplasma. Posteriormente en los paneles de la parte
inferior, se encuentra un panorama de células donde se puede ver la localización del N-
terminal de ZmZIM91 en el núcleo y en el citoplasma (c y d), a continuación se enseña
una ampliación de una célula que sobre expresaba el N-terminal de ZmZIM91 donde se
evidencia la localización núcleo-citoplasma (e y f). Para B, paneles a, b, c, d, e, f Bar =
20µm.

63
Capítulo I

3.1.5 ZmZIM91 se degrada en presencia de metil jasmonato por la vía del

proteasoma 26S

La estabilidad de ZmZIM91 fue investigada en respuesta a metil jasmonato usando

protoplastos de maíz que sobre expresaban la proteína ZmZIM91 fusionada a GFP y
realizando el seguimiento de una célula con microscopio confocal. La señal de GFP fue
detectada en el núcleo bajo condiciones control a tiempo 0 minutos, 30 minutos y 1
hora, mientras que con aplicación de 25 µM de metil jasmonato a 1 hora la señal de
GFP desaparece en gran medida. Por otra parte, cuando se aplicó a los protoplastos 25
µM de metil jasmonato y 5 µM de MG132 (inhibidor específico del proteasoma 26S), se
observó mayor conservación de la fluorescencia que en las muestras tratadas sólo con
metil jasmonato (Figura 3-12).

0 minutos 30 minutos 60 minutos

Control MeJA MeJA+MG132
CONTROL
ZmZIM91_C-GFP

MeJA 25 µM

60 min
MeJA 25 µM+MG132
5µM

0 0,5 1 1,5

Figura 3-12. Ensayo de degradación por metil jasmonato en protoplastos de maíz

de ZmZIM91_C-GFP. En el panel izquierdo, se puede observar las imágenes de
protoplastos sin tratar (control), y tratados con 25 µM de metil jasmonato y 25 µM de
metil jasmonato y 5 µM de MG132. En el panel derecho, se muestra la cuantificación de
la GFP de tres replicas biológicas independientes mediante el uso del software ImageJ,
la normalización se hizo con respecto al ratio de cambio de la fluorescencia al tiempo
cero. Para todos los paneles de imágenes Bar = 10µm.

La degradación de la proteína ZmZIM91 se desencadena mediante la relocalización de

dicha proteína dentro del núcleo en gránulos. En el ensayo de degradación efectuado

64
Capítulo I

aplicando MeJA a 1 hora en protoplastos de maíz que sobre expresaban la proteína

ZmZIM91 fusionada a GFP, se pudo observar que en el 50% de los casos la
degradación llevaba a la formación de un gránulo y en el otro 50% había formación de
más de dos (Figura 3-13).

Célula Detalle del núcleo

MeJA 25µM 60 minutos

a b
ZmZIM91_C-GFP

c d
Control DMSO 60 minutos

e f

Figura 3-13. Formación de gránulos después de la aplicación de MeJA en

protoplastos de maíz sobre expresando la proteína ZmZIM91 fusionada a GFP
(60X). (a) y (c) muestran protoplastos expresando 35S::ZmZIM91:GFP después de 1
hora con tratamiento de 25 µM de MeJA y en (b) y (d) se puede observar el detalle de
los núcleos de estos protoplastos y la formación de gránulos por efecto del tratamiento
con de MeJA. En (e) y (f) se presenta el control de 35S::ZmZIM91:GFP con DMSO,
tanto en un protoplasto completo como en la ampliación de su núcleo. Para a, c y e Bar
= 10µm

Existen diferentes tipos de gránulos, por ejemplo los gránulos que corresponden a
estructuras subnucleares que están enriquecidas en factores de transcripción RNA pre
mensajeros y están localizados en regiones intercromáticas (Lamond y Spector, 2003).
Para verificar la localización de los gránulos formados por la proteína ZmZIM91
después del tratamiento con MeJA, se llevó a cabo un experimento de transfección en
tabaco, después de tres días de agroinfiltración y se realizó aplicación de 100 µM de

65
Capítulo I

MeJA, posteriormente se adicionó DAPI para determinar la localización de los gránulos

formados tras el tratamiento, lo que se observó es que estos gránulos se localizan en la
región de la intercromatina (Figura 3-14).

ZmZIM91_C-GFP

CONTROL DMSO MeJA 100 µM DAPI MERGED

a b c d

e f g h

Figura 3-14. Células de tabaco conteniendo la proteína ZmZIM91 fusionada a

GFP y tratadas con 100 µM de MeJA a una hora. En los paneles (a) y (b) se observa
la proteína 35S::ZmZIM91:GFP en condiciones control con DMSO. En (b) y (f) se
muestra el canal con la GFP, donde se presenta la proteína ZmZIM91 después de 1 hora
de tratamiento con 100 µM de MeJA. En (c) y (g) se muestra el canal del DAPI, donde
se puede observar núcleo marcado con dicha tinción. Y finalmente en (d) y (h) se
encuentra la imagen de colocalización entre el canal del DAPI y el de GFP que es el que
presenta la proteína ZmZIM91 después del tratamiento con MeJA a 1 hora, se observa
la localización de los gránulos en la intercromatina. Para el panel a y el e Bar = 20µm;
para los paneles b, c, d, f, g y h Bar = 10µm.

El análisis de la expresión de la proteína ZmZIM91 también se estudio en planta, para

ello, se realizaron experimentos de western blot con aplicación de de metil jasmonato y
MG132 en hojas de plantas de maíz de 9 días y se detectó la respuesta de ZmZIM91 a
estos tratamientos usando el anticuerpo endógeno contra ZmZIM91 generado en este
trabajo. La sección de la hoja usada para la realización de los western blot fue
determinada por datos in silico encontrados en la literatura de microarrays y RNA-Seq
de ZmZIM91 (Figura 3-15A y 3-15B) (Sekhon et al., 2011 y Li et al., 2010).

66
Capítulo I

En las muestras tratadas con 0,01% de metil jasmonato, a 30 minutos se puede ver un
incremento de la proteína, mientras que a 1 hora se observa la degradación de la
proteína. Al adicionar el inhibidor del proteasoma 26S (100 µM de MG132), a 1 hora
después de la aplicación del tratamiento, se ve que la proteína ZmZIM91 se conserva
(Figura 3-16). Los resultados indican que el proteasoma 26S media la degradación de
ZmZIM91 en respuesta a metil jasmonato, al igual que lo hace en el caso de las
proteínas JAZ de Arabidopsis (Chini et al., 2007; Yan et al., 2007; Thines et al., 2007)
y además confirma los resultados obtenidos en los protoplastos de maíz presentados
anteriormente.

A B

ZmZIM91
ZmZML3

Figura 3-15. Datos de RNA-Seq encontrados para ZmZIM91 y usados para la

selección del tejido para el análisis de la proteína por western blot. (A) Datos
derivados del Atlas del Genoma de maíz (de la transcripción global durante el desarrollo
en maíz), solo para dos miembros de la familia ZML en maíz, ZmZIM91 y ZmZML3
(Sekhon et al., 2011). (B) Datos de RNA-Seq para ZmZIM91 del estudio de Li et al.,
2010.

67
Capítulo I

DMSO Control MeJA

0.5 h
0.5 h
0h

1h
1h
Anti_ZmZIM91

β-Actin

DMSO Control MeJA+MG132

0.5 h
0.5 h
0h

1h
1h
Anti_ZmZIM91
β-Actin

Figura 3-16. Respuesta en plantas silvestres de ZmZIM91 a tratamientos con metil

jasmonato y metil jasmonato e inhibidor del proteasoma 26S (MG132). En plantas
tratadas con 0,01% de MeJA, ZmZIM91 es degrada a 1 hora, mientras que en plantas
bajo tratamientos con 0,01% de MeJA y 100 µM de MG132, la proteína ZmZIM91 se
conserva 1 hora después.

3.1.6. Identificación del consenso in vitro de unión a ADN para las proteínas
ZmZIM91 de maíz y AtZIM de Arabidopsis mediante la técnica protein-binding
microarray (PBM11)

Para determinar la unión específica a ADN de los putativos factores de transcripción

putativos AtZIM de Arabidopsis y ZmZIM91 de maíz, primero fueron sobre expresadas
en E.coli tanto la proteína AtZIM como un clon de ZmZIM91 que contenía los
dominios conservados incluyendo el dominio putativo de unión a ADN, GATA-Zinc
Finger. Ambas proteínas estaban fusionadas al tag Maltose Binding Protein (MBP).
Para la realización del experimento en primer lugar se hizo un western usando el
anticuerpo de la MBP para verificar óptima sobreexpresión de ambas proteínas y su
unión al tag de la MBP. A continuación, se procedió a la identificación de los sitios de
unión a ADN de AtZIM y ZmZIM91 mediante la técnica unión de proteínas a un chip
de ADN “protein-binding microarray” (PBM11). El gran número de secuencias que
contiene el chip PBM11 permite la cuantificación precisa y a gran escala de los sitios de

68
Capítulo I

factores de transcripción, superando los métodos anteriores de identificación de

elementos en cis de unión de factores de transcripción (Godoy et al., 2011). El
experimento arrojó como resultado dos probables consensos de unión de ADN tanto
para ZmZIM91 como para AtZIM. Para ambas proteínas los consensos identificados
fueron los mismos: GATC con un 100% y GATA con un 50% (Figura 3-17).

A B
0.4
ZmZIM91

E-score
0.2

0.0

ZIM ZIM
-0.2 ZmZIM91

GATC GATA GTAC PBM

C D
0.50 0.50

0.25 0.25
E-score

E-score

0.00 0.00

-0.25 -0.25
ZIM
ZmZIM91 ZIM
-0.50
ZmZIM91
-0.50
PBM
TGATCA
CGATCG

CGATCC
CGATCA
CAGATC

AGATCC
AGATCT

AGATCG

GGATCC
AGATCA

GGATCA

CAGATA

CGATAA
TGATAA

AGATAA
AGATAT

AGATAC

CGATAC
CGATAG

AGATAG

GGATAA

PBM
GGATAC
Figura 3-17. Identificación de los motivos in vitro de unión a ADN de AtZIM y
ZmZIM91. (A) Representación de la matriz de posición de peso correspondiente a
ZmZIM91 y AtZIM. Ambas proteínas muestran alta afinidad de unión al elemento 5’-
AGATCT-3’, seguido por el elemento 5’-GATATC-3’. (B) Diagrama de caja de
enriquecimiento de todos los posibles 6-mers que contienen el consenso de 4-mer
indicado. Las cajas representan cuartiles desde 25% a 75%, y la línea negra representa
la distribución media (cuartil 50%). Las barras indican cuartiles de 1 a 25% (arriba) y 75
a 100% (a bajo) y los puntos denotan los valores extremos de la distribución. Las cajas
en azul corresponden a AtZIM y las verdes a ZmZIM91. Ambas proteínas presentan alta
y similar afinidad por el consenso 5’-GATC-3’ y de baja a media por el elemento 5’-
GATA-3’ y una no unión a un irrelevante elemento 5’-GTAC-3’. PBM indica la
distribución de los puntajes (E-scores) de todos los posibles 6-mers representados en el
microarray. (C) El diagrama de caja de puntajes (E-scores) de todos los posibles 8-mers
que contienen los 6-mer del consenso 5’-AGATCT-3’. Ambas proteínas muestran
afinidades similares por el elemento indicado. (D) El diagrama de caja de puntajes (E-
scores) de todos los posibles 8-mers que contienen los 6-mer del consenso 5’-
GATATC-3’. Ambas proteínas muestran afinidades similares por el elemento indicado
(En colaboración con el Dr. José Manuel Franco, la Dra. Irene Vidrieros y el Dr.
Roberto Solano. Servicio de Genómica del Centro Nacional de Biotecnología-CSIC,
Madrid).

69
Capítulo I

3.1.7 Regulación de ZmZIM91 por la proteína quinasa CK2 de maíz

Como ya se había mencionado anteriormente en la introducción de esta investigación,

un clon parcial de ZmZIM91 fue identificado en un trabajo previo mediante la técnica
de doble híbrido mediante un cribado de hoja de maíz estresada por sequía usando la
subunidad reguladora CK2β1 de la proteína quinasa CK2. Por tal motivo, se procedió a
realizar experimentos de interacción y fosforilación de ZmZIM91 con CK2 para
confirmar si la proteína ZmZIM91 era tanto un interactor de dicha quinasa como un
sustrato.

3.1.7.1 Interacción de ZmZIM91 con las subunidades reguladoras CK2β1, CK2β2,

CK2β3 y la catalítica CK2α1

Para confirmar la interacción entre ZmZIM91 y CK2β, se utilizó la técnica de

Complementación Bimolecular (BiFC) en hojas de tabaco, usando las construcciones
35S::YFPN-ZmZIM91 y 35S::YFPC-CK2β1. Los resultados mostraron que ZmZIM91
era capaz de interaccionar con la subunidad reguladora CK2β1. Los controles negativos
de ambas proteínas con el vector vacío fueron negativos. Además para verificar la
interacción, se utilizó la técnica de pull down para lo que ZmZIM91 fue traducida in
35
vitro y etiquetada con metionina marcada con S ([35S]-Met), y las subunidades
reguladoras CK2β1, CK2β2, CK2β3 y la subunidad catalítica CK2α1 fue expresada en
bacteria y purificada de acuerdo con un protocolo estándar. Como resultado se obtuvo
que ZmZIM91 podía interaccionar no sólo con CK2β1, CK2β2, CK2β3 sino también
con CK2α1 (Figura 3-18).

70
Capítulo I

A
35S::ZmZIM91:GFP 35S::YFPN ZmZIM91+35S::YFPC CK2β1

35S::CK2β1:GFP

B Proteínas
Fusionfusionadas
proteins

β1 β2 β3 α GST
ZmZIM91.1
ZmZIM91

Figura 3-18. ZmZIM91 interacciona con la proteína quinasa CK2 de maíz. En (A)
utilizando la técnica de complementación bimolecular en hojas de tabaco, se muestra la
interacción entre ZmZIM91 y CK2β1. En la parte izquierda, se muestra la localización
tanto de 35S::ZmZIM91:GFP como de 35S::CK2β1:GFP y en la parte derecha la
interacción entre ambas proteínas (núcleo y panorama respectivamente). En (B) se
enseña la interacción entre ZmZIM91 y CK2β1, CK2β2, CK2β3 y CK2α1 mediante un
experimento de pull down, el control negativo con la GST sola no presenta interacción.

3.1.7.2 CK2β1 y CK2β2 son capaces de relocalizar a ZmZIM91 en gránulos en el

núcleo

Ya que la interacción entre ZmZIM91 y CKβ1 se localizó en gránulos en el núcleo, se

consideró interesante estudiar si la subunidad reguladora de la proteína quinasa CK2 era
capaz de relocalizar a la proteína ZmZIM91 que en condiciones normales está
localizada en el núcleo. Por tal motivo, se usaron tres subunidades reguladoras CK2β
con un tag MYC y ZmZIM91 con un tag de GFP. La finalidad de este experimento de
co-transformación era poder observar el efecto que causan directamente estas
subunidades reguladoras en la localización subcelular de ZmZIM91 ya que la
fluorescencia que se observa corresponde solo a dicho factor.

El experimento fue realizado en hojas de tabaco, agroinfiltrando las siguientes

combinaciones de construcciones: 35S::ZmZIM91:GFP y 35S::CKβ1:MYC,

71
Capítulo I

35S::ZmZIM91:GFP y 35S::CKβ2:MYC y 35S::ZmZIM91:GFP y 35S::CKβ3:MYC.

Los resultados obtenidos mostraron que tanto CKβ1 como CKβ2 son capaces de
relocalizar a ZmZIM91 en gránulos en el núcleo, mientras que CKβ3 no lo puede hacer
con tanta eficiencia, lo que conlleva a pensar que ZmZIM91 tiene más afinidad por
CKβ1 y CKβ2 (Figura 3-19A).

También fueron realizados controles de este experimento (Figura 3-19B), donde se

puede observar que el vector MYC solo, no afecta la localización de ZmZIM91 que
permanece localizado en el núcleo, por tanto, efectivamente son CKβ1 y CKβ2 las que
pueden relocalizar a ZmZIM91. También se muestra la localización subcelular de
35S::CKβ1:GFP, 35S::CKβ2:GFP y 35S::CKβ3:GFP, donde se puede ver que las dos
primeras subunidades están localizadas en gránulos en el núcleo, mientras que la tercera
está tanto en núcleo como en citoplasma.

72
Capítulo I

a b c
B

d e f
C

g h i

Figura 3-19A. CKβ1 y CKβ2 son capaces de relocalizar eficientemente en el núcleo

a ZmZIM91. Para la realización de este experimento se transfectaron hojas de tabaco
con 35S::ZmZIM91:GFP y 35S::CKβ1:MYC, 35S::ZmZIM91:GFP y 35S::CKβ2:MYC
y 35S::ZmZIM91:GFP y 35S::CKβ3:MYC. En (A) a y b muestran el panorama de
35S::ZmZIM91:GFP y 35S::CKβ1:MYC, y en c se observa la ampliación de un núcleo
con dichas construcciones, donde se puede ver que CKβ1 ha relocalizado a ZmZIM91
(que expresa la GFP) en gránulos en el núcleo de manera eficiente. En (B) d y e
muestran el panorama de 35S::ZmZIM91:GFP y 35S::CKβ2:MYC, y f la ampliación de
un núcleo, donde se puede ver que CKβ2 ha relocalizado a ZmZIM91 en gránulos en el
núcleo. En (C) en g y h se observa el panorama de 35S::ZmZIM91:GFP y
35S::CKβ3:MYC, y en i la ampliación de un núcleo, donde se puede ver que CKβ3 no
produce ningún efecto sobre ZmZIM91 y por tanto éste se mantiene difuso en el núcleo.
Para todas las imágenes Bar = 20µm.

73
Capítulo I

a b c
B

d e f
C

g h i
D

j k l

Figura 3-19B. Localización subcelular de las subunidades reguladoras CKβ1,

CKβ2 y CKβ3 y de ZmZIM91 con el vector vacío con un tag MYC. Para la
realización de este experimento se transfectaron hojas de tabaco con 35S::CKβ1:GFP,
35S::CKβ2:GFP, 35S::CKβ3:GFP y 35S::ZmZIM91:GFP con el vector vacío con un
tag MYC. En (A) a y b se muestra una célula sobre-expresando a 35S::ZmZIM91:GFP
con 35S::MYC, y en c la ampliación de un núcleo, donde se puede ver que el vector
vacío con el tag MYC no afecta la localización subcelular de 35S::ZmZIM91:GFP. En
(B) d y e muestran el panorama de 35S::CKβ1:GFP, y f la ampliación de una célula,
donde se puede ver que CKβ1 tiene localización en gránulos en el núcleo. En (C) g y h
muestran el panorama de 35S::CKβ2:GFP, en i se observa la ampliación de un núcleo,
donde se puede ver que CKβ2 tiene localización en gránulos en el núcleo. En (D) j y k
muestran el panorama de 35S::CKβ3:GFP, y l la ampliación de una célula, donde se
puede ver que CKβ3 tiene localización tanto nuclear como citoplasmática con algunos
gránulos. Para a, b, c, d, e, g, h, j, k, l Bar = 20µm; para f, i Bar = 10µm.

74
Capítulo I

3.1.7.3 La subunidad catalítica CK2α1 no puede relocalizar a la proteína

ZmZIM91

Experimentos realizados agroinfiltrando hojas de tabaco con 35S::ZmZIM91:GFP y la

Figura 3-22. La subunidad reguladora CK2β1 cambia la localización subcelular de

las proteínas CK2α1 y ZmZIM91. Para la realización de este experimento se
transfectaron hojas de tabaco con 35S::ZmZIM91:GFP, 35S::CK2β1:MYC y
35S::CK2α1:DsRed. En (A) se muestra un panorama de células que sobre-expresan
35S::ZmZIM91:GFP, 35S::CK2β1:MYC y 35S::CK2α1:DsRed, en a se muestra el
canal de la DsRed, en b el canal de la GFP, en c el merge de ambos canales. En algunas
células se pueden ver que la subunidad catalítica CK2α1 está aún en el nucléolo,
mientras en otras ya se ha desplazado al núcleo. En (B) se enseña la ampliación de un
núcleo que sobre-expresa 35S::ZmZIM91:GFP, 35S::CK2β1:MYC y
35S::CK2α1:DsRed, en e se puede ver el canal de la DsRed, en f el canal de la GFP, en
g el merge de ambos canales. En esta imagen se puede ver como la subunidad catalítica
CK2α1 sale del nucléolo y entra al núcleo. Para a, b, c Bar = 20µm; para d, e y f Bar =
10µm.

3.1.7.5 ZmZIM91 es sustrato in vitro de la proteína quinasa CK2 de maíz

Ya que anteriormente se demostró que ZmZIM91 era un interactor de la proteína

quinasa CK2, se realizaron experimentos de fosforilación in vitro para determinar si
además ZmZIM91 era sustrato de dicha quinasa (Figura 3-23). En primer lugar, fueron
localizados consensos putativos de fosforilación por CK2 en la secuencia aminoacídica
de ZmZIM91 (los cuales se muestran en la Figura 3-1). Se realizó un ensayo de
actividad quinasa in vitro y el resultado que se obtuvo fue que ZmZIM91 es sustrato in
vitro tanto de CK2α1 como del holoenzima CK2α1β1.

78
Capítulo I

GATA/Zinc
ZIM Jas CCT Finger
A N-Ter C-Ter
(TIFY)

P P P P

CK2α1 CK2 CK2α1 CK2 α1β1 ZmZIM91

α1β1 ZmZIM91 ZmZIM91

B
k Da

kDa
68
ZmZIM91
47 kDa
47 kDa
45
36

Figura 3-23. ZmZIM91 es sustrato in vitro de CK2α1 y el holoenzima CK2α1β1. En

(A) Se muestra la estructura con los dominios de ZmZIM91 y la localización dentro de
ellos de putativos consensos de fosforilación por la proteína quinasa CK2 de maíz. En
(B) se muestra a la izquierda la proteína T7::6xHis ZmZIM91 sobre expresada en E.coli
para el ensayo de fosforilación. El peso molecular de la proteína recombinante
ZmZIM91 fue calculado con la herramienta PI en EXPASY
(http://us.expasy.org/tools/pi_tool.html) y fue de 47 kDa. A la derecha se enseña el
resultado del experimento, donde se puede concluir que ZmZIM91 es sustrato tanto de
la subunidad catalítica CK2α1 como del holoenzima CK2α1β1. Como control positivo
se usó el holoenzima CK2α1β1 que se autofosforila y también se enseñan los controles
negativos CK2α1 y ZmZIM91 solos donde se observa que no hay señal.

3.1.7.6 La fosforilación in vivo de ZmZIM91 por la proteína quinasa CK2 de maíz

es afectada mediante tratamientos con MeJA

Con el fin de conocer si ZmZIM91 era sustrato in vivo de la proteína quinasa CK2, se
realizaron ensayos quinasa en gel los cuales permitieron detectar la actividad de
proteínas quinasas nativas que fosforilan a ZmZIM91. A diferencia del ensayo de
fosforilación in vitro, la señal detectada en el ensayo en gel aparece en el lugar
correspondiente a la/s quinasa/s y no al sustrato.

Ya que los resultados expuestos hasta el momento indican que la proteína ZmZIM91
está afectada por MeJA, se quiso determinar si la fosforilación de ZmZIM91 por CK2

79
Capítulo I

variaba en presencia de MeJA. Para esto, se procedió a realizar el ensayo quinasa en gel
utilizando extractos de raíz de plántulas de maíz de 6 días tratados con 100 µM de
MeJA y como extractos de raíz de plántulas de maíz de 6 días con DMSO (debido a que
el MeJA estaba diluido con DMSO). Los extractos fueron tomados a diferentes tiempos:
0 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 1 hora y 4 horas. En este experimento, se usó
también 5,6-dicloro-1-(b-d-ribofuranosil) benzimidazol (DRB), un inhibidor específico
de CK2 que permitiría ubicar la banda exacta correspondiente a CK2 para hacer los
respectivos análisis de su comportamiento de fosforilación de ZmZIM91 bajo
tratamientos con MeJA (Meggio et al., 1990; Szyszka et al., 1995).

Los resultados obtenidos en el caso del gel que no fue tratado con el inhibidor de CK2,
exhiben un incremento de fosforilación de la muestra tratada con MeJA a 30 minutos en
comparación con la control, mientras que a 1 hora de tratamiento con MeJA se observa
una disminución de la fosforilación, finalmente a las 4 horas tanto en la muestra tratada
como en la control se evidencia un incremento de la actividad de la CK2 (Figura 3-24,
parte A). Lo anterior, fue concluido con ayuda del gel hecho en paralelo con las mismas
condiciones que el anterior, pero tratado con 50 µM de DRB confirma que la banda que
se ve afectada por el tratamiento con MeJA, corresponde a la proteína quinasa CK2α
(Figura 3-24, parte B) ya que tiene un tamaño de 38 kDa y disminuye tanto en las
muestras tratadas como en las control.

80
Capítulo I

Control MeJA
IN GEL ZmZIM91

0 min 15 min 30 min 1 hora 4 horas 15 min 30 min 1 hora 4 horas

CK2
38 kDa.

B
Control MeJA
IN GEL ZmZIM91 +

0 min 15 min 30 min 1 hora 4 horas 15 min 30 min 1 hora 4 horas

DRB

CK2
38 kDa.

Figura 3-24. ZmZIM91 es sustrato in vivo de la proteína quinasa CK2 y es

regulada por esta quinasa bajo tratamiento con MeJA. Se usó la técnica de ensayo
de quinasa en gel. Se tomaron muestras tanto control como tratadas a 0 minutos, 15
minutos, 30 minutos, 1 hora y 4 horas. En (A) se muestra un gel que contienen la
proteína recombinante de ZmZIM91 purificada y extractos de raíz de plántulas de maíz
de 6 días tratadas con 100 µM de MeJA y como control muestras de raíz a los mismos
tiempos con DMSO, donde se puede observar que incrementa la actividad de CK2α a
30 minutos de tratamiento con MeJA, disminuye a 1 hora de tratamiento con MeJA y a
4 horas tanto en la muestra control como en la tratada con MeJA la fosforilación
incrementa. En (B) se observa un gel realizado con condiciones idénticas al anterior
pero que además fue incubado con 50 µM de DBR un inhibidor específico de la CKα.
En este gel se observa que la banda correspondiente a 38 kDa (CKα) disminuye en
todos los casos.

81
Capítulo I

3.2 Discusión de resultados

3.2.1 El dominio ZIM/TIFY en ZmZIM91

La familia TIFY específica de plantas está compuesta por cuatro subfamilias (TIFY,
PPD, JAZ y ZML) en Arabidopsis, que han sido implicadas en diferentes respuestas a
estrés (Ye et al., 2009), de las cuales la subfamilia JAZ ha sido la mejor caracterizada.
Sin embargo, pese a la importancia del maíz como cultivo para la alimentación y la
generación de biocombustibles y al impacto que puede tener tanto el estrés biótico como
abiótico en su producción, no había sido llevado a cabo un estudio de los TIFY en esta
especie. Uno de los principales aportes de esta investigación radica en ampliar el
conocimiento sobre la subfamilia ZML en maíz, en el cual han sido identificados tres
miembros de la subfamilia ZML (Bai et al., 2011), los cuales de acuerdo al árbol
filogenético muestran alta conservación con respecto a los homólogos en Arabidopsis.

Los miembros de la subfamilia ZML poseen cuatro dominios conservados: el TIFY, el

Jas, el CCT y el GATA-Zinc Finger (Bai et al., 2011), siendo este último exclusivo de
esta subfamilia ZML. ZmZIM91 al igual que los miembros de la subfamilia JAZ, tiene
localización nuclear, que es común para factores de transcripción, sin embargo antes del
presente trabajo no se había demostrado que ningún miembro de la familia TIFY fuera
un factor de transcripción y por tanto siempre se han referido a ellos como factores de
transcripción putativos.

Dentro de la caracterización de ZmZIM91 se analizaron los dominios conservados. En

el caso del dominio TIFY, se encontró que a diferencia de los otros miembros de las
subfamilias que conforman la familia TIFY (TIFY, PPD y JAZ), el consenso TIFYAG
no está conservado y en su lugar se encuentra la secuencia aminoacídica TLSFQ (Bai et
al., 2011). También se identificaron dos putativos consensos de represión dentro de este
dominio que son el XLLLXX (VLLLLG) y el LXLXFXGXV (LTLSFQGEV). El
dominio TIFY en la subfamilia JAZ también es el responsable de la dimerización de
estas proteínas, ya que se demostró que la proteína ZmZIM91 es capaz de dimerizar.
Seria interesante realizar un experimento que permita determinar si el dominio TIFY en
ZmZIM91 cumple un papel similar en la dimerización que el que desempeña en los
miembros de la subfamilia JAZ, a pesar no tener el consenso TIFYAG.

82
Capítulo I

3.2.2 La proteína ZmZIM91 se degrada en presencia de MeJA

La respuesta a estrés biótico causada por insectos herbívoros e infección por patógenos,
es mediada por una variedad de hormonas, entre las cuales está el jasmonato (Bari et al.,
2009; Pieterse et al., 2009). Los JAs juegan una amplia variedad de papeles en la
respuesta a herida y en la producción de metabolitos secundarios (Farmer et al., 1992;
Wasternack y Hause, 2002; Lorenzo y Solano, 2005; Shan et al., 2009). La
caracterización molecular de ZmZIM91 se llevo a cabo basándose en la información
disponible sobre los genes de la subfamilia JAZ de Arabidopsis, que como es conocido
han sido implicados en la respuesta a jasmonato, ya que su degradación es promovida
por esta fitohormona y es mediada por el complejo SCFCOI1, lo que a su vez elimina la
represión de factores de transcripción como MYC2 y MYC3 (Bai et al., 2011; Thines et
al., 2007; Yan et al., 2007; Melotto et al., 2008). En Arabidopsis la mayoría de los
genes JAZ son inducidos por infección con Pseudomonas syringae (Demianski et al.,
2012), lo que indica que esta subfamilia en Arabidopsis está involucrada en la
resistencia a patógenos, mientras que en uva bajo el mismo tratamiento el número de
genes que se indujeron fue reducido (Yucheng et al., 2012). Esta diferencia de respuesta
entre especies hace que sea relevante estudiar la regulación de la familia TIFY en otras
plantas de interés agronómico como es el caso del maíz.

Los resultados obtenidos en la primera parte de esta investigación muestran una

respuesta tardía de ZmZIM91 a tratamientos con MeJA, ya que se observa la
degradación de la proteína después de una hora de la aplicación del tratamiento, lo que
permite determinar que ZmZIM91 es estable en presencia de MeJA, sin embargo debido
a que experimentos preliminares de expresión de ZmZIM91 no revelaron cambios
significativos a nivel transcripcional de ZmZIM91 bajo tratamientos con MeJA, es
probable que el papel relevante de los ZML en respuesta a MeJA sea a nivel de
proteína. Por otra parte, un trabajo reciente a cerca de los genes de la subfamilia ZML
en uva, mostró que estos fueron inducidos por al menos un tipo de estrés abiótico
(Yucheng et al., 2012), este resultado sugiere que es relevante estudiar a ZmZIM91 en
relación a estos tipos de estrés en trabajos futuros.

También es necesario mencionar que en los tratamientos con MeJA en protoplastos

sobre-expresando ZmZIM91, éste se relocaliza dentro del núcleo en gránulos en la

83
Capítulo I

intercromatina, simultáneamente con su degradación. Los gránulos son estructuras

dinámicas, y tanto sus proteínas componentes como el ARN, pueden alternar
continuamente entre gránulos y otros lugares nucleares, incluidos los sitios activos de
transcripción (Spector y Lamond, 2011). Por tal motivo, podría ser interesante el estudio
de la composición y estructura de los gránulos que forma la proteína ZmZIM91 después
de la aplicación de MeJA, ya que podría ayudar a generar un modelo que permita
entender la maquinaria de degradación por MeJA y así mismo el papel de ZmZIM91 en
este proceso.

3.2.3 La variación de la secuencia en el N-teminal del dominio Jas de ZmZIM91

interviene en la interacción con COI1

El motivo LPIARR, el cual está localizado en el N-terminal del motivo Jas y que ha
sido descrito como el responsable de la interacción de los JAZ con COI1 en presencia
de la hormona JA-Ile (Pauwels y Goossens, 2011), está altamente conservado en
proteínas JAZ (JAZ1, JAZ2, JAZ3, JAZ9, JAZ10 Y JAZ12) que interaccionan
fuertemente con COI1, lo cual es consistente con la vida media de las proteínas JAZ
mediadas por JA (Chini et al., 2007; Thines et al., 2007; Chung y Howe, 2009;
Grunewald et al., 2009; Pauwels et al., 2010). La importancia del motivo LPIARR en la
degradación de los JAZ por tanto es muy relevante, lo que está respaldado por los
resultados obtenidos en el estudio realizado a JAZ8, ya que esta proteína carece de este
motivo, teniendo en su lugar la secuencia PKASM, lo cual no permite a JAZ8
interaccionar fuertemente con COI1 en presencia de JA-Ile, lo que trae como
consecuencia que JAZ8 sea más estable en presencia de la hormona (Shyu et al., 2012).

Experimentos de mutagénesis demostraron que las características únicas de JAZ8 son

atribuidas a la variación de la secuencia en la región bucle, al remplazar PKASM por
LPIAR, éste obtiene la capacidad de interaccionar con COI1 en presencia de JA-Ile y
decrece su estabilidad (Shyu et al., 2012). Estos resultados muestran que el motivo
LPIARR funciona in vivo como una parte critica del dominio Jas de los JAZ, que
confirman los estudios estructurales anteriores, sin embargo la no presencia del mismo
no es excluyente en cuanto a la degradación por JA como es el caso de JAZ8 (Sheard et
al., 2010). En el caso de ZmZIM91, el motivo LPIARR no está conservado, en su lugar
se encuentran los aminoácidos YPHRVA. Ensayos de doble híbrido entre los ZML y

84
Capítulo I

COI1 de Arabidopsis (Figura 3-10) al igual que inter-especie entre ZmZIM91 y COI de
Arabidopsis (Figura 3-25) en presencia de diferentes concentraciones de
CORONATINA mostraron que los ZML no son capaces de interaccionar con COI1. Sin
embargo sería interesante realizar el experimento de interacción entre ZmZIM91 y
ZmCOI1, con el fin de determinar si se trata de un mecanismo conservado entre
especies. También hay que tener en cuenta que la variación en el N-terminal del
dominio Jas de ZmZIM91, puede reflejar la existencia de una funcionalidad específica
para la subfamilia ZML.

-4

Figura 3-25. ZmZIM91 no es capaz de interaccionar con COI1 de Arabidopsis. En

el resultado del experimento de doble híbrido, se muestra que ni en presencia de altas
concentraciones de CORONATINA, ZmZIM91 puede interaccionar con COI1 de
Arabidopsis. Zm91FL es el clon completo de ZmZIM91 y Zm91p es el clon de
ZmZIM91 sin el N-terminal de la proteína (En colaboración con el Dr. Andrea Chini,
investigador postdoctoral en el laboratorio del Dr. Roberto Solano, Centro Nacional de
Biotecnología-CSIC, Madrid).

3.2.4 Señales de Localización Nuclear (NLS) y de Exportación Nuclear (NES) de la

proteína ZmZIM91

Los consensos putativos de localización nuclear encontrados en entre los dominios Jas y
CCT, pueden ser los responsables de la localización de ZmZIM91 en el núcleo, sin
embargo en su región N-terminal ZmZIM91 posee tanto un motivo putativo de Señal de
Localización Nuclear (NLS) como un motivo putativo de Señal de Exportación Nuclear
(NES) que también pueden ser relevantes.

85
Capítulo I

3.2.5 La proteína ZmZIM91 puede unir ADN

Estudios previos acerca de la subfamilia ZML en Arabidopsis, no habían demostrado

que estos fueran factores de transcripción porque no determinaron la funcionalidad de
su dominio GATA-Zinc Finger en la unión a ADN, con lo cual no se conocía si se
trataban de factores o co-factores de transcripción como los miembros de la subfamilia
JAZ. Por tanto, fue llevado a cabo para AtZIM y ZmZIM91 un ensayo in vitro de unión
de proteína a un chip de ADN, que permitió determinar que los miembros de la
subfamilia ZML tanto en Arabidopsis como en maíz son un grupo de factores de
transcripción que pueden unir directamente ADN, siendo capaces de reconocer los
motivos GATC y GATA (Figura 3-26). Además el hecho de que ambos homólogos
mostraran la misma preferencia y en iguales proporciones para los consensos
identificados, conlleva a pensar que se trata de un resultado sólido.

En mamíferos, el factor de transcripción GATA-1 que es requerido para el normal

desarrollo eritroide y megacariocítico, contiene dos Zinc Finger, el C-terminal finger, el
cual es conocido por unir motivos en ADN (A/T)GATA(A/G) y el N-finger, el cual
también es capaz de unir ADN pero reconociendo la secuencia consenso GATC
(Newton et al., 2001). Los factores GATA son una clase de reguladores
transcripcionales presentes en hongos, metazoos y plantas que normalmente reconocen
la secuencia consenso WGATAR (W = T or A; R = G or A; Lowry y Atchley, 2000).
En plantas, el motivo de ADN GATA ha sido implicado en el control de la transcripción
dependiente de luz y dependiente de nitrato (Reyes et al., 2004). La anterior
información está acorde con lo resultados obtenidos de unión a ADN de ZmZIM91 si se
tiene en cuenta que esta proteína contiene un dominio GATA-Zinc Finger y reconoce
una secuencia diana típico de este tipo de dominios.

86
Capítulo I

0.50

0.25
E-score

0.00

-0.25
GATC
GATA
-0.50

CGATCA
TGATCA

AGATCA
AGATCT

CGATCC
CGATCG

CAGATC

AGATCC
AGATCG

GGATCA

GGATCC

PBM
Figura 3-26. Diagrama de caja de puntajes (E-scores) de todos los 8-mers posibles
conteniendo los consensos de 6-mer indicados y reconocidos por AtZIM y
ZmZIM91. En verde están representados los puntajes correspondientes a los elementos
contenidos GATC y en azul están los puntajes de los mismos motivos conteniendo el
elemento GATA, donde el C en rojo fue remplazado por A (En colaboración con el Dr.
José Manuel Franco, la Dra. Irene Vidrieros y el Dr. Roberto Solano. Servicio de
Genómica del Centro Nacional de Biotecnología-CSIC, Madrid).

3.2.6 Modelos hipotéticos de regulación por MeJA de ZmZIM91

Los resultados obtenidos en el capítulo I del presente trabajo, permiten tener una
noción a cerca del modelo de comportamiento de ZmZIM91, por tal razón en esta parte
de la discusión se proponen dos modelos hipotéticos de regulación para ZmZIM91.

Pese a que los ZML no pueden interaccionar con COI1, es interesante tener en cuenta
que se ha demostrado que la proteína de ZmZIM91 es conservada in vivo por la
presencia de MG132, lo cual indica que se podría degradar vía proteasoma 26S. A pesar
de esto el mecanismo por el cual ZmZIM91 es degradado permanece desconocido como
en el caso de JAZ8 y otros JAZ de Arabidopsis, que se comportan de manera similar a
ZmZIM91 en presencia de MeJA.

Una de las hipótesis que se proponen para explicar el mecanismo por el cual se degrada
ZmZIM91 por MeJA, es que éste es eliminado por una vía independiente de COI1 que
tal vez está involucrado con otras proteínas F-box receptoras de JA. La vía en la cual

87
Capítulo I

este nuevo receptor funcionaría podría ser similar a la acción de COI1 sobre los
miembros de la familia JAZ que interaccionan fuertemente con COI1.

Otra hipótesis que se plantea es que la degradación de ZmZIM91 por MeJA vía el
proteasoma 26S, se lleve a cabo a través de la interacción con los JAZ, la cual fue
demostrada entre los ZML y JAZ de Arabidopsis. En el caso de ZML2 el dominio Jas
de JAI3 fue suficiente para que existiera la interacción de ambas proteínas, este es el
mismo caso de JAZ3 y MYC2 descrito por Chini et al. (2009), donde el dominio Jas
también fue suficiente para mediar la interacción independiente de la hormona JA entre
ambas proteínas. En conclusión, probablemente los JAZ interaccionen con los ZML y
en presencia de MeJA sean degradados por el proteasoma 26S en forma de una especie
de “complejo degradador” que incluiría a COI1.

3.2.7 La proteína ZmZIM91 interacciona y es fosforilada por la proteína quinasa

CK2

La proteína ZmZIM91 es tanto un interactor como substrato de CK2. El hecho de que

ZmZIM91 pudiera interaccionar con tres de las subunidades reguladoras de la CK2
(CK2β1, CK2β2 y CK2β3) y la subunidad catalítica CK2α1, pero que sólo CK2β1 y
CK2β2 pudieran relocalizar en gránulos en el núcleo a ZmZIM91, muestra
probablemente que tiene más afinidad con estas proteínas que con CK2β3. Con respecto
a que CK2α1 no pueda relocalizar a ZmZIM91 se puede decir que es de esperarse ya
que se ha visto en maíz que solo las subunidades reguladoras de la proteína quinasa
CK2 tienen la capacidad de transportar sus sustratos (Riera et al., 2011), mientras que
las subunidades catalíticas solo pueden fosforilar.

Los resultados también mostraron que el holoenzima CK2α1β1, relocalizaba a la

proteína ZmZIM91, probablemente la CK2 este interviniendo en la regulación de dicha
proteína para que cumpla funciones específicas en otros sitios diferentes de su
localización habitual en el núcleo cuando es fosforilada.

Por otra parte, los ensayos de fosforilación in vitro, evidenciaron que ZmZIM91 era
sustrato tanto de CK2α1 como del holoenzima CK2α1β1, lo que era esperado si se tiene
en cuenta que ZmZIM91 posee putativos consensos de fosforilación por CK2, sin

88
Capítulo I

embargo aún queda por determinar los residuos específicos de ZmZIM91que son
fosforilados por CK2.

3.2.8 La fosforilación de ZmZIM91 por la proteína quinasa CK2 es regulada por

estrés biótico y abiótico

Con el fin de estudiar las modificaciones postraduccionales, más específicamente la

fosforilación de ZmZIM91 bajo tratamientos, se uso el ensayo de quinasa en gel. El uso
del inhibidor específico de CK2 (DRB), permitió identificar la banda correspondiente a
CK2α con lo cual se pudo evaluar el comportamiento de dicha quinasa bajo el
correspondiente tratamiento.

Al realizar el experimento de fosforilación in vivo con aplicación de MeJA, lo que se

obtuvo fue un incremento de la fosforilación por CK2 a 30 minutos de tratamiento con
MeJA y una disminución de la fosforilación por CK2 a 1 hora. A pesar de que se trata
de un experimento realizado con raíces tratadas con MeJA y no con hojas como los
western, se puede observar una correlación de los datos obtenidos en ambos
experimentos, es decir que podría pensarse que la fosforilación por CK2 interviene en la
vida media de ZmZIM91 y su respuesta a MeJA.

En investigaciones anteriores también se ha demostrado la reducción de la fosforilación

por CK2 de proteínas bajo tratamientos con MeJA. En Arabidopsis fue llevado a cabo
una investigación para analizar las interacciones postraduccionales en las vías de
señalización por MeJA y SA, ambas hormonas median la fosforilación diferencial de
substratos por muchas familias de quinasas. También algunos substratos fueron
fosforilados diferencialmente, incluyendo péptidos derivados del fitocromo A y
proteínas del fotosistema II D (Ritsema et al., 2010).

Posterior al tratamiento con MeJA, se llevó a cabo el experimento de quinasa en gel con
muestras de raíz tratadas con sequía para evaluar el comportamiento de la fosforilación
de ZmZIM91 por CK2 en condiciones de estrés abiótico (Figura 3-27). Se observó que
en todos los casos la fosforilación de ZmZIM91 por CK2 incrementa, caso contrario al
presentado bajo tratamiento con MeJA. Sería interesante analizar el comportamiento de

89
Capítulo I

la proteína ZmZIM91 bajo sequía para determinar si existe alguna relación entre la
conservación o degradación de ZmZIM91 y su fosforilación por CK2.

Figura 3-27. ZmZIM91 es sustrato in vivo de la proteína quinasa CK2 y es

regulada por esta quinasa en sequía. Se usó la técnica de ensayo en gel. Se tomaron
muestras tanto control como tratadas a 0 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 1 hora y 4
horas. En (A) se muestra un gel que contienen la proteína ZmZIM91 y extractos de
raíces de maíz de 6 días tratadas con sequía, donde se puede observar que incrementa la
actividad de CKα en todas las muestras tratadas con respecto al control. En (B) Se
observa un gel que contiene la proteína ZmZIM91 y extractos de raíces de maíz de 6
días tratadas con sequía, además el gel fue incubado con 50 µM de DBR un inhibidor
específico de la CKα. Se observa que la banda correspondiente a 38 kDa (CKα)
prácticamente desaparece.

90
Capítulo II
Capítulo II

Capítulo II

4. Caracterización funcional de la proteína ZmZIM91 de maíz

4.1 Resultados

4.1.1 ChIP-Seq de ZmZIM91 a partir de protoplastos de maíz transfectados

Con el objetivo de conocer la función del factor de transcripción ZmZIM91, se buscó

identificar sus genes diana a nivel genómico para lo cual se llevó a cabo un experimento
de Inmunoprecipitación de la Cromatina seguida de secuenciación masiva paralela
(ChIP-Seq). Esta metodología combina una técnica ampliamente utilizada para el
estudio de las interacciones proteína-ADN in vivo con las nuevas tecnologías de
secuenciación masiva (Next Generation Sequence). En esta parte del trabajo, se
presentan los resultados del ChIP-Seq proveniente de protoplastos de maíz que sobre
expresaban tanto 35S::ZmZIM91:GFP como 35S::GFP, utilizando dos tipos de
anticuerpos: 1) el anti_ZmZIM91 (ver materiales y métodos) y 2) un anticuerpo
comercial contra la GFP (abcam).

4.1.1.1 Elaboración de ChIP utilizando protoplastos de maíz que sobre-expresaban

35S::ZmZIM91:GFP y 35S::GFP

Para la identificación de genes diana de ZmZIM91, se generaron anticuerpos contra la

proteína endógena de ZmZIM91. La efectividad para realizar inmunoprecipitaciones
con estos anticuerpos se validó utilizando ChIP de protoplastos de maíz que sobre-
expresaban la proteína ZmZIM91 fusionada a la GFP y como control de este ensayo se
usó ChIP de protoplastos que sobre-expresaban el vector de la GFP.

Dado que no existían trabajos previos acerca de la elaboración de ChIP usando

protoplastos, fue necesario realizar la puesta a punto del mismo. Para ello, se llevó a
cabo un primer experimento de ChIP usando protoplastos de maíz que sobre-expresaban
el vector de la GFP y se procedió a probar diversas condiciones de crosslinking (tiempo
de vacío, concentraciones adecuadas de cantidad de formaldehido y BSA), ya que este
es un paso fundamental para el funcionamiento del ChIP (Figura 4-1).

92
Capítulo II

B Input IgG GFP

Actina

Figura 4-1. Validación mediante PCR semi-cuantitativa de las condiciones óptimas

para la preparación de ChIP de protoplastos de maíz que sobre-expresaban
35S::GFP. En (A) se muestra la imagen de los protoplastos de maíz sobre-expresando
la GFP, usados para la puesta a punto del ChIP en protoplastos de maíz y en (B) se
observan los resultados de PCR semi-cuantitativa usando la actina como control (40
ciclos) para el Input, el anticuerpo secundario contra la IgG (control negativo) y el
anticuerpo de la GFP. Las PCRs semi-cuantitativas se realizaron en cuatro diluciones
seriadas del material inmunoprecipitado (1, 1/10, 1/100 y 1/1000). El anti_IgG fue
usado para determinar la inmunoprecipitación no específica. Las condiciones del
experimento fueron: 2.6 x105 protoplastos con una tasa de eficiencia de transformación
mayor del 65% + 1% de formaldehído + 2 µg de BSA.

Posteriormente, con las condiciones iniciales puestas a punto, se efectuó el ChIP usando
protoplastos de maíz transformados por una parte con 35S::ZmZIM91:GFP y por otra
con el vector 35S::GFP (Figura 4-2). Para las inmunoprecipitaciones de cada muestra se
utilizaron: 1) un anticuerpo contra la GFP (abcam), 2) los dos anticuerpos previamente
purificados de ZmZIM91 (anti_ZmZIM91#1 y anti_ ZmZIM91#2), 3) un anticuerpo
contra histona H3 (abcam) y 4) el anticuerpo secundario contra la IgG. Para evaluar la
calidad de los inmunoprecipitados con los diferentes anticuerpos usados, se realizaron
PCRs semi-cuantitativas de ChIP utilizando cebadores específicos para amplificar la
actina de maíz.

93
Capítulo II

A B ZmZIM91 GFP

Input
ZmZIM91_GFP

IgG

Anti_GFP

Anti_Histona
GFP

Anti-91#1

Anti-91#2

Figura 4-2. Validación de la técnica de ChIP de protoplastos mediante PCR semi-

cuantitativa. En el panel (A) se muestran los protoplastos de maíz sobre-expresando
35S::ZmZIM91:GFP y 35S::GFP (Control). En el panel (B) se presentan las PCRs
semi-cuantitativas usando la actina de maíz, para los inmunoprecipitados de
35S::ZmZIM91:GFP y 35S::GFP. Al lado izquierdo se etiqueta cada muestra: en primer
lugar el Input y posteriormente los inmunoprecipitados con el anti_IgG, el anti_GFP, el
anti_Histona (como control positivo de la inmunoprecipitación y funcionamiento del
ChIP), el anti-91#1 y el anti-91#2.

Los resultados obtenidos en este segundo ensayo de ChIP de protoplastos de maíz,

mostraron un comportamiento normal en el caso del Input de ambas muestras donde se
observó amplificación de actina. Con las inmunoprecipitaciones usando como control
negativo el anticuerpo secundario contra la IgG, no hubo amplificación de actina, lo que
indica la ausencia de inmunoprecipitación inespecífica en los protoplastos que sobre-
expresaban 35S::ZmZIM91:GFP y 35S::GFP.

En el caso de las inmunoprecipitaciones con el anticuerpo contra la GFP, en ZmZIM91

la actina no amplifica, mientras que en el del vector de GFP se observa una banda de
actina inespecífica, sin embargo como se trata de un control negativo no se considera
como un problema para continuar empleando la técnica de ChIP de protoplastos de
maíz.

Las PCRs semi-cuantitativas de actina realizadas usando las muestras

inmunoprecipitadas con el anti-91#1 y el anti-91#2, mostraron que en el caso de los
protoplastos transformados con la GFP, el anticuerpo 2 de ZmZIM91 era inespecífico

94
Capítulo II

ya que la actina se amplificó en este inmunoprecipitado, por tanto se decidió descartar

este anticuerpo y realizar las siguientes inmunoprecipitaciones con el anti-91#1.

Los inmunoprecipitados generados con el anticuerpo contra la histona, fueron usado

como control positivo del correcto funcionamiento de la inmunoprecipitación realizada
sobre los protoplastos de maíz transfectados, debido a que no se conocía un probable
gen diana de ZmZIM91. Al amplificar la actina en la PCR semi-cuantitativa de ChIP, se
concluye que la inmunoprecipitación funcionó correctamente tanto para los protoplastos
que sobre-expresaban 35S::ZmZIM91:GFP como para los que sobre-expresaban
35S::GFP. Además, es necesario tener en cuenta que en las inmunoprecipitaciones
usando el anticuerpo contra la histona deben estar inmunoprecipitada la actina, mientras
que en el caso de los anticuerpos contra la GFP y contra ZmZIM91 la presencia de
actina sería un indicador de inespecificidad.

4.1.1.2 Construcción de librerías a partir del ChIP de protoplastos de maíz usando

la tecnología de ILLUMINA-SOLEXA

Para la elaboración de las librerías de ChIP-Seq, el protocolo utilizado es el descrito en

los materiales y métodos. Tanto para la GFP como para ZmZIM91 se construyeron
librerías del Input, el inmunoprecipitado con el anticuerpo de la GFP y el
inmunoprecipitado con el anticuerpo contra ZmZIM91: anti-91#1 (Figura 4-3). Cada
librería fue elaborada con adaptadores que poseían distintos códigos de barra
(adaptadores) que permiten la identificación posterior de cada una de las muestras tras
la secuenciación.

Posteriormente a la construcción de las librerías, se llevó a cabo un análisis de la

calidad, cuantificación y distribución (entre 200 y 400 pares de bases) de las mismas
usando la tecnología del Bioanalyzer (Figura 4-4). De acuerdo a estos datos, se decidió
enviar a secuenciar 4 librerías: ZmZIM91_antiGFP, ZmZIM91_anti91, Vector
GFP_antiGFP, Vector GFP_anti91.

95
Capítulo II

Figura 4-3. Diagrama representando la construcción de la librería de ChIP de

protoplastos de maíz usando la tecnología Illumina/Solexa.

A
ZmZIM91_Input ZmZIM91_AntiGFP ZmZIM91_Anti91

Vector GFP_Input Vector GFP_AntiGFP Vector GFP_Anti91

Vector GFP_AntiGFP
ZmZIM91_AntiGFP

Vector GFP_Anti91
ZmZIM91_Anti91

Vector GFP_Input

library nM
ZmZIM91_Input

B C
ZmZIM91_Input
21.5
ZmZIM91_AntiGFP
0
ZmZIM91_Anti91
14.5
Vector GFP_Input
66.4
Vector GFP_AntiGFP
33.2
Vector GFP_Anti91
36.8

Figura 4-4. Control de la calidad y cuantificación de las muestras de las librerías

de ChIP de protoplastos de maíz, usando Bioanalyzer. En (A) se muestran los
diagramas de las imágenes generadas por bioanalyzer, en el caso de ZmZIM91_anti91,
GFP_antiGFP y GFP_anti91 se observa un pico de contaminación de aproximadamente
123 pares de bases. En (B) se puede ver la imagen del gel conteniendo cada una de las
librerías y en (C) se presenta la cuantificación de cada una de las librerías.

96
Capítulo II

Para la secuenciación por el sistema de Illumina fueron enviados aproximadamente

unos 20 ng de cada librería, sin embargo en el caso de la librería de ZmZIM91_antiGFP
probablemente la cantidad enviada para secuenciar fue menor debido a la baja
concentración de la muestra.

4.1.1.3 Mapeo de datos de lecturas cortas en el genoma de maíz e identificación de

picos.

Para el mapeo de las lecturas cortas en el genoma de maíz de la variedad B73 fue usado
el software BOWTIE (Langmead et al., 2009).

Los resultados obtenidos de la secuenciación de las librerías elaboradas con los

protoplatos transformados con el vector de GFP (control negativo), fueron de 56.543
lecturas que alineaban con el genoma de maíz para el inmunoprecipitado con el
antiGFP, mientras que para el anti91 fueron de 32.305 lecturas (Figura 4-5).

La secuenciación de las librerías de los inmunoprecipitados de lo protoplastos sobre-

expresando ZmZIM91 aportó los siguientes resultados: con el antiGFP se obtuvieron
1.062.351 de lecturas en contraste con las obtenidas para el anti91 que fueron 154.994,
probablemente porque esta última librería a diferencia de la primera, contenía un pico
de contaminación por adaptadores que pueden llegar a interferir en la eficiencia de la
obtención de lecturas útiles (Figura 4-5).

Para la identificación de picos o “peak calling” se usó el software Model-based analysis

of ChIP-Seq MACS (Zhang et al., 2008). En un trabajo de comparación de cinco
programas muy usados para identificar picos (Rye et al., 2011), se demostró que MACS
tiene el mejor rendimiento sobre el análisis manual de conjuntos de datos.

97
Capítulo II

A B

ZmZIM91_GFP
GFP
Resultados de
Vector GFP
Resultados ZmZIM91_GFP
AntiGFP Anti91
Lecturas Lecturas
empleadas empleadas Anti GFP Anti91
para búsqueda para búsqueda Lecturas empleadas Lecturas empleadas
de picos de picos
para búsquedas de para búsqueda de
56.543 32.305 picos picos
1.062.351 154.994

Figura 4-5. Análisis de los datos de las librerías de ChIP de protoplastos de maíz
usando BOWTIE y MACS. En (A) se presentan las lecturas que alinean en el genoma
de maíz del vector GFP con el antiGFP y el anti91. En (B) Se presentan las lecturas que
alinean en el genoma de maíz después de descartar las encontradas en los
correspondientes controles negativos (vector GFP) de ZmZIM91 con el antiGFP y el
anti91 y que fueron usadas para buscar los picos en cada caso.

4.1.1.4 Información y localización de sitios de unión obtenidos a partir de los

análisis estadísticos del ChIP-Seq proveniente de protoplastos de maíz

La cantidad de picos encontrados para ZmZIM91_anti91 fue de 1454, mientras que para
ZmZIM91_antiGFP fueron 5824 (Figura 4-6).

Picos AntiGFP
Picos Anti91.1

Figura 4-6. Gráfico de la intersección entre los picos de ZmZIM91_anti91 y

ZmZIM91_antiGFP. El círculo rosa señala los picos obtenidos con el antiGFP (5824)
y el verde los del anti91 (1454), la flecha negra indica los picos que coinciden para
ambos anticuerpos (En colaboración con María Katherine Mejía-Guerra del laboratorio
del Dr. Erich Grotewold, Department of Molecular Genetics, Ohio State University,
Columbus, Ohio, USA).

98
Capítulo II

Tanto para los picos obtenidos con el antiGFP como con el anti91, se llevó a cabo un
análisis de los mismos y se determinó en ambos casos la localización de los sitios
relativos de unión a los genes más cercanos. Para conocer la distribución de los picos, se
realizó una búsqueda de los picos relativa a la coordenada de inicio de los genes
localizados en la vecindad, en una ventana de 10 Kb aguas arriba y aguas abajo (Figura
4-7 A y B), esta distribución reveló que la unión de ZmZIM91 está altamente
enriquecida en las proximidades cercanas a los genes, también se determinó que la
mayoría de los picos en ambos casos se encontraban localizados en mayor proporción
aguas arriba de los genes, seguido por una gran cantidad de picos dentro del gen y en un
porcentaje muy similar a los encontrados aguas abajo (Figura 4-7 C y D).
Posteriormente, se realizó un cruce con los picos obtenidos para las librerías generadas
con los ChIPs de ZmZIM91 generados con los dos anticuerpos y se obtuvo que 82
interceptaban (Figura 4-6). Dada la complejidad de esta técnica y para tratar de asegurar
la identificación de un candidato fiable, se decidió trabajar sólo con los picos que
interceptaban, aunque se estima que al llevar a cabo esta estrategia, fueron descartados
candidatos positivos.

99
Capítulo II

A B

Upstream Downstream Upstream Downstream

C D

Figura 4-7. Distribución de picos relativa a la coordenada de inicio de los genes

ubicados en la vecindad y porcentaje de picos localizados en las zonas adyacentes a
los genes cercanos. En (A) y (B) se muestran los histogramas que representan la
distribución de picos obtenidos para ZmZIM91_antiGFP y ZmZIM91_anti91, relativa a
la coordenada de inicio de los genes en vecindad en una ventana de 10 Kb aguas arriba
y aguas abajo. La barra más alta que en ambos casos está centrada en cero pares de
bases, indica que la unión de ZmZIM91 está enriquecida cerca al TSS. En (C) y (D) se
representa el porcentaje de picos localizados en diferentes zonas adyacentes a los genes
cercanos para ZmZIM91_antiGFP y ZmZIM91_anti91: en rosa se presenta el porcentaje
de picos aguas arriba (40.05% y 41.85% respectivamente), en azul oscuro el
correspondiente a los que solapan con el inicio (19.5% y 9.67%), en rojo los picos aguas
abajo (17.16% y 19.06%), en verde los que se encuentran dentro de los genes (17.68% y
24.86%) y finalmente en azul claro el porcentaje de los picos que caen al final de los
genes (5.49% y 3.87%) (En colaboración con María Katherine Mejía-Guerra del
laboratorio del Dr. Erich Grotewold, Department of Molecular Genetics, Ohio State
University, Columbus, Ohio, USA).

4.1.1.5 Localización de los picos en el genoma de maíz

A continuación, con los picos de ZmZIM91 que interceptaban en las librerías generadas
con los ChIPs de ZmZIM91 generados con los dos anticuerpos usados, fueron
elaborados dos tipos de archivos con el programa MACS: los bed que son los que dan

100
Capítulo II

información de la posición del pico y los wig que son los picos en sí. Ambos archivos
fueron usados en el programa IGV 2.1 y a partir de esto fueron generados los gráficos
de localización de los picos en cada cromosoma tanto para la librería de
ZmZIM91_antiGFP como para la de ZmZIM91_anti91 y para las librerías de los
controles de ambos con el vector de GFP (Figura 4-8).

Cromosoma 1 Cromosoma 2

Cromosoma 3 Cromosoma 4

Cromosoma 5 Cromosoma 6

Cromosoma 7 Cromosoma 8

Cromosoma 9 Cromosoma 10

Figura 4-8. Localización de picos en cada cromosoma del genoma de maíz. En lila
se presenta en primer lugar los picos correspondientes a las librerías de
ZmZIM91_antiGFP y en segundo las de ZmZIM91_anti91. En rojo se muestran los
controles con el vector de GFP, primero los correspondientes a las librerías
GFP_antiGFP y luego a las de GFP_anti91.

4.1.1.6 Clasificación y anotación de genes diana seleccionados

Los criterios de selección de los picos del ChIP-Seq de ZmZIM91 proveniente de

protoplastos de maíz seleccionados para la validación fueron 2: 1) p-value (mayor de
50) y 2) que estuvieran entre 2000 pares de bases cerca de la región que flanquea la

101
Capítulo II

zona 5´ de los genes tanto los picos para la librería de ZmZIM91_antiGFP (Tabla 4-1)
como los de la librería de ZmZIM91_anti91 (Tabla 4-2).
Identificador
pico en Gen en la zona que
Cromosoma Posición en el genoma MACS P-Value flanquea el pico

1 2908528 2909990 MACS_peak_437 509.97 GRMZM2G436038

1 96314345 96314932 MACS_peak_808 131.70 GRMZM2G070899
1 103616737 103617310
103617310 MACS_peak_824 93.26 GRMZM2G057466
1 123772516 123772766
123772766 MACS_peak_849 56.18 GRMZM2G009655
1 204693488 204694114
204694114 MACS_peak_1000 186.02 GRMZM2G058402
1 278024486 278024815 15 MACS_peak_1278 51.31 GRMZM2G031138
1 283253736 283254052
283254052 MACS_peak_1312 75.80 GRMZM2G463726
2 12600466 12600747 MACS_peak_1521 114.03 GRMZM2G176225
2 15128432 15128977 MACS_peak_1555 79.91 GRMZM2G050234
3 176000444
186380483 176001040
176001040
186380919
186380919 MACS_peak_2386
MACS_peak_2453 63.77
152.79 GRMZM2G135722
GRMZM2G155285
3 186381444 186381580
186381580 MACS_peak_2453 152.79 GRMZM2G155321
3 218480031 218480344
218480344 MACS_peak_2639 70.11 GRMZM2G114444
4 25787643 25788146 MACS_peak_2764 82.28 GRMZM2G147726
4 231411220 231411490
231411490 MACS_peak_3163 71.02 GRMZM2G003377
4 231411376 231411686 MACS_peak_3163 71.02 GRMZM2G003411
5 2792233 2792359 MACS_peak_3230 117.64 GRMZM2G108716
5 4256470 4256729 MACS_peak_3250 51.31 GRMZM2G012209
GRMZM2G007063
5 146885958
77922026 146886003
77922073
146886003 MACS_peak_3591
MACS_peak_3509 67.52
69.78 GRMZM2G129713
GRMZM2G097207
5 207893065 207893256
207893256 MACS_peak_3813 127.85 GRMZM2G320786
5 215267226 215267661
215267661 MACS_peak_3884 86.57 GRMZM5G862817
7 140424779 140425342
140425342 MACS_peak_4634 93.85 GRMZM2G071147
7 144980649 144980736
144980736 MACS_peak_4654 97.39 GRMZM2G096709
7 161958265 161958418
161958418 MACS_peak_4761 99.87 GRMZM2G010702
7 161958951 161959052
161959052 MACS_peak_4762 67.07 GRMZM2G010702
7 163005646 163005888
163005888 MACS_peak_4771 57.33 GRMZM2G144030
8 170055854 170056180
170056180 MACS_peak_5351 92.03 GRMZM2G043498
9 137092451 137092950 950 MACS_peak_5650 94.79 GRMZM2G053908
9 150745517 150745583
150745583 MACS_peak_5747 68.86 GRMZM2G438606

Tabla 4-1. Picos que interceptan entre las librerías de ZmZIM91_anti91 y de

ZmZIM91_antiGFP. La lista de picos corresponde a la librería de ZmZIM91_antiGFP.

102
Capítulo II

Identificador
pico en Gen en la zona que
Cromosoma Posición en el genoma MACS P-Value flanquea el pico

1 2908528 2909990 MACS_peak_119 66.10 GRMZM2G436038

1 96314470 96314757 MACS_peak_184 57.33 GRMZM2G070899
1 103617115 103617592 MACS_peak_188 73.63 GRMZM2G057466
1 123772367 123772766 MACS_peak_200 70.80 GRMZM2G009655
1 204693619 204693824 MACS_peak_258 122.83 GRMZM2G058402
1 278024493 278024904 MACS_peak_316 76.20 GRMZM2G031138
1 283253718 283254346 MACS_peak_319 89.62 GRMZM2G463726
2 12600466 12600834 MACS_peak_340 107.14 GRMZM2G176225
2 15128596 15128956 MACS_peak_345 76.67 GRMZM2G050234
3 176000663 176000935 MACS_peak_605 99.36 GRMZM2G135722
3 186381444 186381757 MACS_peak_617 76.67 GRMZM2G155321
3 218480031 218480536 MACS_peak_642 71.08 GRMZM2G114444
4 25787741 25788091 MACS_peak_674 76.67 GRMZM2G147726
4 231411375 231411686 MACS_peak_797 72.30 GRMZM2G003377
4
5 231411376 2379629
2379578 231411686 MACS_peak_813
MACS_peak_797 71.02
51.68 GRMZM2G003411
GRMZM2G002805
5 2792233 2792556 MACS_peak_814 72.85 GRMZM2G108716
5 4256453 4256778 MACS_peak_816 76.67 GRMZM2G007063
5 146886556
77922018 146886984
77922073 MACS_peak_875 96.62 GRMZM2G014444
GRMZM2G097207
5 207893149 207893256 MACS_peak_956 90.60 GRMZM2G320786
5 215267358 215267696 MACS_peak_967 76.67 GRMZM5G862817
7 140424942 140425225 MACS_peak_1184 99.36 GRMZM2G071147
7 144980649 144980823 MACS_peak_1186 76.67 GRMZM2G096709
7 161958265 161958588 MACS_peak_1205 76.67 GRMZM2G010702
7 161958987 161959052 MACS_peak_1206 52.89 GRMZM2G010702
7 163005782 163005888 MACS_peak_1208 75.30 GRMZM2G144030
8 170055995 170056204 MACS_peak_1321 76.67 GRMZM2G043498
9 137092720 137092950 MACS_peak_1410 140.04 GRMZM2G053908
9 150745517 150745725 MACS_peak_1417 71.30 GRMZM2G438606

Tabla 4-1. Picos que interceptan entre las librerías de ZmZIM91_anti91 y de

ZmZIM91_antiGFP. La lista de picos corresponde a la librería de ZmZIM91_anti91

En los picos de mayor interés, seleccionados de acuerdo a los parámetros mencionados

anteriormente, se identificaron los genes que se encontraban en las zonas que flanquean
los picos y además se examinó en cada una de las secuencias de los picos, si contenían
alguno de los motivos de unión a ADN identificado in vitro para ZmZIM91: GATA o
GATC. Se encontró que el 68% de los genes poseían alguno de los motivos de unión de
ZmZIM91. Debido a la escasa información acerca de la función de los genes
identificados en las zonas que flanquean los picos, se procedió a realizar una búsqueda
de los homólogos en Arabidopsis usando para ello la base de datos del TAIR y con esto,
se determinó la función putativa para estos genes (Gene Ontology: GO) (Anexo I, Tabla
SI1).

Del total de picos seleccionados para la validación del ChIP-Seq de ZmZIM91

proveniente de protoplastos de maíz, se decidió efectuar el análisis de algunos picos que
contenían genes que se encontraban en las zonas que flanqueaban la región 5´,

103
Capítulo II

interesantes para este trabajo porque están involucrados en la respuesta a estrés. Estos
picos fueron localizados en el genoma de maíz con ayuda del software IGV 2.1. Las
imágenes se muestran en el Anexo I, Figuras SI1 a SI16.

4.1.1.7 Validación de genes diana de ZmZIM91 identificados en el ChIP-Seq

proveniente de protoplastos de maíz

La primera validación de los picos fue llevada a cabo mediante PCR semi-cuantitativa
de ChIP, para esto fueron diseñados cebadores en la zona central del alineamiento entre
las secuencias obtenidas para las librerías de ZmZIM91_antiGFP y las de
ZmZIM91_anti91 (ver materiales y métodos), un ejemplo de esto es mostrado en la
Figura 4-9.

>MACS_peak_824 chr1 and chr5 GFP

GTTTAGTTGATGACTTAATCATGTTTTATTTGTTACTGCTATTATCGCTAAGCATCTTGCACTGTTATGGATAATTGATTGATTATACAAGCTAGAGC
GCGTGGCTGCTAAAAATCATATTGCAAACTGATTGTGACTATGGGCGTGGTAGGGAAACAACCCCAGGAATATCAACGTGCCGTGTTTGGTTTCGGTA
CCTACAGCTTTCTTGACTTGGTTGCCGAGTTACTGCTCTTTTGGTACTACATAAGACCAATCTGTGGTATCCAAACAATTGGTGCTGTTTCAGTCTGC
TGTCTCTGTTGGTCAATGTCTACTTGTAATACCGAACTGCAGTAAATGATAGTTTTG

>MACS_peak_188 91
TGCACTGTTATGGATAATTGATTGATTATACAAGCTAGAGCGCGTGGCTGCTAAAAATCATATTGCAAACTGATTGTGACTATGGGCGTGGTAGGGAA
ACAACCCCAGGAATATCAACGTGCCGTGTTTGGTTTCGGTACCTACAGCTTTCTTGACTTGGTTGCCGAGTTACTGCTCTTTTGGTACTACATAAGAC
CAATCTGTGGTATCCAAACAATTGGTGCTGTTTCAGTCTGCTGTCTCTGTTGGTCAATGTCTACTTGTAATACCGAACTGCAGTAAATGATAGTTTTG
TTTGACTGCAAAATTGACTAGTTTACCTACGCCTTAGGTGGAGGGTAGGAGCTATCT

MACS_peak_824 GTTTAGTTGATGACTTAATCATGTTTTATTTGTTACTGCTATTATCGCTAAGCATCTTGC 60
MACS_peak_188 ---------------------------------------------------------TGC 3
***

MACS_peak_824 ACTGTTATGGATAATTGATTGATTATACAAGCTAGAGCGCGTGGCTGCTAAAAATCATAT 120

MACS_peak_188 ACTGTTATGGATAATTGATTGATTATACAAGCTAGAGCGCGTGGCTGCTAAAAATCATAT 63
************************************************************

MACS_peak_824 TGCAAACTGATTGTGACTATGGGCGTGGTAGGGAAACAACCCCAGGAATATCAACGTGCC 180

MACS_peak_188 TGCAAACTGATTGTGACTATGGGCGTGGTAGGGAAACAACCCCAGGAATATCAACGTGCC 123
************************************************************

MACS_peak_824 GTGTTTGGTTTCGGTACCTACAGCTTTCTTGACTTGGTTGCCGAGTTACTGCTCTTTTGG 240

MACS_peak_188 GTGTTTGGTTTCGGTACCTACAGCTTTCTTGACTTGGTTGCCGAGTTACTGCTCTTTTGG 183
************************************************************

MACS_peak_824 TACTACATAAGACCAATCTGTGGTATCCAAACAATTGGTGCTGTTTCAGTCTGCTGTCTC 300

MACS_peak_188 TACTACATAAGACCAATCTGTGGTATCCAAACAATTGGTGCTGTTTCAGTCTGCTGTCTC 243
************************************************************

MACS_peak_824 TGTTGGTCAATGTCTACTTGTAATACCGAACTGCAGTAAATGATAGTTTTG--------- 351

MACS_peak_188 TGTTGGTCAATGTCTACTTGTAATACCGAACTGCAGTAAATGATAGTTTTGTTTGACTGC 303
***************************************************

MACS_peak_824 ------------------------------------------------
MACS_peak_188 AAAATTGACTAGTTTACCTACGCCTTAGGTGGAGGGTAGGAGCTATCT 351

Figura 4-9. Ejemplo de diseño de cebadores para PCR semi-cuantitativa de picos

que interceptaban entre las librerías de ZmZIM91_antiGFP y las de
ZmZIM91_anti91. En amarillo se puede ver las secuencias usadas como cebadores de
este pico.

104
Capítulo II

Los datos obtenidos con la PCR semi-cuantitativa del ChIP de ZmZIM91 a partir de
protoplastos de maíz (Anexo I, Figura SI17), permitieron descartar algunos picos, ya
que o bien no amplificaban en el ChIP o amplificaban tanto en el control negativo
(GFP_antiGFP, GFP_anti91) como en las muestras de protoplastos que sobre-
expresaban 35S::ZmZIM91:GFP (ZmZIM91_antiGFP, ZmZIM91_anti91).

Posteriormente, con el fin de verificar los resultados obtenidos por PCR semi-
cuantitativa de ChIP de protoplastos de maíz, se eligieron tres picos candidatos que se
consideraban de gran interés debido a que en las zonas que flanqueaban estos picos se
encontraban genes relacionados con estrés. Los picos seleccionados fueron el 8, el 14 y
el 21, de los que se llevó a cabo la validación por PCR cuantitativa de ChIP de
ZmZIM91 de protoplastos de maíz.

En la Figura 4-10, se muestra la lista de los genes que flanquean las regiones donde se
encuentran los picos seleccionados para la validación por PCR cuantitativa de ChIP,
además de su función putativa, el respectivo homólogo en Arabidopsis y la expresión en
la hoja de maíz obtenida del trabajo de Lie et al, 2010.

Homólogo en
Gen Función putativa Arabidopsis

Pico 8
Quinasa 2 asociada a pared,
GRMZM2G176225 fosforilación de proteína, respuesta AT1G21270 (WAK2)
a estímulos por ácido salicílico

ABCG40, transportador de la
GRMZM2G003411 familia ABC involucrado en el AT1G15520
Pico 14
transporte de ABA

GRMZM2G003377 Proteína de unión a ARN AT5G19960

(motivos RRM/RBD/RNP)
Pico 21

GRMZM5G862817 AT2G02230
ATPP2-B1, unión a carbohidrato
(dominio F-Box)

Figura 4-10. Genes seleccionados para la validación por PCR cuantitativa de ChIP
de ZmZIM91a partir de protoplastos de maíz. Los genes seleccionados para la
validación se flanquean las regiones de los picos encontrados en el ChIP-Seq de
ZmZIM91 proveniente de protoplastos de maíz. A la izquierda se enseña los patrones de
expresión de cada gen obtenidos del estudio de Lie et al., 2010 y a la derecha en la tabla
se puede ver el nombre del gen, la función putativa sacada de los homólogos en
Arabidopsis, los cuales están identificados en la última columna.

105
Capítulo II

A continuación, se llevó a cabo la identificación de los picos 8, 14 y 21 en el genoma de

maíz usando el software IGV 2.1 (Figuras 4-11, 4-12, 4-13 y 4-14). En las imágenes se
puede observar que hay lecturas en los ChIP con el anti91 como y con el antiGFP de
protoplastos de maíz que sobre-expresaban 35S::ZmZIM91:GFP, mientras que en los
controles negativos que eran los ChIP de protoplastos de maíz que sobre-expresaban
35S::GFP, no se obtuvieron lecturas con ninguno de los dos anticuerpos usados (anti91
y antiGFP).

Figura 4-11. Pico 8 detectado en el ChIP-Seq de ZmZIM91 proveniente de

protoplastos de maíz. Los picos fueron mapeados en el genoma del maíz usando el
software IGV 2.1. El gen GRMZM2G176225_T0 se encuentra próximo al pico 8. El
orden de cada reglón es el siguiente: En el primero, ZmZIM91_antiGFP; en el segundo,
el control negativo GFP_antiGFP; en el tercero, ZmZIM91_anti91 y en el cuarto, el
control negativo GFP_anti91. En la parte inferior se puede ver el diagrama del gen
GRMZM2G176225_T01 y los identificadores de los picos en MACS para
ZmZIM91_antiGFP y ZmZIM91_anti91.

106
Capítulo II

Figura 4-12. Pico 14 detectado en el ChIP-Seq de ZmZIM91 proveniente de

protoplastos de maíz. Los picos fueron mapeados en el genoma del maíz usando el
software IGV 2.1. El gen GRMZM2G003411_T01 se encuentra próximo al pico 14. El
orden de cada reglón es el siguiente: En el primero, ZmZIM91_antiGFP; en el segundo,
el control negativo GFP_antiGFP; en el tercero, ZmZIM91_anti91 y en el cuarto, el
control negativo GFP_anti91. En la parte inferior se puede ver el diagrama del gen
GRMZM2G003411_T01 y los identificadores de los picos en MACS para
ZmZIM91_antiGFP y ZmZIM91_anti91.

107
Capítulo II

Figura 4-13. Pico 14 detectado en el ChIP-Seq de ZmZIM91 proveniente de

protoplastos de maíz. Los picos fueron mapeados en el genoma del maíz usando el
software IGV 2.1. El gen GRMZM2G003377_T01 se encuentra próximo al pico 14. El
orden de cada reglón es el siguiente: En el primero, ZmZIM91_antiGFP; en el segundo,
el control negativo GFP_antiGFP; en el tercero, ZmZIM91_anti91 y en el cuarto, el
control negativo GFP_anti91. En la parte inferior se puede ver el diagrama del gen
GRMZM2G003377_T01 y los identificadores de los picos en MACS para
ZmZIM91_antiGFP y ZmZIM91_anti91.

108
Capítulo II

Figura 4-14. Pico 21 detectado en el ChIP-Seq de ZmZIM91 proveniente de

protoplastos de maíz. Los picos fueron mapeados en el genoma del maíz usando el
software IGV 2.1. El gen GRMZM5G862817_T04 se encuentra próxima al pico 14. El
orden de cada reglón es el siguiente: En el primero, ZmZIM91_antiGFP; en el segundo,
el control negativo GFP_antiGFP; en el tercero, ZmZIM91_anti91 y en el cuarto, el
control negativo GFP_anti91. En la parte inferior se puede ver el diagrama del gen
GRMZM5G862817_T04 y los identificadores de los picos en MACS para
ZmZIM91_antiGFP y ZmZIM91_anti91.

La PCR cuantitativa a tiempo real (qRT-PCR) para los tres picos, fue hecha utilizando
tres réplicas biológicas y tres réplicas técnicas, sobre las muestras de ChIP de
protoplastos de maíz: GFP_antiGFP, ZmZIM91_antiGFP, GFP_anti91 y
ZmZIM91_anti91 usando SYBR Green chemistry. El vector vacío fue usado como
control negativo con el fin de asegurarse de que el respectivo pico no correspondía a un
artefacto. También se utilizó un control negativo interno de la PCR cuantitativa de ChIP
llamado copia, que es un elemento retrotransponible usado como control en este tipo de
aproximaciones. Los resultados obtenidos de la PCR cuantitativa de ChIP utilizando
cebadores específicos (ver materiales y métodos), permitieron confirmar como positivos
los picos 8, 14 y 21 (Figuras 4-15, 4-16 y 4-17) confirmando a su vez los resultados
obtenidos con la PCR semi-cuantitativa de ChIP.

109
Capítulo II

A INPUT Anti_GFP Anti_ZmZIM91

PCR semi-cuantitativa
35S:: ZmZIM91:GFP

del pico 8
35S::GFP

B Enriquecimiento del pico 8 con respecto a copia

GFP_AntiGFP

GFP_Anti91
ZmZIM91_Anti 91
ZmZIM91_AntiGFP
GFP_Anti91
ZmZIM91_AntiGFP GFP_AntiGFP

ZmZIM91_Anti 91

0,000 0,010 0,020 0,030 0,040 0,050 0,060 0,070 0,080 0,090

Figura 4-15. Validación del pico 8 utilizando PCR semi-cuantitativa y PCR

cuantitativa de muestras de ChIP de protoplastos de maíz. En (A) se muestran los
resultados de la PCR semi-cuantitativa de ChIP de protoplastos de 35S::ZmZIM91:GFP
y de 35S::GFP, realizada de tres diluciones seriadas del material inmunoprecipitado. La
PCR semi-cuantitativa se realizó utilizando cebadores diseñados específicamente para
amplificar la secuencia correspondiente al pico 8. Se observa que los protoplastos que
sobre-expresaban la GFP, no presentan enriquecimiento del pico 8 en las muestras
inmunoprecipitadas con el anti91 y el antiGFP. En (B) se presenta la PCR cuantitativa
de ChIP de protoplastos de 35S::ZmZIM91:GFP y de 35S::GFP. Los datos fueron
procesados estadísticamente utilizando como control de la PCR cuantitativa el gen de
referencia llamado copia. En verde oscuro se presenta la PCR cuantitativa de ChIP del
control negativo GFP_antiGFP y en verde claro la de ZmZIM91_antiGFP, en este caso
se observa enriquecimiento del pico 8 con respecto al control. En lila oscuro se presenta
la PCR cuantitativa de ChIP del control negativo GFP_anti91 y en lila claro la de
ZmZIM91_anti91, en este caso el control está más enriquecido que la muestra, sin
embargo hay que tener en cuenta que así los protoplastos sobre-expresen la GFP, al usar
el anticuerpo contra la proteína ZmZIM91 podría estar inmunoprecipitando la proteína
ZmZIM91 endógena de los protoplastos.

110
Capítulo II

A INPUT Anti_GFP Anti_ZmZIM91

PCR semi-cuantitativa
35S:: ZmZIM91:GFP

del pico 14
35S::GFP

B Enriquecimiento del Pico 14 con respecto a copia

GFP_AntiGFP

GFP_Anti91 ZmZIM91_Anti91

ZmZIM91_AntiGFP

ZmZIM91_AntiGFP GFP_Anti91

GFP_AntiGFP

ZmZIM91_Anti91

0,000 0,020 0,040 0,060 0,080

Figura 4-16. Validación del pico 14 utilizando PCR semi-cuantitativa y PCR

cuantitativa de muestras de ChIP de protoplastos de maíz. En (A) se muestran los
resultados de la PCR semi-cuantitativa de ChIP de protoplastos de 35S::ZmZIM91:GFP
y de 35S::GFP, realizada de tres diluciones seriadas del material inmunoprecipitado. La
PCR semicuantitativa se realizó utilizando cebadores diseñados específicamente para
amplificar la secuencia correspondiente al pico 14. Se observa que los protoplastos que
sobreexpresaban la GFP sola presentan menor enriquecimiento en las muestras
inmunoprecipitadas con el anti91 y el antiGFP. En (B) se presenta la PCR cuantitativa
de ChIP de protoplastos de 35S::ZmZIM91:GFP y de 35S::GFP. Los datos fueron
procesados estadísticamente utilizando como control de la PCR cuantitativa el gend e
referencia llamado copia. En verde oscuro se presenta la PCR cuantitativa de ChIP del
control negativo GFP_antiGFP y en verde claro la de ZmZIM91_antiGFP. En azul
oscuro se presenta la PCR cuantitativa de ChIP del control negativo GFP_anti91 y en
azul claro la de ZmZIM91_anti91. En ambos casos se puede ver que hay
enriquecimiento del pico 14 en el ChIP de protoplastos que sobre-expresaban la
proteína ZmZIM91_GFP con respecto al control de ChIP de protoplastos que sobre-
expresaban el vector de GFP.

111
Capítulo II

A INPUT Anti_GFP Anti_ZmZIM91

PCR semi-cuantitativa
35S:: ZmZIM91:GFP

del pico 21
35S::GFP

B Enriquecimiento del pico 21 con respecto a copia

GFP_AntiGFP

GFP_Anti91
ZmZIM91_Anti 91
ZmZIM91_AntiGFP
GFP_Anti91
ZmZIM91_AntiGFP GFP_AntiGFP

ZmZIM91_Anti 91

0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200 1,400 1,600 1,800

Figura 4-17. Validación del pico 21 utilizando PCR semi-cuantitativa y PCR

cuantitativa de muestras de ChIP de protoplastos de maíz. En (A) se muestran los
resultados de la PCR semi-cuantitativa de ChIP de protoplastos de 35S::ZmZIM91:GFP
y de 35S::GFP, realizada de tres diluciones seriadas del material inmunoprecipitado. La
PCR semicuantitativa se realizó utilizando cebadores diseñados específicamente para
amplificar la secuencia correspondiente al pico 21. Se observa que los protoplastos que
sobreexpresaban la GFP sola presentan menor enriquecimiento en las muestras
inmunoprecipitadas con el anti91 y el antiGFP. En (B) se presenta la PCR cuantitativa
de ChIP de protoplastos de 35S::ZmZIM91:GFP y de 35S::GFP. Los datos fueron
procesados estadísticamente utilizando como control de la PCR cuantitativa el gend e
referencia llamado copia. En verde oscuro se presenta la PCR cuantitativa de ChIP del
control negativo GFP_antiGFP y en verde claro la de ZmZIM91_antiGFP. En naranja
se presenta la PCR cuantitativa de ChIP del control negativo GFP_anti91 y en amarillo
la de ZmZIM91_anti91. En ambos casos se puede ver que hay enriquecimiento del pico
21 en el ChIP de protoplastos que sobre-expresaban la proteína ZmZIM91_GFP con
respecto al control de ChIP de protoplastos que sobre-expresaban el vector de GFP.

Posteriormente, para estos picos se realizó la búsqueda in silico de los motivos GATC y
GATA de unión a ADN identificadas in vitro para ZmZIM91 mediante el experimento
de PBM11.

112
Capítulo II

En los picos 14 y 21, se identificaron cajas GATA y GATC en las secuencias obtenidas
con el antiGFP y el anti91, sin embargo en su mayoría eran motivos GATC (Figura 4-
18). En el caso del pico 8, no se encontraron motivos de unión a ADN GATA y GATC.

Figura 4-18. Localización en los picos 8, 14 y 21, de los motivos de unión a ADN
GATA y GATC identificados in vitro para el factor de transcripción ZmZIM91. En
la imagen se muestra la localización de los sitios de unión a ADN de ZmZIM91. En los
picos 14 y 21 fueron identificados tanto en la secuencia obtenida con el antiGFP como
en la secuencia obtenida con el el anti91, los motivos de unión a ADN de ZmZIM91,
GATA y GATC. En el pico 8 no fueron detectadas cajas GATA y GATC. En azul se
presentan la caja GATA y en rojo se muestran las cajas GATC.

4.1.1.8 Construcción de nuevas librerías de ChIP de ZmZIM91 a partir de

protoplastos de maíz

Con el fin de obtener réplicas biológicas del primer ChIP-Seq de ZmZIM91 proveniente
de protoplastos, se generaron dos réplicas biológicas más, modificando la elaboración
de las librerías reduciendo la cantidad de adaptadores presentes en la muestra para
mejorar la eficiencia de la secuenciación (ver materiales y métodos). La calidad de estas
librerías fue analizada mediante bioanalyzer (Figura 4-19), donde se pudo observar que
no tenían picos de contaminación por adaptadores y que además presentaban una mayor
concentración. En el momento de escritura de esta tesis doctoral, las muestras fueron
enviadas a secuenciar y por lo tanto no se tienen datos a cerca de los nuevos resultados
obtenidos que permitan sacar conclusiones acerca del mejoramiento de la técnica.

113
Capítulo II

91FL_Anti GFP BR2 (A)

PC1302_Anti 91 BR2 (D)

A B C D
91FL_Anti 91 BR2 (B)

PC1302_Anti GFP BR2 (C)

91FL_Anti GFP BR3 (A)

A B C

91FL_Anti 91 BR3 (B)

PC1302_Anti 91 BR3 (C)

Figura 4-19. Librerías de ChIP de ZmZIM91 a partir de protoplastos de maíz.

Cada imagen corresponde al resultado del bioanalyzer de cada muestra la librería de
ChIP de protoplastos maíz tanto de ZmZIM91 como de la GFP (Vector pCambia 1302:
PC1302). En (A) se muestra la réplica biológica 2. Las muestras se identifican de la
siguiente manera: A, ZmZIM91_antiGFP; B, ZmZIM91_anti91; C, PC1302_antiGFP y
D, PC1302_anti91. En (B) se muestra la réplica biológica 3. Las muestras se identifican
de la siguiente manera: A, ZmZIM91_antiGFP; B, ZmZIM91_anti91; C,
PC1302_anti91.

114
Capítulo II

4.1.2 Identificación de genes diana de ZmZIM91 en el genoma de maíz usando

ChIP-Seq de ZmZIM91 proveniente de hojas de plantas de maíz de 9 días

En esta parte del trabajo, se exponen los resultados obtenidos del ChIP-Seq de
ZmZIM91 proveniente de hojas de plantas de maíz de 9 días, usando el anticuerpo
contra la proteína endógena de ZmZIM91 (ver materiales y métodos) que de acuerdo
con el ChIP de ZmZIM91 a partir de protoplastos de maíz, era el anticuerpo endógeno
que mejor funcionaba. En este caso se utilizó como control el Input y las librerías fueron
realizadas de acuerdo con el protocolo expuesto en los materiales y métodos.

4.1.2.1 Preparación y control de calidad de librerías de ChIP de ZmZIM91 a partir

de hojas de plantas maíz

Para identificar las regiones genómicas a las que se une in vivo ZmZIM91, se realizaron
experimentos de ChIP-seq con la tecnología Illumina-Solexa, que combina la
inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) con secuenciación masiva paralela, con el
objetivo de identificar los sitios de unión a ADN de dicho factor de transcripción.

Inicialmente se prepararon cuatro librerías de ChIP de hoja de maíz de las muestras

inmunoprecipitadas con el anticuerpo endógeno de ZmZIM91 y las muestras del Input.
La calidad de las librerías fue medida mediante Bioanalyzer. En el caso de las cuatro
librerías realizadas con los ChIPs de ZmZIM91 de hojas de plantas de maíz, fue
detectado un pico de 123 pares de bases, que correspondía a contaminación por
adaptadores, lo que se ha visto que impide una buena secuenciación de las librerías. Este
es un problema común en las librerías generadas con el sistema Solexa-Illumina y en la
mayoría de los casos esta contaminación no puede ser eliminada mediante la
electroforesis en gel, dado a que corresponde a adaptadores que se autoligaron y
posteriormente amplificaron durante la PCR, cuya concentración es elevada y que
debido a la conformación estructural que poseen presentan una migración normal y no
son eliminados mediante la purificación por gel. En este trabajo se puso a punto un paso
intermedio en la generación de librerías elimina esta contaminación de fragmentos
cortos utilizando la tecnología AMPure XP Beads.

115
Capítulo II

Antes de llevar a cabo la secuenciación de las muestras fue necesario determinar la

concentración exacta de cada librería con Qubit, con el fin de evitar que las líneas de
secuenciación se colapsaran y no se pudiera obtener unos óptimos resultados.
Luego, se procedió a la secuenciación con el sistema de Illumina (Facility, Ohio State
University en Columbus, Ohio, USA) de tres librerías de ZmZIM91 y el Input (Figura 4-
20: A, B, D y E) para ello las muestras fueron mezcladas y divididas en dos líneas de
secuenciación (con cuatro muestras cada una) de acuerdo a los diferentes códigos de
barras y la concentración de cada muestra. Los protocolos detallados para el
funcionamiento de la estación de clúster y secuenciación usando Genome Analyzer II
están disponibles en la web de Illumina (http://www.illumina.com/).

B73_Anti 91.1 (A) B73_Anti 91.2 (B) B73_Anti 91.3 (C) B73_Anti 91.4 (D)

A B C D E

Input B73 (E)

Figura 4-20. Librerías de ChIP de ZmZIM91 a partir de hoja de maíz. Cada

imagen corresponde al resultado del Bioanalyzer de cada muestra la librería de ChIP de
hoja de maíz de ZmZIM91 independiente. En (A) se muestra la réplica biológica 1,
llamada B73_anti91.1; en (B) se muestra la réplica biológica 2, llamada B73_anti91.2;
en (C) se muestra la réplica biológica 3, llamada B73_anti91.3; en (D) se muestra la
réplica biológica 4, llamada B73_anti91.4; y finalmente en (E) se muestra la librería
elaborada con el Input. En todos los casos, se puede observar que no hay picos de
contaminación por adaptadores en 123 pares de bases.

4.1.2.2 Análisis de datos de ChIP-Seq de ZmZIM91 proveniente de hojas de

plantas de maíz de 9 días

Para el mapeo de las lecturas cortas en el genoma de maíz de la variedad B73 fue
empleado el software BOWTIE (Langmead et al., 2009) (Tabla 4-3).

116
Capítulo II

El porcentaje de lecturas alineadas con el genoma de maíz, permiten concluír que la

librería correspondiente a la muestra ZmZIM91.2 con un 42,16% es la que presenta
mejor calidad, seguida por la ZmZIM91.1 con un 37,79% y finalmente por ZmZIM91.4
con un 21,64%.

Total de
Múltiples % lecturas
Nombre de Total lecturas
Único alineado_BOWTIE % alineadas % alineadas
la librería lecturas alineadas
BOWTIE BOWTIE
BOWTIE
ZmZIM91.1 72.457.244 6.735.490 9,30% 20.648.167 28,50% 37,79% 27.383.657
ZmZIM91.2 53.387.067 7.789.658 14,59% 14.719.861 27,57% 42,16% 22.509.519
ZmZIM91.4 36.464.983 3.090.484 8,48% 4.802.202 13,17% 21,64% 7.892.686
Input 68.205.250 18.170.029 26,64% 48.688.410 71,39% 98,03% 66.858.439

Tabla 4-3. Resultados de los ChIP-Seq de tres réplicas biológicas de ZmZIM91

provenientes de hojas de plantas de maíz. Los datos generados de la secuenciación
fueron analizados con el software BOWTIE. Para la librería de ZmZIM91.1 se
obtuvieron un total de lecturas de 72.457.244, de las que 27.383.657 alinearon en el
genoma de maíz, el equivalente a un 37,79%. Para la librería de ZmZIM91.2 se
obtuvieron un total de lecturas de 53.387.067, de las que 22.509.519 alinearon en el
genoma de maíz, el equivalente a un 42,16%. Para la librería de ZmZIM91.4 se
obtuvieron un total de lecturas de 36.464.983, de las que 7.892.686 alinearon en el
genoma de maíz, el equivalente a un 21,64%. Para el Input se obtuvieron un total de
lecturas de 68.205.250, de las que 66.858.439 alinearon en el genoma de maíz, el
equivalente a un 98,03%.

4.1.2.3 Identificación de genes diana in vivo de ZmZIM91

La búsqueda de picos o “peak calling” en las secuencias obtenidas de las diferentes

librerías se realizó usado el software Model-based analysis of ChIP-Seq MACS (Zhang
et al., 2008).

Los análisis de los resultados de las tres réplicas biológicas de ChIP-Seq de ZmZIM91
provenientes de hojas de plantas de maíz, permitieron identificar entre los promotores
más enriquecidos en las tres librerías secuenciadas, el promotor del gen de la enzima
Caffeic Acid Omethyltransferase (COMT) y el del gen DFR (A1) (Tabla 4-4). COMT es
un gen involucrado en la biosíntesis de lignina. Una de las alteraciones más marcadas a
la estructura de la lignina viene de la baja expresión de la enzima caffeic acid
Omethyltransferase (COMT). Un estudio realizado por Piquemal et al. (2002), permitió
concluir que la baja expresión de la enzima COMT altera los perfiles de la lignina y el

117
Capítulo II

ester p-Hidroxicinámico contenido en el maíz y que además es beneficiosa para la

digestibilidad en el maíz. La asociación de COMT con mutantes brown midrib (bm3)
fue identificada en maíz por Vignols et al. (1995). Estas mutaciones pueden alterar la
composición de la lignina y la digestibilidad e incrementan la cantidad de etanol en un
30% usando procesos convencionales de fermentación de biomasa. Por otra parte, el gen
de ZmA1 pertenece a la ruta de la biosíntesis de antocianinas. En investigaciones previas
se ha demostrado que el factor MYB C1 o PL1 (ZmMYB1 o ZmMYB2) (Sainz et al.,
1997), activa la expresión del gen de ZmA1 a través de interacción con las proteínas
bHLH R o B (Goff et al., 1992).

De igual forma, se llevo a cabo una búsqueda en los picos de otros promotores
enriquecidos en los ChIP-Seq de ZmZIM91 y se encontró que los promotores de
MYB42 y R estaban enriquecidos en las tres réplicas biológicas, mientras que el
promotor de C1 estaba enriquecido en dos de las réplicas y finalmente se encontró que
los promotores de P1, de ZmNAC115, de una proteína de unión a ARN y de CESAA6
estaban enriquecidos en una de las réplicas biológicas (Tabla 4-4). Las proteínas CESA
forman una familia génica amplia cuyo número varía entre especies, en maíz se han
identificado doce genes que codifican para la celulosa sintasa, estando implicadas en la
síntesis de celulosa y por tanto en la formación de pared celular.

Por otra parte y de acuerdo a los datos arrojados por el software MACS, se llevó a cabo
la búsqueda en el genoma de maíz de otros picos que también estaban muy enriquecidos
en las tres réplicas biológicas de ZmZIM91 utilizando el software IGV 2.1. Los
resultados se muestran en el Anexo II Figura SII1 a SII16, donde además se indica el
gen o los genes que se localizan en las zonas que flanquean los picos, su respectivo
homólogo en Arabidopsis y el putativo proceso biológico en el que está involucrado.

118
Capítulo II

Replicas biológicas
Identificador del gen en maíz Búsqueda con IGV Nombre del gen diana
de ZmZIM91
GRMZM2G113137 GRMZM2G113137_T01 1 CESAA6
GRMZM2G026930 GRMZM2G026930_T01 3 DFR (A1)
AC196475.3_FG004 AC196475.3_FG004 3 COMT
GRMZM2G419239 GRMZM2G419239_T01 3 MYB42
GRMZM2G084799 GRMZM2G084799 1 P1
GRMZM2G005066 GRMZM2G005066 2 C1
GRMZM5G822829 GRMZM5G822829 3 R
GRMZM2G069047 GRMZM2G069047 1 ZmNAC115
Proteína que contiene un
GRMZM2G069102 GRMZM2G069102_T01 1 dominio de reconocimiento a
ARN, putativo, expresado.

Tabla 4-4. Identificación de genes diana de ZmZIM91 mediante ChIP-Seq. Se

muestran los genes diana identificados en las replicas biológicas del ChIP-Seq de
ZmZIM91, algunos fueron encontrados en las tres réplicas biológicas, otros en una y
uno solo en dos.

4.1.2.4 ZmZIM91 interactúa con el promotor del gen ZmCOMT in vivo

En primer lugar, se procedió a localizar el pico correspondiente al promotor del gen

ZmCOMT en el genoma de maíz usando el software IGV 2.1 (Figura 4-21). En la
imagen se puede observar un pico similar y muy enriquecido en las tres réplicas
biológicas.

Figura 4-21. Pico detectado en las tres réplicas biológicas de ChIP-Seq de

ZmZIM91 que flanquea el promotor del gen ZmCOMT. Los picos fueron mapeados
en el genoma del maíz usando el software IGV 2.1. En la parte superior se observan los
picos de enriquecimiento sobre el promotor del gen de ZmCOMT y en la parte inferior
se puede ver el diagrama del gen de ZmCOMT y los identificadores en MACS de los
picos detectados en cada réplica biológica.

119
Capítulo II

B 25,00
% de enriquecimiento de ZmCOMT con respecto a Input

20,00

15,00

ACTIN UTR
10,00 COPIA
NBZ
COMT-3'-UTR
5,00
COMT

0,00
ACTIN UTR COPIA NBZ COMT-3'-UTR COMT

-5,00

Figura 4-22. Validación por PCR cuantitativa en tiempo real del promotor de
ZmCOMT en muestras de ChIP de ZmZIM91 a partir de hojas de plantas de maíz.
En (A) se muestra el esquema del promotor del gen ZmCOMT, las cajas en color lila
representan los sitios GATA y GATC. En (B) se muestra la PCR cuantitativa del
promotor de ZmCOMT de cuatro réplicas biológicas de muestras de ChIP de
ZmZIM91, al igual que la de los controles negativos. La gráfica se calculó como
porcentaje de enriquecimiento de ZmCOMT con respecto al Input.

4.1.2.5 ZmZIM91 reprime al promotor del gen de maíz ZmCOMT in vivo

La validación por PCR cuantitativa de ChIP confirmó que ZmZIM91 podía unirse al
promotor del gen ZmCOMT, por consiguiente para determinar cuál era el papel
regulador de ZmZIM91 sobre ZmCOMT, fue llevado a cabo un ensayo de expresión
transiente en protoplastos de maíz, donde el promotor de ZmCOMT (1 kb desde la
región reguladora 5´) estaba fusionado al gen reportero de la luciferasa y ZmZIM91
estaba fusionado a la GFP. Como resultado se obtuvo que ZmZIM91 es capaz de
reducir la expresión del promotor de ZmCOMT aproximadamente en un 50% (Figura 4-
23), lo que convierte a ZmZIM91 en un represor de la expresión de ZmCOMT.

120
Capítulo II

1,4
pCOMT:LUC+ ZIM91
1,2

0,8

0,6

0,4

0,2

Figura 4-23. ZmZIM91 reprime el promotor del gen de ZmCOMT. Mediante un

ensayo de luciferasa en protoplastos de maíz, se determinó que ZmZIM91 era capaz de
reprimir el promotor de ZmCOMT aproximadamente en un 50%.

4.1.2.6 ZmZIM91 se une al promotor del gen ZmA1 in vivo

Para realizar la validación del promotor del gen ZmA1, fueron llevados a cabo
experimentos independientes de nano PCR cuantitativa de ChIP de ZmZIM91 a partir
de hojas de plantas de maíz (Fluidigm), en estos experimentos se usaron como control
negativo actina UTR, copia, NBZ y ZmCOMT-3´UTR. Los datos fueron procesados
siguiendo los parámetros descritos en los materiales y métodos.

Los resultados muestran que el promotor del gen ZmA1 se encuentra enriquecido 5,5
veces en los ChIPs de ZmZIM91. En el promotor del gen ZmA1 fueron identificadas
cajas GATA y GATC, indicando que in vivo ZmZIM91 podría unirse al promotor del
gen ZmA1 a través de los motivos de unión a ADN GATA y GATC (Figura 4-24).

121
Capítulo II

B 8,00 % de enriquecimiento de ZmA1 con respecto a Input

7,00

6,00

5,00

4,00
ACTIN UTR
3,00 COPIA
NBZ
2,00
COMT-3'-UTR
1,00 A1

0,00
ACTIN UTR COPIA NBZ COMT-3'-UTR A1
-1,00

-2,00

Figura 4-24. Validación por PCR cuantitativa en tiempo real del promotor de
ZmA1 en muestras de ChIP de ZmZIM91 a partir de hojas de plantas de maíz. En
(A) se muestra el esquema del promotor del gen ZmA1, las cajas en color lila
representan los sitios GATA y GATC. En (B) se muestra la PCR cuantitativa del
promotor de ZmA1 de cuatro réplicas biológicas de muestras de ChIP de ZmZIM91, al
igual que la de los controles negativos. La gráfica se calculó como porcentaje de
enriquecimiento de ZmA1 con respecto al Input.

4.1.2.7 ZmZIM91 reprime al promotor del gen de maíz ZmA1 in vivo

Con el fin de estudiar el papel de ZmZIM91 sobre el promotor del gen ZmA1, se realizó
un ensayo de luciferasa, utilizando expresión transciente en protoplastos de maíz.
Teniendo en cuenta que el nivel basal del promotor de ZmA1 es muy bajo, se usó para
realizar el experimento el complejo activador C1+R que además permitiría estimar de
una forma más clara la acción de ZmZIM91 sobre el promotor de ZmA1. Lo que se
observó fue que ZmZIM91 podía generar una fuerte reducción de la activación que
producía el complejo C1+R sobre el promotor de ZmA1 (Figura 4-25), indicando esto
que ZmZIM91 puede actuar como un represor de la transcripción del gen ZmA1.

122
Capítulo II

3,000

2,500 A1

2,000 A1+CR

1,500 A1+CR+ZmZIM91

1,000

0,500

0,000
A1 A1+CR A1+CR+ZmZIM91

Figura 4-25. ZmZIM91 reprime el promotor del gen de ZmA1. Mediante un ensayo
de luciferasa en protoplastos de maíz, se determinó que ZmZIM91 era capaz de reprimir
el promotor del gen de ZmA1. Debido a que el nivel basal del promotor del gen de
ZmA1 es muy bajo (en color azul), se usó el complejo C+R para activarlo (en color
verde) y se adicionó a ZmZIM91, el cual es capaz de reprimir el promotor de ZmA1
interfiriendo en la activación del mismo por el complejo C+R (en color lila).

4.1.2.8 La interacción in vivo entre ZmZIM91 y los promotores de ZmCOMT y de

ZmA1 se reduce en presencia de MeJA

Con el fin de determinar si el tratamiento con MeJA influía en la interacción ADN-

proteína de ZmZIM91, se llevaron a cabo experimentos de ChIP en hojas de maíz de 9
días tratadas con MeJA 0,01%, utilizando el anticuerpo que reconoce la proteína
endógena de ZmZIM91. Al realizar una PCR cuantitativa en tiempo real con los
cebadores de los promotores de ZmCOMT y ZmA1, se obtuvo que el porcentaje del
enriquecimiento de ambos promotores en las muestras de ChIP tratadas con MeJA fue
menor que el porcentaje de enriquecimiento de las muestras de ChIP control tratadas
solo con DMSO (el DMSO fue usado para diluir el MeJA). Lo anterior se refleja en que
el valor obtenido del cociente entre las muestras tratadas y sin tratar fue menor de 1
(Figura 4-26), lo que indica un menor porcentaje de enriquecimiento generado por el
tratamiento. El procesamiento de los datos se hizo siguiendo el manual SABiosciences
(ChampionChIP™ PCR Array).

123
Capítulo II

A2,00 B 2,00
1,80 1,80
1,60 1,60
1,40 1,40

Fold Difference
Fold Difference

1,20 1,20
1,00 1,00
ZmZIM91
Zm91 ZmZIM91
Zm91
0,80 0,80
0,60 0,60
0,40 0,40
0,20 0,20
0,00 0,00
Promotor
COMTde ZmCOMT
Promoter Promotor de ZmA1
A1 Promoter

Figura 4-26. La interacción in vivo entre ZmZIM91 y los promotores de ZmCOMT

y de ZmA1 se reduce en presencia de MeJA. En ambos casos se observa el resultado
de la PCR cuantitativa de ChIP de muestras tratadas con la hormona MeJA al 0,01% de
dos réplicas biológicas de ChIP de hoja de maíz con el anticuerpo de ZmZIM91. En (A)
se enseña la PCR cuantitativa de ChIP usando los cebadores del promotor de ZmCOMT
y en (B) se enseña la PCR cuantitativa de ChIP usando cebadores del promotor de
ZmA1.

4.1.3 Identificación de otras proteínas que interactúan con ZmZIM91

Debido a que resultados de ChIP-Seq de ZmZIM91 indicaban que este factor se unía al
promotor del gen ZmCOMT, se procedió a realizar un análisis en la literatura tanto del
gen como de los factores que se habían descrito como reguladores de su promotor,
encontrando que los factores MYB-R2R3 del subgrupo cuatro regulaban este gen a
nivel transcripcional, específicamente se conocía que el factor de transcripción
ZmMYB31 que es capaz de unirse in vivo al promotor del gen ZmCOMT (Fornalé et al.,
2010), así como ZmMYB42 (Gray et al., 2012; Sonbol et al., 2009). Los MYB-R2R3
del subgrupo cuatro han sido descritos como represores de genes de la biosíntesis de
lignina.

En investigaciones anteriores, ZmMYB31 y ZmMYB42 fueron sobre-expresados

empleando la planta modelo Arabidopsis thaliana como sistema heterólogo y se
encontró que eran capaces de reducir el contenido de lignina (Sonbol et al., 2009;
Fornalé et al., 2010). También ha sido descrito que los genes implicados en la síntesis
de los monolignoles incrementan sus niveles de expresión cuando la planta sufre herida
mecánica y aplicación de MeJA. En particular se conoce que en respuesta a herida en
Arabidopsis AtCOMT incrementa su expresión, pero esta inducción es dependiente de
AtCOI (Reymond, 2000). Esto indica la existencia de una conexión entre la inducción
de ZmCOMT por herida y la respuesta a la aplicación de MeJA. Adicionalmente, como
124
Capítulo II

ya se ha mencionado ZmZIM91 se degrada por la aplicación de MeJA y actúa como un

represor de ZmCOMT al igual que los MYB-R2R3 del subgrupo cuatro.

Basándose en la información anterior y con el fin de conocer si existía una conexión

biológica entre la regulación efectuada al promotor del gen COMT por ZmZIM91 y los
MYB-R2R3 ZmMYB31 y ZmMYB42, se realizaron experimentos de interacción
proteína-proteína usando la técnica de Complementación Bimolecular en protoplastos
de maíz. Los resultados de estos experimentos permitieron concluir que ZmZIM91
puede interaccionar con ZmMYB31 y ZmMYB42 (Figura 4-27) y que dicha interacción
en ambos casos es tanto en núcleo como en citoplasma.

A YFP N ZmMYB31+ YFP C ZmZIM91 YFP N ZmZIM91+ YFP C VECTOR YFP N VECTOR+ YFP C ZmMYB31

ZmMYB31 YN YC YN+YC

ZmZIM91

YFPN ZmMYB42 Mutant + YFP C

B
YFPN ZmZIM91+ YFPC VECTOR YFPN VECTOR+ YFPC ZmMYB42
ZmZIM91

ZmMYB42
YN YC YN+YC

ZmZIM91

Figura 4-27. Interacción por Complementación Bimolecular entre ZmZIM91 y

ZmMYB31, y entre ZmZIM91 y ZmMYB42. Protoplastos de maíz fueron
transfectados con los vectores de Complementación Bimolecular. En (A) se enseña la
interacción entre ZmZIM91 y ZmMYB31 y sus respectivos controles negativos. En (B)
se muestra la interacción entre ZmZIM91 y ZmMYB42 y sus respectivos controles
negativos. En ambos casos la interacción entre las dos proteínas tiene localización en
núcleo y citoplasma. Para los paneles que muestran la interacción entre las proteínas
Bar = 10µm. Para las imágenes de los controles Bar = 20µm.

Seguidamente, dado que se consideró que probablemente ZmZIM91 y los MYB-R2R3

del subgrupo cuatro, formaban parte de un sistema conjunto de regulación del promotor
de ZmCOMT y que la presencia de cajas AC y GATA/GATC en el promotor de
ZmCOMT conformaban un módulo regulador en cis, por tanto, se procedió a analizar si

125
Capítulo II

este putativo módulo estaba conservado evolutivamente, para lo cual se evaluó in silico
la presencia de dichas cajas en el promotor de COMT en otras especies de gramíneas.

Para evaluar la conservación del putativo módulo regulador AC/(GATA/GATC) entre

especies de gramíneas, se utilizo el software matrix-scan, que efectúa la identificación
de regiones enriquecidas por elementos reguladores en cis usando el software matrix-
scan (ver materiales y métodos) que detecta regiones cortas de ADN que muestran una
significativa densidad de elementos reguladores en cis putativos. Buscando identificar
regiones enriquecidas en elementos reguladores en cis (CRERs) (Turatsinze, 2008).

En la Figura 4-28, se identificaron zonas enriquecidas en elementos reguladores en cis

en el promotor del gen COMT en las gramíneas, sin embargo es de destacar que en el
Sorgo bicolor no se evidencia la conservación del modulo AC/(GATA/GATC).

Módulo regulatorio cis

AC-GATA
AC_ZmMYB3/ZmMYB42
AC_ZmMYB11
GATC_ZmZIM91
GATC_ZmZIM91
crer
crer

Figura 4-28. El módulo regulador putativo AC-GATA en el promotor del gen de

COMT está conservado en las gramíneas. En azul se muestra la posición de las cajas
AC y en lila se enseña la localización de las cajas GATC sobre el promotor del gen
COMT en las gramíneas. Se observa que la conservación en Sorgo bicolor no se
mantiene, ya que solo se localizan cajas AC.

126
Capítulo II

4.2 Discusión de resultados

4.2.1 Identificación de genes diana de ZmZIM91 mediante la técnica de ChIP-Seq

de protoplastos de maíz

Uno de los principales objetivos de la presente tesis doctoral era determinar si

ZmZIM91 era un factor de transcripción. Posteriormente a establecer si ZmZIM91 era
un factor de transcripción, se quería conocer las secuencias de ADN a la que se unía in
vivo y cuáles eran sus genes diana para identificar en qué procesos biológicos estaba
involucrado.

Los datos obtenidos anteriormente para ZmZIM91 permitían sugerir que estaba
involucrado en la regulación de genes de respuesta a estrés, ya que como se describió en
el capítulo I, fue identificado en un cribado de doble híbrido de una librería de hoja
estresada por sequía utilizando la subunidad reguladora β1 de la proteína quinasa CK2
de maíz, de la que se sabe que está implicada en diferentes procesos biológicos
incluyendo estrés. Parte del proceso de determinación de la relevancia biológica del
factor ZmZIM91 era la identificación de sus genes diana, para ello se utilizó la técnica
de ChIP-Seq, que permite la identificación de las regiones de unión de factores de
transcripción en el genoma (Buck y Lieb, 2004; Jiang y Pugh, 2009).

En primer lugar, se quería verificar si el anticuerpo que reconoce la proteína endógena

de ZmZIM91, producido y purificado en este trabajo era efectivo para realizar
inmunoprecipitaciones. Para ello, se llevó a cabo un experimento de ChIP-Seq usando
protoplastos de maíz que sobre-expresaban la proteína ZmZIM91 fusionada a la GFP y
protoplastos que sobre-expresaban el vector de la GFP, para ambos casos se realizaron
inmunoprecipitaciones, por un lado con un anticuerpo comercial contra GFP y por otro
con el anticuerpo contra ZmZIM91, con el fin de comparar los resultados de la
secuenciación obtenidos con ambos anticuerpos y estimar la calidad del anticuerpo
ZmZIM91. De acuerdo con los resultados obtenidos se pudo determinar que el
anticuerpo ZmZIM91 tenía especificidad ya que se encontraron picos en común con el
anticuerpo comercial de la GFP.

127
Capítulo II

Debido a que la mayoría de los genes que fueron seleccionados de acuerdo a la posición
de los picos en sus regiones 5´ no estaban caracterizados en maíz, fue necesario realizar
una búsqueda de sus homólogos en Arabidopsis. Interesantemente se encontró que estos
genes fueron catalogados como de respuesta a patógenos, en un trabajo donde se realizó
un análisis global de la expresión génica en Arabidopsis de genes de respuesta a
patógenos y ciclo celular durante la infección por pequeños virus de ADN
(Geminivirus) que usan la maquinaria de replicación de la planta para amplificar sus
genomas (Ascencio-Ibáñez et al., 2008). En esta investigación se llevó a cabo un
análisis de microarray del transcriptoma de Arabidopsis thaliana en respuesta a
infección por cabbage leaf curl virus (CaLCuV), descubriendo 5,365 genes (con una
tasa de falsos positivos de 0.005) diferencialmente expresados en hojas infectadas de
roseta después de 12 días de post-inoculación. Lo que conlleva a pensar que ZmZIM91
podría estar modulando genes de respuesta a patógenos, esta hipótesis sería coherente si
se tiene en cuenta que ZmZIM91 responde a MeJA, al igual que muchos genes
implicados en defensa como por ejemplo MYC2 que induce respuestas mediadas por JA
tales como defensa contra patógenos necrotrópicos (Lorenzo et al., 2004; Boter et al.,
2004; Dombrecht et al., 2007).

Después de llevar a cabo una pre-selección de candidatos usando PCR semi-cuantitativa

de ChIP, se decidió realizar PCR cuantitativa de ChIP con los picos que contenían
promotores de genes que podrían ser interesantes. Finalmente, se obtuvo una validación
positiva de los picos 14 y 21, ya que la proporción obtenida entre los valores Ct de la
muestra y los valores Ct del gen de referencia copia del ChIP de protoplastos que sobre-
expresaban 35S::ZmZIM91:GFP fue mayor que la obtenida en la PCR cuantitativa del
ChIP de protoplastos que sobre-expresaban 35S::GFP.

4.2.2 Identificación de genes diana de ZmZIM91 mediante la técnica de ChIP-Seq

de hojas de maíz

Ya que los resultados obtenidos en el experimento de ChIP-Seq de ZmZIM91

proveniente de protoplastos permitieron determinar que el anticuerpo contra ZmZIM91
era funcional para inmunoprecipitar, se procedió a usarlo para realizar el experimento
de ChIP-Seq de ZmZIM91 in vivo utilizando hojas de plantas de maíz de 9 días. En este
estudio, los resultados iniciales del ChIP-Seq ZmZIM91 proveniente de hojas de plantas

128
Capítulo II

de maíz sugieren cientos de genes diana para ZmZIM91 in vivo involucrados en

distintos procesos.

Los resultados obtenidos de la secuenciación de las tres réplicas biológicas de ChIP-Seq

de ZmZIM91 provenientes de hojas de plantas de maíz, permitió identificar genes diana
de ZmZIM91 que estaban involucrados en la ruta de la biosíntesis de los
fenilpropanoides. Para la validación fueron seleccionados ZmCOMT y ZmA1, porque
presentaban un mayor enriquecimiento en los resultados de la secuenciación masiva de
acuerdo a los análisis realizados.

Los ácidos fenólicos, flavonoides y lignina juegan un papel crucial en la defensa en

plantas y la tolerancia al estrés (Dixon y Paiva, 1995), por tanto al ZmZIM91estar
regulando tanto a ZmCOMT como ZmA1, probablemente indique que la relevancia
biológica del factor de transcripción ZmZIM91 está en la respuesta a estrés biótico, más
específicamente en defensa.

Debido a que se ha descrito anteriormente que ZmMYB31 el cual está involucrado en

respuesta a herida, interactua in vivo con los promotores de los genes ZmCOMT y ZmA1
(Fornalé et al., 2010), y además a que se conoce que condiciones de herida u otros
estreses inducen la formación de lignina, se estudio la respuesta de ZmZIM91 en
condiciones de herida (Figura 4-29), siendo este resultado interesante, dado que se vio
que este factor se degrada a una hora por herida lo que le da soporte al hecho de que
regule genes involucrados en la ruta de los fenilpropanoides.

La influencia de la composición de lignina en la digestibilidad de la pared celular ha

sido estudiada en diferentes gramíneas (Smith y Flinn, 1985, 1991; Chesson et al.,
1986; Jung y Vogel, 1986; Buxton y Russell, 1988; Buxton y Martin, 1989; Jung, 1989;
Grabber et al., 1992). El mutante de maíz bm3, en el cual la actividad de COMT está
reducida de un 70 a 90%, muestra niveles bajos de los constituyentes de la pared
celular, fibra detergente ácida, lignina detergente ácida y también incremento de la
digestibilidad (Grand et al., 1985; Vignols et al., 1995; Guillaumie et al., 2008). En
plantas transgénicas de maíz en las que la expresión de ZmCOMT y la biosíntesis de la
subunidad de lignina S están de-reguladas, la digestibilidad de las hojas y los tallos es
de un 2 y 7%, respectivamente, en comparación con las plantas silvestres (Piquemal et

129
Capítulo II

al., 1998). Esto muestra la importancia de ZmCOMT en la producción de bioetanol y

otros alcoholes, lo que a su vez conlleva a determinar que ZmZIM91 puede jugar un
papel importante en la producción de biocombustibles.

Control Herida
0h 0.5h 1h 0.5h 1h

Anti_ZmZIM91

β-Actin

Figura 4-29. Respuesta de ZmZIM91 a tratamiento de herida en hojas de plantas

silvestres de maíz. En el panel superior usando en anti91, se observa la respuesta de
ZmZIM91 al tratamiento de herida en plantas silvestres a 1 hora, evidenciándose la
degradación de ZmZIM91. En el panel inferior se muestra el control de carga del
western usando para esto el anticuerpo de la β-Actina.

En esta investigación, además de identificar la interacción in vivo de ZmZIM91 con los

promotores de los genes ZmCOMT y ZmA1, se demostró que ZmZIM91 actuaba como
represor de ambos promotores. Los represores transcripcionales son generalmente
clasificados como activos o pasivos (Hanna-Rose y Hansen, 1996). Aproximadamente
el 6% del proteoma de Arabidopsis está representado por represores transcripcionales de
los cuales el 30% tienen función como activos represores (Kagale y Rozwadowski,
2010).

La expresión de los represores de lignina está controlada por desarrollo y

medioambiente. El fino control especial y temporal de la deposición de lignina depende
de la acción antagónica de los represores y activadores para asegurar el nivel preciso de
acumulación de lignina en las células, tejidos u órganos específicos. Los diferentes
genes de biosíntesis de lignina y activadores, están preferencialmente expresados en
tejidos altamente lignificados durante el desarrollo, mientras que muchos represores
están expresados preferencialmente en tejidos no lignificados o poco lignificados. (Zhao
y Dixon, 2010). La activación de la deposición de lignina en la defensa de la planta
puede ocurrir a través de la represión de los represores de lignina más que por la

130
Capítulo II

inducción de los activadores. Es bien conocido que la lignina es inducida en respuesta a

factores de estrés ambiental, tal como herida, estrés mecánico y patógenos, ya que
algunos genes de la vía de los monolignoles estás inducidos específicamente por estrés
(Escamilla-Trevino et al., 2010; Bhuiyan et al., 2009).

La represión de ZmCOMT y ZmA1 por ZmZIM91 podría estar indicando la

participación activa de ZmZIM91 en la regulación de la producción de lignina y
antocianinas, ya que en condiciones normales o sin presencia de estrés mantiene
reprimidos ambos genes, mientras que una situación de herida o presencia de la
hormona MeJA, al promoverse la degradación de ZmZIM91 deja libre a estos genes
para que puedan desempeñar su papel y así mismo pueda la planta responder frente al
estrés. Por ejemplo en el caso de ZmCOMT una importante enzima en la regulación del
flujo de metabolitos hacia la lignina (Figura 4-30), la herida conlleva a que este gen
ayude a la producción de lignificación de la planta como respuesta defensiva.

La lignina es uno de los biopolímeros más abundantes del planeta, es probable que se
encuentre bajo la regulación de diferentes mecanismos, uno de ellos podría ser
manejado por ZmZIM91. De igual forma, la presencia de lignina no es deseable en la
biomasa destinada a la alimentación animal, por lo cual también es interesante el estudio
de probables modificaciones biotecnológicas con miras a reducir el contenido de
lignina. En este contexto, se sugiere que la sobre-expresión de ZmZIM91 puede ayudar
a obtener plantas que sean más digeribles, lo cual rebajaría los costos de producción de
biocombustibles, convirtiendo a ZmZIM91 en una herramienta biotecnológica útil para
el aprovechamiento del maíz en la producción de biocombustibles.

131
Capítulo II

Figura 4-30. La represión del promotor de ZmCOMT por ZmZIM91 puede tener
un impacto significativo en la reducción del contenido de lignina en maíz.
(Adaptado de Fornalé, S. et al., 2010).

132
Capítulo II

En el caso de ZmA1, el hecho de que ZmZIM91 pueda competir con el complejo

activador de C1+R sobre este promotor, es evidencia de que ZmZIM91 en condiciones
normales, mantiene controlado dicho gen, el cual es activado cuando ZmZIM91 es
degradado, generándose así la producción de antocianinas. También cabe anotar que se
ha demostrado que el MeJA aumenta la producción de las antocianinas en el maíz, en
este trabajo se sugiere que se debe a la degradación de sus represores como en es el caso
de ZmZIM91.

También el hecho de que ZmZIM91 pueda regular tanto un gen de la biosíntesis de la

lignina como otro de la biosíntesis de antocianinas sugiere que la ruta de la biosíntesis
de lignina y la de antocianinas pueden ser reguladas por una red transcripcional común.

Por otra parte, los datos obtenidos de la PCR cuantitativa de las muestras de ChIP de
ZmZIM91 de hojas de maíz tratadas con MeJA a 1 hora, evidenciaron una menor
interacción de ZmZIM91 con los promotores de los genes de ZmCOMT y ZmA1,
demostrando la importancia del efecto de la hormona sobre la regulación de ambos
promotores.

Los genomas de las eucariotas poseen cientos de E3 ligasas las cuales proveen
especificidad para los procesos de degradación de las proteínas. En este trabajo se pudo
demostrar que ZmZIM91 era degradado por la vía del proteasoma 26S, aunque no se
conoce el funcionamiento del mecanismo. En este contexto, es importante mencionar
que en un trabajo realizado en Arabidopsis acerca del gen diana de ZmZIM91, COMT,
se observó que dicho gen aumentaba su expresión en condiciones de herida, pero que
sin embargo en mutantes de coi1 sometidos a herida, la expresión de COMT decrecía, lo
cual indicaba que la expresión del gen COMT era dependiente de COI1 (Reymond et
al., 2000). Esto indica la existencia de una conexión entre la inducción de ZmCOMT por
herida y la respuesta a la aplicación de MeJA. Lo anterior podría apoyar la hipótesis del
complejo degradador planteado en la discusión de resultados del capítulo I conformado
por ZmZIM91/JAZ/COI1, teniendo en cuenta que sin la presencia de COI1 no se
pueden degradar los represores y por lo tanto los niveles de COMT se mantienen bajos.

De acuerdo a los resultados obtenidos de la caracterización de ZmZIM91, se ha

propuesto un modelo hipotético del mecanismo de regulación de ZmZIM91 utilizando

133
Capítulo II

como ejemplo el promotor del gen de ZmCOMT, en la Figura 4-31A se muestra el

modelo sin presencia de MeJA en condiciones control, mientras en la Figura 4-31B se
plantea el modelo bajo condiciones de tratamiento con MeJA. En el modelo propuesto
se tiene en cuenta el hecho de que ZmCOMT pertenece a la ruta de los fenilpropanoides,
que responde a estrés por herida, y que además que es reprimido por ZmZIM91 y que
en presencia de MeJA el sistema de represión sobre ZmCOMT por ZmZIM91
desaparece al ser este factor de transcripción degradado por la fitohormona en cuestión.

MeJA

ZIM
Sin
CT

GATA
0 horas GATC El promotor de ZmCOMT está
reprimido

B ZmZIM91 es degradado
UBI
por la vía del proteasoma UBI
UBI
26S
ZmZIM91 está
ZIM
interaccionando con las
proteínas ZmJAZ?
?
CT
MeJA
GATA Datos preliminares en Arabidopsis
Con GATC muestran que AtZIM interacciona con
algunosAtJAZ

1 hora El promotor de Producción

ZmCOMT es activado de lignina

Figura 4-31. Modelo propuesto de regulación del promotor de ZmCOMT por el

factor de transcripción ZmZIM91 de maíz. En (A) se presenta el modelo de
regulación de ZmZIM91 sobre el promotor de ZmCOMT sin presencia de MeJA,
enseñando que el promotor de ZmCOMT mantiene reprimido en condiciones normales
o sin presencia de estrés. En (B) se muestra un modelo de regulación del factor
ZmZIM91 sobre el promotor de ZmCOMT en presencia de MeJA, donde ZmZIM91 es
degradado vía proteasoma 26S, dejando libre a ZmCOMT para que sea activado y se
pueda generar pared y por consiguiente se produzca lignina.

Finalmente, cabe anotar que en el presente trabajo se logró identificar el papel de

ZmZIM91 como un factor de transcripción que interviene en la regulación de genes de
la biosíntesis de la lignina y las antocianinas, pudiéndose establecer un proceso
biológico en el que está involucrado ZmZIM91.

134
Capítulo II

4.2.3 Diferencias entre las técnicas de ChIP-Seq empleadas

Los resultados obtenidos de la secuenciación de las librerías de ChIP de ZmZIM91

tanto en hojas de maíz como en protoplastos de maíz sobre-expresando la proteína,
permitieron identificar diferentes tipos de genes candidatos, sin embargo fueron
encontradas diferencias entre ambas aproximaciones.

El ChIP-Seq proveniente de protoplastos que sobre-expresaban ZmZIM91 es una

técnica que incorpora alta complejidad y muchos controles que permiten eliminar falsos
positivos. Con está técnica solo se obtuvieron lecturas y no picos de los dos genes diana
(ZmCOMT y ZmA1) más enriquecidos en las librerías de ChIP de ZmZIM91 realizado
con hojas de maíz, lo que conlleva a pensar que probablemente el hecho de que se
utilicen células sin pared pueda afectar los resultados con respecto al enriquecimiento de
algunos genes diana y además que es probable que no puedan ser identificados
candidatos positivos.

Por otra parte, para validar los picos obtenidos con el ChIP-Seq de protoplastos, se
validó el pico 14, usando tanto PCR semi-cuantitativa (Figura 4-32A) como PCR
cuantitativa (Figura 4-32B) en las muestras de ChIP de ZmZIM91 realizado con hojas
de maíz. Los resultados confirmaron el enriquecimiento del pico 14 en los ChIP de hoja
de maíz, siendo el resultado igual al obtenido en las PCR cuantitativas de ChIP de
protoplastos.

135
Capítulo II

A INPUT Anti_ZmZIM91

Pico 14

B Enriquecimiento del pico 14 con respecto a copia

INPUT
INPUT

ZmZIM91_Anti91
ANTI_91FL 91FL
INPUT
INPUT

ANTI_91FL 91FL
ZmZIM91_Anti91

0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05

Figura 4-32. Validación utilizando PCR semi-cuantitativa y PCR cuantitativa de

muestras de ChIP de hojas de plantas de maíz del pico 14. En (A) se muestran los
resultados de la PCR semi-cuantitativa de ChIP de hojas de plantas de maíz de 9 días,
realizada de tres diluciones seriales del material inmunoprecipitado. La PCR semi-
cuantitativa se realizó utilizando cebadores diseñados específicamente para amplificar la
secuencia correspondiente al pico 14. En (B) se presenta la PCR cuantitativa de ChIP de
hojas de plantas de maíz de 9 días. La gráfica muestra el enriquecimiento del pico 14
con respecto a copia, donde se observa mayor enriquecimiento en el inmunoprecipitado
usando en anti91 que en el Input.

Analizando y comparando los datos obtenidos con las dos técnicas de ChIP-Seq, se
encontró que la cantidad de lecturas obtenidas en los ChIP-Seq provenientes de hojas de
maíz que alineaban con el genoma de maíz fueron mayores que las que se obtuvieron
con el ChIP-Seq proveniente de protoplastos de maíz. En cuanto a las librerías de ChIP
de ZmZIM91 utilizando hojas de maíz, se obtuvo que para B73_ZmZIM91.1 eran
27.383.657 lecturas, el equivalente a un 37,79%; para B73_ZmZIM91.2 eran
22.509.519 lecturas, el equivalente a un 42,16%; para B73_ZmZIM91.4 eran 7.892.686
lecturas, el equivalente a un 21,64% y finalmente para el Input eran 66.858.439 lecturas,

136
Capítulo II

el equivalente a un 98,03%. En el caso de las librerías realizadas usando ChIPs de

protoplastos de maíz que sobre-expresaban ZmZIM91 se obtuvo con el antiGFP
1.062.351 lecturas mientras que con el anti91 se obtuvieron 154.994 lecturas. La
diferencia entre los resultados (lecturas) en ambas técnicas puede radicar en la
metodología para realizarlas, ya que fue mejorada para ChIP-Seq de ZmZIM91
proveniente de hojas de maíz. El mejoramiento se vio reflejado en la calidad y cantidad
de lecturas obtenidas de la secuenciación que podían ser alineadas en el genoma de
maíz. Por tal razón, no se puede descartar que el ChIP-Seq proveniente de protoplastos
de maíz, no sea una metodología válida para ser usada en caso de ausencia de
anticuerpos específicos y mutantes, sin embargo, deben ser tenidas en cuenta las
limitantes que tiene este tipo de aproximación.

Otro punto importante a destacar en cuanto las muestras de ChIP-Seq efectuado con
protoplastos de maíz, es la variación de la cantidad de lecturas obtenidas entre los
anticuerpos usados (anti91 y antiGFP), ya que probablemente en el caso de
ZmZIM91_anti91 el hecho de que la librería tuviera un banda de contaminación de 123
pares (contaminación por adaptadores), interfirió con la secuenciación de los
fragmentos de interés y en cambio favoreció la lectura de secuencias sobre-
representadas que correspondían a adaptadores. En el momento de realización de estas
librerías, debido a que la técnica del ChIP-Seq proveniente de protoplastos de maíz
estaba en construcción y puesta a punto, no fueron descontaminadas, sin embargo como
actualmente la contaminación por adaptadores ha sido detectada como uno de los
principales problemas en la obtención de la baja cantidad de lecturas que alinean con los
genomas, para elaboración de las librerías de ChIP tanto de hojas de maíz como las
réplicas biológicas restantes de ChIP-Seq efectuado a partir de protoplastos de maíz, fue
usada la tecnología de AMPure Beads, que permite eliminar la contaminación por
adaptadores, lo que aumenta la calidad de las librerías.

4.2.4 Hipótesis de la existencia de un módulo regulatorio entre ZmZIM91,

ZmMYB31 y ZmMYB42

Datos proporcionados por esta investigación, así como trabajos previos realizados por
Fornalé et al. (2006, 2010) y Sonbol et al. (2009), sugieren que ZmZIM91, ZmMYB31
y ZmMYB42, pueden tener papeles y mecanismos similares de regulación. Además de

137
Capítulo II

lo anterior, los resultados de interacción entre estos factores de transcripción, los

análisis bioinformáticos de los módulos reguladores putativos AC/GATC y el hecho de
haber identificado dos genes diana comunes que podían interactuar in vivo con estos
factores de transcripción y ser reprimidos por ellos, conllevaron a plantear la existencia
de un módulo regulador entre los ZML y los MYB del subgrupo IV.

La interacción proteína-proteína entre ZmZIM91 y los factores MYB (ZmMYB31 y

ZmMYB42), fue clave para el entendimiento del proceso regulador de los genes
ZmCOMT y ZmA1. De manera más general, muchos otros factores de transcripción
relativos a los MYB se conoce que regulan diferentes ramas del metabolismo de
flavonoides en plantas y que son capaces de jugar amplios papeles en la regulación del
metabolismo de los fenilpropanoides.

Los factores de transcripción MYB contienen un dominio conservado de unión de ADN

(DBD) que es homólogo al DBD animal c-Myb (Aasland et al., 1996) este dominio está
conformado típicamente por entre una a cuatro repeticiones imperfectas (R) (Dubos et
al., 2010) cada repetición es de aproximadamente 50 aminoácidos de longitud y codifica
para un 3 a-hélice. La subfamilia más grande de los MYB son los MYBs R2R3, que
tiene miembros involucrados en la regulación metabólica en diversas vías, incluyendo
compuestos fenólicos, tales como antocianinas, proantocianidinas, flavonoles, ligninas y
bencenoides volátiles, en una amplia gama de especies de plantas diferentes (Spitzer-
Rimon et al., 2010; Dubos et al., 2010; Petroni y Tonelli, 2011; Feller et al., 2011).
Algunos de estos MYBs R2R3 son sensibles a jasmonato, tales como PAP1, que regula
la expresión de genes de la biosíntesis de antiocianinas y en consecuencia, induce
acumulación de antocianinas en Arabidopsis (Borevitz et al., 2000; Shan et al., 2009).
Ha sido bien establecido que las proteínas MYB R2R3 interactúan y ejercen una
regulación combinatoria con los factores de transcripción bHLH para activar la
biosíntesis fenólica. Dentro de estos complejos de proteínas, los MYBs R2R3 confieren
la especialidad para los efectos aguas abajo y parecen estar conservados en todo el reino
vegetal (Petroni y Tonelli, 2011; Feller et al., 2011). Por ejemplo, en Arabidopsis, los
factores de transcripción bHLH TT8, GL3 y EGL3 pueden interactuar con PAP1. Los
jasmonatos pueden afectar la abundancia y actividad de estas proteínas MYB y bHLH,
tanto a nivel transcripcional como a nivel post-traduccional, a través de la expresión

138
Capítulo II

inducida de los factores de transcripción correspondientes y la interacción con las

proteínas JAZ (Qi et al., 2011; Maes et al., 2008).

El estudio de la regulación del gen ZmCOMT ha abierto una puerta al conocimiento de

cómo estos factores pueden estar interaccionando para regular dicho gen, actuando en
forma de módulo regulador. En la actualidad se han venido adelantando estudios a gran
escala de redes reguladoras, esto debido a que se sabe que los genes no actúan solos
sino en combinación con otros genes para regular rutas de señalización.

A través del uso de herramientas bioinformáticas se han llegado a identificar módulos

reguladores en plantas. En el trabajo realizado por Ding et al.(2011), fueron
identificaron 18638 posibles combinaciones de módulos reguladores en Arabidopsis. La
identificación de módulos reguladores en cis (CRMs) puede ser un gran avance para
entender el mecanismo regulador de los genes. A pesar de la existencia de sitios de
unión de más de 3 factores de transcripción en un módulo regulador en cis, estudios en
plantas consideran únicamente la co-ocurrencia de sitios de unión de uno o dos factores
de transcripción (Ding et al., 2011). En esta tesis, se formula la hipótesis de la
existencia de un módulo regulador compuesto por 2 factores de transcripción:
ZmZIM91/ZmMYB31 o ZmMYB42 (Figura 4-33).

Tanto el promotor del gen ZmCOMT como el promotor del gen ZmA1, posee elementos
GATA y ACII. Un análisis a nivel filogenético más detallado sobre la conservación de
las cajas GATA (motivo de unión de ZmZIM91) y ACII (Motivo de unión de
ZmMYB31) en el promotor del gen de COMT en las gramíneas, permitió determinar
que el módulo regulador putativo compuesto por ZmZIM91/ZmMYB31o
ZmZIM91/ZmMYB42 está evolutivamente conservado. La elaboración de un serial
ChIP de ZmZIM91/ZmMYB31 o ZmZIM91/ZmMYB42, podría ser útil para demostrar
la existencia del módulo regulador propuesto en esta investigación.

139
Capítulo II

Figura 4-33. Modelo hipotético de módulo regulatorio entre ZmZIM91 y

ZmMYB31 o ZmZIM91 y ZmMYB42. La figura muestra, promotores de genes diana
específicos de cada uno de los factores de transcripción representados y promotores de
genes diana comunes entre ellos.

140
Conclusiones
Conclusiones

5. Conclusiones

1. ZmZIM91 interacciona in vitro con la subunidad catalítica CK2α1 y las

reguladoras CK2β1, CK2β2 y CK2β3 .

2. Las subunidades reguladoras CK2β1, CK2β2 y el holoenzima CK2α1β1 pueden

relocalizar a ZmZIM91. Mientras que CK2β3 al igual que CK2α1 no afectan la
localización subcelular de ZmZIM91.

3. La proteína ZmZIM91 es substrato in vitro e in vivo de la proteína quinasa CK2

de maíz. Además la fosforilación de ZmZIM91 por la proteína quinasa CK2
varia en situaciones de estrés por sequía y MeJA.

4. La proteína ZmZIM91 presenta diversos dominios putativos de señales de

localización nuclear (NLS), ubicados en sus dominios JAS y CCT. En el N-
terminal de ZmZIM91 también se identificó otra secuencia de NLS y una señal
export (NES).

5. La proteína ZmZIM91 es capaz de dimerizar y degradarse en presencia de la

hormona MeJA vía el proteasoma 26S.

6. Las secuencias GATC y GATA fueron identificadas como los motivos de unión
a ADN tanto in vitro como in vivo de la proteína ZmZIM91.

7. Mediante el uso de la técnica de ChIP-Seq fueron identificados genes diana de

ZmZIM91. El factor de transcripción ZmZIM91 regula negativamente los genes
ZmCOMT y ZmA1, implicados en la biosíntesis de los fenilpropanoides.

8. El estudio de la regulación del gen ZmCOMT permitió identificar a los factores

ZmMYB R2R3 del subgrupo IV (ZmMYB31 y ZmMYB42) como proteínas que
interaccionan con ZmZIM91.

142
Materiales y Métodos
Materiales y métodos

6. Materiales y métodos

6.1 Cepas de bacterias y levaduras

6.1.1 Cepas bacterianas

En la realización de los experimentos de este trabajo se usaron las siguientes cepas

bacterianas de Escherichia coli y Agrobacterium tumefaciens:

E. coli DH5αF’ para la amplificación de plásmidos y construcciones.

E. coli TOP10 para la amplificación de plásmidos y construcciones.
E. coli BL21 para la sobreexpresión de proteínas recombinantes.
Agrobacterium tumefaciens EHA105 para la transformación transitoria en Nicotiana
bentamiana.

Los cultivos de E. coli se realizaron en medio LB a 37ºC suplementado con el

antibiótico necesario en cada caso de acuerdo al plásmido usado para la construcción
(Kanamicina, Ampicilina o Espectinomicina).

Para el crecimiento de la cepa EHA105 A. tumefaciens se utilizó medio YEB a 28ºC,

suplementado con los antibióticos correspondientes: Rifampicina y Kanamicina.

Medio Luria-Bertoni (LB): 10 g/l triptona, 5 g/l extracto de levadura, 10 g/l NaCl.
Ajustar el pH a 7,5 con NaOH. Para preparar medio LB sólido, añadir 15 g/l agar.
Autoclavar.

Medio Yeast Extract Broth (YEB): 5 g/l extracto de carne, 1 g/l extracto de levadura,
5 g/l peptona, 0,5% sacarosa, 2 mM MgSO4. Ajustar el pH a 7,5 con NaOH. Para
preparar medio YEB sólido, añadir 15 g/l agar. Autoclavar.

6.1.2 Saccharomyces cerevisiae

La cepa de levadura S. cerevisiae empleada para la realización de los experimentos de

doble híbrido fue la AH109 (Clontech) cuyo genotipo (MATa, trp1-901, leu2-3, 112,

144
Materiales y métodos

ura3-52, his3-200, gal4 ∆, gal80∆, LYS2::GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3, GAL2UAS-

GAL2TATA-ADE2, URA3::MEL1UAS-MEL1TATAlacZ, MEL1) le confiere
auxotrofía para la leucina (L), el triptófano (T), la histidina (H), la adenina (A) y el
uracilo (U). Los cultivos se realizaron a 30ºC en medio rico YPD (suplementado con A
en ocasiones, YPDA) o medio mínimo SD suplementado con L, T, H, A o U, según el
caso.

6.2 Plásmidos y construcciones

6.2.1 Plásmidos

Los plásmidos usados en esta tesis se presentan a continuación en la siguiente tabla 6-1:

PLÁSMIDO SELECCIÓN USO REFERENCIA

pCR®II y pCR®2.1 Ampicilina Clonación de productos Invitrogen

(AmpR) de PCR

pENTRY3C Kanamicina Clonación de productos Invitrogen

(KmR) de PCR

pDONR 207 Espectinomicina Clonación de productos Gateway, Invitrogen

de PCR

pDONR 221 KmR Clonación de productos Gateway, Invitrogen

de PCR

pET-28ª KmR Sobreexpresión Novagen

proteínas en E.coli

pGEX4T1 AmpR Sobreexpresión Amersaham

proteínas en E.coli
Pharmacia Biotech

PDESTH1 AmpR Sobreexpresión Gateway

proteínas en E.coli
Vector con tag de MBP

pCambia 1302 KmR Vector binario utilizado

en transformación
transitoria CambiaTM

145
Materiales y métodos

pCambia 1303 KmR Vector binario utilizado CambiaTM

en transformación
transitoria

pCambia 2300 KmR Vector binario que fue CambiaTM

modificado para ser
utilizado en
transformación
transitoria (pCambia
2300 y dsRED tag;
pCambia 2300 y Myc
tag)

pGJ1425 AmpR Vector utilizado para la Jach et al., 2001

transformación
transitoria de células
vegetales

PLOLA AmpR Vector utilizado para la Ferrando et al., 2000

transformación
transitoria de células
vegetales

YFPN KmR Vector binario utilizado Ferrando et al., 2000

en transformación
transitoria para
Complementación
Bimolecular

YFPC KmR Vector binario utilizado Ferrando et al., 2000

en transformación
transitoria para
Complementación
Bimolecular

C-GFP AmpR Vector utilizado en Gateway, Invitrogen

transformación
transitoria

PGBKT7 Bacteria: KmR Vector usado para Clontech

Levadura: TRP1 ensayo de doble
híbrido;

dominio BD

PGADT7 Bacteria: AmpR Vector usado para Clontech

Levadura: ensayo de doble
LEU2 híbrido; dominio AD

PGBKT7 Bacteria: KmR Vector usado para Gateway

ensayo de doble

146
Materiales y métodos

híbrido;

dominio BD

PGADT7 Bacteria: AmpR Vector usado para Gateway

ensayo de doble
híbrido; dominio AD

Tabla 6-1. Plásmidos Usados.

Las concentraciones de antibióticos y suplementos utilizadas para la selección de las

bacterias fueron las siguientes:

Ampicilina: 100 µg/ml

Kanamicina: 25 µg/ml para bacterias y plantas
Rifampicina: 100 µg/ml
Espectinomicina: 100 µg/ml
IPTG: 23,8 µg/ml

6.2.2 Construcciones

Para efectuar el clonaje de ZmZIM91, se utilizaron plántulas de Zea Mays de la

variedad W64+/+ de 6 días de germinación, crecidas en rollo de papel y cámara de
germinación con un fotoperíodo de 16 horas luz a 28ºC/8 horas de oscuridad a 22ºC,
una humedad del 60% y 100% iluminación (20.000 luxes). Las semillas empleadas para
la germinación de plántulas se esterilizan con etanol absoluto por 5 minutos, luego se
retira el etanol y se adiciona hipoclorito cálcico (5g/100ml) durante 10 minutos,
posteriormente se realizan tres lavados con agua Mili-Q estéril y se resuspenden de
nuevo las semillas en hipoclorito cálcico durante 7 minutos, a continuación se dejan las
semillas 10 minutos dentro de una bomba de vacío y por último se realizan 5 lavados
con agua Mili-Q estéril de 10 minutos cada uno. Para llevar a cabo los análisis se tomó
por separado la parte aérea de las plántulas y la raíz y se congeló el material vegetal a -
80ºC.

Las construcciones utilizadas en el presente trabajo se listan en la tabla 6-2 junto con
sus dianas de clonaje y la región.

de pDONR 207 AtZML1 codificante
AtZML1

AtZML1 PGBKT7 Recombinación pDONR 207 Región

Tabla 6-3. Cebadores de ADN usados para realizar los clones en este estudio.

151
Materiales y métodos

En la Tabla 6-4, se muestran los cebadores utilizados para realizar la PCR semi-
cuantitativa de ChIP de protoplastos de maíz:

Nombre del cebador Secuencia cebador Forward (5´-3´) Secuencia cebador Reverse (5´-3´)
ICVB ChIP2009_Pico 1 CAAGACGTTCAACAACTGC AACCGACATCTCCGGGTCGT
ICVB ChIP2009_Pico 2 TGGACTCGTCAAAATCAGGACAGC TGCTGCGTGCGGTGCAGAATCC
ICVB ChIP2009_Pico 3 TACAAGCTAGAGCGCGTGGC TACTGCAGTTCGGTATTACA
ICVB ChIP2009_Pico 4 GGAGGAAACCAAGAAAGAA ACCTGTCCCAAACGGCCTA
ICVB ChIP2009_Pico 5 GCTGACGACAGCCATGCAC ACCCCAGTAGTCCTAGGCA
ICVB ChIP2009_Pico 6 TCAGTCCAGGACAATTAAT CTCTGTGAGGACTGAAGAG
ICVB ChIP2009_Pico 7 CCTACAAACCTTTCAGACA TAGGCCTATTATTGGAATG
ICVB ChIP2009_Pico 8 ATTGTTTGCATATGAGTCG TTTGCCATTTGTTTCTGCG
ICVB ChIP2009_Pico 9 ATTTGCTTTCGTCTCTCTC CAGTTACCAGCATGGTCGA
ICVB ChIP2009_Pico 10 AGGCTTTTTCTACGCAATC ACCGCTATGGTGAATTGGA
ICVB ChIP2009_Pico 11 ACAGCCAATCCACACCTCGCT TTTATGCCTCGAGATCCAA
ICVB ChIP2009_Pico 12 TAGCTCGAGCTATTTGGCT GCAGAAGTGGAACCCTGGG
ICVB ChIP2009_Pico 13 GGCAAGCGATTGTTCCATC GAGCAGCTGTTTTCGTGAT
ICVB ChIP2009_Pico 14 CTGATCCTTACACAACATT CGCTGATCCTCTGTTTTGA
ICVB ChIP2009_Pico 15 TCTGTACTTTCTCCTTTCA CGGAGGGAGGCCTTTATAG
ICVB ChIP2009_Pico 16 TGTTGGGAATACTTTCAGG TGGAGGTGCTCCAGGCTTG
ICVB ChIP2009_Pico 17 GGTGTAGAAACAGACAGCC CGAGCTTGACGCGTCCGCT
ICVB ChIP2009_Pico 18 GCCAGATGCAAAAGAGAACC ATTGCCTGGCTTTGTAGCAC
ICVB ChIP2009_Pico 19 CATGCGATGCGACAGTAGAT GGATTACCATCTCCCGGTCT
ICVB ChIP2009_Pico 20 TCGAATAATGATTGTCTATTG CGTCGTCTCACGTTCGCACGT
ICVB ChIP2009_Pico 21 AACTGGAAGAGAGGTCTTA GTGTTCTCCATTGGTGATT
ICVB ChIP2009_Pico 22 GCTGCCGCCTGCCGACGCG TCCACACAACTAACGGCCC
ICVB ChIP2009_Pico 23 ACCATACCATTCCCACACT CGGTGGACGGAGAGACAGG
ICVB ChIP2009_Pico 24 GCTGTTCATTTCAGACATG TAGCACCGCATTGTAATCT
ICVB ChIP2009_Pico 25 TCTATCCTTCTCGCGTTGG TCAACAGCCACCACCAGAC
ICVB ChIP2009_Pico 26 TGTTTCACTGACTCTTGGG AAGGTGACGCTGAAAAGAA
ICVB ChIP2009_Pico 27 ACTGCTAGAATGTGGCACG TCTTCAATGCTGGGCGCTC
ICVB ChIP2009_Pico 28 ATAAGGAGGACGAAGTTGG GGATCTGGAACCCTGCAAA
ICVB ChIP2009_Pico 29 GGTCTGCAGCATCCACGGC TGGGCGTGCGGGTGGGTGC
ICVB ChIP2009_Pico 30 GCGCGGGGCTTACGTGTTC ATCATCACCCTCATCCCCC
ICVB ChIP2009_Pico 31 GCCCAGTGCTGAAGCTTAC TTTCTTCGTCGTGAAGCTT
ICVB ChIP2009_Pico 32 CGTCTTCACCGCCTCGCCT CGGGTATATAGCCGTTGCC
ICVB ChIP2009_Pico 33 TGAGATCACGCTGTCACCA TGCGCGTGATGCGGTGGAG
ICVB ChIP2009_Pico 34 ACGTAGAACTGCCACTGACG TTCTCACTGACCGACTGACG
ICVB ChIP2009_Pico 35 TCGAGATGATGCAGCTTTTG GTTCATTCATCCGAGGAAGC
ICVB ChIP2009_Pico 36 ACTCTGGACGCTTGTTTGCT GTGTCACTCAGGGTCCGTCT
ICVB ChIP2009_Pico 37 ACAGACTTGGGCAATCCATC TGGTTGCTCGAGAACTGTTG
ICVB ChIP2009_Pico 38 GGCTTCCAGCTTCTCTCTGA CTGCTGGTGACCTGAATCAA
ICVB ChIP2009_Pico 39 AGGGTCAACTCAAACCGTTG CAAACGTTGTCTCGGTCAAA
ICVB ChIP2009_Pico 40 CACAAGCAGACGTGTCCAGT CATGCATTTGGAACAGTTGG
ICVB ChIP2009_Pico 41 GGTGTGGGGATTTTGAGTTG CCAAATTCACGCCGAATC
ICVB ChIP2009_Pico 42 GAAGACAAGGCGGAGTTCTG AATTTAGCACGACGGGTTTG
ICVB ChIP2009_Pico 43 GTGGTGGTCGGGTCGAGT CTGGGTAGCCCAGTTCCAC
ICVB ChIP2009_Pico 44 ATATCCGAATGCGAGAGCAG GGAACACTGTGCTGCCTGTA
ICVB ChIP2009_Pico 45 TGCACCAAGACAGACGGATA CCGGATTGTTTGTTGTCCTT
ICVB ChIP2009_Pico 46 CCTTCGAAATCGACAGCAC AACCACATCGCACTGGTTTT
ICVB ChIP2009_Pico 47 AAACAAGTCACCCGAACGAC TCAAGAAAACCGAACCCAAC

Tabla 6-4. Cebadores utilizados para la validación por PCR semi-cuantitativa de

los picos identificados en el ChIP-Seq proveniente de protoplastos de maíz.

152
Materiales y métodos

En la Tabla 6-5, se muestran los cebadores utilizados para realizar la PCR cuantitativa
de ChIP de protoplastos de maíz:

Nombre del cebador Secuencia cebador Forward (5´-3´) Secuencia cebador Reverse (5´-3´)
ICVB ChIP-QPCR_Pico 4 CCATGTAGCGGTGTAAGGG GGGACCAGACATTAGGAACC
ICVB ChIP-QPCR_Pico 7 TAAAGCCTTCTCGAGCCTCT TATCACATGTGCAGGACCAA
ICVB ChIP-QPCR_Pico 8 CAAATTGAATTGGCACCTTG TCAAATGAGAGACCAAAGTCAGA
ICVB ChIP-QPCR_Pico 10 CCTCTAGCCATTGGCAATTT GTCTGTGACCGATTGTTTGG
ICVB ChIP-QPCR_Pico 11 CCCTTCGGCTTATTATACGTG TGCCGATTCTGTAATTATGCTT
ICVB ChIP-QPCR_Pico 12 GGTGGAAACAAAGACAGGAGA GCTCAAGTTTACAGCTTTGCC
ICVB ChIP-QPCR_Pico 14 GCTCTGATATTAGGGCAGATCA GCACATTTGCTATGGCTTGT
ICVB ChIP-QPCR_Pico 15 TAGGGTTATCTGGGCCAAAC CTGCTGCTGCAGTCCTAGAG
ICVB ChIP-QPCR_Pico 16 AACAGTTACTTCGCCAACCC TGTTGAACCGAGGAGGCTAT
ICVB ChIP-QPCR_Pico 17 CATCTCGCACGTCGATAAGT TTCAGATTCCGAAACGACAG
ICVB ChIP-QPCR_Pico 20 AGTCAGTACCTAATCTGCATCCAC CACGTGGACGAGTTGCTAAG
ICVB ChIP-QPCR_Pico 21 GGATCTTAGTTAGATTTGTAGTGCGT CTGGGCATAGGCAAGACAC
ICVB ChIP-QPCR_Pico 23 GCCATACTGTCTCAGACCCA GGAAACGCACGAAGCTAAAT
ICVB ChIP-QPCR_Pico 24 GCCGATCTAGAAGCTACCCA GTGCATGCCAATCAGAGTGT
ICVB ChIP-QPCR_Pico 26 CAGGTGCATATGTTGAGCGT GTGATTCAAACGCGAGAAGA
ICVB ChIP-QPCR_Pico 28 TTGTAAAGTTGAAGCCCATTTG TCTCGTCGCCCTTTATTTCT
ICVB ChIP-QPCR_Pico 29 GCGAACGGCACGATTTAT CTGCTGTGCCTGTGCTGTA
ICVB ChIP-QPCR_Pico 34 CTATGCGACATCATGCGTTT CATCGGCACGTGAGATTC
ICVB ChIP-QPCR_Pico 35 TGGAACCCAGTACGCAATAA AGGAAGCGAGTTGGTCCTAA
ICVB ChIP-QPCR_Pico 36 GACGGCCACAAGTCAGAAA GTCCGTCTTGCTTTGCTTC
ICVB ChIP-QPCR_Pico 37 CTAGATGGCTGGATGCAGAA AGTTCCTTGGATGGTTGCTC
ICVB ChIP-QPCR_Pico 39 GGTGGCTGACCTGACTAGACT CCTACGGAACTACGGAAGGA
ICVB ChIP-QPCR_Pico 40 AAGGGCTTAGAGGTGACCAA TGGGATAGAGTGATGATGTGC
ICVB ChIP-QPCR_Pico 41 GTTGAAAGAGGAGGGATTGG CCGCGTCGCCTTTATTAT
ICVB ChIP-QPCR_Pico 42 AAACCAGCCCATAAATCCAG GCCGAAGTTCAAGAGAGGAG
ICVB ChIP-QPCR_Pico 43 TTCGCTTGGAGCTTTCTTCT GCCCAAATCTATACTGGGTAGC
ICVB ChIP-QPCR_Pico 44 ACAAGATTCGTCCTCGGAAC TGGAGGGCATTGTCATTGT
ICVB ChIP-QPCR_Pico 45 CCATTAATGAAGGCCGAGAG CGGATTGTTTGTTGTCCTTG
ICVB ChIP-QPCR_Pico 46 CCTTCGAAATCGACAGCAC TTGTCACCATCATGATCAACTC
ICVB ChIP-QPCR_Pico 47 GGATCGGAAGCTGACAGTG CACGAGGGTCCAAGTCATC
Copia-qPCR CGATGTGAAGACAGCATTCCT CTCAAGTGACATCCCATGTGT

Tabla 6-5. Cebadores utilizados para la validación por PCR cuantitativa de los
picos identificados en el ChIP-Seq proveniente de protoplastos de maíz.

153
Materiales y métodos

En la Tabla 6-6, se muestran los cebadores utilizados para realizar la PCR cuantitativa
de ChIP de hojas de plantas de maíz de 9 días:

Nombre del cebador Secuencia cebador Forward (5´-3´) Secuencia cebador Reverse (5´-3´)
COMT qPCR TCACGCAAACCTAACGCATA TATGCGCGCACTAATTCAAG
KM_qPCR_A1pr ox-A1 AGGAGCTCCAGCTAGATGTGTC CTGCAACTACCGGCATATCTCT
ICVB ChIP-QPCR_Pico 14 GCTCTGATATTAGGGCAGATCA GCACATTTGCTATGGCTTGT
Copia-qPCR CGATGTGAAGACAGCATTCCT CTCAAGTGACATCCCATGTGT
KM_qPCR_Bz1 prox-A1 CATACGGCACAGGTTTAGTCAC GATTGTCACGGGATCTGGTCTA
ZmActin TTTAAGGCTGCTGTACTGCTGTAGA CACTTTCTGCTCATGGTTTAAGG
ZmCOMT3’-UTR TCTGCGTCGAATTGTCTCTGC GAGAGCAATTAAACCGCCATGT

Tabla 6-6. Cebadores utilizados para la validación por PCR cuantitativa de los
picos identificados en el ChIP-Seq proveniente de hojas de plantas de maíz.

6.3 Métodos

6.3.1 Técnicas empleadas para el clonaje de ADN.

El proceso de elaboración de una construcción implica la utilización de múltiples

técnicas que a continuación se detallan. Todos ellas se han extraído o se han basado en
los protocolos descritos en los manuales Molecular Cloning: A laboratory Manual
(Sambrock y Russel, 2001) y Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al.,
1989).

6.3.2 Preparación de células competentes

6.3.2.1 Obtención de células competentes por choque térmico de Escherichia coli

El protocolo seguido para la preparación de células competentes de E.coli para

transformación por choque térmico es el descrito por Hanahan (Hanahan, 1983).

6.3.2.2 Obtención de células competentes por choque térmico de Agrobacterium

tumefaciens

Para la preparación de células competentes por choque térmico de Agrobacterium

tumefaciens, se inocula una colonia en 2 ml de medio YEB suplementado con
rifampicina (Rf) y carbenicilina (Cb), se incuba O/N a 28ºC, posteriormente se inocula

154
Materiales y métodos

50 µl del cultivo inicial en 50 ml de medio YEB-Rf-Cb y se incuba a 28ºC en agitación

hasta que alcanza una densidad óptica (OD600) de 0,5-0,8. Se deja enfriar el cultivo en
hielo durante 15-30 minutos. Se centrifuga el cultivo a 5000 rpm durante 5 min a 4ºC.
Luego el sobrenadante se descarta y el pellet se resuspende en 10 ml de solución A fría
a 4ºC. Posteriormente, se centrifuga a 5000 rpm durante 5 min a 4ºC. Se vuelve a
descartar el sobrenadante y se resuspende el pellet en 1 ml de solución fría a 4ºC de 20
mM CaCl2. Finalmente se generan alícuotas de 50 µl, que son congeladas en nitrógeno
líquido y guardadas a -80ºC.

Solución A: 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA pH 8.

6.3.2.3 Transformación de células competentes de Escherichia Coli por choque

térmico

Para la transformación de E.Coli se añade primero 50-100 ng de ADN plasmídico o el

producto de ligación a una alícuota de células competentes, previamente descongelada
en hielo. A continuación el ADN y las células, se mezclan y se incuban en hielo durante
20-30 minutos. Luego se aplica un choque térmico de 42ºC durante 45 segundos. Se
incuban las células en hielo durante 2 minutos. Se añade 800 µl de medio LB, se
incuban durante 45-60 minutos a 37ºC en agitación. Se centrifugan a 6000 rpm durante
1 minuto. El sedimento bacteriano se resuspende en 200 µl del sobrenadante. Y
finalmente se siembra en placas de LB (con el antibiótico correspondiente para la
selección de transformantes) y se incuban a 37ºC, en posición invertida, durante toda la
noche (12-16 h).

6.3.2.4 Transformación de células competentes de Agrobacterium tumefaciens por

choque térmico

Para la transformación de Agrobacterium, en primer lugar se añade 1 µg de ADN

plasmídico a una alícuota de 30 µl de células competentes, se mezclan e incuban en
hielo durante 5 minutos. Se introduce la muestra en nitrógeno líquido durante 5 minutos
y seguidamente en un baño a 37°C durante 5 minutos más. Posteriormente, se añade 1
ml de medio YEB a la muestra y se incuba durante 3-4 horas a 28°C. Se centrifuga 5

155
Materiales y métodos

minutos a 2000 rpm. Las células se resuspenden en 200 µl de medio YEB Rif-
antibiótico correspondiente al vector usado. Las placas son incubadas a 28°C protegidas
de la luz, durante 2 días aproximadamente (hasta la aparición de colonias). Luego, se
seleccionan algunas colonias y se inoculan en 3 ml de medio YEB suplementado con
los antibióticos correspondientes. Y finalmente se crecen los cultivos hasta saturación a
28°C y con agitación.

6.3.3 Obtención de ADN plasmídico

Para la obtención de ADN plasmídico, se sigue el protocolo del kit comercial Plasmid
Mini Kit (QIAGEN®). Asimismo, para obtener mayores cantidades de ADN plasmídico
se elaboraron MaxiPreps con el QIAGEN® Plasmid Purification Kit, usando el
protocolo propuesto por la casa comercial (Ver Handbook QIAGEN Plasmid Midi,
Maxi, Mega, and Giga Kits. For purification of ultrapure plasmid DNA).

6.3.4 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

La amplificación de fragmentos de ADN por el método de la reacción en cadena de la

polimerasa (PCR) se utilizó para elaborar construcciones o comprobar la presencia del
inserto de interés en las colonias transformadas.

Las enzimas ADN polimerasa termoestables empleadas fueron las comerciales Pfu DNA
Polymerase (Stratagene) y Ex TaqTM Polymerase (Takara), todas ellas con una baja
tasa de error (HF, high fidelity). Para el clonaje de fragmentos se utilizaron ambas Taq
combinadas y para la comprobación de insertos de interés en colonias se usó
únicamente la Takara.

Debido a que la secuencia de ADN de ZmZIM91 tiene un alto contenido de GC, la PCR
para la obtención del clon presentaba bandas inespecíficas (Figura 6-1A). Para solventar
dicho problema, se realizó un experimento utilizando diferentes cantidades de Betaina y
DMSO (Figura 6-1B) (Henke, 1997) y se determinó que las condiciones 1 donde se usó
DMSO al 5% eran las óptimas ya que se obtuvo una banda específica.

156
Materiales y métodos

A Marcador B Marcador
de peso de peso
molecular PCRs sin DMSO/Betaina molecular PCRs con DMSO/Betaina

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1092pb
ZmZIM91

Figura 6-1. Puesta a punto de condiciones óptimas de PCR para la obtención del
clon de ZmZIM91. En (A) se observan bandas inespecíficas en las direntes PCRs
realizadas sin DMSO y sin Betaina, usando oligos específicos para la obtención del clon
completo de ZmZIM91. Para la amplificación de ZmZIM91 se utilizaron diferentes
cDNAS: 1. Raíz control, 2. Hoja control, 3. Hoja sequía, 4. Raíz sequía y 5. Hoja NaCl.
En (B) se muestran diferentes condiciones de PCRs usando oligos específicos para la
obtención del clon completo de ZmZIM91 y DMSO y/o Betaina. En todos los casos fue
utilizado cDNA de Hoja control. Las diferentes condiciones fueron: 1. DMSO 5%, 2.
DMSO 10%, 3. Betaina 1M, 4. Betaina 2M y 5. Betaina 2M+DMSO 5%.

Las condiciones generales para realizar la PCR se muestran a continuación (Tablas 6-7
y 6-8), aunque para cada caso en particular se modificó la temperatura de
emparejamiento (unos 2-5ºC por debajo de la Tm del cebador con la Tm más baja), el
tiempo de extensión (las ADN polimerasas incorporan aproximadamente 1 kb/min) o el
número de ciclos para optimizar la amplificación. El volumen de reacción utilizado fue
en la mayoría de casos de 50 µl.

PCR MIX

cDNA molde 1 µl

Primer Fw 0,5 µl (10 mM)

Primer Rv 0,5 µl (10 mM)

dNTPs 4 µl

Buffer 10X 5 µl

DMSO 2,5 µl (5%)

Taq TaKara 0,25 µl

Pfu 0,5 µl

H2O Hasta 50 µl

Tabla 6-7. Condiciones generales de PCR.

157
Materiales y métodos

1 ciclo 2 min 94ºC Pre-desnaturalización

X ciclos (entre 24 y 35) (1) 15 seg 94ºC Desnaturalización

30 seg XºC (2) Hibridación

X seg 72ºC (3) Extensión

1 ciclo 5 min 72 ºC Extensión final

Tabla 6-8. Condiciones de la reacción de PCR.

(1) El número de ciclos de amplificación depende del tipo de PCR: para comprobar la
presencia de un inserto normalmente es de 30 ciclos y para clonar fragmentos de ADN es de
30 ciclos, y en el caso de análisis de expresión por RT-PCR de 25.
(2) En general, se ha utilizado una temperatura 2ºC inferior a la Tm del cebador con Tm
más baja.
(3) Depende de longitud del fragmento; la Taq incorpora 1Kb/min.

6.3.5 Digestión enzimática del ADN plasmídico

La digestión con enzimas de restricción permite la liberación del inserto, el gen

reportero o el gen de resistencia antibiótica, con el fin de verificar el estado de una
construcción. Una unidad de enzima es la cantidad necesaria de enzima para digerir 1
µg de ADN durante 1 hora a 37ºC, en el tampón apropiado. En general las digestiones
se llevaron a cabo utilizando 5 µl de ADN. Las enzimas que han sido empleadas durante
este trabajo pertenecen a las casas comerciales Fermentas o Roche.

6.3.6 Electroforesis de fragmentos de ADN y ARN en gel de agarosa

La migración electroforética de las PCRs de cDNA se ha llevado a cabo, en geles de

agarosa al 1%, al igual que para digestiones y prácticas estándar, mientras que para las
PCR semi-cuantitativas de ChIP se usaron geles de agarosa al 2%.

Para el ARN se usaron geles de 1,5%, con 0,05% de bromuro de etidio.

Para cargar el ADN y el ARN en el gel se añade tampón colorante de carga en el gel. La
migración se realiza, normalmente, a un voltaje constante de 100 Voltios en 1X TAE.

158
Materiales y métodos

Soluciones:

• TAE 1X: 40 mM Tris Base, 20 mM HAc, 2 mM EDTA pH 8.

• Tampón de carga 10X: 0,25% azul de bromofenol, 0,25% xileno cianol, 50% glicerol,
10 mM EDTA pH 8.

6.3.7 Extracción y purificación de fragmentos de ADN, reacción de ligación y

recombinaciones

Para la extracción de fragmentos de ADN desde gel de agarosa, tras la migración de los
mismos, se ha utilizado el kit QIAquick® Gel Extraction Kit (QIAGEN), según las
indicaciones del fabricante. Una vez purificados, los productos de PCR en el caso de los
vectores de clonaje con enzimas de restricción, fueron ligados siguiendo las
instrucciones de la casa comercial. En el caso de los fragmentos de ADN digeridos, las
ligaciones se realizaron en un volumen de 10 µl y una unidad de enzima T4 ligasa
(Roche). Por regla general, la proporción de ADN de inserto y vector empleada fue de
3:1. Las reacciones se incubaron a 4ºC durante 14 horas.

Para los clones que fueron hechos utilizando vectores de tecnología Gateway de
Invitrogen, las reacciones fueron llevadas a cabo con BP en el caso de un vector de
entrada o con LR en caso de un vector de destino, siguiendo el protocolo proporcionado
por Invitrogen.

6.3.8 Cuantificación de ácidos nucleícos

La cuantificación de ácidos nucleicos se ha realizado por espectrofotometría utilizando

un NanoDrop® ND-1000 Spectrophotometer y el programa informático ND-1000
V3.1.0 (NanoDrop Technologies Inc.).

6.3.9 Extracción y purificación de ARN de maíz

El material vegetal usado para la extracción de ARN, fueron plántulas de Zea Mays de
la variedad W64+/+ de 6 días de germinación, crecidas en rollo de papel y cámara de

159
Materiales y métodos

germinación con un fotoperíodo de 16 horas luz a 28ºC/8 horas de oscuridad a 22ºC,

una humedad del 60% y 100% iluminación (20.000 luxes).

El ARN en todos los casos, fue elaborado usando Trizol.

Se deben utilizar morteros libres de RNasas, a continuación, se trituran 300 mg de

material vegetal con nitrógeno (N2) líquido hasta obtener un polvo fino, posteriormente
se resuspende el tejido macerado en 1 ml de Trizol, la muestra se deja a temperatura
ambiente durante 5 minutos para permitir la completa disociación de los complejos
nucleoprotéicos, se adiciona 0.2 ml de cloroformo, se agitan los tubos durante 15
segundos y se dejan 3 minutos a temperatura ambiente. Las muestras se centrifugan a
12,000 x g por 15 minutos a 4ºC. El sobrenadante se transfiere a un nuevo tubo y se
añade 0.5 ml de isopropanol, la muestra se incuba durante 10 minutos a temperatura
ambiente y luego se centrifuga a 12,000 x g durante 10 minutos a 4ºC. Posteriormente el
sobrenadante se retira y el pellet se lava con etanol fresco al 75%, por último se
centrifuga la muestra a 7,500 x g durante 5 minutos a 4ºC, se retira el sobrenadante, se
deja secar el pellet a temperatura ambiente durante 15 minutos y se resuspende el ARN
en agua milli-Q libre de RNasas.

6.3.10 Elaboración de cDNA

Para la elaboración del cDNA se usaron las muestras de ARN obtenidas como se indica
en el apartado anterior y el Kit QuantiTect® Reverse Transcription, siguiendo el
protocolo de QIAGEN (Handbook For cDNA synthesis with integrated removal of
genomic DNA contamination. For use in real-time two-step RT-PCR).

6.3.11 Transformación transiente en protoplastos de maíz

Para el aislamiento de protoplastos, se utilizó la hoja 2 de plantas de la línea híbrida B73

x MO17 crecidas durante 13 días en condiciones de oscuridad a 28ºC y con un 70% de
humedad.

El material conformado por grupos de 12 hojas debe ser cortado cuidadosamente con
cuchillas quirúrgicas y sobre una superficie de vidrio para evitar causar herida ya que

160
Materiales y métodos

reduce la eficiencia de obtención de protoplastos. Las finas capas del material vegetal
cortado, se colocan en un erlenmeyer con la solución enzimática, posteriormente se les
aplica vacío durante 15 minutos. El erlenmeyer con el material vegetal se pone en
agitación a 50 rpm, durante 2.5 horas en oscuridad, luego para liberar los protoplastos se
aumentan las revoluciones por minuto a 90 durante 30 minutos más. Los protoplastos
son filtrados a través de un filtro de 35um de poro y lavados con 10 ml de buffer A. A
continuación se da un spin a 1000 rpm por 2 minutos y se remueve el sobrenadante
cuidadosamente para no tocar el pellet (protoplastos) dejando 1 ml de buffer A. Se lavan
con 10 ml de buffer A, se resuspenden delicadamente, de nuevo se llevan a la centrifuga
a 1000 rpm por 2 minutos y se repite el lavado una vez más. La transformación de los
protoplastos se realiza mediante electroporación de la siguiente forma: se adiciona 20
µg de ADN y buffer A a las cubetas de electroporar de 2mm (150ul en total), se mezcla
el ADN con el buffer A y luego se adiciona 150 µl de protoplastos (1-2x105), se mezcla
con cuidado y posteriormente se electroporan a 0.15V, con dos pulsos a 200 UF. Los
protoplastos electroporados se recuperan de la cubeta con 700 µl de buffer A y se
transfieren a nuevo tubo. Por último, las muestras deben ser guardadas durante 14 horas
a temperatura ambiente, en oscuridad y en posición horizontal.

Reactivos:

Buffer A: 0.6M Manitol, 10mM KCL, 10mM MES.

Solución enzimática: 10 ml de buffer A, Celulasa 0.3g, macerozima 0.06g.

Resuspender en el buffer A la celulasa y la macerozima con una espátula. Nota: No usar
vórtex, ya que las enzimas son sensibles al oxígeno. Incubar la solución enzimática 10
minutos a 55ºC, llevar a temperatura ambiente colocando la solución sobre hielo.
Adicionar 50ul 1M CaCl2 y 100ul 10% BSA, mezclar cuidadosamente. Darle un Spin a
la solución enzimática por 1 minuto a 4000 rpm antes de usar.

Equipamento: 35um mesh, cuchillas quirurgícas, superficie de vidrio para cortar,

erlenmeyer.

161
Materiales y métodos

6.3.12 Transformación transitoria por biolística en epidermis de cebolla

Para la preparación de la muestra biológica, las células epidérmicas de escamas de

bulbo de cebolla se colocan en placas con medio MS con Manitol, 4 horas antes de
bombardear. La preparación de partículas de oro se realiza de la siguiente manera: En
un eppendorf de 1,5 ml de la marca Treff Lab, se pesan 60 mg de partículas y se añade 1
ml de EtOH HPLC. El oro es agitado en un vórtex durante 10 minutos. A continuación
se centrifugan las partículas de oro 1 minuto a 10000 rpm y se descarta el sobrenadante.
Posteriormente, se añade 1 ml de glicerol estéril 50% al eppendorf que contiene las
partículas de oro y luego, el eppendorf se agita con vórtex durante 30 segundos. El
paso 2 es repetido y se realizan dos lavados más con glicerol. Las partículas de oro se
resuspenden en 1 ml de glicerol estéril 50%, y se agitan con vórtex durante 1 minuto.
Finalmente, se reparten alícuotas de 20 µl que son mantenidas a -20ºC hasta su uso.

Para realizar la precipitación del ADN, las partículas de oro preparadas anteriormente
son sonicadas durante 15 segundos antes de ser utilizadas, a continuación se agitan con
vórtex las partículas (20 µl), y se añaden al mismo tiempo (todo en frío y en agitación):
1,5 µg/µl de DNA (en un total de aproximadamente 10 µl), 50 µl CaCl2 2.5 M, 20 µl
espermidina 0,1 M, este paso se realiza durante 10 minutos, posteriormente las muestras
se incuban 15 min en hielo, luego se da un spin de centrifuga, se descarta el
sobrenadante y se añade 250 µl de EtOH HPLC frío. Las muestras se agitan
manualmente de 3-5 minutos. Posteriormente se realiza un spin de centrifuga 15
segundos a 5000 rpm y se descarta el sobrenadante. A continuación se añade 120 µl de
EtOH HPLC frío y se incuban las muestras hasta el momento de bombardear. Sobre la
membrana utilizada para el bombardeo, se colocan 10 µl de las partículas de oro que
contienen el ADN y la membrana se deja secar de 5-10 minutos. Las epidermis de
cebolla son bombardeadas con el PDS1000/He, realizando dos disparos por cada placa
Petri, girando la placa 90º entre cada disparo. Y finalmente la epidermis bombardeada
es incubada en oscuridad a 22-24 ºC durante 16-24 horas.

162
Materiales y métodos

6.3.13 Transformación transitoria de hojas de tabaco mediante infiltración de

Agrobacterium

La cepa de Agrobacterium es transformada por choque térmico con las construcciones

de interés, luego se siembran y se dejan 2 días a 28°C. Posteriormente, se inocula una
colonia en 30 ml de medio YEB Rif-Kana y se deja toda la noche a 28°C en agitación a
250 rpm. Al día siguiente el cultivo es centrifugado, y se diluye el pellet en la solución
de inducción, se deja a temperatura ambiente durante 2 horas y finalmente se infiltra el
Agrobacterium con una jeringa de 2 ml en las hojas de las plantas de tabaco (Nicotiana
Benthamiana) de un mes.

Buffer de inducción (200ml): 196 ml de agua Mili-Q, 2 ml de MgCl2 1M, 2 ml MES

1M, pH 5,6 con KOH, 200 µl de Acetosiringona.

6.3.14 Obtención de proteínas recombinantes

En la presente tesis fueron producidas dos tipos de proteínas recombinantes: unas

fusionadas a una etiqueta de 6×His y otras fusionadas a GST. Las primeras sirvieron
para la obtención de dos anticuerpos policlonales contra la proteína ZmZIM91y el
estudio de su actividad quinasa in vitro e in vivo, y las segundas para realizar la
purificación del anticuerpo producido contra la proteína ZmZIM91. En ambos casos la
sobre-expresión se llevó a cabo en la cepa bacteriana E. coli BL21.

6.3.14.1 Sobreexpresión de proteínas recombinantes fusionadas a His o GST en

E.Coli BL21

Inicialmente, se transforman las células competentes de E.coli BL21 con las

construcciones y se seleccionan en placas con la resistencia adecuada. Se inocula una
colonia en 4 ml LB-antibiótico correspondiente y se incuba toda la noche a 37ºC a 250
rpm. Posteriormente, se inocula 1 ml cultivo en 500 ml de LB con la resistencia
adecuada (dilución 1:50), se deja crecer a 37º C hasta que alcance una OD600 de 0,7-0,8
(tarda unas 2h). Se guarda una alícuota de 1ml de cultivo (control negativo pre-
inducción). Luego se lleva a cabo una inducción con IPTG 1mM (alternativamente se
puede utilizar 0,5 mM IPTG, el crecimiento de la bacterias es más lento pero favorece la

163
Materiales y métodos

producción de las proteínas en la fracción soluble más que en los cuerpos de inclusión)
y se deja crecer de 3-5 horas a 37ºC en agitación a 250 rpm. Se centrifuga el cultivo a
6500 rpm durante 15 min a 4ºC, se recoge el pellet bacteriano y se guarda a -20 ºC para
su posterior purificación.

6.3.14.1.1 Extracción y purificación de proteínas recombinantes fusionadas a His o

GST y sobreexpresadas en E.Coli BL21

Las proteínas producidas durante el desarrollo de esta tesis se encontraban en la fracción

soluble. Se procedió entonces a su extracción y purificación, usando los protocolos
específicos para proteínas fusionadas a 6×His o a GST.

6.3.14.1.2 Obtención de proteínas recombinantes fusionadas a His

La extracción de proteínas bacterianas y purificación se hizo siguiendo el protocolo de

Quiagen para obtención de proteínas fusionadas a His-tag.

La proteína de interés se expresa como una proteína de fusión con el marcador His-Tag
en su extremo N-terminal. Este marcador interacciona con el NiSO4 presente en la
resina con la que se purifica la proteína, que se eluye con una solución que contiene
imidazol, el cual disrupciona la interacción anterior. Se utiliza una columna Poly-Prep®
Chromatography (BioRad) equilibrada con la resina comercial Chelating Sepharose
Fast Flow (Amersham Biosciences) cargada con iones Ni2+. Los pasos para equilibrar la
columna son los siguientes: Se añade 500 µl de resina Chelating Sepharose Fast Flow a
la columna, posteriormente se lava la columna con 10 ml de agua destilada y se pasan
20 ml de Charger buffer 1X en dos pasos de 10 ml cada uno, luego se pasan 10 ml de
binding buffer para quitar el exceso de níquel de la columna y finalmente se pasa la
muestra por la columna. Para la elución de la muestra, se lava la columna con 5 ml de
wash buffer a 20 mM, 40 mM, 60 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM y 500
mM de imidazol, se recogen las fracciones y se realiza un gel SDS-PAGE que se tiñe
con Coomassie blue para detectar la fracción que contiene la mayor concentración de
proteína y la mayor pureza. Todos los pasos se realizan a 4ºC.

164
Materiales y métodos

Tampón de carga 8X : 50 mM NiSO4.

Tampones de lavado: 20 mM Tris-HCl pH 7,9, 0,5 M NaCl, entre >20 y <100 mM

imidazol.

Tampones de elución: 20 mM Tris-HCl pH 7,9, 0,5 M NaCl, entre 100 mM y hasta 1

M imidazol.

6.3.14.1.3 Obtención de proteínas recombinantes fusionadas a GST

El pellet bacteriano se resuspende en 20 ml de tampón NETN suplementado con los

inhibidores de proteasas 1 mM de PMSF, 1 µM de pepsatina, 2 µg/ml de aprotinina y 2
µg/ml de leupeptina. A continuación, se realiza la sonicación del pellet resuspendido
3x45 segundos con una potencia 4-5 al 50-60%, manteniendo la muestra en hielo.
Luego, se centrifuga la muestra a 3500 rpm durante 30 min a 4ºC, se recupera el
sobrenadante y se repite la centrifugación, se vuelve a recuperar el sobrenadante y se
guarda a 4ºC hasta el momento de la purificación.

La preparación de la resina GSH-sefarosa e inmovilización de las proteínas

recombinantes fusionadas a GST se lleva a cabo siguiendo los pasos mencionados a
continuación: Se lava 1 ml de ‘slurry’ al 50% de resina GSH-sefarosa (Amersham
Pharmacia Biotech) con 3x5 ml (10 vol.) de NENT. Entre lavado y lavado se dejan
precipitar las bolas por gravedad, a las que se les añade el lisado obtenido en el apartado
anterior (unos 20 ml) y se mantienen en rotación a 4ºC durante 14 horas. Al día
siguiente las bolas se lavan con 3x2 ml (4 volúmenes) de NENT-0,7 M NaCl, 3x4
volúmenes de NENT y 2x4 volúmenes de tampón TST. Por último la proteína se eluye
usando 2 ml de Glutathione Elute Buffer frío.

Tampón NaCl-EDTA-Tris-NP40 (NETN): 0,1 M NaCl, 1 mM EDTA pH 8, 20 mM

Tris-HCl pH 8, 0,5% NP40.

Tampón TST: 50 mM Tris-HCl pH 8, 0,15 M NaCl, 0,1% Triton X-100.

165
Materiales y métodos

Glutathione Elute Buffer: 50 mM Tris-HCl, 30 mM Reduced Glutathione, pH 8.0.

6.3.15 Obtención de anticuerpos policlonales contra la proteína ZmZIM91

La producción de los dos anticuerpos contra la proteína ZmZIM91 fue realizada en el

servicio de animalario del Centro de Investigación y Desarrollo (CID-CSIC).

Se inmunizaron dos conejos con tres inyecciones subcutáneas de 150 µg (1 ml) de

proteína recombinante ZmZIM91 purificada por gel de acrilamida y disuelta en 50 mM
Tris-HCl pH 7,5. Antes de comenzar la inmunización de los conejos, se les extrajo
sangre para obtener suero preinmune. Después de la primera dosis, el resto de dosis se
inyectaron en intervalos de tres semanas, tras las cuales se procedió a desangrar a los
animales. La sangre extraída proveniente de cada conejo, fue alícuotada en tubos de 1
ml que fueron guardados a -80 ºC para su adecuada conservación.

6.3.16 Purificación de anticuerpos policlonales contra la proteína ZmZIM91

Los anticuerpos específicos de ZmZIM91 fueron purificados siguiendo el método

descrito por Bar-Peled (Bar- Peled y Raikhel, 1996). La resina sefarosa GSH-sepharose
resin (1 ml de 50% “slurry”) (Qiagen, Valencia, CA) debe ser equilibrada con buffer
(50 mM Tris pH 7.5; 150 mM NaCl; 0.5 % Trition-X). A continuación la resina se
incuba con la proteína ZmZIM91 fusionada a GST durante dos horas en rotación a 4°C.
Posteriormente, la resina se recupera por centrifugación (500g, 2 minutos) y se lava
cinco veces con 10 ml de buffer. Seguido al paso de lavado, únicamente la GST o la
proteína fucionada a GST permanece unida a la resina sefarosa GSH. Para la unión
covalente a las bolas de sefarosa GSH de la proteína ZmZIM91 fusionada a GST, la
resina es lavada dos veces con 10 ml de 0.2 M borato-NaOH (pH 8.6), cada 5 minutos.
El sobrenadante se remueve después de la centrifugación (500g, 2 minutos), y se
adiciona 2 ml de solución fresca de DMP (2 ml 0.2 M trietanolamina, pH 8.3; 15.5 mg
de dimetil pimelimidato-HCl, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a 1 ml de resina (la
concentración final de DMP debe ser de 20 mM). Después de 30 minutos de mezcla
continua a temperatura ambiente, las muestras se centrifugan (500g, 2 minutos) y el
sobrenadante se remueve. La reacción de unión se detiene con la adición de 0.2 M
etanolamina-HCl (pH 8.2) por 1 hora, luego la resina se lava dos veces por 3 minutos

166
Materiales y métodos

con 2 ml de 0.1 M glicina-HCl (pH 2.5), para remover las moléculas no unidas
covalentemente. La resina se lava dos veces con 10 ml TBS (50 mM Tris pH 7.5; 150
mM NaCl). Posteriormente, se adiciona el anticuerpo de ZmZIM91 a la resina que tiene
unida la proteína ZmZIM91 fusionada a la GST. Después de 4 horas de mezcla
continua a 4°C, se realiza un spin de la resina (500g, 2 minutos, 4°C), se descarta el
sobrenadante, y se lava la resina cinco veces, durante 5 minutos cada vez, con 10 ml de
TBS frío, seguido por dos lavados con 1 ml de 0.1x TBS. Los anticuerpos específicos se
eluyen incubando la resina durante 5 minutos con 0.5 ml de 0.1 M glicina-HCl (pH 2.5).
El pH del anticuerpo eluído purificado se debe ajustar a 7 con 2 M Tris-HCl.

6.3.17 Análisis de proteínas mediante western blot

Para los tratamientos de MeJA y MeJA +MG132, fue usada la base de la hoja 2 de
plantas de 9 días de la línea homocigótica B73 (4 cm a partir de la base de la hoja,
donde según datos de RNA-Seq, habían mayores niveles de expresión de ZmZIM91 (Li
et al., 2010)), crecidas bajo un fotoperiodo de 16 horas de luz a 28°C y 8 horas de
oscuridad a 28°C, con un porcentaje de humedad del 60-70%. En cada caso se hicieron
3 réplicas biológicas usando grupos de 3 plantas para cada una.

Los tratamientos de las plantas de maíz con MeJA fueron realizados como se indica a
continuación: Se esparce sobre las hojas de las plantas de maíz 0,01% de MeJA diluido
en agua destilada (inicialmente el MeJA se diluye en DMSO hasta una concentración
del 10%), con ayuda de un spray, de igual manera se llevan a cabo los tratamientos con
el control con DMSO diluido en agua destilada.

En el caso de los tratamientos de plantas de maíz con MeJA +MG132, se siguieron los
mismos pasos que para los tratamientos con MeJA. Los tratamientos fueron hechos con
0,01% de MeJA mezclado con 100 µM de MG132 y diluidos en agua destilada. Para el
control se usa DMSO diluido en agua destilada.

Para llevar a cabo el análisis de la proteína ZmZIM91 in vivo, se utilizó el anticuerpo

purificado ZmZIM91#1.

167
Materiales y métodos

6.3.17.1 Obtención de extractos proteicos vegetales

Se obtuvieron extractos protéicos de hoja de maíz de 9 días llevando a cabo el siguiente

procedimiento: Se tritura en un mortero el tejido congelado con nitrógeno líquido. Se
transfiere el material pulverizado a un eppendorf. Se añade el tampón de extracción que
debe ser aproximadamente un tercio del volumen de material pulverizado, y se realiza
un vórtex vigoroso cada 3 minutos durante 20 minutos, manteniendo las muestras en
hielo. Finalmente, se centrifugan las muestras a 12.000 rpm durante 15 minutos a 4°C y
se transfieren los sobrenadantes a nuevos tubos eppendorf. Los extractos de proteína se
pueden guardar a -20°C.

Tampón de extracción de proteínas: 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA, 1 mM

DTT, 150 mM de NaCl, 5X de inhibidores de proteasas.

6.3.17.2 Cuantificación de proteínas

Para determinar la concentración de proteínas se utilizó el método estándar descrito por

Bradford (1976). Su rango de detección varía entre 1-20 µg/ml y se basa en el cálculo
de una recta de regresión a partir de una serie de diluciones de concentración conocida.

6.3.17.3 Electroforesis de proteínas en gel SDS-PAGE y tinción de comassie

La electroforesis en gel desnaturalizante de SDS/poliacrilamida (SDS-PAGE) se realizó

según Sambrook y col. (1989), utilizando los sistemas Miniprotean Gel-2 y 3 (Biorad),
con espaciadores de 1,5 mm. El voltaje utilizado fue de 80-100 V.

Soluciones:

• Lower Buffer: 1,5 M Tris HCl pH 8,8; 0,4% SDS

• Upper Buffer: 0,5 M Tris HCl pH 6,8; 0,4% SDS
• Tampón de electroforesis 10X: 1,92 M glicina; 0,25 M Tris HCl, pH 8,3; 1% SDS
• Tampón de muestras 2X: 125 mM Tris HCl pH 6,8; 4% SDS; 20% glicerol; 0,04%
azul de bromofenol

168
Materiales y métodos

• Poliacrilamida (SDS-PAGE)

6.3.17.4 Visualización de las proteínas por tinción de coomassie

Una vez finalizada la electroforesis, el gel se tiñe con una solución de azul de
Coomassie durante 20 minutos a temperatura ambiente y luego se destiñe con
metanol/acetico/agua (30:10:60), hasta poder ver las bandas de proteínas.

Solución de Coomassie: 50% (p/v) ácido tricloroacetico; 0,45% (p/v) Coomassie

Brilliant Blue (Sigma)

6.3.17.5 Transferencia de proteínas y tinción de ponceau

La transferencia de las proteínas separadas en gel SDS-PAGE a membranas de

nitrocelulosa se realizó con el aparato Transfer Blot Semidry (Bio-Rad), durante 45 min
y con un amperaje constante de 20V/gel. La transferencia se realiza con los elementos
en el siguiente orden: papel Whatman 3MM, membrana de nitrocelulosa, gel de
poliacrilamida y papel Whatman 3MM, todos ellos embebidos en tampón de
transferencia.

Después de la transferencia, las membranas se tiñen con rojo ponceau para comprobar
la correcta transferencia de las proteínas, para ello las membranas se sumergen en
solución de ponceau durante 1 minuto en agitación suave. Posteriormente, se lavan las
membranas con PBS 1X para quitar el exceso de ponceau y se bloquean con leche
diluída en PBS 1X durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de este
procedimiento las membranas se incuban con el anticuerpo como se explica a
continuación o también se pueden dejar secar y guardar para futuras hibridaciones con
el anticuerpo de interés.

Solución de Ponceau: 0,1% Ponceau disuelto en 1% (v/v) ácido acético.

169
Materiales y métodos

6.3.17.6 Hibridación e inmunodetección mediante ECL

Para la hibridación e inmunodetección mediante ECL, después del bloqueo de la

membrana, se añade la solución con el anticuerpo primario y se incuba durante 14 horas
a 4ºC y en agitación suave. Al día siguiente se realizan 3 lavados de 10 minutos con 1X
PBS-T. Se adiciona la solución con el anticuerpo secundario y se incuba durante 1 hora
a temperatura ambiente. Luego, se realizan 3 lavados de 10 minutos con 1X PBS-T y se
mantiene la membrana en PBS-T, hasta ser revelada utilizando el equipo LAS 4000.
Los dos reactivos del kit de detección ECL (Amersham) en relación 1:1 (1 ml de mezcla
por membrana) se mezclan y se reparten sobre la membrana que ha sido previamente
colocada con la superficie donde están las proteínas hacia arriba, sobre un plástico
transparente y finalmente se introduce dentro de LAS 4000, se selecciona las
condiciones de preferencia que para este trabajo fueron en el caso de la detección del
anticuerpo: Chemiluminescent, incremento, cada 10 segundos y en el caso de la
membrana para obtener la imagen del marcador de color: White, presición, 60
segundos. Finalmente se capturan las imágenes y se sobreponen ambas imágenes para
para identificar el tamaño de las bandas detectadas con el anticuerpo.

Soluciones:

PBS-T: 0,1% Tween 20 disuelto en 1X PBS.

Solución de bloqueo: 5% leche desnatada en polvo disuelta en PBS-T

6.3.18 Ensayos de fosforilación

Se realizaron dos diferentes tipos de ensayos de fosforilación: en primer lugar, ensayos

quinasa en tubo y en segundo, ensayos quinasa en gel. Con los primeros se comprobó la
actividad in vitro de ZmZIM91 por la proteína quinasa CK2 de maíz, para lo que se
usaron proteínas que estaban fusionadas a una etiqueta 6×His. En este ensayo se probó
tanto la fosforilación de ZmZIM91 por la subunidad catalítica CK2α1 como por el
holoenzima CK2α1β1.

170
Materiales y métodos

Por otra parte, el ensayo quinasa en gel permitió analizar la actividad de

transfosforilación de las proteínas quinasas nativas, presentes en extractos crudos de
proteínas de plántulas de maíz de 6 días frente a ZmZIM91.

6.3.18.1 Ensayo quinasa in vitro

Los experimentos de fosforilación in vitro se llevaron a cabo utilizando las proteínas

ZmZIM91, CK2β1 y CK2α1 sobre expresadas en E.coli e incubadas con ATP frío (el
holoenzima CK2α1β1 fue reconstituido antes de realizar el ensayo) y posteriormente se
llevó a cabo un ensayo de fosforilación in vitro con [γ33P]-ATP.

Para los ensayos de fosforilación con la proteína quinasa CK2 de maíz, se usó 0,4 µg de
proteína purificada ZmZIM91, adicionando 2 ρmol de subunidad catalítica CK2α sola y
también con 2 ρmol de subunidad CK2β (la quinasa se dejó previamente a temperatura
ambiente por 30 minutos para permitir su reconstitución) en un volumen total de 30 µl
de tampón CK2 (8.9 mM de MgCl2, 0.5 mM EGTA, 27 mM de β-glicerolfosfato, 0.5
mM EDTA, 1 mM DTT, 0.08 mM ATP y 3 µCi [γ33P]-ATP).

Las muestras se incuban 20 minutos a 30°C. La reacción de fosforilación se detiene

adicionando tampón de carga a las muestras, posteriormente se cargan las proteínas en
un gel SDS-PAGE al 15%, que es teñido con Coomassie blue y desteñido con ácido
acético y que finalmente se seca con una bomba de vació, para su exposición en una
pantalla de phosphorimager. Tras 1 hora, la pantalla se revela utilizando un equipo
llamado STORM que permite capturar la imagen.

6.3.18.2 Ensayo quinasa en gel

Para este ensayo fueron usadas raíces de maíz de 6 días de la variedad W64, tratadas
con sequía y 100 µM de MeJA, además de sus respectivos controles que en el caso del
tratamiento con MeJA eran tratadas con DMSO. Los extractos fueron hechos el mismo
día del experimento para ser usados frescos.

Se trituran 100 mg de material fresco con Nitrógeno líquido. El material triturado es

resuspendido en 80 µl del tampón de extracción. Las muestras se dejan en hielo durante

171
Materiales y métodos

20 minutos, realizando vórtex cada 3 minutos. Posteriormente las muestras son

centrifugadas a 12.000 rpm durante 15 minutos a 4°C y cuantificadas con Bradford.

Para cada ensayo se usan 50 µg de extracto de proteínas y se les adiciona tampón de

carga 5X. Las muestras son hervidas durante 3 minutos y se mantienen en hielo
mientras se cargan en un gel SDS-PAGE.

La técnica consiste en separar las proteínas procedentes de extractos de raíz de plántulas

de maíz de 6 días tratadas con 100µM de MeJA y extractos de raíz de plántulas de maíz
tratados con DMSO para usar como control, en un gel SDS-PAGE desnaturalizante que
contiene como sustrato copolimerizado la proteína purificada de ZmZIM91.
Posteriormente, las proteínas son renaturalizadas en el gel realizando varios lavados y,
por último, son sometidas al ensayo de fosforilación sumergiendo el gel en el tampón de
reacción.

Tampón de extracción de proteínas: 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 1 mM

EGTA, 2 mM DTT, 2mM Na3VO4, 2 mM NaF, 10 mM β-glicerolfosfato, 1 mM
PMSF, 1 µM pepsatina, 2 µg/ml aprotinina, 2 µg/ml pepstatina, 150 mM NaCl, 0,5%
Triton X-100, 0,5 % Nonidet NP40.

6.3.18.2.1 Preparación del gel SDS-PAGE copolimerizado con ZmZIM91

Los geles SDS-PAGE se preparan como se indicó anteriormente, la única diferencia

radica en que antes de añadir el APS y el TEMED, se deben incorporar 0,25 mg/ml de
la proteína ZmZIM91 purificada. Los componentes del gel con la proteína deben
mezclarse bien con el fin de que el sustrato quede uniformemente repartido.

Los geles deben prepararse con un espesor de 0,75 mm. Además, es necesario utilizar
un marcador de peso molecular visible que permita controlar la posterior identificación
del tamaño de las proteínas de interés. Las muestras utilizadas para realizar este ensayo
fueron extractos de raíces de plantas de maíz de 6 días tratadas y control.

172
Materiales y métodos

6.3.18.2.2 Renaturalización y reacción de fosforilación

Al finalizar la electroforesis de los geles de proteína, se procede a realizar lavados de

estos geles de 30 minutos cada uno, con 150 ml (3x50 ml) de tampón A en agitación y a
temperatura ambiente, para eliminar el SDS. Posteriormente se da inicio al proceso de
renaturalización de las proteínas, realizando tres lavados con 150 ml de tampón B (3x50
ml), los dos primeros de 30 min y el último durante 14 horas, en agitación y a 4ºC.

Antes de iniciar la reacción, el gel se lava una vez más con 50 ml de tampón C durante
30 min y temperatura ambiente. Se incuba en 10 ml de tampón C que contiene 25 µM
de ATP y 10 µl de [γ33P]-ATP, durante 1 hora a temperatura ambiente. El [γ33P]-ATP
no unido covalentemente a las proteínas se elimina realizando diez lavados de 30 min
con 500 ml (10x50 ml) de tampón D, en agitación y a temperatura ambiente (hasta
detectar una señal de unas 10-20 cpm). Estos lavados también permiten fijar las
proteínas al gel. Por último, el gel debe secarse y exponerse en una pantalla de
Phosphorimager durante 3 días.

Tampón A: 25 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5 mM DTT, 0,1 mM Na3VO4, 5 mM NaF, 0,5

mg/ml BSA, 1% Triton X-100.

Tampón B: 25 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM DTT, 0,1 mM Na3VO4, 5 mM NaF.

Tampón C: 25 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM DTT, 2 mM EGTA, 0,1 mM Na3VO4, 12

mM MgCl2.

Tampón D: 5% TCA, 1% Na2PPi.

6.3.18.2.3 Tratamiento de geles quinasa en gel con DRB

Con el fin de identificar la banda correspondiente a la proteína quinasa CK2 en los geles
de fosforilación in vivo, se utilizó el inhibidor específico de CK2 (DRB). Este
compuesto se debe adicionar en el último lavado con el tampón C, antes de la
incubación con el [γ33P]-ATP, durante 30 minutos a temperatura ambiente.

173
Materiales y métodos

La concetración utilizada de DRB para los experimentos realizados en este trabajo fue
de 50 µM y los geles control fueron incubados con DMSO (dimetil sulfoxido) ya que el
DRB fue diluido en DMSO.

6.3.19 Ensayos de interacción proteína-proteína

6.3.19.1 Sistema de doble híbrido

Para la detección de la interacción entre dos proteínas mediante la técnica de doble

híbrido, se utilizó la cepa S.cerevisiae AH109 incluida dentro del sistema
MATCHMAKER Two-hybrid 3 de Clontech. Esta cepa contiene tres genes reporteros:
His3, Ade1 y X-Gal. El hecho de presentar un tercer marcador reduce la posibilidad de
falsos positivos respecto al sistema original, que no más presenta como marcadores
His3 y X-Gal. Los experimentos de transformación, selección se realizan según los
protocolos estándar del sistema MATCHMAKER de Clontech.

En este trabajao, para clonar en el vector pGBKT7 se utilizaron las dianas EcoRI-SalI,
mientras que para clonar en el vector pGADT7 se usaron EcoRI/SalI o XhoI/SalI
dependiendo del inserto.

6.3.19.2 Complementación Bimolecular

La secuencias utilizadas para este experimento fueron clonadas en dos plásmidos

pENTRY3C modificados para Complementación Bimolecular (BiFC) GATEWAY
desarrollados por A. Ferrando (http://www.ibmcp.upv.es/FerrandoLabVectors.php,
López-Paz et al. (2009)) y fueron transfectados tanto en plantas de N. benthamiana
como en protoplastos de maíz. La detección de la YFP se hizo con el microscopio
Confocal Olympus.

6.3.19.3 Ensayo de interacción ‘TnT pull-down’

El ensayo ‘TnT pull-down’ se empleó para confirmar la interacción entre ZmZIM91 y la

proteína quinasa CK2. Este experimento permite establecer la interacción directa in
vitro entre proteínas.

174
Materiales y métodos

En primer lugar se inmovilizaron en resina GSH-sefarosa las proteínas GST:CK2β1,

GST:CK2β2, GST:CK2β3 y GST:CK2α1 y GST para utilizarla como control, y se
transcribió y tradujo in vitro la proteína ZmZIM91, que estaba clonada en el vector de
expresión pET28. Para ello se usó el kit TnT® Coupled Reticulocyte Lysate System
(Promega), que incluye todos los reactivos necesarios para realizar la reacción excepto
la metionina marcada con 35S ([35S]-Met).

Debido a que no se puede cuantificar la cantidad de proteína inmovilizada en la resina,

se cargaron entre 5 y 10 µl de cada una de las resinas de las proteínas fusionadas a GST
junto con una muestra que contenía 1 µg de BSA en un gel SDS-PAGE que
posteriormente se tiñó con Comassie y que permitió determinar la concentración de
proteína en la resina comparando la intensidad de las distintas bandas. Para el
experimento usó aproximadamente 1 µg de proteína fusionada a resina.

Procedimiento:

En primer lugar, se realiza bajo campana, la transcripción y traducción in vitro de

ZmZIM91 clonada en el vector pET28 en un volumen final de 100 µl (20 µl para cada
proteína inmovilizada), usando para ello los siguientes reactivos y componentes:

1,5 µg DNA molde (vector pET28)

30 µl Rabbit Reticulocyte Lysate
2,4 µl Reaction Buffer
1,2 µl RNA polymerase
1,2 µl Aminoacid mixture minus Met
1,2 µl RNAasin
3 µl [35S]-Met

Esta reacción se incuba durante 2 horas a 30ºC. Luego, en un eppendorf de 0,5 ml, se
mezcla 1 µg (aprox.) de proteína recombinante inmovilizada en la resina GSH-sefarosa
con el volumen necesario de resina lavada y resuspendida con TST para obtener 40 µl
de ‘slurry’ al 50%. Posteriormente, se añade al ‘slurry’ 200 µl de tampón de unión, 0,24
µl de 1M de DTT, 3 µl de suero pre-inmune y 3 µl de 100 mM de PSMF y se incuba en
rotación durante 1 hora a 4ºC. A continuación se incorpora 20 µl de reacción TnT a la

175
Materiales y métodos

resina y se incuba en rotación durante aproximadamente 14 horas a 4ºC. La resina es

lavada 4 veces con 0,5 ml con tampón RIPA, se mezcla por inversión y se deja
precipitar por gravedad manteniendo la muestra en hielo. Luego se descartar el
sobrenadante y se resuspende en 30 µl de 2X tampón de muestras, se deja hervir durante
3 minutos y se mantiene en hielo durante 5 minutos más. Se da un pulso de centrífuga
(30 segundos a velocidad máxima) y se carga de 25-30 µl de sobrenadante en un gel
SDS-PAGE. Finalmente, tras la separación, se seca el gel y se expone toda la noche, en
una pantalla de phosphorimager.

Tampón de unión: 20 mM HEPES pH 7,9, 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 10% glicerol,

0,2% NP40.

Tampón RIPA: 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,2% NP40.

6.3.20 Determinación de motivos de unión a ADN mediante la técnica unión de

proteínas a un microarray de ADN (PBM11)

La elaboración del experimento de PBM11 de ZmZIM91 y AtZIM fue llevado a cabo

en colaboración con el Dr. José Manuel Franco, la Dra. Irene Vidrieros y el Dr. Roberto
Solano del Servicio de Genómica del Centro Nacional de Biotecnología-CSIC, Madrid.
La técnica de PBM11 se realizó de acuerdo al protocolo descrito por Godoy et al.
(2011) (Figura 6-2). Para ello se usan las proteínas sobre-expresadas (en este caso
ZmZIM91_MBP y AtZIM_MBP), sin purificar, las que son hibridadas durante 2.5
horas a temperatura ambiente con un microarray que contiene secuencias de ADN
independientes (11-mers en todas las posibles dobles cadenas, 4.2 millones
compactadasen 240,000 puntos). Posteriormente, el microarray se lava varias veces y se
incuba con un anticuerpo primario contra la proteína de unión a la maltosa (MBP) y un
secundario marcado con un fluoroforo (DyLight 549). Finalmente, el microarray se
procesa usando un escáner GenePix 4000B y la intensidad de la señal se cuantifica con
el software GenePix Pro 5.1, generando los consensos de unión de ADN de las
proteínas estudiadas.

176
Materiales y métodos

Microarreglo de
ADN
Oligos ssDNA
Extensión oligos in situ
Extracto de
E. coli
ds ADN (Cy5)

Incubación
1. Ab
2. Ab-Cy3

Cuantificación
de la imágen

Identificación de motivos de ADN

(6-8 pb)

Figura 6-2. Pasos realizados para la detección de motivos de unión de ADN de

factores de transcripción mediante la técnica unión de proteínas a un microarray
de ADN (PBM11).

6.3.21 Experimentos de Inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP)

Todos los experimentos de ChIP tanto de hojas como de protoplastos de maíz fueron
realizados en colaboración con el Dr. Kengo Morohashi y la Dra. Antje Feller,
investigadores post-doctorales en el laboratorio del Dr. Erich Grotewold, Department of
Molecular Genetics, Ohio State University, Columbus, Ohio, USA, siguiendo el
protocolo descrito por Morohashi en el 2007, pero con modificaciones.

6.3.21.1 Inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) a partir de protoplastos

transfectados con 35S::ZmZIM91:GFP y 35S::GFP. Versión 1.0

Aquí se explica el primer protocolo generado para la realización de ChIP de

protoplastos.

177
Materiales y métodos

El material empleado para la realización de los ChIPs son protoplastos de maíz de

plantas etioladas de la variedad MO17xB73 de 13 días. Los protoplastos se aíslan como
y se transfectan con las construcciones de interés (para este caso con
35S::ZmZIM91:GFP y 35S::GFP). Al día siguiente de la transformación de los
protoplastos, se realiza un conteo de la cantidad de protoplastos transformados usando
microscopio confocal y una cámara de malassez y se estima la eficiencia de
transformación (debe ser mayor a 65%). Posteriormente, se procede a realizar el
crosslinking del material adicionando 100 µl buffer A (es el mismo que se usa para los
protoplastos) que además contiene 1 mM de PMSF, 1% de Formaldehido y 0.25% de
BSA. A continuación se aplica vacío durante 10 minutos, y se añade 2 M de glicina y
posteriormente se continúa con la incubación en vacío por 5 minutos más. Luego se
realizan dos lavados con el buffer A (1ml), se centrifugan las muestras a 2000 rpm por
2.5 minutos, se retira el sobrenadante y se guardar los protoplastos a -80°C hasta su uso.

Los protoplastos preaparados, son resuspendidos en 500 µl de lysis buffer para obtener
el extracto de cromatina, luego a la muestra se le realiza vórtex durante 30 segundos y
posteriormente, se lleva a cabo la fragmentación de la cromatina a un rango de 100–
1,000 bp (~500 bp en promedio) mediante sonicación empleando un Biorupter (UCD-
200TM, Diagenode Inc.) con las siguiente condiciones: 30 sec ON y 30 sec OFF al
nivel de poder H por 30 minutos y se centrifuga el material a 10,000 ×g por 5 minutos a
4°C. Posteriormente, el sobrenadante se incuba con 30 µl de esperma de
salmón/proteína agarosa A durante 4 horas con rotación a 4ºC. La muestra es
centrifugada a 3.000 rpm durante 1 minuto a 4°C.

El sobrenadante es transferido a cinco tubos nuevos con 100 µl cada uno, a los que se
les adiciona el respectivo anticuerpo y se incuban durante aproximadamente 14 horas en
rotación a 4°C. Adicionalmente, se guarda una pequeña cantidad de extracto como
fracción de Input.

Nota. Para esta investigación, en cada inmunoprecipitación se usó 100 µl de extracto de

cromatina y la cantidad de anticuerpo que se menciona a continuación: 2 µl o 1 mg de
IgG (abcam), 2 µl o 1 mg de histona H3 (abcam), 0.5 µl de anticuerpo contra la GFP
(abcam), 5 µl o 1 mg de anticuerpo purificado contra ZmZIM91.

178
Materiales y métodos

Al siguiente día, a cada uno de los extractos de protoplastos incubados con los
anticuerpos (100 µl) se les adiciona 40 µl de esperma de salmón ADN/Protein A-
agarose beads (Upstate Biotechnology, Charlottesville, VA) y se continúa con la
incubación durante 4 horas más a 4°C. Luego, las muestras son centrífugadas durante 1
minuto a 3.000 rpm y el sobrenadante es descartado.

Después de la incubación, las beads son lavadas dos veces con 0.5 ml de lysis buffer,
dos veces con LNDET y finalmente dos veces con TE. Las beads lavadas y la fracción
de Input son resuspendidas en elution buffer e incubados durante 14 horas a 65°C para
llevar a cabo el reverse-crosslinking del inmunoprecipitado (para que las proteínas se
degraden y queden solo los fragmentos de ADN que han sido inmunoprecipitados).

Finalmente el ADN del ChIP y el ADN del Input es purificado usando el PCR
Purification kit (Qiagen, Valencia, CA).

Soluciones:

Lysis buffer: 50 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100,

0.1% deoxycholate, 0.1% SDS, 10 mM Na butyrate, 1 mM PMSF, 1X plant proteinase
inhibidor cocktail (sigma).

Buffer A: 0.6M Manitol, 10mM KCL, 10mM MES.

LNDET: 0.25 M LiCl, 1% NP40, 1% deoxycholate, 1 mM EDTA.

TE: 10 mM Tris-Cl, pH 7.5. 1 mM EDTA.

Elution buffer: 1% SDS, 0.1 M NaHCO3, 1 mg/ml proteinase K.

6.3.21.2 Inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) a partir de protoplastos

transfectados con 35S::ZmZIM91:GFP y 35::GFP. Versión 2.0

Este protocolo ha sido adaptado del protocolo para chromatin immunoprecipitation

para material de plantas con Dynabeads descrito por el Dr. Kengo Morohashi
([email protected]).

179
Materiales y métodos

Cada experimento individual de ChIP se realizó a partir de aproximadamente 3x105

protoplastos de maíz transformados con el DNA de interés (con un porcentaje de
eficiencia de transformación superior al 60%), provenientes de la mezcla de tres
transformaciones independientes de 1x105 protoplastos de maíz.

El primer paso para iniciar este protocolo, es la preparación de las Dynabeads/Protein A

(Invitrogen). Las Dynabeads se resuspenden delicadamente, posteriormente se
transfirieren 30 µl de Dynabeads a un eppendorf de 1.5 ml por cada anticuerpo, al
mismo tiempo en otro eppendorf de 1.5 ml se adiciona 90 µl de Dynabeads en caso de
tener tres muestras: anticuerpo 1, anticuerpo 2 e Input.

A continuación, se lava cada tubo que contiene las Dynabeads dos veces con 500 µl de
lysis buffer, poniendo cada vez los tubos en un soporte magnético durante 30 segundos
y descartando el sobrenadante. Antes de retirar el sobrenadante del último lavado, los
tubos con las Dynabeads se mantienen en el soporte magnético, mientras en tubos
nuevos eppendorf de 1.5 ml se prepara una mezcla de 100 µl blocking buffer con 1 µl
(or 1 µg) de cada anticuerpo (en el caso del antiGFP se adicionaron 0,5 µl y para el
anti91 10 µl). Posteriormente, se transfiere la mezcla del blocking buffer con el
anticuerpo en las Dynabeads lavadas y se incuban durante 14 horas en rotación a 4°C.
Por otra parte, se adiciona 300 µl de blocking buffer sin anticuerpo en el tubo que
contiene los 90 µl de Dynabeads y se incuba durante 14 horas en rotación a 4°C (las
Dynabeads sin anticuerpo serán usadas al día siguiente para la preclearation de las
muestras a usar en las inmunoprecipitaciones).

En este caso el material empleado para la realización de los ChIPs fueron protoplastos
de plantas de maíz etioladas de la variedad MO17xB73 de 13 días. Los protoplastos
fueron aislados y transfectados con 35S::ZmZIM91:GFP y 35S::GFP. Posterior a la
obtención de los protoplastos transformados, se procedió a realizar el crosslinking del
material adicionando 100 µl buffer A (es el mismo que se usa para los protoplastos) que
además debe contener 1 mM de PMSF, 1% de formaldehido y 0.25% de BSA. A
continuación se aplica vacío por 10 minutos, y se añade 2 M de glicina y se continúa
con la incubación en vacío por 5 minutos más. Luego se realizan dos lavados con el
buffer A (1ml), se centrifugan las muestras a 2000 rpm por 2.5 minutos, se retira el
sobrenadante y se guardan los protoplastos a -80°C hasta su uso.

180
Materiales y métodos

Las muestras se resuspenden en 500 µl de lysis buffer para realizar la preparación del
extracto de cromatina, luego se les da un vórtex durante 30 segundos y posteriormente,
se realiza la fragmentación de la cromatina a un rango de 100–1,000 bp (~500 bp en
promedio) mediante sonicación empleando un Biorupter (UCD-200TM, Diagenode
Inc.) con las siguiente condiciones: 30 sec ON y 30 sec OFF al nivel de poder H por 30
minutos y se centrifuga el material a 10,000 ×g por 10 minutos a 4°C. A continuación,
se descarta el blocking buffer sin anticuerpo contenido en el eppendorf con los 90 µl de
Dynabeads, se le adiciona los 500 µl de extracto de cromatina generado anteriormente
y se mantiene en incubación a 4 ºC durante cuatro horas más.

Después de las cuatro horas de la incubación del extracto, los eppendorf que tiene el
blocking buffer con los anticuerpos, y el que contiene los 500 µl del extracto de
cromatina, se colocan en el soporte magnético durante 30 segundos, se descarta el
sobrenadante de los tubos que contienen el blocking buffer con los anticuerpos y se le
adiciona a cada uno, 100 µl del extracto de cromatina que fue incubada el eppendorf con
los 90 µl de Dynabeads. Se debe almacenar 100 µl de la cromatina a 4ºC para generar el
Input. Las Dynabeads con los extractos de cromatina se incuban en rotación durante 14
horas a 4ºC.

Posteriormente, los tubos incubados, se colocan en el soporte magnético durante 30

segundos y el sobrenadante es descartado. A continuación, se realizan 2 lavados con 0.5
ml de lysis buffer, 2 lavados con 0.5 ml de LNDET y 2 lavados con 0.5 ml de TE,
utilizando siempre el soporte magnético. Las Dynabeads se resuspenden en 50 µl de
elution buffer y son incubadas durante 10 minutos a 65°C, luego se colocan los tubos en
el soporte magnético y se recuperan los 50 µl en un nuevo tubo eppendorf, se repite el
paso una vez más, para obtener un volumen final de 100 µl. Por otro lado, se adiciona
70 µl de elution buffer a 30 µl de extracto de cromatina inicial para producir el Input
(30% de la cromatina inicial). Todas las muestras incluyendo los Input, son incubadas
durante 14 horas a 65ºC para llevar a cabo el "reverse-crosslinking". Por último, el
ADN de las muestras se purifica usando el PCR Purification kit (Qiagen, Valencia,
CA).

181
Materiales y métodos

Soluciones:

Lysis buffer: 50 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100,

0.1% deoxycholate, 0.1% SDS, 10 mM Na butyrate, 1 mM PMSF, 1X plant proteinase
inhibidor cocktail (sigma).

Blocking buffer: BSA (10 mg/ml), 10 µl Yeast transfer RNA (10µg/µl) 20 µl of t-

RNA, Up to 1 ml with Lysis Buffer.

Buffer A: 0.6M Manitol, 10mM KCL, 10mM MES.

LNDET: 0.25 M LiCl, 1% NP40, 1% deoxycholate, 1 mM EDTA.

TE: 10 mM Tris-Cl, pH 7.5. 1 mM EDTA.

Elution buffer: 1% SDS, 0.1 M NaHCO3, 1 mg/ml proteinase K.

6.3.21.3 Inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) a partir de hojas de plantas

de maíz de 9 días de la variedad B73

En primer lugar, se debe realizar la preparación de las Dynabeads/Protein A

A continuación, se lava cada tubo que contiene las Dynabeads dos veces con 500 µl de
lysis buffer, poniendo cada vez los tubos en un soporte magnético durante 30 segundos
y descartando el sobrenadante. Antes de retirar el sobrenadante del último lavado, los
tubos con las Dynabeads se mantienen en el soporte magnético, mientras en tubos
nuevos eppendorf de 1.5 ml se prepara una mezcla de 100 µl blocking buffer con 10 µl
(or 1 µg) de cada anticuerpo (en este caso el anti91). Posteriormente, se transfiere la
mezcla del blocking buffer con el anticuerpo en las Dynabeads lavadas y se incuban
durante 14 horas en rotación a 4°C. Por otra parte, se adiciona 300 µl de blocking buffer
sin anticuerpo en el tubo que contiene los 90 µl de Dynabeads y se incuba durante 14
horas en rotación a 4°C (las Dynabeads sin anticuerpo serán usadas al día siguiente para
la preclearation de las muestras a usar en las inmunoprecipitaciones).

182
Materiales y métodos

El material empleado para la realización de los ChIPs fue la base de la segunda hoja de
plantas de maíz de 9 días. Para cada ChIP se usan cuatro hojas provenientes de plantas
distintas (300 mg), a continuación se realiza el crosslinking del material sumergiéndolo
en 10 ml buffer A, se le aplica vacío por 20 minutos, se le añade 2 M de glicina y se
continúa con el vacío por 10 minutos. El material se lava 6 veces con abundante agua
destilada.

Posteriormente, los tubos incubados, se colocan en el soporte magnético durante 30

183
Materiales y métodos

(30% de la cromatina inicial). Todas las muestras incluyendo los Input, son incubadas
durante 14 horas a 65ºC para llevar a cabo el "reverse-crosslinking". Por último, el
ADN de las muestras se purifica usando el PCR Purification kit (Qiagen, Valencia,
CA).

Soluciones:

Lysis buffer: 50 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100,

0.1% deoxycholate, 0.1% SDS, 10 mM Na butyrate, 1 mM PMSF, 1X plant proteinase
inhibidor cocktail (sigma).

Blocking buffer: BSA (10 mg/ml), 10 µl Yeast transfer RNA (10µg/µl) 20 µl of t-

RNA, Up to 1 ml with Lysis Buffer.

Buffer A: 0.4 M sucrose, 10 mM Tris pH8, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1%

Formaldehyde.

LNDET: 0.25 M LiCl, 1% NP40, 1% deoxycholate, 1 mM EDTA.

TE: 10 mM Tris-Cl, pH 7.5. 1 mM EDTA.

Elution buffer: 1% SDS, 0.1 M NaHCO3, 1 mg/ml proteinase K.

6.3.22 Test de enriquecimiento y análisis por PCR semi-cuantitativa y cuantitativa

de ChIP

Para el test de enriquecimiento usando PCR semi-cuantitativa, se usó como control

negativo a copia. Las PCRs semi-cuantitativas fueron hechas utilizando diluciones
seriadas de las muestras inmunoprecipitadas (1, 1/10 y 1/100) y el Input. La mix usada
se describe en la Tabla 6-9 y a continuación, las condiciones de PCR utilizadas:

184
Materiales y métodos

Componente Por Rxn 7 Rxn MM

10X PCR Buffer w/o MgCl2 2.0 µl 14 µl

MgCl2 0.6 µl 4.2 µl

dNTPs 10 mM 0.4 µl 2.8 µl

Cebador A (50 µM) 0.1 µl 0.7 µl

Cebador B (50 µM) 0.1 µl 0.7 µl

dH2O 15.72µl 110.04 µl

Platinum Taq 0.08 µl 0.56 µl

Template DNA 1 µl -

Total Vol 20.0 µl 140 µl

Tabla 6-9. Reacción de PCR para validación de muestras de ChIP.

Condiciones de PCR:

Paso 1: 95ºC por 3 minutos

Paso 2: 95° C por 30 segundos
Paso 3: 55° C por 30 segundos
Paso 4: 72° C por 30 segundos
40 ciclos del paso 2 al paso 4

Los resultados de los productos de PCR semi-cuantitativa fueron analizados por

electroforesis en geles de agarosa al 2% y cuantificados por tinción con EtBr.

Por otra parte, la PCR cuantitativa de ChIP de protoplastos de maíz (en tiempo real) fue
realizada usando el iQTM SYBR Green supermix (Bio-Rad, Hercules, CA) en una
reacción de PCR de 10 µl de acuerdo con el protocolo recomendado. Los cebadores se
diseñaron usando el software de GenScript específico para el diseño de cebadores para
PCR cuantitativa en tiempo real. Los cebadores pueden amplificar una zona de 100
pares de bases.

185
Materiales y métodos

Para la reacción de 10 µl iQTMSYBR Green supermix, se usa 1 µl de ADN de ChIP de

protoplastos de maíz o ADN Input y 0.3 µM de cada cebador. La PCR cuantitativa para
ChIP de protoplastos de maíz fue realizada usando BioRad CFX96 real-time PCR
Detection System (Applied Biosystems, Foster City, USA) con las siguientes
condiciones:

Paso 1: 95ºC por 3 minutos

Paso 2: 95° C por 10 segundos
Paso 3: 60° C por 15 segundos
Paso 4: 72° C por 30 segundos
40 ciclos del paso 2 al paso 4

Seguida por la determinación de curva de melting. Con todos los experimentos, fueron
usados controles sin ADN y muestras con el Input.

La PCR cuantitativa de ChIP de hojas de maíz fue realizada mediante la tecnología

Fluidigm, utilizando la plataforma del Servicio de Genómica del Centre de Recerca en
Agrigenòmica (CRAG), Barcelona.

6.3.23 Preparación de ChIP-Seq para la plataforma Solexa-Illumina

La preparación de las librerías de ChIP de protoplastos de maíz versión 1.0 (Figura 6-3),
se llevó a cabo en colaboración con el Dr. Kengo Morohashi, investigador del
laboratorio del Dr. Erich Grotewold, mientras la construcción de las librerías los ChIP
de protoplastos versión 2.0 (Figura 6-3) y las librerías de ChIP de hojas de maíz (Figura
6-4) fue realizada en el Centre de Recerca en Agrigenòmica (CRAG) en colaboración
con Jorge Enrique Salazar Henao del laboratorio del Dr. David Caparrós-Ruíz del
Departamento de Genética Molecular del CRAG, Barcelona.

Para la construcción de las librerías, fue necesario poner la técnica a punto ya que los
reactivos usados en USA no eran los mismos que se podían adquirir en España, sin
embargo, este experimento se realizó basándose en el protocolo elaborado por el Dr.
Kengo Morohashi ([email protected]).

186
Materiales y métodos

Aislamiento y
transformación de
protoplastos de hojas de Sonicación
plantas etioladas de maíz de muestras
de 13 días Input ZmZIM91GFP I
Input GFP I
Réplica
ZmZIM91_
GFP
Biológica 1: Crosslinking ZmZIM91GFP_AntiGFP
Protoplastos ZmZIM91GFP_Anti91 LIBRERIA
de maíz
GFP

ZmZIM91GFP_
GFP_AntiGFP
n:13. AntiGFP
Adición de GFP_Anti91
solución de
lisado

Input ZmZIM91GFP I LIBRERIA

Input GFP I ZmZIM91GFP_
Réplica Anti91
ZmZIM91_
GFP

Biológica 2: Crosslinking ZmZIM91GFP_AntiGFP

Protoplastos ZmZIM91GFP_Anti91
de maíz
GFP

GFP_AntiGFP
n:13. Adición de
GFP_Anti91
solución de LIBRERIA
lisado GFP_AntiGFP

Input ZmZIM91GFP I
Input GFP I
Réplica
ZmZIM91_
GFP

Biológica 3: Crosslinking ZmZIM91GFP_AntiGFP

Protoplastos LIBRERIA
ZmZIM91GFP_Anti91
de maíz GFP_Anti91
GFP

GFP_AntiGFP
n:13.
Adición de GFP_Anti91
solución de
lisado

Figura 6-3. Procedimiento de elaboración de librerías de ChIP de protoplastos de

maíz sobre expresando 35S::ZmZIM91:GFP y 35S::GFP. En la imagen se observan
los pasos que se realizaron para la construcción de una librería de ChIP de protoplastos
de maíz. Todas las réplicas biológicas fueron elaboradas utilizando este procedimiento.

187
Materiales y métodos

Hojas de Sonicación
maíz de 9 de muestras
días LIBRERIA
Input I INPUT A:
Réplica I+II+III
Biológica Crosslinking
1: Hojas de ZmZIM91.I
diferentes
plantas n:4.
Trituración

Input II
Réplica
Biológica 2: Crosslinking LIBRERIA
Hojas de ZmZIM91. II ZmZIM91:
diferentes I+II+III
plantas n:4.
Trituración

Input III
Réplica
Biológica 3: Crosslinking
Hojas de ZmZIM91. III
diferentes
plantas n:4.
Trituración

Figura 6-4. Procedimiento de elaboración de librerías de ChIP de hojas de plantas

de maíz de 9 días. En la imagen se observan los pasos que se realizaron para la
elaboración de una librería de ChIP de hojas de plantas de maíz de 9 días. Todas las
réplicas biológicas fueron hechas utilizando este procedimiento.

El procedimiento estándar contiene los siguientes pasos:

1. Reparación del final de los fragmentos de ADN

2. Adición de colas “A”
3. Ligación de adaptadores
4. Fraccionamiento de tamaño por gel de agarosa
5. Amplificación por PCR (~ 20 ciclos)
6. Purificación
7. Cuantificación y control de calidad de las librerías
8. Descontaminación de librerías usando AMPure beads
9. Cuantificación y control de calidad de las librerías

188
Materiales y métodos

Para reparar los finales de los fragmentos de ADN, se diluye la polimerasa ADN klenow
1:5 con agua a una concentración final de U/µl y se prepara la siguiente mix de reacción
en tubos de PCR de 0.2 ml:

~30 µl de ChIP enriquecido de ADN, 5 µl de 10x T4 DNA ligase buffer con 10mM
ATP, 2 µl 10mM dNTP mix, 0.5 µl T4 DNA polimerasa (3U/ µl) (NEB), 0.5 µl
Polimerasa ADN Klenow (NEB) (1U/ µl), 0.5 µl T4 PNK (10U/ µl) (NEB) y agua
libre de DNasas hasta 50 µl.

Posteriormente, se incuba la reacción a 20ºC durante 30 minutos en un termociclador.

Luego se procede a purificar el ADN usando QIAGEN PCR purification kit siguiendo
las instrucciones de la casa comercial. La elución se hace con 35 µl de elution buffer
(EB).

A continuación para adicionar las bases “A” a los extremos finales 3' de los fragmentos
de ADN se llevo a cabo la preparación de la siguiente reacción:

34.5 µl de muestra de ADN, 5 µl de NEB buffer 2, 10 µl de 1mM dATP, 0.5 µl de

Klenow exo (3' to 5' exo minus) (5U/ µl) (NEB) y la reacción se lleva a 50 µl con agua
libre de DNasas.

Luego la reacción es incubada a 37ºC por 30 minutos en un termociclador. La

purificación del ADN es llevada a cabo usando el mini Elute QIAGEN purification
Kit,y y cada muestra se eluye en 13 µl de agua libre de DNasas.

Para la ligación de los adaptadores a los fragmentos de ADN, se diluye el adapter oligo
mix (15µM) a 1:10 (para una concentración final de 1.5µM) en agua libre de DNasas
para ajustarlo a las pequeñas cantidades de ADN. La T4 DNA ligasa Ultrapura
(Enzymatics, 600U/ µl) se diluye 10 veces con 1x T4 ligase buffer de T4 DNA ligasa
Ultrapura y a continuación se prepara la siguiente reacción:

13 µl de muestra de ADN, 15 µl de 2x Rapid DNA ligase buffer de T4 DNA ligasa

Ultrapura, 1 µl de adapter oligo mix diluido, 1 µl de T4 DNA ligasa Ultrapura

189
Materiales y métodos

(Enzymatics) diluída (1/10) y se ajusta la reacción hasta 30 µl con agua libre de

DNasas.

La anterior reacción es incubada a temperatura ambiente por 15 minutos y purificada

usando miniElute QIAGEN purification kit y cada muestra se eluye en 20 µl de EB.

A continuación, se realiza el paso del fraccionamiento de tamaño, para lo cual en primer

lugar, se cargan en un gel de agarosa de 2% 10 µl de la muestra de fragmentos de ADN
ligados a los adpatadores, y se cortan 2mm de gel alrededor de 200-400 bp. Se guardan
10 µl en caso de fallos en los siguientes pasos. La purificación se realiza usando el
QIAGEN purification Kit, y las muestras son eluídas en 50 µl de EB. Seguidamente, con
el fin de minimizar la contaminación por adaptadores, antes de realizar la PCR para el
enriquecimiento de las muestras, se procede a tratar las muestras utilizando la
tecnología AMPure beads y se eluyen en 50 µl de EB. Antes del uso de las AMPure
beads hay que realizar la calibración del ratio AMPure beads:muestra ya que
modificando dicho ratio se modifica el tamaño de los fragmentos de ADN eliminados.

Posteriormente se lleva a cabo el enriquecimiento de fragmentos de ADN modificados

con adaptadores, para lo que se prepara la siguiente reacción de mix de PCR:

25 µl de ADN (guardar 25 µl), 10 µl de 5x HF Phusion buffer, 1.5 µl de 10mM dNTP, 1

µl de PCR 1.0 primer (25 µM), 1 µl de PCR 2.0-Index primer (25 µM), 0.5 µl de
Phusion Hot polymerase (source, units) y 11 µl de agua libre de DNasas hasta 50 µl.

La amplificación se lleva a cabo mediante el siguiente protocolo de PCR:

a. 30 segundos a 98ºC
b. 18 ciclos
40 segundos a 98ºC
30 segundos a 65ºC
30 segundos a 72ºC
c. 5 minutos a 72ºC
d. 10ºC α

190
Materiales y métodos

Después de la PCR, las muestras se purifican usando mini Elute QIAGEN purification
Kit, con 12 µl de EB y se realiza un Bioanalyzer de las muestras para verificar la
concentración y la calidad (es importante tener en cuenta que la banda de contaminación
por adaptadores autoligados es de 123 pb).

En caso de contaminación por adaptadores, se procede a realizar la descontaminación de

las muestras utilizando de nuevo la tecnología AMPure beads. Las librerías son eluídas
de nuevo en 12 µl de EB y se vuelven a chequear las muestras usando Bioanalyzer.
Finalmente, antes de la secuenciación se cuantifica la concentración de las librerías
usando Qubit (Invitrogen).

6.3.24 Ensayo de Luciferasa usando protoplastos de maíz transformados

transientemente

Para los ensayos de expresión transiente de Luciferasa usando los promotores de los
genes de ZmCOMT y ZmA1, fueron transformados por electroporación protoplastos de
maíz de plantas etioladas de 13 días de la variedad MO17xB73. Este experimento se
realizó de acuerdo con Sainz et al., 1997, con algunas modificaciones.

Todos los plasmidos de ADN fueron purificados usando el Maxi-Prep Kit (Qiagen,
Valencia, CA). Los µg de ADN utilizados en el experimento se presentan a
continuación: 1 µg de regulador, 3 µg del plasmido reportero (pCOMT::Luc; pA1::Luc)
y p35S::GFP (el vector vacío del plasmido). Para el ensayo de expresión transiente de
firefly luciferase y Renilla luciferase (Renilla), fue usado el Dual-Luciferase Reporter
Assay System (Promega, Madison, WI). Para normalizar la actividad de luciferasa en
cada muestra se incluye el reportero Renilla luciferase, 10 µg de p35S::Renilla.

6.3.25 Captura de imágenes fluorescente mediante Microscopia Confocal

Las imágenes obtenidas de localización subcelular y Complementación Bimolecular

para este trabajo fuero realizadas utilizando un Microscopio Confocal FV 1000
Olympus del Servicio de Imágenes del CRAG.

191
Materiales y métodos

6.3.26 Procesamiento y análisis de datos

6.3.26.1 Análisis de secuencias de nucleótidos

La secuenciación se ha realizado mediante un secuenciador automático ABI PRISM 377

(Applied Biosystems) en el servicio de Secuenciación del CRAG, Barcelona. Las
comparaciones de secuencias con las bases de datos (Maizesequence.org) se han
realizado mediante BLASTN (compara la secuencia de nucleótidos con bases de datos
de nucleótidos) y BLASTX (compara la secuencia de nucleótidos traducida con bases
de datos de secuencias de proteínas). Los alineamientos de secuencias se han realizado
con el programa de alineamiento múltiple CLUSTAL W, (versión 1.5; Higgins et al.,
1994), disponible en la dirección http://www.ebi.ac.uk/clustalw/. La visualización y
optimización de los alineamientos nucleotídicos se realizó mediante el programa
Sequencher 5.1, de Gene Codes Corporation (http://genecodes.com/).

6.3.26.2 Árbol filogenético

Para la realización del árbol filogenético de la familia ZML en Arabidopsis y maíz se

utilizó el programa Multiple Sequence Alignment by CLUSTALW
(http://www.genome.jp/tools/clustalw/). Los parámetros usados se presentan a
continuación:

Output format: CLUSTAL

Pairwise Alignment: SLOW/ACCURATE
Sequences: Protein

Pairwise Alignment Parameters:

For FAST/APPROXIMATE:
K-tuple(word) size:1, Window size:5, Gap Penalty: 3, Number of Top Diagonals: 5,
Scoring Method: PERCENT.

192
Materiales y métodos

For SLOW/ACCURATE:
Gap Open Penalty: 10.0, Gap Extension Penalty: 0.1, Select Weight Matrix: BLOSUM
(for PROTEIN).

Multiple Alignment Parameters:

Gap Open Penalty:10, Gap Extension Penalty: 0.05, Weight Transition: NO,
Hydrophilic Gaps:YES, Select Weight Matrix: BLOSUM (for PROTEIN)

Posteriormente, se ejecuta el múltiple alineamiento y se procede a elaborar el árbol

filogenético usando unrooted phylogenetic tree (N-J) (http://www.genome.jp/tools-
bin/clustalw).

6.3.26.3 Cuantificación de GFP de las imágenes obtenidas mediante microscopia

confocal

La cuantificación de la GFP de los protoplastos de maíz transfectados con

35S::ZmZIM91:GFP y tratados con MeJA 25µM, se realizó utilizando el programa
ImageJ, que está basado en Java y que permite el procesamiento de imágenes. El
software ImageJ ha sido desarrollado por the National Institutes of Health
(http://rsbweb.nih.gov/ij/).

El procesamiento estadístico de los datos obtenidos con el software ImageJ fue

realizado calculando una tasa de cambio de la fluorescencia con respecto al tiempo cero.
Se utilizaron datos de tres réplicas biológicas.

6.3.26.4 Procesamiento y análisis de datos de ChIP-Seq

El procesamiento de los datos de ChIP-Seq fue realizado en colaboración con María

Katherine Mejía Guerra del laboratorio del Dr. Erich Grotewold.

Para el procesamiento de los datos crudos obtenidos de la secuenciación de las librerías

de ChIP-Seq fue utilizado el software BOWTIE, que es un ultrarrápido, y eficiente
alineador de lectura corta (http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml). Para el

193
Materiales y métodos

llamado de picos de los datos obtenidos de la secuenciación de las librerías de ChIP-Seq

fue usado el software MACS (Model-based Analysis for ChIP-), el cual, empíricamente
modela la longitud de los fragmentos secuenciados de ChIP, que tienden a ser más
cortos que las estimaciones de la sonicación o el tamaño de la construcción de las
librerías, y lo utiliza para mejorar la resolución espacial de sitios de unión previsto.
(http://liulab.dfci.harvard.edu/MACS/). Para realizar la localización de los picos de
ChIP-Seq obtenidos con MACS, se usó el programa IGV 2.1 (Integrative Genomics
Viewer:http://www.broadinstitute.org/igv/node/236).

6.3.26.5 Procesamiento de datos de PCR cuantitativa de ChIP de protoplastos de

maíz

El procesamiento estadístico de los datos de la PCR cuantitativa de ChIP de

protoplastos, se realizó empleando un ∆Ct, donde el enriquecimiento de los picos se
calculó con respecto a copia.

6.3.26.6 Procesamiento de datos de PCR cuantitativa de ChIP de hojas de plantas

de maíz de 9 días (Fluidigm)

El procesamiento estadístico de estas muestras se llevó a cabo usando el manual de

SABiosciences (ChampionChIP™ PCR Array. Real-Time PCR-Based Pathway or
Disease-Focused. Profiling of Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Samples, Version
1.1-10/20/2009).

Los valores fueron normalizados con respecto al Input (porcentaje de enriquecimiento

con respecto a Input).

6.3.26.7 Procesamiento de datos de PCR cuantitativa de ChIP de hojas de plantas

de maíz de 9 días tratadas con MeJA

El procesamiento estadístico de estas muestras se llevó a cabo usando el manual de

SABiosciences. Para las PCR cuantitativas de ChIPs con tratamiento, se calculó el Fold
Difference de la siguiente manera:

194
Materiales y métodos

Fold Difference = Fold Enrichment G2 / Fold Enrichment G1

= 2 (∆∆Ct [IP] S2 - ∆∆Ct [IP] S1)

Donde el Grupo 1 (G1) corresponde a los datos del ChIP control con DMSO y el Grupo
2 (G2) es el grupo experimental en este caso los datos obtenidos del ChIP de MeJA al
0,01%.

6.3.26.8 Procesamiento de datos de Luciferasa

Los datos de firefly luciferasa fueron normalizaron empleando los valores obtenidos con
Renilla luciferasa, los datos muestran 3 réplicas biológicas con 3 réplicas técnicas
(n=9). Renilla estaba en un vector que se empleó como control de la transformación
(Dual-luciferase reporter assay system kit, Promega, Madison, WI).

6.3.26.9 Identificación de cajas GATA y GATC en promotores

Para la identificación de los motivos de unión a ADN GATA y GATC (Tabla 6-10), se
empleó el software DNA-pattern (http://rsat.ulb.ac.be//) (Thomas-Chollier, 2008).

195
Materiales y métodos

PatID Strand Pattern SeqID Start End matching_seq Score

START_END DR - 8_MACS_peak_1521 -351 -1 - 0
START_END DR - 8_MACS_peak_340 -351 -1 - 0
START_END DR - 14_MACS_peak_3163_GFP -351 -1 - 0
GATA D GATA 14_MACS_peak_3163_GFP -218 -215 gcatGATAtatg 1
GATA D GATA 14_MACS_peak_3163_GFP -151 -148 ctctGATAttag 1
GATA R GATA 14_MACS_peak_3163_GFP -260 -257 caatGATAaacc 1
GATA R GATA 14_MACS_peak_3163_GFP -129 -126 tgctGATAcggt 1
GATC DR GATC 14_MACS_peak_3163_GFP -139 -136 ggcaGATCatac 1
GATC DR GATC 14_MACS_peak_3163_GFP -38 -35 ccctGATCctta 1
START_END DR - 14_MACS_peak_797 -351 -1 - 0
GATC DR GATC 14_MACS_peak_797 -338 -335 ccctGATCctta 1
GATC DR GATC 14_MACS_peak_797 -97 -94 agagGATCagcg 1
START_END DR - 21_MACS_peak_3884_GFP -351 -1 - 0
GATC DR GATC 21_MACS_peak_3884_GFP -312 -309 ttgaGATCaggg 1
GATC DR GATC 21_MACS_peak_3884_GFP -275 -272 tgggGATCgggc 1
GATC DR GATC 21_MACS_peak_3884_GFP -243 -240 aaagGATCttag 1
GATC DR GATC 21_MACS_peak_3884_GFP -94 -91 cccaGATCactc 1
GATC DR GATC 21_MACS_peak_3884_GFP -28 -25 ttacGATCacac 1
START_END DR - 21_MACS_peak_967_91 -351 -1 - 0
GATC DR GATC 21_MACS_peak_967_91 -316 -313 ttgaGATCaggg 1
GATC DR GATC 21_MACS_peak_967_91 -279 -276 tgggGATCgggc 1
GATC DR GATC 21_MACS_peak_967_91 -247 -244 aaagGATCttag 1
GATC DR GATC 21_MACS_peak_967_91 -98 -95 cccaGATCactc 1
GATC DR GATC 21_MACS_peak_967_91 -32 -29 ttacGATCacac 1

Tabla 6-10. Resultados obtenidos empleando el software DNA-pattern de motivos

de unión a ADN GATA y GATC en los picos 8, 14 y 21 identificados en el ChIP-
Seq de protoplastos de maíz.

6.3.26.10 Procesamiento y análisis de datos de regiones enriquecidas en elementos

reguladores en cis CRERs

Para la detección de módulos reguladores en cis (CRMs) se empleó el Software RSA-

tools - matrix-scan (http://rsat.ulb.ac.be//).

Para realizar la búsqueda de CRERs empleando este programa se generó un modelo de

background de orden 3, empleando las regiones 5´ de los genes de maíz, los promotores
de COMT (ZmCOMT, OsCOMT, BdCOMT, SbCOMT) y matrices en formato Transfac
con los sitios de unión de ZmZIM91 y los MYB R2 R3 del subgrupo IV de maíz. Estas
matrices se generaron empleando los datos obtenidos in vitro mediante PMB11 para
ZmZIM91 y los datos de SELEX existentes para ZmMYB31 (Fornalé et al., 2010).

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ANEXO I
ChIP-Seq de ZmZIM91
proveniente de
protoplastos de maíz
Picos seleccionados para la validación del ChIP-Seq de ZmZIM91 proveniente de
protoplastos de maíz

Identificador
Oligos
Pico Anticuerpo
Anticuerpo Pico
en MACS
GenesGenes
en laenzona flanqueante
la zona 5´y
flanqueante 5´ Función
y función putativa
putativa

GFP 437
1 GRMZM2G436038 (Ribosomal protein)
91,1 119
GFP 808 GRMZM2G070899 (GTPasa activ/GTP binding, defense, response to cadmium
2
91,1 184 ion, vesicle mediated transport)
GFP 824
3 GRMZM2G057466 (Hidroxilase modif hist/Jumonji: response to chitin)
91,1 188
GFP 849 GRMZM2G009655 (Ubiquitin depen/metabolic process, UBIQUITIN-SPECIFIC
4
91,1 200 PROTEASE 10)
GFP 1000 GRMZM2G058402 (Negative regulator of metabolic process/ ATPase inhibitor
5
91,1 258 activity)
GFP 1278
6 GRMZM2G031138 (Metabolic process/UDP-glycosyltransferase activity)
91,1 316
GFP 1312 GRMZM2G463726 (C2 calcium/lipid-binding plant phosphoribosyltransferase
7
91,1 319 family protein)
GFP 1521 GRMZM2G176225 (WAK53a-OsWAK receptor-like protein kinase/calcium
8 binding/cytoplasmic serine/threonine protein kinase induced by salicylic
91,1 340
1555 acid)
GFP GRMZM2G050234 (Metabolic process/2-oxoglutarate (2OG) and Fe(II)-
9
91,1 345 dependent oxygenase superfamily protein, oxidoreductase activity)
GFP 2386 GRMZM2G135722 (Metabolic process/UDP-Glycosyltransferase superfamily
10
91,1 605 protein, transferase activity/Anthocyanidin 3-O-glucosyltransferase)
GFP 2453
11 GRMZM2G155321 (GRMZM2G155285/F-box)
91,1 617
GFP 2639 GRMZM2G114444 (basic Helix-Loop-Helix 121 (bHLH121)/DNA binding,
12
91,1 642 sequence-specific DNA binding transcription factor activity)
GFP 2764
13 GRMZM2G147726 (GTPasa activ/GTP binding/ response to cadmium ion)
91,1 674

GFP 3163 GRMZM2G003377 (RNA-binding (RRM/RBD/RNP motifs) family protein, RNA

14 binding, nucleotide binding, nucleic acid binding/GRMZM2G003411 ABA
91,1 797 transport)

GFP 3230 GRMZM2G108716 ( TFIIS: Regulation of the transc RNA polimerase II

15 promoter/F-box family protein: zinc ion binding/GRMZM5G899149 Ribosomal
91,1 814 protein S26e family protein)

GFP 3250 GRMZM2G007063 (Defense/Inflamation/bZIP protein BZO2H3 mRNA, protein

heterodimerization activity, sequence-specific DNA binding transcription
16
factor activity/COP1-INTERACTIVE PROTEIN 1/GRMZM2G305254 immune
91,1 816
response)
GFP 3509
17 GRMZM2G097207 (Hydrolase activity, hydrolyzing O-glycosyl compounds)
91,1 875

18 GFP 3591 GRMZM2G129713 ( FAD binding / catalytic/ electron carrier/ oxidoreductase)

19 91,1 926 GRMZM2G014444 (Structural constituent of ribosome/traslation)

GFP 3813
20 GRMZM2G320786 (Lignin catabolic process/flavonoides)
91,1 956
GFP 3884
21 GRMZM5G862817 (F-box)
91,1 967
GFP 4634
22 GRMZM2G071147 (Uncharacterized)
91,1 1184
GFP 4654 GRMZM2G096709 (Regulation of transcription/ATP binding/Growth-
23
91,1 1186 regulating factor)
GFP 4761
24 GRMZM2G010702 (Uncharacterized)
91,1 1205
GFP 4762
25 GRMZM2G010702 (Uncharacterized)
91,1 1206
Identificador
Pico
Oligos Anticuerpo
Anticuerpo GenesGenes
en laenzona
la zona flanqueante 5´5´y
y función putativa
en Pico
MACS flanqueante Función putativa

GFP 4771 GRMZM2G144030 (Eukaryotic translation initiation factor 5A/RNA

26
91,1 1208 binding/elongation/ribosoma binding/osmotic stress)
GFP 5351 GRMZM2G043498 (PX_domain; The Phox Homology domain, a
27
91,1 1321 phosphoinositide binding module)
GFP 5650
28 GRMZM2G053908 (Transmembrane transport/binding)
91,1 1410
GFP 5747
29 GRMZM2G438606 (Uncharacterized)
91,1 1417
GRMZM2G002805 (Zinc ion binding/stress response/chitin response: plan
30 91,1 813
defense elicitor)

GRMZM2G155285 (F-box domain: E3 ubiquitin ligase SCF complex that

31 GFP 2453
functions in phosphorylation mediated ubiquitination)

GRMZM5G897818 (DNA replication/G-protein coupled receptor protein

32 GFP 3256
signaling pathway/DNA binding/Nucleotide binding)
GRMZM2G012926 (Phosphopantetheine binding) (GRMZM2G012209: Chloride
33 GFP 3408
transport/cell volume homeostasis)
Involved in abscisic acid (ABA) signal transduction. Negative regulator of ABA
34 91,1 95
promotion of stomatal closure.

35 91,1 111 Involved in the acquisition of freezing tolerance.

INVOLVED IN: signal transduction, protein amino acid phosphorylation,

36 91,1 656
regulation of transcription, DNA-dependent

37 91,1 751 Encodes a putative (NAD+) aldehyde dehydrogenase.

38 91,1 793 INVOLVED IN: metabolic process

Protein serine/threonine kinase activity, protein kinase activity, kinase

39 91,1 803
activity, ATP binding

40 91,1 849 FUNCTIONS IN: protein binding; INVOLVED IN: apoptosis, defense response

41 91,1 903 Involved in Cu detoxification

Protein serine/threonine kinase activity, protein kinase activity, kinase

42 91,1 963
activity, ATP binding, INVOLVED IN: protein amino acid phosphorylation

43 91,1 1070 Helicase activity, binding, DNA binding, nucleic acid binding, ATP binding

44 91,1 1345 Rac GTPase activator activity; INVOLVED IN: signal transduction

45 91,1 1365 ATP-BINDING CASSETTE C8, MULTIDRUG RESISTANCE-ASSOCIATED PROTEIN 6

Protein serine/threonine kinase activity, kinase activity, ATP binding;

46 91,1 1369 INVOLVED IN: transmembrane receptor protein tyrosine kinase signaling
pathway, protein amino acid phosphorylation

47 91,1 1406 Involved in sorting seed storage proteins into vacuoles

Tabla SI1. Picos seleccionados para validación del ChIP-Seq de ZmZIM91

proveniente de protoplastos de maíz. En la primer columna se encuentra la
numeración de cada pareja de cebadores diseñados con el programa PRIMER3; en la
segunda, los anticuerpos con los que se encontró cada pico que está identificado en la
tercer columna y finalmente en la cuarta, se muestran los identificadores de los genes de
las zonas que flanquean los picos y el GO encontrado para sus homólogos en
Arabidopsis.
Identificación de putativos genes diana de ZmZIM91 en el ChIP-Seq de
protoplastos de maíz

Otros picos enriquecidos en el ChIP-Seq de ZmZIM91 proveniente de protoplastos

fueron localizados con ayuda del software IGV y se muestran a continuación:

Figura SI1. Picos detectados en el ChIP-Seq de ZmZIM91 proveniente de

protoplastos de maíz. Los picos fueron mapeados en el genoma del maíz usando el
software IGV 2.1. El gen GRMZM2G009655_T01 se encuentra próximo a los picos. El
orden de cada reglón es el siguiente: En el primero, ZmZIM91_antiGFP; en el segundo,
el control negativo GFP_antiGFP; en el tercero, ZmZIM91_anti91 y en el cuarto, el
control negativo GFP_anti91. En la parte inferior se puede ver el diagrama del gen
GRMZM2G009655_T01 y los identificadores de los picos en con MACS para
ZmZIM91_antiGFP y ZmZIM91_anti91.
Figura SI2. Picos detectados en el ChIP-Seq de ZmZIM91 proveniente de
protoplastos de maíz. Los picos fueron mapeados en el genoma del maíz usando el
software IGV 2.1. El gen GRMZM2G010702_T01 se encuentra próximo a los picos. El
orden de cada reglón es el siguiente: En el primero, ZmZIM91_antiGFP; en el segundo,
el control negativo GFP_antiGFP; en el tercero, ZmZIM91_anti91 y en el cuarto, el
control negativo GFP_anti91. En la parte inferior se puede ver el diagrama del gen
GRMZM2G010702_T01 y los identificadores de los picos en con MACS para
ZmZIM91_antiGFP y ZmZIM91_anti91.
Figura SI3. Picos detectados en el ChIP-Seq de ZmZIM91 proveniente de
protoplastos de maíz. Los picos fueron mapeados en el genoma del maíz usando el
software IGV 2.1. El gen GRMZM2G012926_T02 se encuentra próximo a los picos. El
orden de cada reglón es el siguiente: En el primero, ZmZIM91_antiGFP; en el segundo,
el control negativo GFP_antiGFP; en el tercero, ZmZIM91_anti91 y en el cuarto, el
control negativo GFP_anti91. En la parte inferior se puede ver el diagrama del gen
GRMZM2G012926_T02 y los identificadores de los picos en con MACS para
ZmZIM91_antiGFP y ZmZIM91_anti91.
Figura SI4. Picos detectados en el ChIP-Seq de ZmZIM91 proveniente de
protoplastos de maíz. Los picos fueron mapeados en el genoma del maíz usando el
software IGV 2.1. Los genes GRMZM2G019358_T02 y GRMZM2G020196_T01 se
encuentran próximos a los picos. El orden de cada reglón es el siguiente: En el primero,
ZmZIM91_antiGFP; en el segundo, el control negativo GFP_antiGFP; en el tercero,
ZmZIM91_anti91 y en el cuarto, el control negativo GFP_anti91. En la parte inferior se
puede ver el diagrama de los genes GRMZM2G019358_T02 y GRMZM2G020196_T01
y los identificadores de los picos en con MACS para ZmZIM91_antiGFP y
ZmZIM91_anti91.
Figura SI5. Picos detectados en el ChIP-Seq de ZmZIM91 proveniente de
protoplastos de maíz. Los picos fueron mapeados en el genoma del maíz usando el
software IGV 2.1. El gen GRMZM2G021482_T01 se encuentra próximo a los picos. El
orden de cada reglón es el siguiente: En el primero, ZmZIM91_antiGFP; en el segundo,
el control negativo GFP_antiGFP; en el tercero, ZmZIM91_anti91 y en el cuarto, el
control negativo GFP_anti91. En la parte inferior se puede ver el diagrama del gen
GRMZM2G021482_T01 y los identificadores de los picos en con MACS para
ZmZIM91_antiGFP y ZmZIM91_anti91.
Figura SI6. Picos detectados en el ChIP-Seq de ZmZIM91 proveniente de
protoplastos de maíz. Los picos fueron mapeados en el genoma del maíz usando el
software IGV 2.1. El gen GRMZM2G050234_T01 se encuentra próximo a los picos. El
orden de cada reglón es el siguiente: En el primero, ZmZIM91_antiGFP; en el segundo,
el control negativo GFP_antiGFP; en el tercero, ZmZIM91_anti91 y en el cuarto, el
control negativo GFP_anti91. En la parte inferior se puede ver el diagrama del gen
GRMZM2G050234_T01 y los identificadores de los picos en con MACS para
ZmZIM91_antiGFP y ZmZIM91_anti91.
Figura SI7. Picos detectados en el ChIP-Seq de ZmZIM91 proveniente de
protoplastos de maíz. Los picos fueron mapeados en el genoma del maíz usando el
software IGV 2.1. El gen GRMZM2G070899_T02 se encuentra próximo a los picos. El
orden de cada reglón es el siguiente: En el primero, ZmZIM91_antiGFP; en el segundo,
el control negativo GFP_antiGFP; en el tercero, ZmZIM91_anti91 y en el cuarto, el
control negativo GFP_anti91. En la parte inferior se puede ver el diagrama del gen
GRMZM2G070899_T02 y los identificadores de los picos en con MACS para
ZmZIM91_antiGFP y ZmZIM91_anti91.
Figura SI8. Picos detectados en el ChIP-Seq de ZmZIM91 proveniente de
protoplastos de maíz. Los picos fueron mapeados en el genoma del maíz usando el
software IGV 2.1. Los genes GRMZM2G163251_T01 y GRMZM2G463726_T01 se
encuentran próximos a los picos. El orden de cada reglón es el siguiente: En el primero,
ZmZIM91_antiGFP; en el segundo, el control negativo GFP_antiGFP; en el tercero,
ZmZIM91_anti91 y en el cuarto, el control negativo GFP_anti91. En la parte inferior se
puede ver el diagrama de los genes GRMZM2G163251_T01 y GRMZM2G463726_T01
y los identificadores de los picos en con MACS para ZmZIM91_antiGFP y
ZmZIM91_anti91.
Figura SI9. Picos detectados en el ChIP-Seq de ZmZIM91 proveniente de
protoplastos de maíz. Los picos fueron mapeados en el genoma del maíz usando el
software IGV 2.1. El gen GRMZM2G168096_T01 se encuentra próximo a los picos. El
orden de cada reglón es el siguiente: En el primero, ZmZIM91_antiGFP; en el segundo,
el control negativo GFP_antiGFP; en el tercero, ZmZIM91_anti91 y en el cuarto, el
control negativo GFP_anti91. En la parte inferior se puede ver el diagrama del gen
GRMZM2G168096_T01 y los identificadores de los picos en con MACS para
ZmZIM91_antiGFP y ZmZIM91_anti91.
Figura SI10. Picos detectados en el ChIP-Seq de ZmZIM91 proveniente de
protoplastos de maíz. Los picos fueron mapeados en el genoma del maíz usando el
software IGV 2.1. El gen GRMZM2G169020_T08 se encuentra próximo a los picos. El
orden de cada reglón es el siguiente: En el primero, ZmZIM91_antiGFP; en el segundo,
el control negativo GFP_antiGFP; en el tercero, ZmZIM91_anti91 y en el cuarto, el
control negativo GFP_anti91. En la parte inferior se puede ver el diagrama del gen
GRMZM2G169020_T08 y los identificadores de los picos en con MACS para
ZmZIM91_antiGFP y ZmZIM91_anti91.
Figura SI11. Picos detectados en el ChIP-Seq de ZmZIM91 proveniente de
protoplastos de maíz. Los picos fueron mapeados en el genoma del maíz usando el
software IGV 2.1. El gen GRMZM2G176225_T01 se encuentra próximo a los picos. El
orden de cada reglón es el siguiente: En el primero, ZmZIM91_antiGFP; en el segundo,
el control negativo GFP_antiGFP; en el tercero, ZmZIM91_anti91 y en el cuarto, el
control negativo GFP_anti91. En la parte inferior se puede ver el diagrama del gen
GRMZM2G176225_T01 y los identificadores de los picos en con MACS para
ZmZIM91_antiGFP y ZmZIM91_anti91.
Figura SI12. Picos detectados en el ChIP-Seq de ZmZIM91 proveniente de
protoplastos de maíz. Los picos fueron mapeados en el genoma del maíz usando el
software IGV 2.1. Los genes GRMZM2G031138_T01 y GRMZM2G8228224_T01 se
encuentran próximos a los picos. El orden de cada reglón es el siguiente: En el primero,
ZmZIM91_antiGFP; en el segundo, el control negativo GFP_antiGFP; en el tercero,
ZmZIM91_anti91 y en el cuarto, el control negativo GFP_anti91. En la parte inferior se
puede ver el diagrama de los genes GRMZM2G031138_T01 y GRMZM2G8228224_T01
y los identificadores de los picos en con MACS para ZmZIM91_antiGFP y
ZmZIM91_anti91.
Figura SI13. Picos detectados en el ChIP-Seq de ZmZIM91 proveniente de
protoplastos de maíz. Los picos fueron mapeados en el genoma del maíz usando el
software IGV 2.1. El gen GRMZM2G014444_T02 se encuentra próximo a los picos. El
orden de cada reglón es el siguiente: En el primero, ZmZIM91_antiGFP; en el segundo,
el control negativo GFP_antiGFP; en el tercero, ZmZIM91_anti91 y en el cuarto, el
control negativo GFP_anti91. En la parte inferior se puede ver el diagrama del gen
GRMZM2G014444_T02 y los identificadores de los picos en con MACS para
ZmZIM91_antiGFP y ZmZIM91_anti91.
Figura SI14. Picos detectados en el ChIP-Seq de ZmZIM91 proveniente de
protoplastos de maíz. Los picos fueron mapeados en el genoma del maíz usando el
software IGV 2.1. El gen GRMZM2G436038_T01 se encuentra próximo a los picos. El
orden de cada reglón es el siguiente: En el primero, ZmZIM91_antiGFP; en el segundo,
el control negativo GFP_antiGFP; en el tercero, ZmZIM91_anti91 y en el cuarto, el
control negativo GFP_anti91. En la parte inferior se puede ver el diagrama del gen
GRMZM2G436038_T01 y los identificadores de los picos en con MACS para
ZmZIM91_antiGFP y ZmZIM91_anti91.
Figura SI15. Picos detectados en el ChIP-Seq de ZmZIM91 proveniente de
protoplastos de maíz. Los picos fueron mapeados en el genoma del maíz usando el
software IGV 2.1. El gen GRMZM2G084799_T01 (P1) se encuentra próximo a los
picos. El orden de cada reglón es el siguiente: En el primero, ZmZIM91_antiGFP; en el
segundo, el control negativo GFP_antiGFP; en el tercero, ZmZIM91_anti91 y en el
cuarto, el control negativo GFP_anti91. En la parte inferior se puede ver el diagrama del
gen GRMZM2G084799_T01 (P1) y los identificadores de los picos en con MACS para
ZmZIM91_antiGFP y ZmZIM91_anti91.
Figura SI16. Picos detectados en el ChIP-Seq de ZmZIM91 proveniente de
protoplastos de maíz. Los picos fueron mapeados en el genoma del maíz usando el
software IGV 2.1. El gen GRMZM5G822829_T03 (R) se encuentra próximo a los picos.
El orden de cada reglón es el siguiente: En el primero, ZmZIM91_antiGFP; en el
segundo, el control negativo GFP_antiGFP; en el tercero, ZmZIM91_anti91 y en el
cuarto, el control negativo GFP_anti91. En la parte inferior se puede ver el diagrama del
gen GRMZM5G822829_T03 (R) y los identificadores de los picos en con MACS para
ZmZIM91_antiGFP y ZmZIM91_anti91.
Validación de picos por PCR semi-cuantitativa de ChIP de protoplastos de maíz
que sobre-expresan 35S::ZmZIM91:GFP y ChIP de protoplastos de maíz que
sobre-expresan 35S::GFP

INPUT Anti_GFP Anti_ZmZIM91

PCR semi-cuantitativa
35S:: ZmZIM91:GFP

del pico 4
35S::GFP

INPUT Anti_GFP Anti_ZmZIM91

PCR semi-cuantitativa
35S:: ZmZIM91:GFP

del pico 7
35S::GFP

INPUT Anti_GFP Anti_ZmZIM91

PCR semi-cuantitativa
35S:: ZmZIM91:GFP

del pico 11
35S::GFP

INPUT Anti_GFP Anti_ZmZIM91

PCR semi-cuantitativa
35S:: ZmZIM91:GFP
del pico 19

35S::GFP

INPUT Anti_GFP Anti_ZmZIM91

PCR semi-cuantitativa

35S:: ZmZIM91:GFP
del pico 34

35S::GFP

INPUT Anti_GFP Anti_ZmZIM91

PCR semi-cuantitativa

35S:: ZmZIM91:GFP
del pico 39

35S::GFP
INPUT Anti_GFP Anti_ZmZIM91

PCR semi-cuantitativa
35S:: ZmZIM91:GFP

del pico 40
35S::GFP

INPUT Anti_GFP Anti_ZmZIM91

PCR semi-cuantitativa
35S:: ZmZIM91:GFP

del pico 42
35S::GFP

INPUT Anti_GFP Anti_ZmZIM91

PCR semi-cuantitativa
35S:: ZmZIM91:GFP

del pico 43
35S::GFP

INPUT Anti_GFP Anti_ZmZIM91

PCR semi-cuantitativa
35S:: ZmZIM91:GFP

35S::GFP del pico 45

Figura SI17. PCRs semi-cuantitativas de picos identificados en el ChIP-Seq de

ZmZIM91 proveniente de protoplastos de maíz. Las PCRs semi-cuantitativas de
ChIP, se hicieron en diluciones seriadas del material de ChIP de protoplastos de maíz
que sobre-expresaban 35S::ZmZIM91:GFP y de ChIP de protoplastos de maíz que
sobre-expresaban 35S::GFP, utilizando las muestras del Input y las
inmunoprecipitaciones realizadas con el Anti_GFP y el Anti_ZmZIM91 para cada caso.
ANEXO II
ChIP-Seq de ZmZIM91
proveniente de hojas de
plantas de maíz de 9 días
Identificación de genes diana putativos de ZmZIM91 en el ChIP-Seq de hojas de
plantas de maíz de 9 días

Otros picos enriquecidos en el ChIP-Seq de ZmZIM91 proveniente de hojas de plantas

de maíz de 9 días, fueron localizados con ayuda del software IGV y se muestran a
continuación:

A
Gen Función putativa Homólogo en Arabidopsis

AC232289.2_FGT009 PPR. Proceso biológico desconocido AT5G04780.1

Figura SII1. Pico detectado en dos réplicas biológicas de ChIP-Seq de ZmZIM91

de hojas de plantas de maíz. El gen AC232289.2_FGT009 se encuentra próximo a los
picos. En (A) se muestra una tabla que contiene el identificador del gen en maíz, su
función putativa y el homólogo en Arabidopsis. En (B) fueron mapeados los picos en el
genoma del maíz usando el software IGV 2.1. En la parte superior se observan los picos
de enriquecimiento en dos de las réplicas biológicas sobre el promotor del gen
AC232289.2_FGT009 y en la parte inferior se puede ver el diagrama del gen
AC232289.2_FGT009 y los identificadores en MACS de los picos detectados en cada
réplica biológica.
A
Gen Función putativa Homólogo en Arabidopsis

AC216872.3_FGT002 Factor de transcripción AP2/B3-like. AT1G01030.1

Desarrollo de flores y hojas, regulación de
la transcripción, dependiente de ADN.

Figura SII2. Pico detectado en dos réplicas biológicas de ChIP-Seq de ZmZIM91

de hojas de plantas de maíz. El gen AC2168723_FGT002 se encuentra próximo a los
picos. En (A) se muestra una tabla que contiene el identificador del gen en maíz, su
función putativa y el homólogo en Arabidopsis. En (B) fueron mapeados los picos en el
genoma del maíz usando el software IGV 2.1. En la parte superior se observan los picos
de enriquecimiento en dos de las réplicas biológicas sobre el promotor del gen
AC2168723_FGT002 y en la parte inferior se puede ver el diagrama del gen
AC2168723_FGT002 y los identificadores en MACS de los picos detectados en cada
réplica biológica.
A Gen Función putativa Homólogo en Arabidopsis
GRMZM5G844124 Transcripción dependiente de ADN, elongación, generación de ATCG00820.1
precursores de metabolitos y energía, fotosíntesis, translación.

GRMZM2G400925 Transportador de sulfato, transportador transmembrana. AT3G15990.1

Figura SII3. Pico detectado en tres réplicas biológicas de ChIP-Seq de ZmZIM91

de hojas de plantas de maíz. Los genes GRMZM5G844124 y GRMZM2G400925 se
encuentran próximos a los picos. En (A) se muestra una tabla que contiene el
identificador del gen en maíz, su función putativa y el homólogo en Arabidopsis. En (B)
fueron mapeados los picos en el genoma del maíz usando el software IGV 2.1. En la
parte superior se observan los picos de enriquecimiento en las tres réplicas biológicas
sobre los promotores de los genes GRMZM5G844124 y GRMZM2G400925 y en la
parte inferior se puede ver el diagrama de los genes GRMZM5G844124 y
GRMZM2G400925 y los identificadores en MACS de los picos detectados en cada
réplica biológica.
A
Gen Función putativa Homólogo en Arabidopsis
GRMZM5G869030 Unión a ATP, actividad nucleosido ATCG01280.1
trifosfatasa, unión a nucleotido.

Figura SII4. Pico detectado en tres réplicas biológicas de ChIP-Seq de ZmZIM91

de hojas de plantas de maíz. El gen GRMZM5G869030 se encuentra próximo a los
picos. En (A) se muestra una tabla que contiene el identificador del gen en maíz, su
función putativa y el homólogo en Arabidopsis. En (B) fueron mapeados los picos en el
genoma del maíz usando el software IGV 2.1. En la parte superior se observan los picos
de enriquecimiento en las tres réplicas biológicas sobre el promotor del gen
GRMZM5G869030 y en la parte inferior se puede ver el diagrama del gen
GRMZM5G869030 y los identificadores en MACS de los picos detectados en cada
réplica biológica.
A
Gen Función putativa Homólogo en Arabidopsis
GRMZM2G047681 Unión a fosfopanteteina. AT4G09150.2

Figura SII5. Pico detectado en tres réplicas biológicas de ChIP-Seq de ZmZIM91

de hojas de plantas de maíz. El gen GRMZM2G047681 se encuentra próximo a los
picos. En (A) se muestra una tabla que contiene el identificador del gen en maíz, su
función putativa y el homólogo en Arabidopsis. En (B) fueron mapeados los picos en el
genoma del maíz usando el software IGV 2.1. En la parte superior se observan los picos
de enriquecimiento en las tres réplicas biológicas sobre el promotor del gen
GRMZM2G047681 y en la parte inferior se puede ver el diagrama del gen
GRMZM2G047681 y los identificadores en MACS de los picos detectados en cada
réplica biológica.
A
Gen Función putativa Homólogo en
Arabidopsis
AC207533.2_FGT002 División cellular, crecimiento cellular, citoquinesis por formación de célula AT3G08850.1
plate, finalización del desarrollo embrionario en la dormancia de la semilla,
especificación de patrones embrionarios, especificación del meristemo apical
de la raíz primaria, glicosilación de proteínas, regulación de la diferenciación
celular, maduración de la semilla, cohesión de la cromatida hermana, fase de
transcición del meristemo para la reproducción vegetativa.

Figura SII6. Pico detectado en dos réplicas biológicas de ChIP-Seq de ZmZIM91

de hojas de plantas de maíz. El gen AC207533.2_FGT002 se encuentra próximo a los
picos. En (A) se muestra una tabla que contiene el identificador del gen en maíz, su
función putativa y el homólogo en Arabidopsis. En (B) fueron mapeados los picos en el
genoma del maíz usando el software IGV 2.1. En la parte superior se observan los picos
de enriquecimiento en dos de las réplicas biológicas sobre el promotor del gen
AC207533.2_FGT002 y en la parte inferior se puede ver el diagrama del gen
AC207533.2_FGT002 y los identificadores en MACS de los picos detectados en cada
réplica biológica.
A
Gen Función putativa Homólogo en Arabidopsis
AC209062.3_FGT002 Desconocida. No homólogo en Arabidopsis

Figura SII7. Pico detectado en dos réplicas biológicas de ChIP-Seq de ZmZIM91

de hojas de plantas de maíz. El gen AC209062.3_FGT002 se encuentra próximo a los
picos. En (A) se muestra una tabla que contiene el identificador del gen en maíz, su
función putativa y el homólogo en Arabidopsis. En (B) fueron mapeados los picos en el
genoma del maíz usando el software IGV 2.1. En la parte superior se observan los picos
de enriquecimiento en dos de las réplicas biológicas sobre el promotor del gen
AC209062.3_FGT002 y en la parte inferior se puede ver el diagrama del gen
AC209062.3_FGT002 y los identificadores en MACS de los picos detectados en cada
réplica biológica.
A Gen Función putativa Homólogo en
Arabidopsis
GRMZM2G427444_T01 Procesos de reducción-oxidación. ATCG01250.1

GRMZM2G427369_T02 Transporte de sulfato, transporte transmembrana, transporte. AT3G15990.1

GRMZM2G358180_T01 Transcripción dependiente de ADN, elongación, generación de precursors ATCG00280.1

de metabolitos y energía, fotosíntesis, reacción a luz, cadena del transporte
fotosintetico de electrones, transporte fotosintetico de electrones en
fotosistema II, ensamble de fotosistema II.

Figura SII8. Pico detectado en dos réplicas biológicas de ChIP-Seq de ZmZIM91

de hojas de plantas de maíz. Los genes GRMZM2G427444_T01,
GRMZM2G427369_T02 y GRMZM2G358180_T01 se encuentran próximos a los picos.
En (A) se muestra una tabla que contiene el identificador del gen en maíz, su función
putativa y el homólogo en Arabidopsis. En (B) fueron mapeados los picos en el genoma
del maíz usando el software IGV 2.1. En la parte superior se observan los picos de
enriquecimiento en dos de las réplicas biológicas sobre los promotores de los genes
GRMZM2G427444_T01, GRMZM2G427369_T02 y GRMZM2G358180_T01 y en la
parte inferior se puede ver el diagrama de los genes GRMZM2G427444_T01,
GRMZM2G427369_T02 y GRMZM2G358180_T01 y los identificadores en MACS de
los picos detectados en cada réplica biológica.
A
Gen Función putativa Homólogo en Arabidopsis
GRMZM5G849152_T01 Desconocida. No homólogo en Arabidopsis

Figura SII9. Pico detectado en tres réplicas biológicas de ChIP-Seq de ZmZIM91

de hojas de plantas de maíz. El gen GRMZM5G849152_T01 se encuentra próximo a
los picos. En (A) se muestra una tabla que contiene el identificador del gen en maíz, su
función putativa y el homólogo en Arabidopsis. En (B) fueron mapeados los picos en el
genoma del maíz usando el software IGV 2.1. En la parte superior se observan los picos
de enriquecimiento en las tres réplicas biológicas sobre el promotor del gen
GRMZM5G849152_T01 y en la parte inferior se puede ver el diagrama del gen
GRMZM5G849152_T01 y los identificadores en MACS de los picos detectados en cada
réplica biológica.
A
Gen Función putativa Homólogo en Arabidopsis
GRMZM2G157517 Transformación mediada por ADN, metilación de la lisina de histona. AT4G13460.1

GRMZM2G055151 Procesos catabolicos nucleares de transcripción de mRNA. AT1G26580.1

GRMZM2G055567 Transcripción dependiente de ADN, elongación, generación de precursores ATCG00180.1

de metabolitos y energía, fotosíntesis, transcripción, dependencia a ADN.

Figura SII10. Pico detectado en dos réplicas biológicas de ChIP-Seq de ZmZIM91

de hojas de plantas de maíz. Los genes GRMZM2G157517, GRMZM2G055151 y
GRMZM2G055567 se encuentran próximos a los picos. En (A) se muestra una tabla que
contiene el identificador del gen en maíz, su función putativa y el homólogo en
Arabidopsis. En (B) fueron mapeados los picos en el genoma del maíz usando el
software IGV 2.1. En la parte superior se observan los picos de enriquecimiento en dos
de las réplicas biológicas sobre los promotores de los genes GRMZM2G157517,
GRMZM2G055151 y GRMZM2G055567 y en la parte inferior se puede ver el diagrama
de los genes GRMZM2G157517, GRMZM2G055151 y GRMZM2G055567 y los
identificadores en MACS de los picos detectados en cada réplica biológica.
A
Gen Función putativa Homólogo en Arabidopsis
GRMZM2G138349_T04 Transporte vesícula Golgi, crecimiento celular, morfogénesis celular, AT4G21160.1
fusión de la membrana celular, transporte endosomal, transporte
intracelular de proteínas, proteínas dianas, proteínas diana a vacuola,
regulación de la actividad de ARF GTPase, transporte mediado vesícula.

Figura SII11. Pico detectado en tres réplicas biológicas de ChIP-Seq de ZmZIM91

de hojas de plantas de maíz. El gen GRMZM2G138349_T04 se encuentra próximo a
los picos. En (A) se muestra una tabla que contiene el identificador del gen en maíz, su
función putativa y el homólogo en Arabidopsis. En (B) fueron mapeados los picos en el
genoma del maíz usando el software IGV 2.1. En la parte superior se observan los picos
de enriquecimiento en las tres réplicas biológicas sobre el promotor del gen
GRMZM2G138349_T04 y en la parte inferior se puede ver el diagrama del gen
GRMZM2G138349_T04 y los identificadores en MACS de los picos detectados en cada
réplica biológica.
A
Gen Función putativa Homólogo en Arabidopsis
GRMZM2G115895_T01 Vía de señalización por luz roja o rojo lejano, regulación de la AT2G46970.1
transcripción, dependiente de ADN, huida a la sombra.

Figura SII12. Pico detectado en tres réplicas biológicas de ChIP-Seq de ZmZIM91

de hojas de plantas de maíz. El gen GRMZM2G115895_T01 se encuentra próximo a
los picos. En (A) se muestra una tabla que contiene el identificador del gen en maíz, su
función putativa y el homólogo en Arabidopsis. En (B) fueron mapeados los picos en el
genoma del maíz usando el software IGV 2.1. En la parte superior se observan los picos
de enriquecimiento en las tres réplicas biológicas sobre el promotor del gen
GRMZM2G115895_T01 y en la parte inferior se puede ver el diagrama del gen
GRMZM2G115895_T01 y los identificadores en MACS de los picos detectados en cada
réplica biológica.
A
Gen Función putativa Homólogo en Arabidopsis
GRMZM2G473511_T01 Fosforilación de proteínas. AT1G66920.2

GRMZM5G825193 Respuesta a defensa, proceso metabolico de glicerol, proceso metabolico AT1G66980.1

de lípidos, modificación de mRNA, proceso metabolic de maltose,
fosforilación de proteínas.

Figura SII13. Pico detectado en dos réplicas biológicas de ChIP-Seq de ZmZIM91

de hojas de plantas de maíz. Los genes GRMZM2G473511_T01 y GRMZM5G825193
se encuentran próximos a los picos. En (A) se muestra una tabla que contiene el
identificador del gen en maíz, su función putativa y el homólogo en Arabidopsis. En (B)
fueron mapeados los picos en el genoma del maíz usando el software IGV 2.1. En la
parte superior se observan los picos de enriquecimiento en dos de las réplicas biológicas
sobre los promotores de los genes GRMZM2G473511_T01 y GRMZM5G825193 y en la
parte inferior se puede ver el diagrama de los genes GRMZM2G473511_T01 y
GRMZM5G825193 y los identificadores en MACS de los picos detectados en cada
réplica biológica.
A
Gen Función putativa Homólogo en Arabidopsis
GRMZM2G005947_T01 Transporte de lípidos, glicosilación de proteínas. AT2G36360.5

Figura SII14. Pico detectado en dos réplicas biológicas de ChIP-Seq de ZmZIM91

de hojas de plantas de maíz. El gen GRMZM2G005947_T01 se encuentra próximo a
los picos. En (A) se muestra una tabla que contiene el identificador del gen en maíz, su
función putativa y el homólogo en Arabidopsis. En (B) fueron mapeados los picos en el
genoma del maíz usando el software IGV 2.1. En la parte superior se observan los picos
de enriquecimiento en las tres réplicas biológicas sobre el promotor del gen
GRMZM2G005947_T01 y en la parte inferior se puede ver el diagrama del gen
GRMZM2G005947_T01 y los identificadores en MACS de los picos detectados en cada
réplica biológica.
A
Gen Función putativa Homólogo en Arabidopsis
GRMZM2G575954_T01 Desconocida. No homólogo en Arabidopsis

Figura SII15. Pico detectado en dos réplicas biológicas de ChIP-Seq de ZmZIM91

de hojas de plantas de maíz. El gen GRMZM2G575954_T01 se encuentra próximo a
los picos. En (A) se muestra una tabla que contiene el identificador del gen en maíz, su
función putativa y el homólogo en Arabidopsis. En (B) fueron mapeados los picos en el
genoma del maíz usando el software IGV 2.1. En la parte superior se observan los picos
de enriquecimiento en dos de las réplicas biológicas sobre el promotor del gen
GRMZM2G575954_T01 y en la parte inferior se puede ver el diagrama del gen
GRMZM2G575954_T01 y los identificadores en MACS de los picos detectados en cada
réplica biológica.
A
Gen Función putativa Homólogo en Arabidopsis
GRMZM2G455413_T01 Transcripción dependiente de ADN, elongación, generación de ATCG00020.1
precursores de metabolitos y energía, fotosíntesis, reacción a luz,
fotosintético transporte electrón en fotosistema II, ensamble de
fotosistema II.
B

Figura SII16. Pico detectado en dos réplicas biológicas de ChIP-Seq de ZmZIM91

de hojas de plantas de maíz. El gen GRMZM2G455413_T01 se encuentra próximo a
los picos. En (A) se muestra una tabla que contiene el identificador del gen en maíz, su
función putativa y el homólogo en Arabidopsis. En (B) fueron mapeados los picos en el
genoma del maíz usando el software IGV 2.1. En la parte superior se observan los picos
de enriquecimiento en dos de las réplicas biológicas sobre el promotor del gen
GRMZM2G455413_T01 y en la parte inferior se puede ver el diagrama del gen
GRMZM2G455413_T01 y los identificadores en MACS de los picos detectados en cada
réplica biológica.
ANEXO III
PUBLICACIONES
Mol Cell Biochem
DOI 10.1007/s11010-011-0971-6

Specific characteristics of CK2b regulatory subunits in plants

Isabel Cristina Velez-Bermudez • Sami Irar •
Lorenzo Carretero-Paulet • Montserrat Pagès •

Marta Riera

Received: 13 June 2011 / Accepted: 24 June 2011

Ó Springer Science+Business Media, LLC. 2011

Abstract In all eukaryotes, the typical CK2 holoenzyme structure for Zea mays CK2b1 by homology modeling and
is an heterotetramer composed of two catalytic (CK2a and we discuss about possible structural changes in the acidic
CK2a0 ) and two regulatory (CK2b) subunits. One of the loop region that could affect the enzyme regulation.
distinctive traits of plant CK2 is that they present a greater
number of genes encoding for CK2a/b subunits than ani- Keywords Protein kinase CK2 CK2b regulatory
mals or yeasts, for instance, in Arabidopsis and maize both subunit Multigenic family Acidic loop
CK2a/b subunits belong to multigenic families composed Homology modeling
by up to four genes. Here, we conducted a genome-wide
survey examining 34 different plant genomes in order to
investigate if the multigenic property of CK2b genes is a Introduction
common feature through the entire plant kingdom. Also, at
the level of structure, the plant CK2b regulatory subunits In plants, protein kinase CK2 is a key enzyme involved
present distinctive features as (i) they lack about 20 ami- in relevant processes such as plant growth and light-
noacids in the C-terminal domain, (ii) they present a spe- regulated gene expression; circadian rhythm; cell-cycle
cific N-terminal extension of about 90 aminoacids that regulation and development; and biotic and abiotic stress
shares no homology with any previously characterized responses [1–7]. As in the case of mammals, the typical
functional domain, and (iii) the acidic loop region is poorly CK2 holoenzyme is a heterotetrameric complex com-
conserved at the aminoacid level. Since there is no data posed of two catalytic (CK2a and CK2a0 ) and two reg-
about CK2b or holoenzyme structure in plants, in this ulatory (CK2b) subunits. CK2b regulatory subunits are
study, we use human CK2b as a template to predict a inactive and present no homology to regulatory subunits
or domains of other protein kinases. The CK2b regula-
tory subunits are involved in the assembly of CK2 tet-
Electronic supplementary material The online version of this rameric complexes, in enhancing catalytic activity and
article (doi:10.1007/s11010-011-0971-6) contains supplementary stability of CK2a and in modulation of the substrate
material, which is available to authorized users.
specificity of CK2 [8]. In addition, CK2b can interact
I. C. Velez-Bermudez S. Irar L. Carretero-Paulet and regulate other proteins in the absence of CK2a
M. Pagès M. Riera (&) subunits [9, 10].
Molecular Genetics Department, Centre for Research In contrast to animals, plants present a high number of
on Agricultural Genomics CRAG (CSIC-IRTA-UAB-UB),
genes encoding for CK2a/b subunits: in humans there are
Campus UAB 08193 Bellaterra, Cerdanyola del Vallès,
Barcelona, Spain two genes encoding for catalytic subunits (CK2a/a0 ) and
e-mail: [email protected] only one for CK2b regulatory subunits [11, 12], whereas in
Arabidopsis and maize, both CK2a/b subunits belong to
L. Carretero-Paulet
multigenic families composed by up to four genes [2,
Institute for Plant Molecular and Cell Biology – IBMCP
(CSIC-UPV) Integrative Systems Biology Group, 13–18]. However, the presence of multiple CK2a/b iso-
C/Ingeniero Fausto Elio s/n., 46022 Valencia, Spain forms in plants is unlikely to be redundant, since specific

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Mol Cell Biochem

functions have been associated to each isoform [19]. For (http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) was used for viewing
instance, in maize, we previously described differential the sequences and structures.
subcellular localization and expression levels for each
CK2b isoform [7, 15]. In Arabidopsis, only CK2B3 and
CK2B4 isoforms play a role in circadian-clock regulation
[2, 17] and specific CK2 holoenzymes present differential Results and discussion
substrate specificity [20]. Also in tobacco differential
expression of genes encoding protein kinase CK2 subunits The CK2b regulatory subunits families in plants
in the plant cell cycle has been described [21]. Here, we
conducted a genome-wide survey examining 34 different In order to identify and classify all CK2b homologue genes
plant genomes in order to investigate if the multigenic in plant species, searches were performed throughout the
property of CK2b genes is a common trait of plant kingdom. proteomes of thirty-four plant species with whole
The CK2a catalytic subunits are highly conserved among sequenced genomes Zea mays CK2b1 as a query [14]. As a
eukaryotic organisms, but the level of identity between result, 90 sequences, corresponding to the CK2b gene
plant, yeast and human CK2b subunits is not so high. families of red and green algae, moss, lycophytes, gym-
Despite the elucidation of the human CK2a/b subunits and nosperms, and angiosperms, representing the main plant
holoenzyme and maize CK2a structure [22–24], there is no evolutionary lineages were found (Table 1 and Supple-
data about CK2b or holoenzyme structure in plants. All mental Table 1). Unicellular algae species showed a single
plant CK2b subunits preserve in their central core the CK2b gene, while land plants commonly showed three-to-
characteristic CK2b feature, the zinc finger region that five CK2b genes. It could be argued that evolutionary
contains four conserved cysteine residues involved in CK2b expansion of the CK2b gene family is related to the
dimerization. However, there are distinctive features in acquisition of multicellulalirity. However, it is not very
plant CK2b: (i) they are about twenty aminoacids shorter in likely since only one gene was found in the multicellular
the C-terminal domain, (ii) they present a specific N-ter- algae Volvox carteri as well as in all the animal species
minal extension of about ninety aminoacids that shares no examined, except Drosphila melanogaster that present two
homology with any previously characterized functional genes. In addition, the fungal species (including unicellular
domain, and (iii) the acidic loop region present in animal yeasts) and protist (as Plasmodiun falciparum) also showed
CK2 is poorly conserved in plant sequences. Here, using two genes copies (Supplemental Table 2). Additional gene
human CK2b as template we predict a hypothetical struc- family expansion would have occurred in specific plant
ture for Zea mays CK2b1 and describe its structural features lineages, as reflected the higher number of CK2b genes
to give clues to understanding its molecular functions. found in the genomes of the dicots Malus domestica (ele-
ven) or Glycine max (six). In these specific cases, redun-
dancy could be also considered, even if the main
Materials and methods hypothesis links the presence of multiple isoforms in plants
to specific functions [2, 15, 17, 20, 21]. Similarly, lineage-
Plant CK2b regulatory subunits sequence analysis specific contraction of this family could be observed in
Medicago truncatula, bearing one CK2b gene. In monocots
Searches were performed throughout the proteomes of there is also heterogeneity between the different CK2b
thirty plant species with whole sequenced genomes (Sup- families, since three to four genes are found in Zea mays,
plemental Table 1). For the not fully sequenced genomes, Sorghum bicolor, and Brachypodium distachyon but only
sequences were retrieved from UNIPROT. We have used one or two genes are found in Hordeum vulgare and Oryza
BLASTP [25] and Zea mays CK2b1 as a query [15]. Hits sativa. It is possible that the sizes of the CK2b gene fam-
returning E values \10E-5 were considered as significant. ilies differ mainly because of differential rates of gene
Sequences were aligned using CLUSTAL [26] and the duplication and retention and may reflect species-specific
resulting alignments examined individually. Finally, adaptations. This observation is in agreement with the
redundant sequences and alternatively spliced isoforms proposed ancient origin of the basic genetic toolkit of land
were discarded. plants [29]; much of plant diversity may have arisen largely
Homology modeling for Zea mays CK2b1 was per- following the duplication and adaptive specialization of
formed by comparative modeling approach using three pre-existing genes [30]. Differential evolutionary expan-
automated homology modeling programs, MODELLER sion of this family reflects the prevalence of gene dupli-
9v9 (http://www.salilab.org/modeller/), SWISS-MODEL cation in land plant genome evolution [31–34] as well as
[27], and GENO3D [28]. Human CK2b structure (PDB ID: the major role of polyploidization in speciation of vascular
1JWH) was used as as template [23]. CHIMERA program plants [35, 36].

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Mol Cell Biochem

Table 1 CK2b regulatory

Species name Family Clade/lineage Number of
subunits genes in plants
CK2b genes

Cyanidioschyzon merolae 10D Cyanidiaceae Red algae 1

Chlamydomonas reinhardtii Chlamydomonadaceae Green algae 1
Chlorella variabilis NC64A Chlorellaceae Green algae 1
Chlorella vulgaris C-169 Chlorellaceae Green algae 1
Micromonas sp. RCC299 Mamiellaceae Green algae 1
Micromonas pusilla CCMP1545 Mamiellaceae Green algae 1
Ostreococcus lucimarinus Mamiellaceae Green algae 1
Ostreococcus tauri Mamiellaceae Green algae 1
Volvox carteri Volvocaceae Green algae 1
Selaginella moellendorffii Selaginellaceae Spike moss 3
Physcomitrella patens Funariaceae Moss 4
Picea sitchensis Pinaceae Gymnosperms 2
Solanum lycopersicum Solanaceae Dicot (Asterids) 5
Nicotiana tabacum Solanaceae Dicot (Asterids) 2
Vitis vinifera Vitaceae Dicot (Rosids) 2
Cucumis sativus Cucurbitaceae Dicot (Rosids) 2
Populus trichocarpa Salicaceae Dicot (Rosids) 4
Ricinus communis Euphorbiaceae Dicot (Rosids) 2
Jatropha curcas Euphorbiaceae Dicot (Rosids) 2
Malus x domestica Rosaceae Dicot (Rosids) 11
Fragaria vesca Rosaceae Dicot (Rosids) 3
Medicago truncatula Fabaceae Dicot (Rosids) 1
Glycine max Fabaceae Dicot (Rosids) 6
Lotus japonicus Fabaceae Dicot (Rosids) 3
Carica papaya L. Caricaceae Dicot (Rosids) 2
Arabidopsis thaliana Brassicaceae Dicot (Rosids) 4
Arabidopsis lyrata Brassicaceae Dicot (Rosids) 5
Brassica oleracea Brassicaceae Dicot (Rosids) 2
Theobroma cacao Malvaceae Dicot (Rosids) 2
Oryza sativa Japonica Poaceae Monocot 2
Brachypodium distachyon Poaceae Monocot 4
Zea mays Poaceae Monocot 4
Sorghum bicolor Poaceae Monocot 3
Hordeum vulgare Poaceae Monocot 1

Homology modeling of maize CK2b1 prediction programs were unable to determine tertiary
regulatory subunit structure for this domain.
The human CK2b subunit (1–215) is a compact globular
Homology modeling is based on the fact that protein ter- homodimer organized in seven a-helices and three b-sheets
tiary structure is better conserved than amino acid sequence [24]. The tertiary structure predicted for the central core of
[37]. Thus, we have used human CK2b sequence and maize CK2b1 (82–276) overlaps with the human CK2b
structure as a template to predict a possible tertiary struc- structure in almost all the structure (1–197) (Fig. 1b). Since
ture of maize CK2b1. As shown in the alignment in maize CK2b1 is eighteen aminoacids shorter than human
Fig. 1a, the sequence identity between the central core of CK2b in the C-terminal domain, the a7 helix of human
maize CK2b1 (82–276) and human CK2b is 51%. Unfor- CK2b (196–202) is not present in the maize structure. The
tunately, since the plant specific N-terminal domain of other six a-helices and three b-strands overlap in both
maize CK2b1 (1–81) presents no homology with other structures. It is noteworthy that the most diverging region
protein or domains either in sequence or in structure, the between both structures corresponds to the acidic loop

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Mol Cell Biochem

Fig. 1 a Pairwise alignment of

Zea mays CK2b1 (accession
number AF239816) and the
template human CK2b (PDB
ID: 1JWH). The acidic loop
region is boxed. b Superposition
of the predicted model of Zea
mays CK2b1 (in blue) onto the
template human CK2b (PDB
ID: 1JWH) (in red, represented
as dimer). c Detail of the
structure of acidic loop region
of human CK2b (58
PDEELEDNP 66) and Zea mays
CK2b1 (139 SSHGDMLTE
147)

domain. In human CK2b the acidic loop region (residues shown in Fig. 1c, within and close to the human CK2b
55–64) has been described as a regulatory region since acidic loop there are two Pro residues (position 58 and 66).
contains the binding domain for polyamines [38]. The Proline presents an exceptional conformational rigidity
crystal structure of human CK2b demonstrates that the compared to other amino acids, therefore, it is remarkable
acidic loop is probably a very flexible region since the that these two residues are not conserved in any of the plant
electron density in this region is not well defined and CK2b sequence analyzed whereas they are present in the
adapts more than one conformation [25]. The aminoacid animal sequences examined (data not shown). In animals it
composition of maize CK2b1 acidic loop differs from that has been shown that mutation in residues in the acidic loop
of human CK2b. Whereas in human CK2b in eight of the region affects the CK2 activity [39], therefore, it is likely to
ten aminoacids are acidic (55 DLEPDEELED 64), in think that the differences found in this region could also
maize, CK2b1 there are only three acidic of ten, two of affect to plant enzyme regulation. In agreement with that
them conserved in the same position (136 DVESSHGDML hypothesis, we have previously demonstrated that the in
145). The maize acidic loop presents high heterogeneity vitro properties of the maize holoenzyme are different from
since contains different types of residues: basic (as His), those of the human CK2, since human CK2 holoenzyme
non-polar (as Val, Gly, Leu, and Met) and polar (Ser). As present higher stability and specific activity than its maize

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Mol Cell Biochem

counterpart [40]. Work is in progress to confirm if the plant 15. Riera M, Peracchia G, De Nadal E, Ariño J, Pagès M (2001)
specific N-terminal domain and the low-conserved acidic Maize protein kinase CK2: regulation and functionality of three b
regulatory subunits. Plant J 25:365–374
loop have a role in modulation of the enzyme in plants. 16. Collinge MA, Walker JC (1994) Isolation of an Arabidopsis
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supported by grant BIO2009-13044-CO2-01 from MICINN (Spain). 18. Mizoguchi T, Yamaguchi-Shinozaki K, Hayashida N, Kamada H,
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Role of Plant-Specific N-Terminal Domain of Maize CK2b1
Subunit in CK2b Functions and Holoenzyme Regulation
Marta Riera1., Sami Irar1., Isabel C. Vélez-Bermúdez1, Lorenzo Carretero-Paulet1,2¤, Victoria
Lumbreras1, Montserrat Pagès1*
1 Department of Molecular Genetics, Centre for Research on Agricultural Genomics CRAG (CSIC-IRTA-UAB), Barcelona, Spain, 2 Department of Applied Biology (Area of
Genetics). University of Almerı́a, Spain

Abstract
Protein kinase CK2 is a highly pleiotropic Ser/Thr kinase ubiquituous in eukaryotic organisms. CK2 is organized as a
heterotetrameric enzyme composed of two types of subunits: the catalytic (CK2a) and the regulatory (CK2b). The CK2b
subunits enhance the stability, activity and specificity of the holoenzyme, but they can also perform functions
independently of the CK2 tetramer. CK2b regulatory subunits in plants differ from their animal or yeast counterparts, since
they present an additional specific N-terminal extension of about 90 aminoacids that shares no homology with any
previously characterized functional domain. Sequence analysis of the N-terminal domain of land plant CK2b subunit
sequences reveals its arrangement through short, conserved motifs, some of them including CK2 autophosphorylation sites.
By using maize CK2b1 and a deleted version (DNCK2b1) lacking the N-terminal domain, we have demonstrated that CK2b1
is autophosphorylated within the N-terminal domain. Moreover, the holoenzyme composed with CK2a1/DNCK2b1 is able to
phosphorylate different substrates more efficiently than CK2a1/CK2b1 or CK2a alone. Transient overexpression of CK2b1
and DNCK2b1 fused to GFP in different plant systems show that the presence of N-terminal domain enhances aggregation
in nuclear speckles and stabilizes the protein against proteasome degradation. Finally, bimolecular fluorescence
complementation (BiFC) assays show the nuclear and cytoplasmic location of the plant CK2 holoenzyme, in contrast to
the individual CK2a/b subunits mainly observed in the nucleus. All together, our results support the hypothesis that the
plant-specific N-terminal domain of CK2b subunits is involved in the down-regulation of the CK2 holoenzyme activity and in
the stabilization of CK2b1 protein. In summary, the whole amount of data shown in this work suggests that this domain was
acquired by plants for regulatory purposes.

Citation: Riera M, Irar S, Vélez-Bermúdez IC, Carretero-Paulet L, Lumbreras V, et al. (2011) Role of Plant-Specific N-Terminal Domain of Maize CK2b1 Subunit in
CK2b Functions and Holoenzyme Regulation. PLoS ONE 6(7): e21909. doi:10.1371/journal.pone.0021909
Editor: Arthur J. Lustig, Tulane University Health Sciences Center, United States of America
Received December 23, 2010; Accepted June 14, 2011; Published July 15, 2011
Copyright: ß 2011 Riera et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits
unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited.
Funding: MR was financed by I3P-CSIC2006, ICV-B by predoctoral fellowship FPI2007 from MICINN (Spain) and LC-P by Juan de la Cierva Programme, MICINN
(Spain). This work was also supported by grant BIO2009-13044-CO2-01 from MICINN (Spain) and CONSOLIDER-INGENIO 2010 MEC (CSD2007-00057). The funders
had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Competing Interests: The authors have declared that no competing interests exist.
* E-mail: [email protected]
. These authors contributed equally to this work.
¤ Current address: Integrative Systems Biology Group, Institute for Plant Molecular and Cell Biology - IBMCP (CSIC-UPV), Valencia, Spain

Introduction disassembly and re-assembly [6]. In addition, localization studies

of individual CK2 subunits indicate that both types of subunits
Protein kinase CK2 is a constitutively active, highly conserved have been found in different compartments [7,8]. These findings
serine/threonine protein kinase that is ubiquitously distributed in indicate that individual CK2 subunits may have an independent
eukaryotes. CK2 is one of the most pleiotropic kinases known, able role. All these evidences support the idea of the independent role
to phosphorylate and interact with multiple cellular proteins [1,2]. of the individual CK2 subunits versus the classical holoenzyme.
In mammals the typical CK2 holoenzyme is a heterotetrameric In plants CK2 is involved in relevant processes such as plant
complex composed of two catalytic (CK2a and CK2a9) and two growth and light-regulated gene expression [9], circadian rhythm
regulatory (CK2b) subunits. The CK2b regulatory subunits are [10,11], cell-cycle regulation and development [12,13], salicylic
inactive and present no homology to regulatory subunits or acid mediated defense [14] and abiotic stress responses [15].
domains of other protein kinases. In the classical model of CK2 CK2a/b subunits family is expanded in plant genomes relative to
tetrameric holoenzyme, CK2b regulatory subunits are involved in animal genomes, since they belong to multigenic families
the assembly of CK2 tetrameric complexes, in enhancing catalytic composed by up to 4 genes. As reported in animals, differential
activity and stability of CK2a and in modulation of the substrate subcellular localization of plant CK2 subunits suggests specific
specificity of CK2 [3]. However, CK2b subunits also have functions for each CK2 subunit or CK2 isoform [15,16]. This
additional functions in addition to regulation of the holoenzyme, hypothesis is also supported by new findings showing that specific
since they can interact with and regulate other proteins in the CK2 holoenzyme isoforms can regulate the initiation of translation
absence of CK2a subunits [4,5]. Structural analysis by X-ray in Arabidopsis [17]. In maize, three genes for each CK2a/b have
crystallographic assays shows that CK2 tetramers are subject to been described to date [18–20]. A fourth CK2b gene (CK2b4) has

PLoS ONE | www.plosone.org 1 July 2011 | Volume 6 | Issue 7 | e21909

Role of N-terminal of CK2b1 in CK2 Regulation

been found in the Maize Genomic Database (MaizeGD) and is (averaging ca. 10%), Thr and Tyr. Using the N-terminal domain
included in this paper. Since it was crystallized [21], maize CK2a1 of maize CK2b1 as a query, BLAST searches were performed in
subunit has been widely studied as a model of CK2 structure and it different protein databases, including the whole proteome of
has been used successfully to design inhibitors of the holoenzyme selected plant species (Table S1). As a result, 34 sequences
[22]. This is due to the biochemical characteristics of maize corresponding to CK2b from 13 species representative of the main
CK2a, which is highly stable and has more specific activity than land plant evolutionary lineages were identified (Table S2).
the human holoenzyme. Comparative studies demonstrate that the Additional searches of the protein databases were performed
maize holoenzyme is less stable than the human counterpart [23]. through HMMer using as a query a hidden Markov models
However, despite copious data on CK2a, little is known about (HMM) profile constructed on the basis of the alignment of 33 N-
CK2b regulatory subunits and CK2 holoenzyme in maize. Plants terminal domains. Despite HMM profiles perform better in
have a greater diversity of CK2b subunits than animals or yeasts detecting remote homologies [25], only land-plant species CK2b
[24]. Although plant CK2bs preserve in their central core the sequences were detected. The architecture of conserved motifs
characteristic CK2b features, they lacked 20 aminoacids from the throughout the N-terminal domains was examined and represent-
C-terminal domain and contain a specific N-terminal extension of ed over the corresponding alignment (Figure 1). Despite the high
about 90 aminoacids. This N-terminal region shares no homology degree of divergence within the N-terminal domain, 15 short
with any previously characterized functional domain. The absence conserved motifs were found, some of them matching the
of functional data about this domain prompted us to investigate its consensus phosphorylation sites for specific protein kinases (Table
putative role in: (i) CK2b functions and (ii) CK2 holoenzyme S4), including putative CK2 autophosphorylation sites (motifs 1
regulation. Using maize CK2b1 and a deleted version lacking N- and 5). Some motifs were highly conserved across almost every
terminal domain (DNCK2b1) we demonstrate that this plant- sequence examined (e.g. motif 1, particularly rich in acidic amino
specific N-terminal extension affects both CK2b and CK2 acids and including at least six Ser and/or Thr residues consensus
holoenzyme properties. In addition, we postulate a new role for of CK2 phosphorylation) while many others were apparently
CK2b subunits in plants, since CK2b1 releases CK2a1 subunits specific to certain evolutionary lineages (e.g. motif 5).
from the nucleolus and the CK2 holoenzyme can be found all over Genomic structure provides an independent criterion to assess
the cell. These findings show that in vivo localization of the plant the evolutionary relatedness among genes and functional domains.
CK2 holoenzyme is different from that of the independent CK2a/ Exon/intron organization of plant CK2b for which the genomic
b subunits alone. Even though the N-terminal domain of CK2b is sequences were available was determined. In all land-plant CK2b
not involved in this export mechanism, the data reported here genes, location of the first intron was conserved at the same
indicates a role of this domain in regulation of both CK2b subunits relative position of the N-terminal domain, just before motif 1.
and CK2 holoenzyme in plants. The first intron always showed phase 0 at the junction with exon 1
and phase 1 at the junction with exon 2 (Figure 1), supporting the
Results acquisition of the N-terminal domain by land plants as encoded by
a single exon.
Sequence and evolutionary analysis of the N-terminal To gain further insights into the evolutionary history of the land
domain of plant CK2b subunits plant CK2b N-terminal domain, we performed a phylogenetic
All plant CK2b subunits display an extra domain located N- analysis of CK2b proteins from different eukaryotic kingdoms. For
terminal to the highly conserved CK2b central region. These N- this purpose, we constructed a sequence dataset of 69 CK2b
terminal CK2b domains are poorly conserved both in length and protein sequences, including sequences from animals and from
in primary sequence. At the amino acid composition level, they are several non-land plant species (algae, fungi, and protists) also
significantly enriched in phosphorylable residues such as Ser displaying N-terminal extensions (Tables S2 and S3). Phylogenetic

Figure 1. Multiple Sequence Alignment of N-terminal domains of land plant CK2b regulatory subunits. Conserved not-overlapping
motifs identified in the MEME analysis are background-coloured. Positions in bold correspond to Serine and Threonine (S, T) residues predicted as
CK2 phosphorylation sites. Location of the first intron is underlined.
doi:10.1371/journal.pone.0021909.g001

PLoS ONE | www.plosone.org 2 July 2011 | Volume 6 | Issue 7 | e21909

Role of N-terminal of CK2b1 in CK2 Regulation

analyses were conducted using two independent methods: confirm this hypothesis, we added increasing amounts of CK2b1
Neighbor Joining (NJ) and Maximum Likelihood (ML) [26–29]. N-terminal domain (1–80) to the in vitro phosphorylation assays
A clade clustering all land-plant CK2b subunits could be with the holoenzyme composed by CK2a1/DNCK2b1. The
unambiguously retrieved in both NJ and ML trees (Figure S1 addition of exogenous CK2b1 N-terminal domain to the CK2a1/
and S2) and is clearly separated from other clades grouping CK2b DNCK2b1 holoenzyme decreases its phosphorylation efficiency
from other organisms and also containing N-terminal extensions. towards the substrates tested, ZIM-like (Figure 2D), b-casein and
Rab17 (Figure S3). In conclusion, these results suggest that the N-
The N-terminal domain of maize CK2b1 affects the CK2 terminal domain of CK2b subunits competes with the substrate for
holoenzyme activity phosphorylation and down-regulate CK2a activity.
To ascertain whether the plant specific N-terminal domain of
maize CK2b1 affects CK2 holoenzyme regulation, we first The N-terminal domain of CK2b1 enhances stability of
analyzed if the domain is needed for CK2 holoenzyme assembly, CK2b1 against proteasome degradation
CK2b/CK2b dimerization or interaction with CK2 substrates. To determine whether the N-terminal domain of CK2b
We prepared constructs harbouring different deletions of the subunits is involved in regulation of their subcellular localization,
CK2b1 protein (Figure 2A) to perform two-hybrid assays. No the deleted version of CK2b1 (del1 DNCK2b1 (80–276)) was fused
significant interaction was detected between empty AD/BD-clone to GFP and examined by confocal microscopy in different plant
combinations (data not shown). Deletion del1 DNCK2b1 (80–276) systems: immature maize embryos (10 DAP) transformed by
strongly interacts with other CK2a catalytic subunits (CK2a2) as particle bombardment, agroinfiltrated tobacco leaves and onion
well as with full-length CK2b1. However, deletions del2 (180– epidermal cells (Figure 3 and Figure S4).
276), corresponding to CK2b without N-terminal domain and In all plant systems examined the results obtained show that
acidic region and del3 (1–80), which corresponds to the N- both CK2b1 and DNCK2b1 are mainly located in the nucleus,
terminal domain alone, do not interact neither with CK2a2 nor but whereas in the transformation with CK2b1 most of cells
with CK2b1 subunits (Figure 2A). Therefore, these results presented nuclear speckles, in cells transformed with DNCK2b1
demonstrate that CK2b N-terminal domain is not essential for we found two different patterns: cells presenting a diffuse nuclear
intra-holoenzyme interactions. pattern as well as cells showing nuclear speckles. Any nuclear
We have previously demonstrated that recombinant maize speckle structures were observed in cells transformed with GFP
CK2a and CK2b subunits can assemble in a functional tetrameric alone. Since the total number of transformed cells after maize
complex, and autophosphorylation of CK2b subunits demon- bombardment is much lower than in tobacco cells, we counted the
strates the functionality of the holoenzyme [20]. As previously percentage of DNCK2b1 cells presenting speckles vs. a diffuse
observed in animals, dimerization of CK2b subunits seems to be a pattern in agroinfiltrated tobacco leaves (Figure 3B). Only 29% of
pre-requisite for holoenzyme formation [30]. Here we have cells transformed with DNCK2b1 presented speckles vs. 71% with
reconstituted the active holoenzyme using the CK2a1 catalytic diffuse pattern, whereas for cells transformed with full-lenght
subunit and the deleted version of CK2b1 subunit (del1 CK2b1 96% of the cells presented speckles. Therefore, the
DNCK2b1 (80–276)) and we found that in absence of the N- absence of nuclear aggregates in the DNCK2b1 cells could be
terminal domain of CK2b1, the CK2a1/DNCK2b1 holoenzyme linked to the deletion of the N-terminal domain.
is also functional and autophosphorylable (Figure 2B). Compar- To test if the better ability of CK2b1 vs. DNCK2b1 to form
ative CK2 autophosphorylation assays using holoenzymes nuclear aggregates affects the protein stability, we performed cell-
CK2a1/CK2b1 and CK2a1/DNCK2b1 have been done and free degradation assays. Total protein extracts from tobacco leaves
quantification of the autophosphorylation of both holoenzymes transformed with CK2b1 and DNCK2b1 fused to GFP were
shows that CK2a1/CK2b1 was about 25% more phosphorylated maintained for 10, 30, 60 min at 30uC without protein inhibitors,
than CK2a1/DNCK2b1 (Figure 2B, right). It is noteworthy that and aliquots were analyzed by Western blot using anti-GFP
when GST-CK2b1 is overexpressed in E coli, a lower band (L) of antibody (Figure 4A, left). Results obtained suggest that the
about 30 kDa appears in addition to a higher band (H) amount of both CK2b1 and DNCK2b1 decreased over time.
corresponding to the fusion protein (56 kDa). Both bands are Subsequently, we added proteasome inhibitor MG132 to test
highly phosphorylated by CK2a in vitro. Purification and whether the degradation observed was due to the proteasome
subsequent protein sequencing of this lower band demonstrate pathway. In samples treated with MG132 the fusion protein
that it corresponds to intermediate products containing the N- remained stable, indicating that MG132 protects CK2b1 and
terminal region of CK2b1. Moreover, the region corresponding to DNCK2b1 against proteasome degradation. The relative amount
the CK2b1 N-terminal alone (1–80) fused to GST (fusion protein of remaining proteins was estimated from these data and plotted,
of 31 kDa) and overexpressed in E coli was also highly and the rates of protein degradation for DNCK2b1 was
phosphorylated by CK2a1 in vitro (Figure 2B). Taken together, considerably higher than the rates for CK2b1 (Figure 4A, right).
all these results suggest that autophosphorylation of CK2b1 occurs These results suggest that the protein lacking the N-terminal
in high proportion at the residues located in the N-terminal domain is more susceptible to degradation by proteasome than the
domain. full-length CK2b1. To examine the effect of the N-terminal
To test whether CK2 activity was affected by the N-terminal domain on CK2b1 degradation by the proteasome pathway, we
domain of CK2b subunits, we compared the ability of both CK2 treated transformed tobacco leaves with cycloheximide (CHX) to
holoenzymes (CK2a1/CK2b1 and CK2a1/DNCK2b1) to phos- inhibit de novo protein synthesis and we observed samples by
phorylate in vitro substrates as b-casein, in vivo substrates as Rab17 confocal microscopy for up to 24 h (Figure 4B). After 4 h of
or interacting partners as maize transcription factor ZIM-like. treatment with CHX, the immunofluorescent signal was visible in
Interestingly, the holoenzyme composed by CK2a1/DNCK2b1 is both CK2b1 and DNCK2b1 samples. In parallel, we have taken
able to phosphorylate b-casein, Rab17 and ZIM-like in greater samples of treated cells at different times and analyzed them by
amount than CK2a1 alone or CK2a1/CK2b1 (Figure 2C). These Western blot. In agreement with the results obtained by confocal
results points towards a possible role of the N-terminal domain of analysis, the in vivo stability at short times is similar for both
CK2b subunits as a negative regulator of CK2 activity. To proteins (Figure S5). However, after 24 h, we detected the

PLoS ONE | www.plosone.org 3 July 2011 | Volume 6 | Issue 7 | e21909

Role of N-terminal of CK2b1 in CK2 Regulation

PLoS ONE | www.plosone.org 4 July 2011 | Volume 6 | Issue 7 | e21909

Role of N-terminal of CK2b1 in CK2 Regulation

Figure 2. Intra-holoenzyme interactions using yeast two-hybrid system and in vitro CK2 phosphorylation assays using CK2
holoenzymes reconstituted with CK2a1 and regulatory subunits CK2b1 and DNCK2b1. (A) Left, Schematic representation of truncated
versions of maize CK2b1 regulatory subunit used in the assay. Deletion 1, del1 DNCK2b1 (80–276): CK2b1 without N-terminal region, deletion 2 (del2)
(180–276): CK2b1 without N-terminal region and acidic region and deletion 3 (del3) (1–80): N-terminal region alone. Right, Interactions between
truncated versions of CK2b1 subunit and CK2a2/CK2b1 subunits with the two-hybrid system. The indicated transformants were selected in Leu-Trp
plates and replated in selective plates lacking Leu-Trp-His-Ade. (B) Left panel, Gel stained with Coomassie Brillant Blue (CBB) containing the fusion
proteins GST-CK2b1, GST-DNCK2b1 and GST-N-terminal domain (1–80) used in the autophosphorylation and CK2 phosphorylation assays. Middle
panel, Autophosphorylation of reconstituted holoenzymes CK2a1/CK2b1, CK2a1/DNCK2b1 and in vitro phosphorylation of N-terminal domain (1–80)
protein by CK2a1. In the first lane H, high molecular weight protein corresponding to fusion protein GST-CK2b1 (56 kDa) and L, low molecular weight
protein, corresponding to intermediate products of about 30 kDa from fusion protein GST-CK2b1. Right panel, Coomassie Brillant Blue (CBB) and CK2
phosphorylation of GST protein alone (control). Right, Quantification of phosphorylated bands corresponding to CK2a1/CK2b1 and CK2a1/DNCK2b1
holoenzymes. 100% intensity corresponds to autophosphorylation of CK2b1. The data shown are calculated average values 6 SD of three
independent experiments. (C) Quantification of in vitro phosphorylation of b-casein, Rab17 protein and ZIM-like transcription factor by CK2a1/CK2b1
and CK2a1/DNCK2b1 reconstituted holoenzymes. 100% intensity corresponds to the phosphorylation of each protein by CK2a1 alone. The data
shown are calculated average values 6 SD of three independent experiments. (D), Left, In vitro phosphorylation of ZIM-like protein with CK2a1/
DNCK2b1 (lane 1). In lanes 2 to 4 increasing amounts of CK2b1 N-terminal domain (1–80) has been added: 0.2 mg (lane 2), 0.4 mg (lane 3) and 0.8 mg
(lane 4). Right, Relative phosphorylation of ZIM-like with the holoenzyme composed by CK2a1/DNCK2b1 with increasing amounts of CK2a1
N-terminal domain (1–80) (lanes 2–4) compared to phosphorylation of ZIM-like with CK2a1/DNCK2b1 holoenzyme (lane 1, assigned a value of 1). The
data plotted (mean 6SD) represent three independent experiments.
doi:10.1371/journal.pone.0021909.g002

immunofluorescent signal only in cells transformed with CK2b1, CK2a1 subunit was mainly detected in nuclear soluble fraction (N)
indicating the requirement of ongoing protein synthesis to whereas in plants co-transfected with CK2a1-GFP/CK2b1-Myc,
maintain steady-state levels of DNCK2b1 protein. When samples CK2a1 is increased in the insoluble fraction (I), which includes all
were treated with MG132 and CHX+MG132, we are able to insoluble particles from nucleus and cytoplasm. These results
detect cells transformed with DNCK2b1 after 24 h of treatment, suggest that CK2b1-Myc is able to shift CK2a1-GFP from nuclear
indicating that proteasome inhibition protects DNCK2b1 from fraction to insoluble aggregates in both nucleus and cytoplasm.
degradation.
Discussion
Localization of CK2a1/CK2b1 holoenzyme is different
Land plant CK2b subunits show distinctive features from their
from its CK2 individual subunits
eukaryotic counterparts, including the formation of expanded
Different localization of plant CK2 subunits have been
families, shorter C-terminal domains and longer N-terminal
previously demonstrated [16]. In maize all CK2a subunits
domains. Preliminary in-silico analysis of the plant specific N-
described to date (CK2a1 to CK2a3) present nuclear localization
terminal domain indicates that it presents no homology with other
with high accumulation in nucleolus; whereas CK2b1 and CK2b2
protein or domains either in sequence or in structure. In addition,
are mainly located in nuclear speckles and CK2b3 can be found in
both nucleus and cytoplasm [15]. However, nothing is known prediction programs were unable to determine a secondary
about plant CK2 holoenzyme localization. To investigate that, we structure for this domain. In an attempt to understand the role
conducted Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) and functionality of this domain in plants, we performed a
assays in agroinfiltrated tobacco leaves [31,32]. In that system, complete sequence analysis. The domain is arranged through
CK2a1 and CK2b1 split YFP tagged proteins must interact in vivo short, conserved motifs, many of them putatively corresponding to
to reconstitute YFP fluorescence. In CK2 heterotetramer the two specific kinase phosphorylation sites, including CK2 autophos-
CK2b subunits associate as a stable dimer in the core of the phorylation sites. The domain may have evolved through the gain
holoenzyme whereas the two CK2a are located in the external and loss of short conserved motifs, resulting in a mosaic pattern.
part without interacting among themselves [29]. Using BiFC we The occurrence of N-terminal extensions is not exclusive of land
show that CK2b1 subunits dimerize and present the same nuclear plants, having been also found in fungi, intracellular protozoan
speckled localization described for CK2b1 fused to GFP parasites and algae. However, we did not found any protein or
(Figure 5A). Interestingly, the CK2 holoenzyme CK2a1/CK2b1 domain outside land plant CK2bs showing significant identity at
is located not only in nucleus but also in cytoplasmic aggregates the sequence level with the N-terminal domain. Moreover,
(Figure 5B). Next, we performed BiFC reconstituting the phylogenetic analysis shows a separated clade clustering all land
holoenzyme with CK2a1 and DNCK2b1. As expected, plant CK2b subunits. As expected, green and red algae CK2b
DNCK2b1 interacted with split CK2a1, being also found in sequences clustered at the base of the land plant clade. However,
nucleus and cytoplasm, as in the case of CK2a1/CK2b1 branching of the single representative from the red algae
holoenzyme (Figure 5B). To confirm the presence of the CK2 Cyanidioschyzon merolae, which diverged from other photosynthetic
holoenzyme in the cytoplasm, we perform an alternative approach eukaryotes 1.5 billion years ago, was less bootstrap supported [33].
by co-transfecting tobacco leaves with CK2a1-GFP and CK2b1 Also protists and fungi are separated from land plants in both
fused to a non-fluorescence tag (Myc). This method allows to verify phylogenetic trees, in accordance to previously reported data that
that the fluorescence signal detected in the cytoplasm is due to the demonstrate the early diverging evolution of CK2b from plants
presence of CK2a1-GFP in this compartment. Since CK2a1- [34]. Furthermore, the exon/intron structure of genomic sequenc-
GFP/CK2b1-Myc holoenzyme is also located in nucleus and es encoding for the CK2b N-terminal domain was absolutely
cytoplasm, we confirmed that CK2b1-Myc is able to modify conserved in all land plant CK2b genes analyzed. All together,
CK2a1-GFP localization from nucleus/nucleolus to nucleus and these results support the independent acquisition of the N-terminal
cytoplasm aggregates. In addition, we have used plants co- domain by land plants as a single exon. Further evolutionary
transfected with CK2a1-GFP/CK2b1-Myc to perform subcellular diversification of land plant CK2b would have involved differen-
fractionation and Western blot analysis using anti-GFP antibody tial gene family expansion, which may have promoted the
(Figure 5C). In control plants overexpressing CK2a1-GFP alone, acquisition of additional functional specificities by multiplying

PLoS ONE | www.plosone.org 5 July 2011 | Volume 6 | Issue 7 | e21909

Role of N-terminal of CK2b1 in CK2 Regulation

Figure 3. Subcellular localization of CK2b1-GFP and DNCK2b1-GFP in maize immature embryos (10 DAP) and Agrobacterium-
infiltrated tobacco leaves. (A) Epifluorescence and bright-field images (merged with epiflourescence) (606) of 10 DAP embryos cells transformed
by particle bombardment with the indicated constructs (CK2b1–GFP, DNCK2b1-GFP and GFP alone). (B) Upper, General views (406) of Nicotiana
benthamiana leaves infiltrated with a mixture of Agrobacterium suspensions harbouring the indicated constructs (CK2b1–GFP, DNCK2b1-GFP and
GFP alone) and the gene silencing suppressor HcPro. Bottom, Quantification of cells presenting speckled pattern in cells transformed with CK2b1 and
DNCK2b1. The graphic representation correspond to average for data corresponding to 3 independent experiments 6SD (n = 100).
doi:10.1371/journal.pone.0021909.g003

PLoS ONE | www.plosone.org 6 July 2011 | Volume 6 | Issue 7 | e21909

Role of N-terminal of CK2b1 in CK2 Regulation

Figure 4. Protein degradation of CK2b1 and DNCK2b1. (A) Immunodetection of CK2b1-GFP protein and DNCK2b1-GFP protein in transformed
N. benthamiana leaves using anti-GFP antibody. Protein extracts were incubated at 30uC in an in vitro degradation buffer (see Experimental
procedures) with or without proteasome inhibitor (MG132) for the indicated time (min). 30 mg of total protein was loaded onto gels. 60+I indicates
extracts treated with 100 mM MG132. Each signal strength was measured by Quantity One and plotted in the right panel as the relative amount of
remaining protein. Quantitative data (mean 6SD) represent three independent experiments. (B) General views (406) of Nicotiana benthamiana
leaves infiltrated with CK2b1-GFP and DNCK2b1-GFP with different treatments: control, cycloheximide treatment (CHX, 50 mM), and CHX (50 mM)+
proteasome inhibitor MG132 (100 mM) combination treatment after 4 and 24 hours. The images shown are representative of more than 5
independent experiments.
doi:10.1371/journal.pone.0021909.g004

PLoS ONE | www.plosone.org 7 July 2011 | Volume 6 | Issue 7 | e21909

Role of N-terminal of CK2b1 in CK2 Regulation

Figure 5. Subcellular localization of CK2 individual subunits and CK2 holoenzyme in leaf epidemis of N. benthamiana plants.
(A) General views (406) of Nicotiana benthamiana leaves co-infiltrated with a mixture of Agrobacterium suspensions harbouring the indicated
constructs: CK2a1-GFP (left), YFPN-CK2b1/YFPC-CK2b1 (right) together with gene silencing suppressor HcPro. (B) General views (406) of Nicotiana
benthamiana leaves co-infiltrated with Agrobacterium containing the gene silencing suppressor HcPro and the following pair constructs: YFPN-
CK2a1/YFPC-CK2b1 (left), YFPN-CK2a1/YFPC-DNCK2b1 (middle), and CK2a1-GFP/CK2b1-Myc (right). In panel A and B upper correspond to
epifluorescence images and bottom to bright-field images (merged with epiflourescence). (C) Immunodetection of CK2a1-GFP and CK2b1-GFP
proteins using anti-GFP antibody in N. benthamiana leaves transformed with CK2a1-GFP, CK2a1-GFP/CK2b1-Myc and CK2b1-GFP. C corresponds to
cytosolic fraction, N to nuclear fraction and I to insoluble fraction (including nuclear and cytosolic aggregates).
doi:10.1371/journal.pone.0021909.g005

PLoS ONE | www.plosone.org 8 July 2011 | Volume 6 | Issue 7 | e21909

Role of N-terminal of CK2b1 in CK2 Regulation

the number of putative regulatory networks in which they could be domain in enhancing CK2b1 aggregation in nuclear speckles,
involved. where the protein is assumed to be tightly complexed and less
Despite of the elucidation of maize CK2a catalytic structure, no accessible to degradation machinery. Nevertheless, although the N-
structure for the plant CK2b regulatory subunit has been reported terminal domain can be considered as an ‘‘enhancer’’ of CK2b1
to date. Here, by using a two-hybrid approach we show that the protein aggregation, it is not essential since DNCK2b1 can also
CK2b N-terminal domain did not affect intra-molecular (CK2a/b aggregate. Thus, we can consider that aggregation in nuclear
or CK2b/b) holoenzyme interactions. These results indicate that speckles protects CK2b1 against fast degradation by proteasome
the N-terminal domain is located in the external part of the even though the protein is eventually degraded.
holoenzyme, although structural studies such as the crystallization In human cells, CK2b is normally expressed at a higher level
of the CK2b regulatory subunit would be needed to localize it with than CK2a catalytic subunits, allowing part of CK2b to be
greater precision. incorporated and stabilized into CK2 tetramers, whereas the
Most animal CK2b subunits are autophosphorylated only at excess CK2b is rapidly degraded with a half-life of less than 1 h
two highly conserved residues, Ser2 and Ser3 [35]. This consensus [41]. Our results indicate that maize CK2b1 regulatory subunits
is only partially conserved in plants: in all plant species Ser2 is are more stable than their animal counterparts probably due to
conserved as Ser residue (Ser83 in maize CK2b1), but Ser3 is their aggregation in nuclear speckles. Since the nature of these
replaced in all plant sequences analyzed by acidic residues (Asp or aggregates remains unclear, further experiments should be done to
Glu). In contrast to animals, land plant CK2b subunits present elucidate their composition and functional role.
additional putative autophosphorylation sites (motifs 1 and 5). For We have previously demonstrated that different localization of
instance, maize CK2b1 has five additional Ser residues at the the individual maize CK2a and CK2b isoforms [15] but nothing
motif 1 of the N-terminal domain that might be targets for CK2 was known about holoenzyme localization in plants. Here by using
autophosphorylation. Motif 1 is rich in Asp and Glu residues and BiFC we show the in vivo localization of CK2 holoenzyme in plant
is one of the most conserved in all plant N-terminal sequences cells. Whereas individual subunits CK2a1 and CK2b1 present a
(Figure 1). In addition, CK2b1 subunits present additional Ser nuclear localization, the holoenzyme CK2a1/CK2b1 is assembled
residues located in the central core of the protein not present in in nucleus and is exported to the cytoplasm, where is complexed in
animal CK2b proteins. Our in vitro phosphorylation assays show aggregates. After analyzing the localization of the holoenzyme
that the holoenzyme reconstituted with CK2a1 and CK2b1 is reconstituted with DNCK2b1, we conclude that the N-terminal
higher autophosphorylated than the holoenzyme with CK2a1 and domain is not involved in this export to the cytoplasm. In
DNCK2b1 (Figure 2B). Moreover, the N-terminal domain alone is mammals it has recently been reported that CK2b regulatory
highly phosphorylated by CK2a1 in vitro. Taken together, these subunits are required for the export of the holoenzyme as an
results suggests that the putative CK2 consensus sites located in the ectokinase bound to the external surface of the cell membrane
N-terminal domain are functional and might be involved in [42]. The same authors postulate a role of CK2b exporting not
regulating CK2 activity. In vitro phosphorylation assays showed only CK2a but other CK2 interacting proteins. Our results
that when the holoenzyme is reconstituted with CK2a1 and implicate CK2b in the shift from nucleus/nucleolus to cytoplasm
DNCK2b1 the phosphorylation of several substrates is enhanced. of CK2a subunits in plants. Further experiments may elucidate
These results point towards a possible role of the N-terminal whether this export mechanism also involves other proteins.
domain of CK2b down-regulating CK2a subunit activity. The In conclusion, our research shed new light on the regulation of
competition assays using the N-terminal fragment support this protein kinase CK2 in plants. The whole amount of data shown in
hypothesis. The N-terminal extension of the protist Plasmodium this work suggests that the plant-specific N-terminal domain of
falciparum has also been postulated to act as a down-regulator of CK2b subunits was acquired in plants, as a single exon, for
CK2a subunits [36], even though our analysis supports the regulatory purposes, particularly in terms of regulation of
independent origin of the N-terminal domain of land plant CK2b. holoenzyme activity and stabilization.
The greater efficiency of the maize holoenzyme without the N-
terminal domain is also consistent with the results of our previous Materials and Methods
studies comparing human vs. maize holoenzyme, which demon-
strated a high stability and high specific activity of human CK2 Plant CK2b regulatory subunits sequence analysis
holoenzyme (without N-terminal domain) compared to its maize Search for CK2b protein sequences was performed through
counterpart [23]. It has been recently reported that a splicing BLAST and HMMER [43,44]. Protein sequences were aligned
variant of maize CK2a1 (named CK2a-4) could act as a specific using CLUSTALW and MUSCLE and the resulting alignments
negative regulator of CK2 activity [37]. Taken together, all these further edited through the MEGA 4.0 Alignment Explorer tool
results suggest that maize CK2 activity could be regulated by [45–47]. The MEME v. 3.5.7 tool was used to search for repeated
different mechanisms involving both CK2a/b subunits. sequence patterns (motifs) conserved across proteins [48]. Settings
Functional studies were performed in order to assess whether the were changed to search for short motifs (3–20 aminoacids)
presence of the N-terminal domain has a role in regulation of CK2b showing any number of repetitions per sequence and position
subcellular localization. Our results show that maize CK2b1 is (p-values,1e-4). Search for functional domain and motifs was
highly prone to aggregation in nuclear speckles and the deletion of performed through the PROSITE and INTERPRO databases
N-terminal domain decreases this accumulation of CK2b1 in stable [49]. NetPhosK v1.0 server was used to predict kinase specific
nuclear aggregates. It has been reported for other proteins such as phosphorylation sites [50]. The location, distribution and phases of
mammalian PGC-1a and transcription factor ATF4 that aggrega- introns at the genomic sequences encoding for the N-terminal
tion in nuclear bodies protects against proteasome degradation CK2b domain were determined using GENEWISE [50,51].
[38,39]. Here we show that maize CK2b1 is also degraded by the Phylogenetic analyses performed are detailed in Text S1.
ubiquitin-dependent proteasome pathway as described for Arabi-
dopsis CK2b4 [40]. Interestingly, cell-free degradation assays show Yeast two-hybrid assays
that deletion of the N-terminal domain increases the rate of CK2b1 The Matchmaker two-hybrid system (Clontech) was used to
protein degradation. Our findings indicate a role for the N-terminal perform yeast two-hybrid assays. For the two-hybrid assays,

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Role of N-terminal of CK2b1 in CK2 Regulation

truncated versions of CK2b1 (del1 DNCK2b1 (80–276) del2 (180– lon-P membranes (Millipore) and incubated with purchased
276), and del3 N-terminal domain (1–80)) were generated by PCR antibodies against GFP (Invitrogen). The immunocomplexes were
and cloned into pGBT9 or pGBTK7 vectors into EcoRI/SalI revealed using the ECL detection kit system (Super Signal West
sites. The specific primers used were detailed in Table S5. The Femto, Pierce). Subcellular fractionation was done according to
other two-hybrid constructs used in the assays (pGBT9-CK2b1, [38]. Briefly, transformed tobacco leaves were excised, ground in
pGAD424-CK2b1 and pGAD424-CK2a2) were previously de- liquid nitrogen and resuspended in hypotonic buffer (10 mM
scribed in [20]. Yeast (AH109 strain) transformation was HEPES, pH 7.9, 10 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA,
performed according to the manufacturer’s instructions. Yeast 1 mM dithiothreitol, and a protease inhibitor cocktail (1.6 mM
cells were cotransformed with the different pairs of BD-AD aprotinin, 50 mM leupeptin, 1 mM pepstatin, 10 mM E-64 and
constructs and transformants were selected on minimal synthetic 1 mM PMSF)). The extracts were homogenized and centrifuged at
dropout medium (SD) -Leu-Trp (SD-LT). To test for protein- 10,000 rpm for 1 min. The supernatant was collected as the
protein positive interaction, independent colonies were transferred cytosolic fraction (C). The pellet was extracted in a high salt buffer
to SD- -Leu-Trp-His-Ade (SD-LTHA). (20 mM HEPES, pH 7.9, 400 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM
EGTA, 1 mM dithiothreitol, and a protease inhibitor cocktail), and
Recombinant protein expression and purification and in the soluble fraction was collected as nuclear extracts following
another centrifugation (N). The remaining insoluble pellet was
vitro autophosphorylation and CK2 activity assays
resuspended in SDS lysis buffer (I).
For expression and purification of recombinant CK2b proteins,
the cDNAs of full-length CK2b1, del1 DNCK2b1 (80–276) and
del3 N-terminal domain (1–80) were digested from pGBT9/ Transient expression of GFP fusions in maize, Nicotiana
pGBTK7 vectors using EcoRI/SalI sites and cloned in expression benthamiana leaves and onion cells
vector pGEX-4T-1 in frame to GST protein. The constructs were For transient expression of GFP fusions in maize, tobacco and
transformed into E.coli BL21(DE), and the proteins were expressed onion cells CK2b1 and del1 DNCK2b1 cDNAs were amplified by
and purified as GST (Glutathione-S-Transferase) fusions as PCR using specific primers (Table S5) and cloned into binary vector
previously described [20] and according manufacturer’s manual. pCAMBIA1302 under the control of a CamV 35S promoter and
Protein concentration of purified proteins (GST-CK2b1, GST- fused in the 39 region with the GFP using BglII-SpeI sites for CK2b1
DNCK2b1 and GST-N-terminal domain) was determined by and BglII site for DNCK2b1. Additionally, the cDNA CK2b1 was
Bioanalyzer methods (Agilent technology) according to the amplified by PCR using specific primers (Table S5) and cloned in
manufacturer’s instructions. pLOLA vector [52] into BglII site in frame with Myc tag. The
For the in vitro autophosphorylation assay, the holoenzymes fusion CK2b1-Myc was transferred to pCAMBIA2300 using KpnI
CK2a1/CK2b1 and CK2a1/DNCK2b1 were reconstituted using restriction site. For maize transformation immature maize embryos
about 1 mm long were aseptically dissected from ears of field-grown
100 ng CK2a1 (Kinase Detect, Denmark) and 400 ng of GST-
maize plants (AxBxB73) after 10 days of pollination (10 DAP).
CK2b1 or GST-DNCK2b1 in a total volume of 30 ml CK2 buffer
Isolated embryos were placed o/n at 24uC in plates containing MS
(8.9 mM MgCl2, 0.5 mM EGTA, 27 mM b-glycerol phosphate,
medium supplemented with 2.2 mg/L of 2,4D. 4 h before
0.5 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.08 mM ATP, 3 mCi of
transformation embryos were moved to MS plates with 16 g/L of
[c-33P]ATP (3000 Ci/mmol). In the case of the CK2 activity
mannitol and were transiently transfected with GFP constructs by
assays, the holoenzymes CK2a1/CK2b1 and CK2a1/DNCK2b1
particle bombardment using the Biolistic PDS-1000/He Particle
were reconstituted as described for the autophosphorylation assays
Delivery System (Bio-Rad). Plasmid DNA containing the different
and 0.6 mg of the different substrates tested (b-casein, GST-N-
constructs was precipitated onto gold particles using CaCl2 and
terminal domain, Rab17 or ZIM-like)were added to the reaction.
spermidine, and 1.5 mg DNA was delivered into intact maize tissue.
In the competition assays, increasing amounts of N-terminal
After 24 h, the fluorescence of the bombarded cells were viewed
domain (1–80) (from 0.2 to 0.8 mg) were added to the reaction
using a FV 1000 confocal microscope (Olympus, http://www.
containing CK2a1/DNCK2b1 holoenzyme and 0.6 mg of b- olympus.com/).The same methodology was used to visualize the
casein, Rab17 or ZIM-like as substrates. In all cases, the samples GFP fusion protein in epidermal onion cells. Young, fully expanded
were incubated for 30 min at 30uC. Reactions were stopped by leaves from 5 week old tobacco plants were transiently transfected
addition of electrophoresis sample buffer, and the phosphorylated with Agrobacterium tumefaciens GV3101/pMP90 transformed with the
proteins were separated by 12% SDS–PAGE, visualized by GFP construct together with the silencing suppressor HcPro as has
PhosphoImager analysis and the intensity of the phosphorylated been described in [30,31]. After 3–4 days, infiltrated areas from
bands obtained was quantified by Quantity One (Bio-Rad) leaves were excised and examined by FV 1000 confocal microscopy
software according the manufacturer’s suggestions. (Olympus). For treatment with cycloheximide (CHX) and protease
inhibitor MG132 leaves were excised and placed in sealed Petri
Cell-free degradation assays, western blot analysis and dishes submerged into the solutions containing CHX 50 mM and
subcellular fractionation MG132 100 mM in 2 ml of phosphate buffer. Treated and control
The in vitro cell-free degradation assays was modified from [40]. samples were ground in liquid nitrogen and resuspended in buffer A
0.2 g transformed N. benthamiana leaves with CK2b1-GFP and (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 5 mM
DNCK2b1-GFP were ground in liquid nitrogen and resuspended DTT, 5 mM ATP, and protease inhibitor cocktail) and analyzed by
in buffer A (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 10 mM Western blot analysis as described above.
MgCl2, 5 mM DTT and 5 mM ATP). Equal amounts of extracts
were transferred to individual tubes and incubated at 30uC and Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays
aliquots were taken at 20, 40 and 60 min. One aliquot was For BiFC assays, the cDNAs corresponding to the CK2a1, CK2b1
incubated with 100 mM of protein inhibitor MG132 (Enzo, Life and DNCK2b1 were cloned in the GATEWAY-compatible vector
Sciences, Inc.) for 1 h at 30uC. Reactions were stopped by adding pENTRY3C (Invitrogen). The cDNA CK21 was amplified by PCR
protein gel-loading buffer. For Western blot analysis, proteins were using the specific primers detailed in Table S5 and the PCR fragment
electrophoresed on 12% SDS-PAGE gels, transferred to immobi- was cloned into BamHI-XhoI sites The cDNAs of full-length CK2b1,

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Role of N-terminal of CK2b1 in CK2 Regulation

and del1 DNCK2b1 (80–276) were digested from pGBT9 vector displayed next to the corresponding nodes. The tree is drawn to
using EcoRI/SalI sites and transferred to pENTRY3C. The three scale, with branch lengths proportional to evolutionary distances.
pENTRY3C plasmids were recombined by Gateway reaction into The scale bar indicates the estimated number of amino acid
pYFPN43 and pYFPC43 vectors (kindly provided by A. Ferrando, substitutions per site.
University of Valencia, Spain, http://www.ibmcp.upv.es/Ferrando (PDF)
LabVectors.php.) to produce YFPN-CK2b1, YFPC-CK2b1, YFPN-
Figure S2 Unrooted Neighbor Joining phylogenetic tree of
CK2a1 and YFPC-DNCK2b1. Transformation of N.benthamiana
CK2b regulatory subunits. The tree is based on the CLUSTAL
leaves and visualization was performed as described above for
alignment of 69 CK2b protein sequences. The clade clustering land
transient expression of GFP fusions.
plant CK2b is indicated. Non-land plant CK2b showing N-terminal
extensions are in bold. Bootstrap values are displayed next to the
Supporting Information corresponding nodes. The tree is drawn to scale, with branch lengths
Text S1 Phylogenetic analysis of CK2b regulatory proportional to evolutionary distances. The scale bar indicates the
subunits. Phylogenetic analyses were performed on the basis of estimated number of amino acid substitutions per site.
amino acid sequence alignments using two independent methods: (PDF)
Neighbor Joining (NJ) and Maximum Likelihood (ML). NJ Figure S3 Quantification of Rab17 and b-casein phos-
analyses were implemented in MEGA 4.0 using the default phorylation with CK2a1/DNCK2b1 holoenzyme and in-
settings [47] Prior to ML analysis; the best-fitting amino acid creasing amounts of CK2b1 N-terminal domain (1–80).
substitution model was selected using the Akaike information Relative phosphorylation of Rab17 and b-casein with the
criterion as implemented in ProtTest v1.4 [26]. The resulting holoenzyme composed by CK2a1/DNCK2b1 with increasing
model: JTT with (i) an estimated proportion of invariable sites and amounts of CK2b1 N-terminal domain (1–80) compared to
(ii) a heterogeneous distribution of substitution rates across phosphorylation of both substrates with CK2a1/DNCK2b1
proteins with eight categories and an estimated shape parameter, holoenzyme alone (assigned a value of 1). The data plotted (mean
was implemented in PHYML v3.0 to infer ML trees, using the 6SD) represent three independent experiments.
subtree pruning and regrafting option to optimize tree topology (PDF)
searching [27–29]. To provide confidence on the resulting tree
topology, a bootstrap analysis with 1,000 and 100 replicates in NJ Figure S4 Subcellular localization of CK2b1-GFP and
and ML analyses, respectively, was performed. DNCK2b1-GFP in Agrobacterium-infiltrated tobacco
(DOC) leaves and onion cells. (A) Upper and middle panels show
detail of fluorescent nucleus (606) of cells from tobacco leaves
Table S1 Summary of genome databases searched for infiltrated with a mixture of Agrobacterium suspensions harbouring
CK2b protein kinases. the indicated constructs (CK2b1–GFP, DNCK2b1-GFP) and the
(DOC) gene silencing suppressor HcPro. In upper panel right, a confocal
Table S2 Summary of 34 land plant CK2b sequences. image of nuclear DAPI staining of cells transformed with CK2b1–
Sequence identifier refers to the UNIPROT database, excepting GFP is shown (606). General views (406) of control cells
for species examined independently, in which case the accession infiltrated with GFP alone and HcPro are shown in the bottom
from the corresponding database was indicated (Table S1). The * of the panels. (B) Detail of fluorescent nucleus (606) of onion cells
designs sequence incomplete at its N-terminal end. Some genes transformed with CK2b1–GFP and DNCK2b1-GFP by particle
have been identified to encode for alternatively spliced variants. In bombardment. General views of onion cells (406) transformed
such cases, only a single representative protein sequence is shown. with GFP alone are shown on the right. In all cases epifluorescence
(DOC) and bright-field images (merged with epiflourescence) are shown.
(TIF)
Table S3 Summary of 7 algae, 14 animal, 12 fungal and
2 protists CK2b sequences from representative species. Figure S5 Immunodetection of CK2b1-GFP protein and
Sequence identifier refers to the UNIPROT database, excepting DNCK2b1-GFP protein in transformed N. benthamiana
for species examined independently, in which case the accession leaves using anti-GFP antibody. (A) Control and Cyclohex-
from the corresponding database was used (Table S1). The * imide treatment (CHX, 50 mM). Aliquots have taken at different
indicates sequences incomplete at its N-terminal end. times (309, 1 h, 2 h and 4 h) (B) Control, Cycloheximide treatment
(DOC) (CHX, 50 mM) and proteasome inhibitor MG132 (100 mM).
Aliquots have taken at different times (4 h and 8 h). In all analysis,
Table S4 Summary of conserved motifs identified by
30 mg of total extracts has been loaded. The hybridation against
MEME in plant CK2b subunits. Matches of motifs with
Rubisco protein is shown as loading control.
specific kinase phosphorylation sites, predicted by NetPhos K v1.0
(TIF)
and PROSITE searches are shown. DNAPK: DNA activated
protein kinase, CDC2: Cell division cycle 2, RSK: 90 kDa
ribosomal S6 kinase, TK: Tyrosine kinase, ATM: Ataxia Acknowledgments
Telangiectasia-Mutated. We thank Dr A. Ferrando for kindly providing the BiFC GATEWAY-
(DOC) modified vectors before publication, Dr. J. López-Moya for p35S::HcPro,
M.Capellades for help in maize embryo bombardment and Imma Perez-
Table S5 List of primers used in this study. Salamó for help in two-hybrid experiments.
(PDF)
Figure S1 Unrooted Maximum Likelihood phylogenetic Author Contributions
tree of CK2b regulatory subunits. The tree is based on the Conceived and designed the experiments: MR MP. Performed the
CLUSTAL alignment of 69 CK2b protein sequences. The clade experiments: MR SI ICV-B LC-P. Analyzed the data: MR SI ICV-B
clustering land plant CK2b is indicated. Non-land plant CK2b LC-P. Contributed reagents/materials/analysis tools: MR SI ICV-B LC-P.
showing N-terminal extensions are in bold. Bootstrap values are Wrote the paper: MR VL LC-P MP.

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Role of N-terminal of CK2b1 in CK2 Regulation

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PLoS ONE | www.plosone.org 12 July 2011 | Volume 6 | Issue 7 | e21909

9 Specific Features of Plant CK2
Marta Riera, Isabel Cristina Vélez-BermÚdez,
Tommaso Legnaioli, and Montserrat Pagès

Abstract

Plant CK2 is a pleiotropic enzyme involved in multiple processes related to plant

growth and development. In this chapter, we summarize data available on plant CK2
enzymes, in order to clarify the distinctive features and functions of plant protein
kinase CK2. Thus, specific characteristics of plant CK2 catalytic, regulatory sub-
units, and holoenzymes as well as functional aspects and physiological roles of plant
CK2 are detailed.

Introduction

Protein kinase CK2 is an evolutionary conserved enzyme present in all eukaryotes

(Litchfield, 2003). The existence of plant CK2-like activity was first described in
wheat germ in the 1980s (Yan and Tao, 1982). Monomeric forms (CK2α catalytic
subunits alone) and oligomeric forms (presumably tetrameric, according to its
molecular size) with CK2-like activity were isolated from different plant sources
such as maize (Dobrowolska et al., 1989; Dobrowolska et al., 1991), pea (Datta and
Cashmore, 1989), or broccoli (Klimczak et al., 1992); however, the presence of
CK2β regulatory subunits in plant holoenzymes was not clear until 1994, when the
CK2β subunits were isolated in Arabidopsis by yeast complementation (Collinge
and Walker, 1994). In the case of maize, CK2β subunits were isolated in 2001 (Riera
et al., 2001a), confirming that, also in plants, CK2 holoenzyme is a heterotetrameric
complex composed of two catalytic (CK2α) and two regulatory (CK2β) subunits.
The plant CK2 holoenzymes share with their mammalian counterparts the main
biochemical properties, since they are constitutively active, independent of second
messengers, they can use both ATP and GTP as phosphate donors, and present
specificity for acidic substrates. Plant CK2 is a pleiotropic enzyme involved in
relevant processes such as plant growth and development, light-regulated gene
expression, circadian rhythm, cell-cycle regulation, or responses to biotic and abiotic

Protein Kinase CK2, First Edition. Edited by Lorenzo A. Pinna. K2

Abiotic and biotic stress

Rab17,ERD14, LEA proteins Maize, Arabidopsis, Stress responsive proteins Plana et al.,1991; Alsheikh
TAS-14 tomato,wheat et al., 2003; Godoy et al., 1994
TsDHN1,2 Dehydrins Thellungiella salsuginea Stress responsive proteins Rahman et al., 2011
EmBP-2/ZmBZ-1 bZIP TF Maize Activate transcription of the abscisic Nieva et al., 2005
acid-inducible gene rab28
TGA2 bZIP TF Arabidopsis Binds to promoter of salicilic-induced Kang and Klessig, 2005
genes
p23 co-chaperone protein Arabidopsis Plant response to Salicilic acid Tosoni et al., 2011
PCS phytochelatin synthase Arabidopsis Synthesis of heavy metal-binding Wang et al., 2009
peptides
Continued

271

8/28/2012 6:40:58 PM
K2
K2

272

Pinna_3036_c09_main.indd 272
Table 9.2. (Continued)
Name Type Specie Role Reference
Chromatin associated and nuclear proteins
lamin-like protein lamina matrix protein Pea Nuclear stability, chromatin Li and Roux, 1992
organization
MFP1 coil-coil protein Tomato Structural roles in nuclear matix and Meier et al., 1996; Samaniego
Allium cepa chloroplast et al., 2006
NopA64/nopA61 nucleolin-like phosphoproteins Allium cepa Located in nucleolus de Carcer et al., 1997
P-proteins Ribosomal proteins Maize Complex with 60S ribosomal Bailey-Serres, et al., 1997
subunits
DNA helicase I DNA helicase I Pea DNA transcription Tuteja et al., 2003
DNA topoisomerase I DNA topoisomerase I Pea DNA transcription Tuteja et al., 2003
HMGB proteins High mobility group B proteins Maize, Arabidopsis Chromatin associated proteins Stemmer et al., 2002
SSRP1 structure-specific recognition Maize Chromatin associated proteins Krohn et al., 2003

Pinna—Protein Kinase CK2

protein
eIF2ab/3c/4b/5 elongation initiation factors Arabidopsis, maize, Translation initiation Dennis and Browing, 2009
wheat
Histone deacetilase Histone deacetilase Arabidopsis Chromatin remodeling enzyme Dennis and Browing, 2009
2B

8/28/2012 6:40:58 PM
Name Type Specie Role Reference

Pinna_3036_c09_main.indd 273
Chloroplast machinery
Chloroplast Ribonucleoproteins Spinach Arabidopsis RNA binding proteins involved in Kanekatsu et al., 1993;
RNPs/28RNP/p34/ chloroplast RNA processing and Kanekatsu et al., 1995;
RNP29,33 stabilization Lisitsky et al., 1995; Reiland
et al., 2009
CP29 photosystem II subunit Maize Light harvesting complex Testi et al., 1996
TOC159 preprotein receptor Arabidopsis Import Agne et al., 2010
Nuclear-encoded chloroplast
preproteins from the cytosol
SIG1/SIG6 plastid sigma factors Arabidopsis Gene-regulatory proteins for Schweer et al., 2010
promoter binding and transcription
initiation

Others

Pinna—Protein Kinase CK2

CFOCF1-ATPase Chloroplast ATP synthase (b Spinach ATP synthesis Kanekatsu et al., 1998
subunit)
C2 subunit of the 20S proteasome Rice Protein degradation of ubiquitinated Umeda et al., 1997
proteins
gp100/gp96 Glycyrrhizin (GL)-Binding Soybean Lipoxygenase that catalyzes the Otsuki et al., 1994; Otsuki
Protein (gp100) oxygenation of unsaturated fatty et al., 1995
acids
β-Conglycinin α β-Conglycinin α Subunit Soybean Storage protein Ralet et al., 1999
Subunit
calreticulin calreticulin Spinach Ca2+ binding protein Baldan et al., 1996
apyrase apyrase Pea ATP hydrolisis Hsieh et al., 2000

273

8/28/2012 6:40:58 PM
K2
274 Specific Features of Plant CK2

Reiland et al., 2009). The cpCK2α isoforms present biochemical properties similar
to nuclear CK2 (Salinas et al., 2006; Schweer et al., 2010b; Turkeri et al., 2012).
Until now, the presence of CK2β subunits has not been described in chloroplast;
however, the catalytic activity of Arabidopsis cpCK2α is enhanced in the presence
of exogenous CK2β suggesting that cpCK2α could be somehow modulated by
CK2β regulatory subunits (Salinas et al., 2006).
As the case of human CK2α′, which is 40 amino acids shorter that human CK2α,
plant CK2α present a C-terminal region shorter that mammalian CK2 (Figure 9.1).
This specific characteristic of plant CK2α subunits gives them higher stability and
more specific activity than animal CK2α subunits and was one of the main reasons
why maize CK2α1 was the first CK2α catalytic subunit crystallized (Niefind et al.,
1998). Since then, most of the CK2α structures are based on the enzyme from Zea
mays, and the structure of maize CK2α (zmCK2α) in complex with the ATP-
analogue adenosine 5′-(β, γ-imido)-triphosphate (AMPPNP) and two magnesium
ions has been described as a functional reference structure (Niefind et al., 2009).
However, it has to be noticed that even though there is a degree of identity of more
that 77% between maize and human CK2, significant differences have been found
between both structures suggesting that plant enzymes can behave differently in
terms of regulation (Battistutta and Lolli, 2011).
For maize CK2α-1 gene, an alternative splicing isoform (named CK2α-4) has
been described and reported that could act as a specific negative regulator of CK2
activity (Lebska, 2009). In addition, other plant databases, such as those of Arabi-
dopsis and maize (http://www.arabidopsis.org, http://maizesequence.org), predict
alternative splicing variants for both CK2α/β subunits suggesting that this regula-
tory mechanism could be involved in CK2 gene regulation in plants.

CK2β Regulatory Subunits

As in the case of animals, plant CK2β subunits present three main properties: they
are inactive by themselves but can stimulate CK2α catalytic activity, they confer
stability to the enzyme, and they provide specificity for the interaction with sub-
strates and inhibitors. However, as shown in Figure 9.2, the level of identity between
the plant and human CK2β regulatory subunits is not as high as in the case of CK2α.
Despite the elucidation of the human CK2β subunit, holoenzyme and maize
CK2α structure (Niefind et al., 1998, 2001; Chantalat et al., 1999), no data exist
about CK2β or holoenzyme structure in plants. The human CK2β subunit is a
compact globular homodimer organized in seven α-helices and three β-sheets
(Chantalat et al., 1999). The tertiary structure predicted for the central core of maize
CK2β1 (82–276) almost overlaps with the human CK2β structure (1–197), indicat-
ing that, as in the case of catalytic subunits, plant and human CK2β are structurally
related (Veléz-Bermudez et al., 2011). All plant CK2β subunits preserve in their
central core the characteristic CK2β feature, the zinc finger region that contains four
conserved Cysteine residues involved in CK2β dimerization. But, as for the catalytic
subunits, there are distinctive features in plant CK2β located in the N-terminal
K2 region, in the acidic loop, and in the C-terminal domain. The CK2β subunits present

Pinna—Protein Kinase CK2

Pinna_3036_c09_main.indd 274 8/28/2012 6:40:58 PM

Figure 9.2. Protein sequence alignment of regulatory CK2β subunits from Zea Mays. Maize
CK2β subunits ZmCK2β2, (GRMZM2G098208); ZmCK2β4 (GRMZM2G148216);
ZmCK2β3 (GRMZM2G161611); and ZmCK2β1 (GRMZM5G857992) were aligned with
the CK2β subunit from Homo sapiens (23503295). The plant specific N-terminal region and
the characteristic CK2β domains are underlined. Unchanged residues are indicated by *,
similar residues by :, and semi-conservative changes by ·.

275

Pinna—Protein Kinase CK2

Pinna_3036_c09_main.indd 275 8/28/2012 6:40:59 PM

276 Specific Features of Plant CK2

a specific N-terminal extension of about ninety amino acids that share no homology
with any previously characterized functional domain. Most of the animal CK2β
subunits are autophosphorylated only at two highly conserved residues, Ser2 and
Ser3 (Litchfield et al., 1991). The functional significance of this autophosphorylation
is still unknown, but it appears that it may enhance CK2β stability (Zhang
et al., 2002). The N-terminal region of plant CK2β subunits present additional puta-
tive autophosphorylation sites. For instance, maize CK2β1 has five additional Serine
residues in this domain that are highly phosphorylated by CK2α1 in vitro. It was
recently demonstrated that the presence of plant-specific N-terminal domain in plant
CK2β subunits affects their CK2 activity, since this region competes with the sub-
strate for phosphorylation and can be described as a downregulator of the CK2α
activity (Riera et al., 2011).
Another characteristic of plant CK2β subunits is that the acidic loop region is
poorly conserved in plant sequences (Figure 9.2). In human CK2β subunits, the
acidic loop region (residues 55–64) has been described as a regulatory region since
it contains the binding domain for polyamines (Meggio et al., 1994). In maize, for
example, the amino acid composition of CK2β1 acidic loop differs from that of
human CK2β (Vélez-Bermúdez et al., 2011). There are only 3 acidic residues of 10,
and 2 of them are in the same position (136 DVESSHGDML 145). The maize acidic
loop presents high heterogeneity since contains different types of residues: basic (as
His), nonpolar (as Val, Gly, Leu, and Met), and polar (Ser). In animals, it has been
shown that mutations in residues in the acidic loop region affect the CK2 activity
(Leroy et al., 1997); therefore, it is likely that the differences found in this region
could also affect plant enzyme regulation.
The C-terminal domain of animals CK2β is only partially present in plant CK2β
(see alignment in Figure 9.2). The crystal structure of human holoenzyme demon-
strated that this region is involved in interaction with the catalytic subunits (Niefind
et al., 2001). This may imply that in plants the interaction between CK2α/β subunits
is weaker than in the case of CK2 human holoenzyme, probably affecting the bio-
chemical properties of plant CK2, as demonstrated by comparative studies between
maize and human CK2 holoenzymes, in which maize holoenzyme is less stable than
the human counterpart (Riera et al., 2003). The C-terminal region of human CK2β
also mediates the association with other kinases such as A-Raf, c-Mos, or the check-
point kinase Chk1 (Boldyreff and Issinger, 1997; Chen et al., 1997; Guerra et al.,
2003) and also this C-terminal region is phosphorylated by p34cdcd2 (Litchfield et
al., 1991). However, in plants, no interaction among CK2β and other kinases neither
CK2 phosphorylation by other kinases has been described so far.

Pinna_3036_c09_main.indd 278 8/28/2012 6:40:59 PM

Physiological Role of CK2 in Plants 279

CK2β2, and CK2β4 are mainly located in nuclear speckles, whereas CK2β3 can be
found in both nucleus and cytoplasm (Riera et al., 2004). In maize, it has been
recently reported that the presence of plant-specific N-terminal domain of CK2β
enhances the protein aggregation in nuclear speckles, where it is assumed to be
tightly complexed and less accessible to degradation machinery (Riera et al., 2011).
Little is known about CK2 holoenzyme localization in plants, but recent work per-
formed in our lab by using bimolecular fluorescence complementation (BiFC)
assays shows the nuclear and cytoplasmic location of the maize CK2 holoenzyme
composed by α1β1 subunits, in contrast to the individual CK2α/β subunits localiza-
tion, mainly observed in the nucleus (Figure 9.3). Thus, the differential localization
of plant CK2α/β isoforms in the cell suggests that both types of subunits could be
found independently in different cellular compartments, and they probably indepen-
dently move in the cell, as reported for animals (Faust and Montenarh 2000; Martel
et al., 2002; Filhol et al., 2003).
Another example of the specific role of plant CK2 isoforms is found in Arabi-
dopsis where only CK2B3 and CK2B4 isoforms have been described to play a role
in circadian-clock regulation (Sugano et al., 1999; Perales et al., 2006). In addition,
it has been shown that CKB4 isoform is ubiquitinated and subsequently degraded
by the proteasome pathway in a process controlled by the circadian clock (Perales
et al., 2006). In animals, it has been demonstrated that CK2β subunits are degraded
by a proteasome-dependent pathway and that phosphorylation enhances CK2β
protein stability (Zhang et al., 2002). In the case of Arabidopsis, the phosphorylated
isoforms of CKB4 are the preferred substrate for degradation. This is a clear
example of both the conserved similarities (phosphorylation, ubiquitination, and
degradation) and distinctive features (stability of isoforms) between CK2β subunits
in plants and mammals.
To sum up, it is likely that in plants, regulation of the CK2 isoforms expression,
degradation, and subcellular distribution could be a mechanism for regulating the
substrate specificity of CK2 through the formation of different CK2 holoenzyme
complexes.

Physiological Role of CK2 in Plants

Through the years, genetic approaches have been difficult in the case of plant CK2
as a result of the multiple genes coding for CK2αβ subunits and also because of
the evidence that yeast CK2 is essential for viability, since depletion of CK2α is
lethal for the organisms (Padmanabha et al., 1990). Several strategies have been
used to partially inactivate CK2 activity in plants. The Arabidopsis CK2α antisense
plants were the first CK2 transgenic lines described, and their phenotype confirmed
the role of CK2 in light-regulated gene expression and plant growth (Lee et al.,
1999). Moreover, a dominant-negative for CK2α has been described. In this case,
a CK2 kinase-inactive mutant has been generated by site-directed mutagenesis of
an essential Lysine residue of CK2α. Phenotypes associated with these plants affect
chloroplast development, cotyledon expansion, and root and shoot growth, as well K2
as different aspects of plant development as cell division, cell expansion, and auxin

Pinna—Protein Kinase CK2

Pinna_3036_c09_main.indd 279 8/28/2012 6:40:59 PM

280 Specific Features of Plant CK2

transport (Moreno-Romero et al., 2008; Moreno-Romero et al., 2011; Marquès-

Bueno et al., 2011).
Recently, two different groups published Arabidopsis CK2a1a2a3 triple mutant,
which were obtained by genetic crosses (Lu et al., 2011; Mulekar et al., 2012). These
plants present significant decrease of CK2 activity and a clear phenotype of late
flowering. According to Lu et al. (2011), analysis of their phenotype suggests that
CK2α subunits are involved in the regulation of the pace of the circadian clock
influencing its period of oscillation. Results obtained by Mulekar et al. (2012)
suggest that CK2α subunits also affect diverse developmental and stress responsive
pathways in Arabidopsis. On the other hand, overexpression of the regulatory sub-
units (such as CKB3 or CKB4) in Arabidopsis displays increased CK2 activity, a
reduction of the subjective day length inducing alterations in clock-regulated gene
expression, hypocotyl elongation, and flowering time (Sugano et al., 1999; Perales
et al., 2006).
In animals, CK2 is able to phosphorylate and regulate a huge number of sub-
strates involved in multiple processes (Meggio and Pinna, 2003). A smaller number
of substrates have been found in plants (Table 9.2).
It is clear that CK2 has a prominent role in light-regulated gene expression in
plants. CK2 phosphorylation regulates the DNA binding stability and activity of
several light-related transcription factors. For instance, phosphorylation of the tran-
scription factors AT-1 and ATBP-1 by CK2 inhibit their in vitro binding to AT-rich
regions in the promoter of the light-regulated gene (Datta and Cashmore, 1989;
Tjaden and Coruzzi, 1994). Another example is GBF1, an Arabidopsis transcription
factor that binds to the light-responsive elements (G-box) of light-regulated genes
such as cab and rbcS. In this case, CK2 phosphorylation gives the opposite effect,
because it increases the G-box-binding ability of GBF1 (Klimczak et al., 1992;
Klimczak et al., 1995).
Phosphorylation of circadian clock proteins is an essential post-transcriptional
mechanism in the regulation of circadian clocks, and protein kinase CK2 has been
shown to regulate key clock components in several eukaryotic systems, including
Neurospora, Drosophila, mice, and Arabidopsis. For review, see Mizoguchi et al.
(2006). In Arabidopsis, it has also been shown that relevant circadian clock compo-
nents as the two Myb-related transcription factors—circadian clock-associated 1
(CCA1) and late elongated hypocotyl (LHY)—interact with and are phosphorylated
by CK2, and this regulation is essential for the proper functioning of the clock
(Sugano et al., 1998; Sugano et al., 1999; Daniel et al., 2004; Portolés and Más
2007). In rice, phosphorylation of circadian clock components such as OsLHY has
been described, and further analysis suggests that CK2 affects the circadian clock
and the flowering time through independent pathways, implying a diversification of
these mechanisms during evolution of higher plants (Ogiso et al., 2010).
Relevant studies in Neurospora described a role for CK2 in the regulatory mecha-
nism of circadian clock known as temperature compensation that allows maintaining
the clock as robust and accurate over a broad range of physiological temperatures
(Mehra et al., 2009). Recently in Arabidopsis, it has been shown that CK2 and CCA1
activities display inverse temperature sensitivity. In this way they constitute a mecha-
K2 nism capable of counterbalancing temperature effects on the circadian oscillator.

Pinna—Protein Kinase CK2

Pinna_3036_c09_main.indd 280 8/28/2012 6:40:59 PM

Physiological Role of CK2 in Plants 281

Thus, this work demonstrates a prominent role of CK2 in regulation of temperature

compensation mechanisms in Arabidopsis (Portolés and Más, 2011).
Photomorphogenesis is a process by which plant development is controlled by
light. CK2 is a central regulator of this process since phosphorylation could dif-
ferentially regulate the stability of positively and negatively acting transcription
factors functioning in this process. Positive regulators, such as bZIP transcription
factor HY5 or bHLH transcription factor HFR1, are degraded in darkness and sta-
bilized by CK2-mediated phosphorylation under light conditions (Hardtke et al.,
2000; Park et al., 2008). Conversely, the negatively acting transcription factor PIF1
(phytochrome interacting factor 1) is stable in the dark, and its degradation through
the ubiquitin/26S proteasomal pathway in response to light is enhanced by CK2-
mediated phosphorylation (Bu et al., 2011). Another transcription factor, the basic
leucine zipper Opaque2 (O2), is phosphorylated by CK2 during maize seed develop-
ment, and its phosphorylation is light dependent and under diurnal control (Ciceri
et al., 1997).
Plant CK2 is also involved in response to abiotic and biotic stress. A role of plant
CK2 in response to salt stress was first demonstrated using yeast complementation
approaches, since overexpression of CK2α subunit from sugar beet increase NaCl
tolerance in S. cerevisiae (Kanhonou et al., 2001). Also overexpression of maize
CK2β1 in yeast cells lacking one of the CK2β isoforms display a phenotype of
increased sensitivity to sodium and lithium ions (Riera et al., 2001a). More recently,
the phenotype of Arabidopsis CK2a1a2a3 triple mutants that are hyposensitive to
NaCl confirms the role of CK2 in response to salt stress in plants (Mulekar et al.,
2012). Many stress-related proteins are substrates of CK2. Late embryogenesis
abundant (LEA) proteins/Rab/dehydrins are among the most common plant proteins
involved in adaptation to water or osmotic stress. In maize Rab17 protein is induced
by abscisic acid (ABA) and strongly phosphorylated by CK2 (Plana et al., 1991).
We also demonstrated that through interaction and phosphorylation, CK2 modulates
developmental functions of Rab17 in seed germination in response to osmotic stress
(Riera et al., 2004). The homologues of Rab17 proteins in tomato (TAS14) and in
Arabidopsis (ERD14) are also phosphorylated by CK2 (Godoy et al., 1994; Alsheikh
et al., 2003). Functional role of dehydrins remains elusive; however, recent works
as phosphorylation of dehydrins TsDHN1, 2 from Thellungiella salsuginea support
the hypothesis that dehydrins stabilize the cytoskeleton under stress conditions and
that phosphorylation may be involved in this stabilization (Rahman et al., 2011). In
addition, in maize, binding activity of bZIP transcription factors EmBP-2/ZmBZ-1
is modulated by CK2 phosphorylation. Both factors are nuclear proteins that bind
to ABRE (ABA Responsive Elements) and activate transcription of the abscisic
acid-inducible gene rab28 (Nieva et al., 2005), thus, suggesting that CK2 regulation
of Rab proteins is not only by directly phosphorylation but also at the level of gene
expression. There are few data about activation of CK2 by plant hormones. Salicylic
acid (SA) is an important phytohormone involved in the activation of defense
responses against biotic stress. It was reported that SA increases nuclear CK2 activ-
ity in tobacco plants (Hidalgo et al., 2001). In Arabidopsis, SA treatment enhanced
the phosphorylation of bZIP transcription factor TGA2, negatively influencing its
DNA-binding ability (Kang and Klessig, 2005). Recently, the co-chaperone p23, K2

Pinna—Protein Kinase CK2

Pinna_3036_c09_main.indd 281 8/28/2012 6:41:00 PM

282 Specific Features of Plant CK2

also involved in SA signaling, has been identified as a new substrate for CK2 in
Arabidopsis (Tosoni et al., 2011). Moreover, it has been shown that activity of phy-
tochelatin synthase (PCS), a protein involved in biotic and heavy metal stress
responses in plants, is increased following phosphorylation by CK2 (Wang et al.,
2009).
CK2 also plays a prominent role phosphorylating proteins involved in many
DNA-dependent processes, such as DNA replication, transcription, translation,
recombination, repair, or ribosome biogenesis.
Arabidopsis and wheat translation initiation factors eIF2alpha, eIF2beta, eIF3c,
eIF4B and eIF5 are phosphorylated by CK2 (Dennis and Browning, 2009; Dennis
et al., 2009). In these works, it is postulated that, by differential phosphorylation of
initiation factor complexes, CK2 holoenzymes may regulate the translation of spe-
cific mRNAs or the stability of various initiation factors in response to abiotic or
biotic stress, development, or changes in the cell cycle. In maize, eukaryotic transla-
tion initiation factor 5A (ZmeIF5A) co-purifies with the catalytic subunit of protein
kinase CK2 and is phosphorylated by this enzyme. This phosphorylation plays a
role in the regulation of the nucleocytoplasmic shuttling of eIF5A in plant cells
(Lebska et al., 2010; Lewandowska-Gnatowska et al., 2011).
The acidic phosphoproteins (P-proteins) P0, P1, and P2 interact with elongation
factors, mRNA, and tRNA during translation, and CK2 phosphorylation of the
P-proteins caused dynamic changes in the P-protein complex (Hasler et al., 1991;
Bailey-Serres et al., 1997).
Among the nuclear proteins regulated by CK2 phosphorylation in plants, there
are the high mobility group (HMG) proteins that are described as chromosomal
proteins and seem to act primarily as architectural facilitators in the manipulation
of nucleoprotein complexes. Several maize and Arabidopsis HMGB proteins are
phosphorylated by CK2, and this phosphorylation increases their thermal stability
and affects their DNA binding activity (Stemmer et al., 2002; Stemmer et al., 2003;
Krohn et al., 2003).
In peas, enzymes involved in DNA transcription as DNA helicase I (PDH65) and
DNA topoisomerase I are modified by phosphorylation. In the case of PDH65, the
DNA and RNA unwinding activities were upregulated after phosphorylation of
PDH65 with CK2 and cdc2 protein kinases (Tuteja et al., 2008). For DNA topoi-
somerase I, its activity increased after phosphorylation with exogenous CK2 and
PKC (Tuteja et al., 2003).
In animals, the nuclear matrix (NM), which plays a major role in growth-related
activities, is a primary locus for CK2 signaling (Yu et al., 2001). In plants, several
NM associated proteins have been found to be phosphorylated by CK2: the pea
functional homologues of lamins (Li and Roux, 1992) and MFP1 from tomato and
Allium cepa (Meier et al., 1996; Samaniego et al., 2006), and their phosphorylation
seems to modulate their binding to NM. Also NopA64, a nucleolar protein that
shares immunological determinants with mammalian nucleolin, is phosphorylated
by CK2 (de Cárcer et al., 1997).
Finally, as shown in Table 9.2, other kinds of proteins have been described as
plant CK2 substrates, as calreticulin, which is specifically phosphorylated in plants.
K2 In addition, it seems that this protein is not a CK2 substrate in other animal systems
such as rat liver (Baldan et al., 1996) and storage proteins, proteaosome subunits,

Pinna—Protein Kinase CK2

Pinna_3036_c09_main.indd 282 8/28/2012 6:41:00 PM

references 283

or enzymes as lipoxygenase or apyrase (Ohtsuki et al., 1994; Ohtsuki et al., 1995;

Umeda et al., 1997; Ralet et al., 1999; Hsieh et al., 2000).

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Pinna—Protein Kinase CK2

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