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Mecanismos genéticos básicos 1

Trabajo práctico N° 5

ADN replicación
ADN
Transcripción

ARN
Traducción

Proteína

Replicación

Durante la replicación del ADN en la célula, cada una de las dos cadenas de ADN originales
actúa como molde para la formación de una nueva cadena completa y complementaria.

Dado que las bases de A solamente se aparean con éxito con bases de T, y las bases de G
solamente con C, la cadena de ADN puede actuar de patrón para especificar la secuencia
de bases de ADN. De este modo, se copia de forma exacta una molécula de ADN de doble
hélice.

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La reacción fundamental mediante la cual se sintetiza el ADN es la adición de un

desoxirribunucleótido al extremo 3´-OH libre de una cadena de polinucléotidos (la cadena
cebadora).

El apareamiento de bases entre el desoxirribonucleósido trifosfato entrante y una cadena

de ADN ya existente (la cadena molde) dirige la formación de la nueva cadena de ADN y
hace que su secuencia de nucleótidos sea complementaria.

Cadena cebadora Cadena molde

Desoxirribonucleósido trifosfato entrante

ADN polimerasa
La replicación del ADN es llevada a cabo por la ADN polimerasa, y su dirección de síntesis
es 5´a 3´

Condiciones de la ADN polimerasa para sintetizar una cadena hija

1) En primer lugar, necesita los sustratos, que para el caso de la ADN polimerasa
son los desoxirribonucleósidos trifosfato. El desoxirribonucleótido entrante
también aporta la energía necesaria para la síntesis de ADN.

2) Segundo, es necesario un cebador/primer. Un cebador es un segmento de cadena

(complementario a la molde) con un grupo 3´-OH libre apareado, al cual
pueden añadirse nucleótidos.

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Los cebadores son a menudo oligonucleótidos de ARN, en lugar de ADN, y son

sintetizados por enzimas especializadas que sintetizan los primers donde y
cuando son requeridos.

3) En tercer lugar, todas las ADN polimerasas requieren un molde. La reacción de

polimerización está dirigida por una cadena molde de ADN según las reglas de
apareamiento de bases A-T y C-G.

Características de la ADN polimerasa

 Alta fidelidad de copia
 Comete un error por cada 109 nucleótidos que coloca
 Sintetiza en dirección 5´→ 3´
 Capacidad autocorrectora (corrección exonucleotídica durante la replicación)

En alguna de las bases de los nucleótidos puede ocurrir un fenómeno llamado

tautomerización. Este fenómeno consiste en un reordenamiento de modo tal que una base
puede ser similar a otra de forma transitoria.
La ADN polimerasa une esta base tautomerizada a otra base nitrogenada que no es su
complementaria, generando una mutación.
Sin embargo, esta tautomerización es un proceso rápidamente reversible. La ADN
polimerasa funciona como una exonucleasa, removiendo nucleótidos desde un extremo en
dirección 3´→ 5´(inversa), produciendo la ruptura de esta base mal apareada.

Mecanismo de corrección de galeradas

Características de la replicación
- Semiconservativa: las estrictas
secuencias de apareamiento
(complementariedad) implican que
cada cadena de ADN actúa como
molde para la síntesis de una cadena
hermana, cuya secuencia es predecible
y complementaria. El resultado son dos
moléculas de ADN nuevas, cada una
con una hebra nueva y la otra vieja.
Este proceso se denomina
REPLICACIÓN SEMICONSERVATIVA

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- Bidireccional: la replicación empieza en un punto de origen llamado “origen de

replicación” (secuencia determina en un lugar determinado del gen) y normalmente
avanza de forma bidireccional. La replicación es un proceso altamente coordinado,
en el que las cadenas parentales se desenrollan y replican simultáneamente.
Cuando se separan las dos hebras complementarias de ADN en el origen de
replicación, se abre la “burbuja de replicación” que posee dos “horquillas de
replicación” (los 2 puntos donde la burbuja se une a la parte enrollada y unida de la
molécula) en cada extremo de la burbuja, que avanzan en direcciones opuestas
produciendo una extensión de esa burbuja de replicación

Horquilla de replicación
5´3´
´ ´

5´
3´
5´

5´
3´ 5´

3´ 5´
´
Cebador
Burbuja de replicación Fragmentos de Okazaki

- Semidiscontinua: una de las cadenas es sintetizada de modo continuo y la otra de

modo discontinuo. La cadena continua, o cadena conductora o líder, es aquella
cuya síntesis en dirección 5´→ 3´transcurre en el mismo sentido que el movimiento
de la horquilla de replicación. La cadena discontinua, o cadena rezagada, es aquella
cuya síntesis en dirección 5´→ 3´transcurre en dirección opuesta a la dirección del
movimiento de la horquilla (llamada “punto hacia atrás”) y se sintetiza en fragmentos
de Okazaki.
Hebra conductora:
sintetizada en forma
continua

Hebra rezagada:
sintetizada en forma
discontinua

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Fragmentos de
ADN más
recientemente
sintetizados

Hebra
Hebra rezagada
conductora
↓
↓
La polimerización ocurre en La polimerización ocurre en la
dirección opuesta a la misma dirección que la
apertura de la horquilla apertura de la horquilla
Se abre como un cierre en
esta dirección

Replicación del ADN en procariotas

Topoisomerasas (I y II), estas
enzimas se encuentran por
Cadena conductora molde delante de la horquilla, cortan
la molécula de ADN, permiten
Abrazadera deslizante
que se alivie la tensión y
ADN polimerasa sobre la vuelven a unir los extremos
Cadena recién sintetizada cadena conductora

El próximo fragmento de Okazaki empieza aquí

Cebador de ARN
ADN helicasa
Primosoma
Fragmento de Okazaki nuevo ADN primasa

Proteínas de unión a ADN

Cadena rezagada molde
monocatenario (SSB)
Cargador de la abrazadera

ADN polimerasa sobre la cadena rezagada

En la horquilla actúan dos moléculas de ADN polimerasa, una en la cadena conductora y la

otra en la retrasada. La hélice de ADN se va abriendo mediante la acción de la Helicasa, que
se va desplazando por las cadenas que tiene por delante. La apertura de la hélice está

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favorecida por moléculas de proteínas de unión cooperativa al ADN monocatenario (las SSB).
Mientras que la molécula de ADN polimerasa que actúa sobre la cadena conductora puede
proceder de una forma continua, la que actúa sobre la cadena retrasada (o rezagada) ha
de volver a empezar a intervalos, usando como cebador cortos segmentos de ARN
sintetizados por una molécula de ADN primasa.
La eficiencia de la replicación aumenta notablemente gracias a la estrecha asociación de
todos estos componentes proteicos.

En procariotas, la molécula de primasa se une directamente a la ADN helicasa, formando

un complejo sobre la cadena rezagada, denominado primosoma. El primosoma se desplaza
con la horquilla y a medida que va avanzando va sintetizando cebadores (o primers) de
ARN (10 nucleótidos). De forma similar, la molécula de ADN polimerasa que sintetiza ADN
sobre la cadena retrasada se desplaza de forma coordinada con el resto de las proteínas,
sintetizando una sucesión de nuevos fragmentos de Okazaki.

la ADN pol no puede sintetizar una cadena

polinucleotídica desde cero, por este motivo la ADN
primasa le da la condición de partida.

Esta enzima es una ARN polimerasa, que sintetiza un

cebador de ARN con el fin de generar un extremo 3´OH
libre, a partir del cual la ADN pol si puede iniciar su
actividad

La ADN primasa tiene capacidad de generar una cadena

de novo pero no tiene capacidad autocorrectora

Parece que, para acomodar este Cadena

ordenamiento, la cadena retrasada ADN polimerasa sobre
conductora molde
la cadena conductora
se va plegando de nuevo (como
observamos en la imagen). Este Cadena recién
ordenamiento también facilita la sintetizada ADN helicasa
unión de la abrazadera de la ADN primasa
Proteínas
polimerasa cada vez que se sintetiza SSB
un fragmento de Okazaki: el Cadena retrasada molde
cargador de la abrazadera y la ADN
polimerasa de la cadena rezagada se
mantienen en su lugar como parte de
Cebador Cargador de
la maquina proteica, incluso cuando Fragmento de la abrazadera Cadena recién
de ARN
se separan del ADN. Asi pues, las Okazaki nuevo sintetizada
proteínas de replicación se
ADN polimerasa sobre la cadena retrasada
mantienen unidad formando una
gran unidad que se desplazará rápidamente a lo largo del ADN, permitiendo su síntesis en
las dos direcciones de la horquilla.

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Luego, la ADN polimerasa I remueve el cebador y la ligasa sella la muesca.

Esta muesca se debe a que los extremos de este

La porción de ARN espacio (3´OH y 5´P) no se encuentran energizados.
debe ser removida La ADN pol no puede concluir esta unión pero la
debido a la alta ADN ligasa sí
probabilidad de error

Esta puede, utilizando el ATP como sustrato,

energizar el extremo 5´de esa muesca, generar
una unión fosfato de alta energía, y a partir de
esta, producir la unión covalente 5´→ 3´, sellando
la muesca

ADN polimerasas en procariotas

I II III
Gen estructural Pol A Pol B Pol C (dna E)
Subunidades I >4 >10
Todas tienen capacidad
Mr 103000 88000 830000
autocorrectora
Actividad SI SI SI
exonucleasa 3´→ 5
Actividad SI NO NO
exonucleasa 5´→3´
Sirve para eliminar los
cebadores Velocidad de 16-20 N/s 40 N/s 250-1000 N/s
polimerización
Procesividad 3-200 1500 >500.000
(nucleótidos
añadidos antes de
la disociación de
la polimerasa)

- I: elimina el cebador (actividad exonucleada 5´→ 3´); función de reparación junto

con la ADN polimerasa II
- II: reparación
- III: es la principal encargada de duplicar el ADN (la de mayor procesividad)

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Replicación del ADN en eucariotas

Cadena conductora de patrón

ADN polimerasa δ
Cadena recién
sintetizada

Fragmento Cebador
de Okazaki de ARN
nuevo ADN helicasa
Abrazadera
deslizante ADN polimerasa α / primasa

Cargador de la abrazadera
ADN
polimerasa δ

En eucariotas, las máquinas de replicación están formadas por más componentes proteicos
que en las células procariotas, a pesar de que las funciones básicas son las mismas.

Así, por ejemplo, la proteína de unión a ADN monocatenario (SSB) en eucariotas está
formada por tres subunidades, mientras que en bacterias solamente tiene una subunidad.
De forma similar, la ADN primasa se incorpora a una enzima con varias subunidades llamada
polimerasa α. La polimerasa α empieza cada fragmento de Okazaki en la cadena retrasada
con ARN y luego alarga este cebador de ARN con un corto fragmento de ADN, antes de
ceder el extremo 3´de este cebador a una segunda enzima, la ADN polimerasa δ. Esta
segunda ADN polimerasa sintetiza entonces el resto de cada fragmento de Okasaki con la
ayuda de una proteína abrazadera.

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En eucariotas hay múltiples orígenes de replicación (ORI), ya que estas células tienen
moléculas de ADN más grandes y sus polimerasas tienen menos procesividad.
Las horquillas de replicación se forman de a pares y
generan una burbuja de replicación a medida que
se van desplazando en direcciones opuestas desde
un punto de origen común. Solamente se detienen
cuando chocan con otra horquilla de replicación que
se desplaza en dirección opuesta 8º cuando llegan al
fin del cromosoma)

Diferencias con procariotas

 Las polimerasas se nombran α y δ, en lugar de I, II y III (en procariotas)

 La cadena rezagada utiliza dos ADN polimerasas
 No hay primosoma, la ADN polimerasa α tiene una subunidad que actúa como
primasa
 Cromosoma bacteriano → circular → 1 solo origen de replicación
 Cromosoma eucariota → lineal → múltiples orígenes de replicación

Enzimas y factores comprometidos en la replicación de ADN en eucariotas

Proteína Función
Helicasa (prot desenrollante) Separa las 2 hélices por ruptura de los
puentes de que mantienen apareadas
las bases
Topoisomerasas I y II Producen cortes en las cadenas de
doble hélice por delante de la horquilla
de replicación, para aliviar las tensiones
creadas por el desenrollamiento
Proteínas SSB o proteína A de Se fija a las hebras separadas del ADN
replicación (RPA) origina e impide su reasociación
(autocomplementación)
Primasa (asociada a polimerasa α) Cataliza la síntesis de ARN iniciador o
“primer”, de unos 10 nucleótidos
ADN polimerasa α Cataliza la síntesis de un trozo de ADN
de unos 20 nucleótidos a continuación
del cebador
Factor C de replicación (RFC) Desplaza el complejo polimerasa α-
primasa. Fija PCNA
Antígeno nuclear de células proliferantes Estructura en anillo que fija la polimerasa
(PCNA) δ y asegura la síntesis ininterrumpida

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ADN polimerasa δ Cataliza la síntesis de ADN a

continuación del iniciador producido
por la polimerasa α-primasa. Tiene
activada exonucleasa 3´→ 5´
ARNasa H1 Eliminan los trozos de ARN iniciador
Nucleasa FEN 1
ADN ligasa Une, mediante enlaces fosfodiéster
3´→5´, los segmentos del ADN
neoformado (muescas)

Reparación y recombinación del ADN

La estructura de doble hélice del ADN es muy adecuada para la reparación porque lleva
dos copias separadas de toda la información genética, una en cada una de sus dos
cadenas. Así, cuando se daña una de las cadenas, la cadena complementaria retiene una
copia intacta con la misma información y esta copia generalmente es utilizada para
restaurar la secuencia correcta de nucleótidos en la cadena dañada.

Alteraciones espontáneas que requieren reparación del ADN

 Ataques hidrolíticos
 Oxidaciones
 Mutaciones

Si estas alteraciones no se reparan, nuestra información genética (genoma) cambiaría

rápida y permanentemente.

Alteraciones espontáneas más frecuentes

- Desaminación: por hidrólisis espontánea de un grupo amino y posteriormente la

transformación de una base en otra

- Depurinación: por hidrólisis espontánea o remoción de una base nitrogenada,

obteniendo un azúcar depurinado.

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Otra alteración común es:

Formación de dímeros de pirimidinas Unión covalente entre pirimidinas

adyacentes, muchas veces ocasionada
por exposición a luz ultravioleta

Dímeros de timina son los más

comunes o unión covalente con el
hidrocarburo benzopireno

Si las alteraciones no se reparan pueden generar cambios permanentes en una secuencia

de ADN

↓
Mutaciones

Cada célula tiene muchos sistemas de reparación del ADN, cada uno de los cuales tiene sus
propias enzimas y preferencias por el tipo de alteración que reconocen. Muchos de estos
sistemas utilizan la cadena no alterada de la doble hélice como patrón para reparar la
cadena dañada.

Las vías de reparación más comunes son la reparación por escisión de base y la reparación
por eliminación de nucleótidos. En ambos casos, la porción del ADN dañada es eliminada,
se restablece la secuencia original de ADN mediante una ADN polimerasa que utiliza la
cadena no dañada como patrón y la rotura que queda en la doble hélice se sella mediante
la ADN ligasa. Se diferencian en cómo se elimina la alteración de la cadena de ADN.

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Reparación por escisión de bases → para reparar desaminación y depurinación

Todas las células contienen una clase de enzimas denominadas ADN glucosilasas que
reconocen lesiones del ADN muy frecuentes y eliminan la base afectada rompiendo el
enlace N-glucosídico. El corte crea sitios apurínicos o apirimidínicos en el ADN,
normalmente conocidos como sitios AP. Una vez formando un sitio AP otro tipo de enzimas
ha de repararlo. La reparación no se realiza simplemente insertando una nueva base y
estableciendo de nuevo en el enlace N-glucosídico. En su lugar, la desoxirribosa 5´-fosfato
restante es eliminada y reemplazada por un nuevo nucleótido. Este proceso empieza con
enzimas denominadas endonucleasas AP, que cortan la cadena de ADN que contiene el
sitio AP.

Luego de la eliminación del segmento de ADN, este es reemplazado por la ADN polimerasa
y la muesca es sellada por la ADN ligasa.

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Reparación por escisión de nucleótidos → para reparar alteración por formación de dímeros de pirimidina
Las lesiones que producen grandes distorsiones en la estructura helicoidal del ADN se
reparan mediante el sistema de escisión de nucleótidos.
En esta vía existe un gran complejo multienzimático que rastrea el ADN buscando, más que
cambios específicos de bases, distorsiones en la doble hélice.
Después de que el complejo reconoce la lesión, como un dímero de pirimidina, una
endonucleasa produce un corte a cada lado de la lesión y una ADN helicasa asociada
elimina toda la porción de la cadena dañada. En las bacterias, este complejo
multienzimático deja un hueco de 12 nucleótidos; en humanos, el número de nucleótidos
eliminados es más del doble.
Luego, la ADN polimerasa rellena el espacio y la ligasa sella la muesca

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Rupturas en la doble cadena

Se produce por exposición de la célula Existen 2 mecanismos de

a radiaciones ionizantes/agentes reparación
oxidantes
↓
Metabolitos que ellas mismas
producen

Mecanismos de unión de Reconstrucción homóloga

extremos no homólogos

Unión de extremos no Solo sirve si los

homólogos cromosomas han duplicado
su ADN (posterior a
duplicación-previo a división
Unión de extremos no homólogos celular)
Se procesan a partir de
proteínas accesorias de 1 cromosoma una vez que son
procesados
Se usa a la cromátide
El fragmento roto puede hermana para reparar la
llegar a unirse a otro ruptura, usándola como
Se ligan los extremos con molde y a través de un
fragmento y provocar
pérdida de algún nucleótido proceso de recombinación
alteraciones cromosómicas

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