138 QUIMICA BIOLOGICA Kmap. Km Pig. 8-11, Efecto de la presencia de un inhibidor anricompetitivo sobre ta actividad enzimatica (Iinea roja: sin inhibidor, Jinea gris: con inhibidor). A. Curva de velocidad inicial en funcién de la concentracién de sustrato. B. Representa- n de dobles reciprocas. de [S] determinada en presencia y en ausencia de inhibidor muestran reduccién de la velocidad a todas fas concentraciones de S (fig. 8-11 A). La representacién de los resultados por el método de dobles reciprocas da una linea paralela a la normal (fig. 8-1] B). La interse cién con los ejes vertical y horizontal indica que el inhibidor produce disminucién tanto de velocidad maxima como de K,,. El equilibrio puede representarse: E+SSES>E+P + 1 1 ESI El inhibidor se une al complejo ES y forma el complejo inactivo ESI. Hay dos reacciones que con- sumen ES, una leva a la formacin de producto y otra a ESI, la reacci6n E+ S FES es favorecida hacia a derecha; entonces parece como si hubiese a mento de la afinidad por et sustrato (reducein de K,,). La actividad es disminuida porque el complejo ES unido al inhibidor es inefectivo, Este tipo de inhibicién se da en casos en los cuales participan varios sustratos en la reaccién No es revertida por aumento de [S]. Regulacién de actividad enzimdtica Laactividad de enzimas en las células es ajus- tada a fos requerimientos fisiolégicos, cambian- tes de momento a momento. Existen varios me- canismos de regulacién. Cuando la concentracién de sustrato es baja, Ja actividad de la enzima es proporcional a los niveles de sustrato. En condiciones fisiolégicas, las concentraciones de sustrato se encuentran por debajo o proximas al K,,, de esta manera, los ni- veles de sustrato determinan la mayor 0 menor actividad enzimatica, Al aumentar la concentra- cién de sustrato, en la célula se acelera su utiliza- cién y viceversa. Las transformaciones de un determinado com, puesto en el organismo se producen generalmente a través de una serie de etapas, cada una de ellas, catalizada por una enzima distinta. En cada paso se forma un nuevo producto, utilizado como sus: trato por la enzima de Ja etapa siguiente. En casi todas estas secuencias de reacciones (vias metabsli- cas) existe una o mas enzimas que actian como reguladores del flujo de sustratos y productos, ajustandolo a las necesidades de la célula. Estas enzimas reguladoras no s6lo cumplen su funcién catalizadora, sino aumentan o disminuyen su ac- tividad en respuesta a sefiales especificas. La enzima que cataliza la primera etapa en una via metab6lica suele ser reguladora. Las restan- tes enzimas de la serie ajustan su actividad a la disponibilidad de sustrato fijada a partir de la pri- mera reaccién. De acuerdo con el tipo de sefial a la cual res- ponden, las enzimas reguladoras pueden distin- guirse en alostéricas y reguladas por modifica- cidn covalente Enzimas alostéricas. En algunas vias me- tabélicas, la enzima que cataliza [a primera etapa de la serie es inhibida por el producto de la dlti- ma. Cuando la cantidad de ese producto final excede las necesidades, se frena el funcionamien- to de la via reduciendo la actividad de la enzima reguladora Se habla de inhibicién por retroalimentacion (del inglés feedback). Por ejemplo, aspartato transcarbamilasa, que cataliza la primera reac- cién en la biosintesis de nuclestidos de piri- midina, es inhibida por citidina trifosfato (CTP), producto final de esa via metabélica. En otros casos, la enzima es estimulada por compuestos que se acumulan en el medio. El activador puede ser el propio sustrato de la enzi- ma. Cuando existe exceso de sustrato, él mismo promueve su utilizacién activando la enzimaEstas acciones, tanto de inhibicién como de activacién, son reversibles; al descender Ja con- centracidn de ta sustancia modificadora se nor- maliza la actividad de Ja enzima, El agente modificador acttia uniéndose a la enzima en un Jugar distinto al del sitio catalitico; de alli el nombre de alostérico de este tipo de regulacién (del griego allo: otro, stereo: sitio 0 lugar), En enzimas alostéricas, ademds del sitio catalitico, existen otros sitios reguladores a los cuales se unen especificamente las moléculas que actiian sobre su actividad catalitica. Estos agen- tes reciben el nombre de moduladores. modifi- cadores 0 efectores alostéricos. Seran positivos si estimulan y negativos si deprimen la activi- dad de la enzima. Cuando el modulador alos- térico es distinto del sustrato, el efecto es deno- minado heterotrépico; si el agente modificador es el mismo sustrato, es homotrdpico En algunos casos, varios moduladores actilan sobre una misma enzima, aun con efectos con- trarios. Cada uno de los moduladores posee un sitio de unién a la enzima (sitio alostérico) con complementariedad estructural para asegurar Ia especificidad (fig. 8-12). Cuando se analiza la actividad de enzimas trente a concentraciones crecientes de sustrato, generalmente se obtiene una curva hiperbélica (fig. 8-5), Esta es la cinética enzimitica clasica, pero no es la correspondiente a enzimas alosté- ricas. Con ellas se obtiene una curva sigmoide (fig. 8-13), semejante a la de saturacién de he- moglobina con oxigeno (pag. 50). La hemoglo- bina es un oligémero, con cuatro sitios de unién para el oxfgeno y ofrece un modelo andlogo al de enzimas alostéricas. En la hemoglobina, el bisfosfoglicerato se comporta como modulador alostérico negativo; el oxigeno, al unirse al pri- mer hemo provoca ‘una modificacién confor- macional que facilita Ja entrada de O; a los res- tantes sitios, produce un efecto cooperativo si- milar al del sustrato de enzimas alostéricas ho- motr6picas. Las enzimas alostéricas, a semejanza de la he- moglobina, estén constituidas por varias subuni- dades polipeptidicas, entre las cuales existe al- atin tipo de comunicacion. Cuando un modulador se une a una subunidad, se produce un cambio conformacional que se transmite a las otras y modifica la aptitud del sitio activo para recibir al sustrato (fig. 8-14). Modificacién covalente. Hay también enzimas reguladas por adicién o sustraccin de grupos unidos covalentemente. Como ejemplo de este tipo se citard ala glucégeno fosforilasa, en- ENZIMAS 139 Sitio Sitio de alosterico sustrato o (destavorable) INACTIVA Sitio de 7 \_ Sitio sustrato ‘alosterico sitio | t Sitio de alostérico, sustrato \ ¥ (favorable) ACTIVA 7 \ sto alostérico Sitio de sustrato Fig, 8-12. Representacién muy esqueiética de una en- zima alostérica. Se trata de un dimero, que puede pre- sentar una conformacién inactiva y una activa, que s¢ en- cuentran en equilibrio. En la forma activa, e! sitio catalitico adquiere la forma favorable para la recepcién del sustrato. zima que inicia la via de degradacién del ghucégeno. Esta enzima se encuentra en estado de baja actividad, Ilamado fosforitasa b, la cual s convertida en fosforilasa a, activa, por adi- cién de fosfato al hidroxilo de residuos serina en la molécula de enzima. La fosforilasa a, a su vez, > Concentracién de sustrato Fig. 8-13. Curva de actividad de una enzima alostérica en funcién de ta concentracién de sustrato: linea negra Se muestra ei efecto de la presencia en el medio de un modulador positivo (activador): Kinea roja_y de uno ne- gativo (inhibidor): linea gris.140 QUIMICA BIOLOGICA ceame Fema 1 oo = oe Macisdr su i Moda Ld posto 7 a j Sustrato ‘Modulador positive \ 4 Fig. 8-14, Representacidn muy esquemstica de interacciones alostéricas en una enzima dimérica. Los sitios del efector negativo y positivo se han dibujado arbitrariamente en la misma zona. A la izquierda, la unién del modulador negativo fija la enzima en la conformacién desfavorable o inactiva. Al centro, la unién del modulador positive promueve ta conformacidn favorable para fa recepcidn del sustrato. A la derecha, la entrada del sustrato en el sitio a ode uno de jos monémeros puede también promover la conformacidn favorable en el otro sitio catalitico de Ja enzima (efecto homotr6pico positivo). Las formas inactiva y activa estén inicialmente en equilibrio. Si en el medio aumenia el efector positivo, o la concentracién de sustrato, se favorece el desplazamiento del equilibrio hacia la conformacién activa. Si en cambio se incrementa en el medio Ja concentracidn de modulador negativo, se promueve la conversiGn de molé- culas de enzima en su conformacién inactiva. es desactivada por eliminacién de fosfato y re- vierte a fosforilasa b. La regulacién covalente se realiza en varias enzimas por un proceso de unién o eliminacién de fosfatos similar al de la fosforilasa. Existen también enzimas cuya actividad es modulada por Ia insercién covalente de otros grupos. Una misma enzima puede responder a mas de un tipo de regulacién. La fosforilasa, men- cionada como ejemplo de regulacién covalente, es también una enzima alostérica que responde a varios moduladores Enzimas constitutivas e inducibles EI nivel que aleanza una enzima determina- da en Jas células depende de la relacién entre su sintesis y su degradacién, Cuando ambos proce- sos se mantienen mas 0 menos constantes a todo lo largo de la vida de la célula, la cantidad de enzima permanece estable. Este es el caso de Jas enzimas constitutivas. Para otras, en cambio, la sintesis se activa 0 deprime de acuerdo con los requerimientos de la célula en un momento dado. Por ejemplo, para algunas enzimas del metabolismo de glucosa y aminoécidos, la sintesis es estimulada cuando Ia presencia del sustrato respectivo las hace nece- sarias. Estas enzimas son inducibles. La induc- cidn comprende sintesis de novo de la enzima y puede ser activada por hormonas (p4g. 399). Procesos enzimdticos en cascada Participan en ellos una serie de zimégenos 0 proenzimas que se activan sucesivamente uno a otro en una cadena de reacciones. Supongamos un sistema constituido por los zimégenos pro-A, pro-B y pro-C. Si un estimulo inicial provoca la activacién de pro-A en enzima A, ésta utiliza como sustrato a pro-B para dar B, la cual a su vez cataliza la conversién de pro-C en C activa. En este ejemplo, si las tres enzimas A,B y C tuviesen una actividad molar de 100,una sola molécula inicial de A produciré en un minuto 100 moléculas de B, las cuales activarén 10.000 moléculas de C en ei minuto siguiente. Como se trata de una progresién logaritmica, el resultado final es un incremento enorme de la actividad enzimética ‘Veremos ejemplos de estas cascadas en pro- cesos como la coagulacién de la sangre, o en la transmisién de estimulos hormonales. Los mecanismos regulatorios que compren- den efectos alostéricos, modificaciones covalen- tes y cascadas enzimiticas se ejercen sobre mo- éculas preexistentes y son de efecto muy répi- do. En cambio, la induccién de enzimas exige sintesis de novo; es de respuesta més lenta Isozimas En un organismo, y aun en una célula, pue- den existir protefnas diferentes dotadas de la mis- ma actividad enzimatica. Esas distintas formas moleculares de una enzima se denominan isoenzimas 0 isozimas. El método més utilizado para la demostraci6n de isozimas es la electroforesis en geles seguida de tincién especifica después de la separacion. Las proteinas con actividad de la enzima inves- tigada se muestran como bandas coloreadas so- bre la superficie del gel Se ha probado la existencia de formas moleculares multiples o isozimas en cientos de enzimas. Desde este punto de vista, ha sido muy estudiada la lactato deshidrogenasa (LDH), que presenta cinco isozimas en la mayoria de tejidos oO 5 DIAFRAGMA, Fig. 8-15. Isozimas de lactato deshidrogenasa de extractos acuosos de tejidos humanos adultos, separa- das mediante electroforesis en gel de almidén y teftidas con coloracién especifica. Las zonas en las cuales se deposita el colorante co- mresponden a las distintas formas moleculares de la enzima. Origen indica el lugar donde se inserté 1a muestra. Los ntimeros | a S sefialan la ubicacién de ta isozima correspondiente Notese el predominio de isozimas { y 2 en corazén yde 5 en higado y misculo. CORAZON SUPRARRENAL MUSCULO RIKION BAZO HIGADO oO 5 oe 4 6 oe | ‘ ENZIMAS 141 de animales. Se numeran de acuerdo con su mo- vilidad electroforética, designando | (uno) a la que migra més hacia el 4nodo (fig. 8-15). La dis- tribuci6n relativa de actividad enzimética entre las cinco formas es caracteristica para cada teji- do. En extractos de miisculo diafragma se reve- lan las cinco isozimas con intensidad aproxima- damente similar. En cambio, en corazén hay un franco predominio de las isozimas 1 y 2; en higa- do y misculo voluntario, la fraccidn 5 es la mas abundante (fig. 8-15). Las cinco isozimas de. LDH son tetrémeros formados por las asociaciones posibles de dos cadenas polipeptidicas diferentes, designadas A o My BoH. La isozima 1 es homotetramero de subunidades B (B,) y la isozima 5 est constitui- da por cuatro cadenas A (A,). Las isozimas res- {antes corresponden a Jas siguientes asociaciones: LDH 2 = A,B,: LDH 3 = A,B, y LDH 4 = A,B). En testiculo humano adulto existe una isozima adicional, cuya movilidad electroforética ¢s intermedia con respecto a las de las fraccio- nes 3 y 4 (sefialada con X en la figura 8-16). Esta forma adicional originalmente fue designada isozima X. Es un homotetramero (C,) formado por subunidades polipeptidicas distintas de A y B. Aparece en testiculos de muchas especies de mamfferos y aves en el momento de la madura- cién sexual y constituye en todas ellas la prin pal lactato deshidrogenasa de espermatozoides. Aungte las seis formas moleculares son to- das lactato deshidrogenasas, hay particularidades en el comportamiento de cada isozima, que con- fieren diferente capacidad funcional a las distin- tas formas moleculares. Por esta razén, la posi- ORIGEN 4 a) 21 a ' 3 6 é 6 ' 8 e e 6 3 ORIGEN 4 2 10)142 QUIMICA BIOLOGICA ORIGEN Oo 5 4 DIAFRAGMA OVARIO MADURO TESTICULO PRE-PUBER TESTICULO POST-PUBER bilidad de sintetizar distintas isozimas otorga al organismo gran flexibilidad fisiolégica, ya que cada érgano produce las formas mas aptas para sus requerimientos especificos. tras enzimas, por ejemplo aspartato amino- transferasa y malato deshidrogenasa, presentan isozimas con diferente ubicacién intracelular. Una forma se encuentra libre en el citosol y otra aso- ciada a mitocondrias. Los conocimientos alcanzados en el Area de Jas isozimas han resultado valiosos no sélo para enzimélogos, sino también para genetistas y bi logos generales. La determinacién de formas mo- leculares de enzimas ha encontrado aplicacin en el laboratorio clinico. Determinacién de enzimas en el Laboratorio clinico E} laboratorio de bioquimica clinica utiliza frecuentemente, con fines diagnésticos, la deter- minacién de enzimas en liquidos orgénicos o biopsias tisulares. Lo mas comin es realizar la vestigacién en plasma o suero sangufneo, ra 6n por Ja cual analizaremos brevemente el ori- gen de enzimas en suero. Enzimas en plasma sangufneo. Las enzimas existentes en plasma pueden ser espectficas de éste 0 no. Las primeras cumplen su funci6n en el plasma como dmbito normal de su accién. En- tre estas enzimas se cuentan trombina y plasmina. comprometidas en Jos procesos de coagulacién y fibrindlisis, ceruloplasmina o ferroxidasa, colinesterasa, etc. Son de interés clinico especial- mente cuando su actividad esté disminuida Las enzimas no espectficas del plasma no tie- nen funcién definida en é1. Normalmente su con- ceniracin es muy baja o nula, Dentro de esta clase se pueden distinguir enzimas extracelulares, Fig, 8-16. Isozimas de lactato deshidrogenasa de extractos acugsos de tejidos humanos, separadas mediante electrofo- resis en gel de almidén y te- flidas con coloracién especi- | fica. Origen indica el lugar donde se inserts la muestra Los mimeros 1 a 5 seftalan ta ubicacién de la isozima co- rrespondiente, Notese la pre- sencia de una banda adicional, de movilidad intermedia entre las de las isozimas 3 y 4, en testiculo post-puber. Esa frac- cin corresponde a la isozirna A X 0 Cy, especifica de esper matozoides. normalmente producidas por glindulas de secre- cidn externa, y enzimas intracelulares. Las enzimas extracelulares 0 de secrecién, como amilasa y lipasa pancredticas y pepsind- geno (zimégeno de la pepsina gastrica), se en- cuentran en el plasma en muy bajas concentra~ ciones. Aumentanen sangre por alteraciones que permiten pasaje desde la glindula de origen ha- cia el espacio intersticial; por ejemplo, obstruc- ciones del conducto pancredtico 0 procesos in- flamatorios serios del pancreas, provocan incre- mento del nivel de amilasa y lipasa en suero. Las enzimas intracelulares participan en el metabolismo y se encuentran distribuidas en los distintos compartimientos de las células. La membrana plasmatica normal no permite e! paso de enzimas a su través; por lo tanto, éstas se man- tienen dentro de la célula y sélo se encuentran cantidades muy reducidas en espacio intersticial y plasma sanguineo, Una alteracién muy intensa de la membrana puede determinar aparicion de estas enzimas en plasma. Si la célula es alterada por procesos inflama- torios serios o interrupcién del suministro de oxi- geno y nutrientes (falta de irrigacién sangufnea), Ta membrana se deteriora. Los procesos mas gra- ves producen destruccién o necrosis celular. En estos casos el contenido, incluidas las enzimas, es liberado al espacio intersticial y de alli Ilegan a la sangre. Cuando el ntimero de células dafia- das es grande, el nivel de enzimas en plasma aumenta marcadamente. Por ejemplo, en el in- farto de miocardio, proceso en el cual un area del miisculo cardiaco queda sin irrigacién san- guinea, se produce destruccion de tejido y libe- racién de enzimas de las fibras miocardicas le- sionadas a la circulacién. En plasma se detecta un brusco aumento de enzimas, particularmente aspartato aminotransferasa (también Hamada glutdmico-oxaloacético transaminasa), lactatodeshidrogenasa y creatina quinasa, abundantes en miocardio. La magnitud y persistencia del incre- mento de esas enzimas en suero tienen valor diag- néstico y pronéstico en pacientes afectados de infarto, En enfermedades hepiticas acompaha- das de alteraciones celulares, también se produ- ce aumento de actividad de transaminasa y lactato deshidrogenasa en suero. Si una enzima se encuentra predominante- mente en un solo tejido u érgano (por ejemplo, alcohol y sorbitol deshidrogenasas en higado, fosfatasa 4cida en préstata), un aumento en su nivel plasmatico indica inequivocamente el ot gano de origen. En cambio, otras enzimas estan distribuidas en muchos tejidos diferentes, razon por la cual su aumento en plasma no es indice seguro de daiio en un tejido determinado. En es- tos casos, ayuda a identificar el origen de la en- zima circulante la determinacién de isozimas. Por ejemplo, el incremento de isozima 1 (B,) de Jactato deshidrogenasa es caracteristico de le- siones del miocardio, mientras en afecciones he- paticas aparece isozima 5 (A,) en suero. El estu- dio de isozimas de creatina quinasa y fosfatasa alcalina también es util para identificar el drga- no afectado. La investigacién de isozimas puede servir para estimar la gravedad del dafio celular en un determinado proceso patolégico. En los casos de enzimas que poseen formas moleculares con dis- tinta localizacién subcelular, por ejemplo as- ENZIMAS 143, partato amjnotransferasa y otras transaminasas malato deshidrogenasa, etc., la presencia en plas- ma de las isozimas citoplasmatica y mitocondrial es un sfntoma de gravedad, pues indica necrosis celular. Se las encuentra en infarto de miocardio y hepatitis muy serias. En procesos inflamatorios {que no han Ilegado a la destruccién total de célu- las pueden aparecer isozimas citosdlicas, pero no es comtin encontrar formas mitocondriales en plasma, Son numerosas las enfermedades en las cua~ les el incremento de enzimas en plasma es un sintoma utilizable para ¢} diagnéstico y pronés- tico, Una enumeracién de las mismas estarfa fue- ra del alcance de este texto En algunos casos resulta de utilidad la deter- minacién de enzimas en otros Iiquidos biolégi- cos, como orina y liquide cefalorraquideo. Existe un grupo de enfermedades producidas por incapacidad genética para sintetizar una en- zima determinada. La investigacién de actividad enzimtica en biopsias de tejidos o células de la sangre certifica el diagndstico y ayuda a detec- tar pacientes portadores de defectos de este tipo La obtencién de células fetales mediante amnio- centesis permite hacer el diagndstico prenatal No es posible aqui hacer consideraciones mas extensas; s6lo destacar la importancia que, des- de el punto de vista del diagnéstico y prondstico clinicos, ha adquirido la determinacién de enzimas en distintos medios biolégicos RESUMEN Las reacciones quimicas se realizan en los seres vivos a gran velocidad, en condiciones muy moderadas de temperatura, pH, presisn, etc.. gracias a la existencia de catalizadores denominados enzimas. Las enzimas se caracterizan por su notable eficiencia y su extraordinaria especificidad. Las sustancias sobre las cuales actiian Jas enzimas se Haman sustratos. Las enzimas se designan agregando el sufijo asa al nombre del sustrato (ureasa, tirosinasa) o al tipo de reaccién catalizada (deshidro- genasa, descarboxilasa): algunas tienen nombres arbitrarios (pepsina, tripsina). El sistema de clasifica- cin asigna a cada enzima un nombre y mimero para identificarla con seguridad. Se agrupan en seis ‘categorias segtin el tipo de seacci6n catalizada: 1. Oxidorreductasas, 2. Transterasas, 3. Hidrolasas, 4 Liasas, 5. Isomerasas y 6. Ligasas. La gran mayoria de enzimas son proteinas; también existe ARN con actividad catalitica (ribozimas). Algunas enzimas son proteinas simples y otras. proteinas conjugadas asociadas con otra molécula no proteica, de pequeio tamafio, la coenzima, La porcién proteica es la apoenzima y junto con ia coenzima forman la holoenzima. La apoenzima es responsable de la especi- ficidad de sustrato, Muchas de las coenzimas estén relacionadas con vitaminas. Existen enzimas con Jones metalicos en sv molécula (metaloenzimas). Mecanismo. Las enzimas aumentan la velocidad de reacci6n disminuyendo la energfa de activacién, Durante el curso de la reaccién, laenzima (E) se une al ©.a los sustrato/s (S) y forma un complejo enzima-sustrato (ES) transitorio. Al final de la reaccign se forman productos. la enzima aparece inalterada y puede unirse nuevamente it otra molécula de sustrato. La misma molécula de E es reutilizada muchas veces, Para formar el complejo ES, $ se fija en un lugar definido de E, el sitio activo, Existe complementariedad estructural entre E y S, Jo cual permite un exacto encaje reciproco. En realidad, hay adaptacisn ajuste inducido; la enzima se amolda al sustr