BACTERIOLOGÍA

CITOLOGÍA BACTERIANA
Las bacterias son los microorganismos de menor tamaño (1 micrómetro aprox) que contienen la
maquinaria necesaria para crecer y autorreplicarse a expensas de los alimentos. Las bacterias
carecen de un núcleo organizado, por lo cual son procariotas; su material nuclear está constituido de
ADN pero carece de membrana nuclear y de sistema mitótico (el aparato mitótico comprende el huso
y los ásteres que rodean a los centríolos; el áster aparece como un grupo de microtúbulos radiales
(microtúbulos astrales) que convergen hacia el centriolo, alrededor del cual se observa una zona
clara llamada centrosoma), de un nucléolo y de los típicos cromosomas, ya que poseen un
cromosoma único de aprox 1 mm de longitud cuando está desenrollado y la cromatina no presenta
las histonas básicas. El cromosoma se encuentra insertado en un punto de una invaginación de la
membrana celular, el mesosoma (mesosoma tabicado, forman paredes transversas durante la
división celular; mesosomas vesiculares o laterales intervienen en la función de secreción).
Estructuras citoplásmicas
- Inclusiones: las bacterias almacenan materiales de reserva en forma de gránulos
citoplásmicos insolubles, que constituyen la fuente de carbono para la síntesis de proteína y
ácidos nucleicos.
- Ribosomas: están compuestos de dos subunidades, una de 50S (cociente de sedimentación)
y otra de 30S.
Estructuras externas
Según la capacidad de retener un colorante o no:
Gramnegativas: tienen tres capas, una interna, la membrana citoplasmática, una capa delgada, la
pared celular, y una capa externa, membrana externa o capa L.
Grampositivas: presentan dos capas, la membrana citoplasmática y la pared celular gruesa.

Memb. plasmática Pared celular Memb. externa

Gramnegativa 75 A° 20 a 30 A° 60 a 180 A°

Grampositiva 75 A° 200 a 800 A° -

Membrana celular
Típica de fosfolípidos y proteínas, se distingue de la membrana celular de las eucariotas por la
ausencia de esteroles, siendo la única excepción los Mycoplasmas, que los incorporan en sus
membranas al crecer en medios que contienen esteroles. La membrana citoplásmica constituye una
barrera osmótica, atravesada por sistemas de transporte con permeabilidad selectiva y transporte de
solutos hacia el interior de la célula. En la membrana se hallan enzimas con distintas funciones.
Pared celular
Externamente y rodea la membrana celular. Ésta membrana debe su fuerza a una envoltura
compuesta por mureína o peptidoglucano, y su composición es igual en bacterias grampositivas
como en gramnegativas.
Grampositivas contienen en su pared:
- Ácido teicoico y ácido lipoteicoico: constituye el Ag primordial de superficie.
- Polisacáridos
Gramnegativas contienen polímeros que están por fuera de la envoltura de peptidoglucano:
- Lipoproteína: entrecruzan la membrana exterior y el peptidoglucano.
- Membrana exterior: es una doble capa de fosfolípidos y bloquea la penetración de moléculas
grandes (resistencia a muchos antibióticos).
- Lipopolisacárido (LPS): consiste en un complejo lípido, lípido A, responsable de su toxicidad,
al cual se le fija un polisacárido responsable de la antigenicidad, constituido por un centro
“core” y una serie terminal de unidades repetidoras que forman una especie de piel molecular
 sobre la superficie celular y representa un Ag principal de superficie de la célula bacteriana,
Ag O. Es extremadamente tóxico para los animales.
Al LPS se lo denomina una endotoxina y solo es liberado cuando la bacteria es lisada.

Ácido alcohol resistentes

Contienen un ácido micólico (ramas de un ácido graso de cadena larga) que está covalentemente
unido por medio de un polisacárido al peptidoglucano. Aparecen otros ácidos micólicos en una fina
membrana serosa por fuera de la pared de peptidoglucano. En este grupo se encuentran las
micobacterias, nocardias y corinebacterias.

Cápsula
Células encapsuladas forman colonias lisas o mucoides, y las no encapsuladas colonias rugosas.
La cápsula protege frente a la fagocitosis por las células blancas de la sangre (fagocitos). Están
compuestas su mayor proporción por complejos de polisacáridos con mucina.
Flagelos
Apéndices filiformes, finos, ondulados y largos (de 3 a 12 micrómetros), compuestos por proteína
(flagelina) y no pueden verse en microscopio óptico a menos que se empleen técnicas de coloración
especiales. Órganos responsables de la locomoción bacteriana. Origen en cuerpo basal en la
membrana citoplásmica
.

Pili o fimbria
Presentes en muchas bacterias gramnegativas. Apéndices superficiales rígidos, más cortos y finos
que los flagelos, y constan solo de proteína (pilina). Origen en cuerpo basal en la membrana
citoplásmica.
Pilis sexuales aquellos involucrados en la conjugación bacteriana y pilis comunes relacionados con
la adherencia celular. Los estreptococos (grampositivos) poseen una capa exterior de fimbrias
proteicas extendidas llamada proteína M y resulta el principal Ag de superficie de estas bacterias y es
esencial para su establecimiento en el hospedador.

Estructura Función Composición química predom.

Flagelo
Pili Movimiento Proteína
Pili sexual Media la transferencia de ADN Proteína
durante conjugación

Pili fimbria Adhesión a superficie Proteína

Cápsula Adhesión a superficie, Polisacárido

protección contra fagocitosis y
contra desecación

Pared celular
Gram+ Previene lisis osmótica del Peptidoglucano (mureína) complejo
protoplasto y da rigidez y forma con ácido teicoicos.
Gram- Previene lisis osmótica del Peptidoglucano (mureína) rodeado de
protoplasto y da rigidez y forma fosfolípidos y membrana externa
proteica y lipopolisacárida

Membrana plasmática Barrera de permeabilidad, Fosfolípidos y proteínas

transporte de solutos,
generación de energía,
sistemas enzimáticos

Ribosomas Sitio de síntesis proteica ARN y proteína

Inclusiones Reservas de nutrientes y Variable, carbohidratos, lípidos,

funciones especializadas proteínas o sustancias inorgánicas
 Cromosoma Material genético de la célula ADN

Plásmido Material genética ADN

extracromosómico

Clasificación bacteriana según morfología:

- Cocos: bacterias esféricas (diplococos-de a pares; estreptococos- cadenas; estafilococos-
agrupados irregularmente)
- Bacilos: bacterias en forma de bastón
- Espirilos: bacilos retorcidos sobre su eje longitudinal y cumplen varias vueltas alrededor de
su eje (Leptospira, Campylobacter)
- Vibriones: semejante a bacilo pero de forma retorcida sobre su eje longitudinal, no alcanzan
a cumplir una vuelta completa alrededor de su eje.
Tamaño: organismos esféricos miden promedio 0,8 a 1 micrómetro de diámetro y los bacilos miden
de 1,0 a 1,5 micrómetros de ancho por 2 hasta 8 micrómetros de longitud.

Endosporas (esporas)
Bajo causa de deficiencia nutricional, cada célula forma una única espora interna la cual es liberada
cuando la célula progenitora sufre autolisis. Es una forma de resistencia bacteriana.
Lo que detiene el crecimiento de estas bacterias y dispara la esporulación es un estado de inanición,
de carencia de nutrientes. El nutriente limitante que puede desencadenar la esporulación puede ser:
la fuente de carbono, la fuente de nitrógeno o incluso la carencia de fosfatos.
Las esporas son células (unicelulares) deshidratadas, resistentes al calor, condiciones ambientales
adversas y agentes químicos.
Básicamente lo que hace la bacteria es concentrar su ácido nucleico, formar un compuesto muy
estable (dipicolinato de calcio) que protege al ácido nucleico y comienza a formar unas capas de tal
forma que queda un esporo con un centro donde está el material nuclear y una envoltura con una
pared, una corteza y una capa o cubierta; y por fuera el exosporio.
La espora puede no modificar el cuerpo bacteriano, o si es más grande que éste, lo modifica.
Ej de bacterias formadoras de esporas: bacilos grampositivos aerobio estricto Bacillus (no lo
modifica) y anaerobio estricto Clostridium (lo modifica, subterminales)
Proceso de esporulación (mecanismo de reproducción asexual a través de esporas y endosporas;
este tipo de reproducción es usual en hongos, plantas y diversos géneros de bacterias y
microorganismos; consiste en una serie de divisiones del núcleo que se rodean de porciones de
citoplasma y de membrana. Al romperse la membrana de la célula originaria quedan en libertad
numerosas células, llamadas esporas): comienza cuando condiciones nutricionales son
desfavorables, activándose genes para la formación de ésta y desactivándose con función vegetativa
(en su morfo normal). Se inicia la formación con la migración de una región nuclear condensada
hacia uno de los extremos de la célula. Junto con un crecimiento invaginante de la membrana celular
se produce una estructura membranosa doble, éstas dos membranas de la espora formarán lo que
es la envoltura celular (pared de la espora, corteza y capa), todas junto con el núcleo forman parte
del endosporio. El exosporio se encuentra por fuera de las membranas.
Núcleo o centro: es el protoplasto de la espora, tiene un cromosoma, el aparato sintetizador de
proteínas y un sistema generador de energía basado en degradación de la glucosa.
Envoltura: a) Pared de la espora: capa más interna que rodea a la membrana interna de la espora, se
transforma en la pared celular de la célula vegetativa germinante; b) Corteza: entre la pared de la
espora y la capa; c) Capa o cubierta: compuesta de una proteína similar a la queratina, debido a su
impermeabilidad es responsable de la resistencia.
Exosporio: proteína de membrana que contiene algo de glúcidos.

Proceso de germinación (proceso por el cual las esporas pasan a formar células vegetativas, ocurre
cuando se las coloca en el medio adecuado y se requiere en muchos casos la disponibilidad, entre
otros, de glucosa, aminoácidos y nucleótidos): consta de tres etapas:
1) Activación: las esporas germinan si es dañada su pared por algún medio (ácido, calor,
abrasión, lesión mecánica o química en la corteza o por acción de una enzima), y así permitir
que la célula capte agua y pierda su elevado contenido en Ca dipicolinato (que genera más
resistencia).
 2) Iniciación: una vez activada inicia la germinación si las condiciones ambientales son
favorables. Se capta agua, se libera el dipicolinato cálcico y varios constituyentes de la
espora son degradados por enzimas.
3) Excrecencia: la degradación de la corteza y de las capas exteriores resulta en la aparición de
una nueva célula vegetativa que consiste en el protoplasto (se refiere al primer cuerpo
organizado de una especie, es una célula de planta, bacteria u hongo que ha perdido total o
parcialmente su pared celular) de la espora con su pared circunvecina.

Reproducción asexual
Por fisión binaria. En este proceso cada célula incrementa su tamaño y se divide en dos células
iguales. Durante esta reproducción hay incremento ordenado de las estructuras y componentes
celulares, replicación del ADN bacteriano y formación de un septum que divide a la célula en dos. La
molécula de ADN está unida a un punto de la membrana donde se replica; las dos moléculas de ADN
permanecen unidas al punto de la membrana hasta que el septum es sintetizado entre ambos puntos
y así quedan separados los dos cromosomas en compartimentos distintos. El tiempo requerido para
que la célula se divida se llama tiempo de generación, y varía entre 15 min hasta varios días.

GENÉTICA MICROBIANA
Cromosoma bacteriano
El material genético de las bacterias está constituido por una única molécula de ADN, doble cadena,
generalmente circular, que almacena la información necesaria para llevar a cabo la biosíntesis de
todos sus componentes. Las bacterias suelen poseer genes auxiliares, presentes en los plásmidos,
elementos también circulares y bicatenarios, pero de menor tamaño que el cromosoma bacteriano.
Estructura del ADN
- Estructura primaria: las moléculas de ADN son de doble cadena con bases complementarias
(compuestas por una purina y una pirimidina). Existe una polaridad en las cadenas, ya que
una cadena del ADN posee una terminación libre 3’ en uno de sus extremos y una
terminación 5’ libre en el otro extremo.
- Estructura secundaria: la estructura clásica del ADN es una hélice formada por dos cadenas.
 - Estructura terciaria: el ADN bicatenario circular cerrado no posee extremos libres, por lo que
el número de veces que las dos cadenas se enrollan una alrededor de la otra no se modifica.
Se produce un superenrollamiento de la molécula de ADN para que el cromosoma bacteriano
pueda acomodarse en el interior del citoplasma, con actividad enzimática de las
topoisomerasas I y II.
Replicación del ADN
Tres etapas:
1) Iniciación: depende de la concentración de determinadas proteínas que forman un complejo
multienzimático que se desplaza a lo largo del ADN. Para que las cadenas de ADN sean
copiadas, la hélice tiene que estar desenrollada en la zona que se está duplicando, para eso
las topoisomerasas alivian el superenrollamiento en el punto de origen en una cadena de
ADN, esto permite la entrada de la enzima helicasa capaz de desenrollar el ADN y
exponerlo. El ADN se copia en dirección 5’ > 3’.
2) Elongación: la reacción química central de la replicación del ADN es catalizada por una
enzima, la ADN polimerasa. Todas las polimerasas agregan nucleótidos en la dirección 5’ >
3’ para el crecimiento de la cadena y requieren un molde, un cebador y un
desoxirribonucleósido trifosfato activado.
3) Terminación: la replicación finaliza cuando las dos horquillas se encuentran a 180° desde el
inicio.
Transcripción del ADN
Proceso por el cual mediante la acción de la ARN polimerasa, se sintetizan las moléculas de ácido
ribonucleico (ARN). La transcripción genera tres tipos de ARN principales: ARN mensajero, ARN de
transferencia y ARN ribosomal.
El ARN se diferencia químicamente de ADN por poseer ribosa en lugar de desoxirribosa, tener la
base uracilo en lugar de timina y ser una molécula de tira simple.
Código genético: está contenido en el cromosoma (ADN) de la célula bacteriana y se transcribe de
la molécula de ADN al ARNm; éste es el molde para el ensamblaje de los aminoácidos.
El triplete de bases ARNm (adenina, guanina, citosina y uracilo son las bases presentes en todos los
tipos de ARN) se denomina codón para un determinado aminoácido. Dado que en los nucleótidos
puede haber cuatro bases y en cada codón hay tres, son posibles 64 tripletes diferentes.
Como existen 20 aminoácidos para codificar, la cantidad de codones es mayor que la necesaria para
trasladar la información genética del ARNm a la proteína.
Existen hasta seis codones diferentes que codifican para la síntesis de un aminoácido. De los 64,
algunos que no codifican para la síntesis de aminoácidos se los denomina codones de terminación,
que sirven como señal para detener la síntesis de una proteína, cuando la molécula está totalmente
formada.
La traducción es el proceso por el cual el código del triplete de bases codificado en el ARNm se usa
para dirigir la secuencia de aminoácidos en las moléculas proteicas. El ribosoma es el sitio donde las
moléculas de ARNt leen el código nucleotídico, y la enzima ARNt sintetasa es responsable de
montar las moléculas de ARNt con los aminoácidos correctos para la síntesis de proteínas.
Mecanismos de transferencia genética (tipo de reprod. sexual)
Por conjugación, que consiste en la transferencia unidireccional de material genético entre dos
bacterias (una donante o célula macho y otra receptora o célula hembra), contacto célula a célula, a
través del pili sexual, mediado por factor F (factor de fertilidad que está presente en célula macho);
por transformación, cuando la bacteria incorpora fragmentos de ADN desnudo a partir del medio
que la rodea (células competentes), ésta puede ser inhibida por DNAsa; o transducción, cuando la
incorporación de material genético ocurre por medio de una bacteriófago, cuando un fago infecta una
bacteria capta fragmentos del genoma de la célula hospedadora y los almacena, al lisar e infectar
otra célula hospedadora, el fago puede transferir no sólo sus propios genes sino también genes de la
célula hospedadora de la cual procede.

Mecanismos de reparación de ADN

Para minimizar los errores de replicación:
- La reparación directa del ADN por acción de enzimas que eliminan las lesiones
- Reparación por escisión, que consiste en la separación del segmento de ADN lesionado,
seguida de la síntesis de una nueva cadena de ADN.
- En la corrección de pruebas actúa la ADN polimerasa III, al insertarse un nucleótido
incorrecto durante la polimerización (enzima detecta la base equivocada y la sustituye por la
base adecuada).
- La reparación por recombinación o respuesta SOS, este sistema repara daños no corregidos
por los sistemas anteriores.

Metabolismo microbiano
Conjunto de reacciones químicas catabólicas y anabólicas que ocurren en la célula bacteriana para
desarrollar sus procesos vitales (transforma sustancias nutritivas para obtener energía que se usa en
componentes estructurales, funcionales y reproductivos); entonces el metabolismo consta de dos
fases:
Anabolismo, formación o síntesis de compuestos químicos (biosíntesis); estructurales como proteínas
de membrana y funcionales cómo enzimas. Requiere energía, acciones catalizadas por enzimas y
transforma compuestos simples en complejos;
Catabolismo, degradación o descomposición de compuestos (biodegradación). Libera energía a
través de reacciones degradativas, catalizadas por enzimas y transforma compuestos orgánicos
complejos en simples.
Las reacciones químicas pueden ser exorganicas (liberación de energía) o endorganicas (consumo
de energía).
La manera en que la bacteria conserva energía es por medio de la síntesis de ATP (nucleótido
compuesto por adenina (base nitrogenada), un azúcar (ribosa) y tres grupos fosfato), que se genera
por la fosforilación del sustrato (fermentación), fosforilación oxidativa y fotofosforilación.
Existen sistemas multienzimáticos (enzimas funcionando secuencialmente, cadena de reacciones de
alguna vía metabólica) presentes en la membrana celular las cuales componen la cadena respiratoria
(proceso de respiración ocurre en membrana celular).

Factores que influyen en la actividad enzimática: T°, pH, sustrato (sobre qué actúa la enzima),
producto final, genética (genéticamente la bacteria debe tener la posibilidad de generar esa enzima).

Existen tres vías para la producción de ATP:

1)Fermentación: en referencia a aquellos microorganismos que producen su ATP en ambientes
anaerobios (sin O2), y lo reemplaza por nitrato o sulfato como aceptor final de e-; son heterótrofos.
2)Respiración: para producir su ATP necesitan del O2, da como producto final CO2 y H2O; son
heterótrofos.
3)Fotosíntesis: son autotróficos, no necesitan del medio ambiente para producir sus compuestos
carbonados.

De acuerdo con los requerimientos de oxígeno las bacterias se clasifican en:

Aerobios obligados: requieren oxígeno para el crecimiento, pues dependen de este elemento para
cubrir sus necesidades energéticas; no proliferan en condiciones de anaerobiosis (Mycobacterium
bovis)
Anaerobios obligados: crecen en ausencia total de oxígeno, obtienen su energía de reacciones
fermentativas. Utilizan CO2 como aceptor final de e- (Clostridium tetanis)
Anaerobios facultativos: crecen en presencia o ausencia de oxígeno. Utilizan O2 como aceptor final
de e-, cuando hay ausencia la energía la obtienen por fermentación (Estreptococos, estafilococos y
alguna enterobacteria cómo Escherichia coli)
Anaerobios aerotolerantes: (toleran la presencia de O2) pueden crecer en ausencia o presencia de él
pero la energía la obtienen por fermentación (algunas especies de Clostridium)
Microaerófilos: crecen con bajas tensiones de O2 porque las altas tensiones son tóxicas para este
tipo de microorganismos (algunos Estreptococos)
Capnófilos: bacterias que se desarrollan mejor en presencia de CO2.

Nutrición bacteriana
Los elementos químicos del ambiente que son utilizados para el crecimiento bacteriano se
denominan nutrientes.
Requerimientos básicos para síntesis de proteínas y ácidos nucleicos:
Fuente de energía: puede ser la luz solar o artificial, sustancias inorgánicas (azufre, monóxido de
carbono, amonio) o sustancias de materia orgánica (h d c, proteínas y lípidos). Según sus
requerimientos energéticos las bacterias se clasifican en:
- Fototrofas (fotosintéticos): luz como fuente de energía
- Litotrofas: utiliza compuestos inorgánicos simples (hábitat común incluye roca de volcanes,
agua de mar, etc)
 - Autótrofas: usan carbono como única fuente en forma de CO2. Sintetizan glucosa a partir de
una fuente inorgánica de carbono y oxígeno (dióxido de carbono) y una fuente de hidrógeno
(agua, gas sulfhídrico, hidrógeno)
- Heterótrofas (quimiorganotróficas): usan el carbono a partir de compuestos orgánicos.
Requieren la presencia de una fuente de carbono orgánica preformada en su medio de
cultivo, como sustrato oxidable para la producción de energía (ATP). La glucosa es la fuente
de carbono más común, otros azúcares como galactosa, manitol, lactosa, rafinosa,
aminoácidos y lípidos también son utilizados como fuente primaria o alternativa de carbono.
Nitrógeno: obtenido del gas nitrógeno, urea, amonio, nitratos o sustancias nitrogenadas como
proteínas o ácidos nucleicos. Representa el 14% del peso seco del organismo, es constituyente de
coenzimas, nucleótidos, aminoácidos y ácidos nucleicos.
Carbono: utilizado en forma de monóxido o dióxido de carbono, metano o compuesto de material
orgánico, para fuente de energía. Representa el 50% del peso seco del organismo.
Oxígeno: representa el 20% del peso en seco microbiano, su fuente de obtención es el agua,
compuestos orgánicos, dióxido de carbono, y el O2 ambiental. Es parte constituyente del agua
intracelular y es el aceptor de e- en la respiración aeróbica. Sobre la base de la utilización del
oxígeno las bacterias se pueden clasificar.

Factores de crecimiento:
Para algunas bacterias, la falta de factores de crecimiento puede producir un bloqueo o desaparición
de caminos metabólicos que imposibilita el crecimiento celular, y son compuestos orgánicos
elementales que son incapaces de sintetizar a partir de variados nutrientes:
- Aminoácidos: constituyentes elementales para la síntesis de proteínas
- Bases púricas y pirimídicas: requeridas para síntesis de ácidos nucleicos
- Vitaminas: necesarias como coenzimas y como grupo funcional de ciertas enzimas
En relación con factores de crecimiento se distinguen dos tipos de microorg:
1) Prototrofos: microorg que sintetizan sus propios factores de crecimiento
2) Auxótrofos: microorg que requieren una fuente exógena de factores de crecimiento debido a
su incapacidad para elaborarlos

Reproducción bacteriana
a) Reproducción binaria o fisión o bipartición, la forma de reproducción más común (se duplica ácido
nucleico, comienza a invaginarse la membrana celular hasta dividirse y se obtienen dos células
exactamente iguales).
b) Reproducción parasexual (para=semejante); intercambio de material genético con otra bacteria
mediante tres mecanismos: transformación, transferencia directa del ADN, conjugación, mediada
por plásmidos y transducción, mediada por fagos.
Tiempo de reproducción: en condiciones favorables, la mayoría de las bacterias lo hacen entre 15 y
20min.

OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA
En fresco
Método que permite observar bacterias vivas y analizar:
- Morfo verdadera
- Agrupación
- Motilidad
- Reproducción (según técnica empleada)
No determina estructura ni constitución química de la bacteria.

Previa coloración
La observación microscópica previa coloración es con bacterias muertas (morfo alterada debido a
métodos de fijación empleados y aplicación de colorantes, no se observa motilidad ni reproducción).
Sí analizamos:
- Estructura
- Constitución química

Microscopio simple: formado por un lente convergente, que genera una imagen agrandada del objeto.
Cuando crecen bacterias en el laboratorio en medio de cultivo sólido se desarrollan en forma de
colonias que son observables por microscopio simple.
Microscopio compuesto: posee dos lentes, una lente inferior en el objetivo y otra lente superior en el
ocular.
Microscopía electrónica (de barrido y de transmisión)
Observación microscópica:
Simple: entre porta y cubreobjetos; por ej una gota de orina sobre el portaobjetos y le ponemos el
cubreobjetos. Observamos la morfo del microorganismo (cocos o bacilos), vemos la movilidad, su
agrupación y la reproducción.
Portaobjetos de Koch: posee una depresión central
Célula de Boettcher: depresión central con fondo plano
Célula de Ranvier: posee una saliencia en forma de cilindro adherido a superficie del portaobjetos.

TINCIÓN
La tinción nos permite tener una idea general sobre las distintas estructuras celulares detectables y
su constitución química.
Sustancias colorantes (sustancias que poseen color y con capaces de transmitirlo a otros elementos):
Violeta de genciana; Safranina; Azul de metileno; Fucsina fenicada de Ziehl
Sustancias coloreadas (productos que poseen color pero son incapaces de transmitirlo a otros
elementos): Rojo de fenol; Rojo de metilo; Azul de bromotimol y Fucsina ácida.

Caract. coloración simple

a) Simple: técnica que emplea un solo colorante (todos los elementos en muestra toman mismo
color)
b) Directa: solo el colorante actúa sobre la muestra
c) Progresiva: cuanto más tiempo se aplica el colorante en la muestra, más tiñe

Caract. coloración compuesta

a) Compuesta: emplea dos colorantes, primero se aplica el colorante principal, que es tomado
y retenido por bacterias positivas; luego colorante de contraste o secundario que es tomado
por bacterias negativas.
b) Indirecta: incluye el uso de un mordiente que incrementa la fijación del colorante principal al
material (Lugol para Gram, ácido fénico y calor para Ziehl)
c) Regresiva: se aplica decolorante para eliminar el colorante principal de las estructuras que
lo han tomado pero que no son capaces de retenerlo, con lo cual se permite la toma del
colorante secundario. Así se diferencian bacterias positivas y negativas (ej decolorantes,
alcohol, alcohol acetona para Gram, alcohol ácido para Ziehl).

Pasos previos a tinción:

1) Extendido (colocación de la muestra en portaobjetos, siguiendo regla de esterilidad y
bioseguridad)
Objetos y pasos a realizar cerca del mechero, donde se supone que está la zona estéril:
Se seca el portaobjeto
Se marca la zona y se rotula
Se esteriliza el ansa (primero en parte azul de la llama de menos temperatura hasta que se pone roja
el ansa y después subo hasta lo naranja de la llama unos segundos más donde hay mayor
temperatura)
Se agrega solución fisiológica estéril (o agua estéril), una gota con el ansa en el portaobjetos
Se esteriliza nuevamente el ansa
Se toca una colonia
Se realiza el extendido
Se esteriliza nuevamente el ansa
2) Secado (elimina exceso de líquido de muestra pero no mata a las bacterias, ya que una
bacteria deshidratada no es una bacteria muerta), al calor de la llama del mechero (no sobre
la llama).
3) Fijado: sí se produce la muerte de bacterias por degradación de sus proteínas somáticas por
acción de un agente químico o físico; ejemplo clásico de fijador físico es el método de Koch
(tres pasajes sobre la llama del mechero). Ej químico es el metanol al 95% durante 1 min
(deforma menos los somas bacterianos).

Tinciones ácido resistentes (BAAR)

(Mycobacterium tuberculosis y parásitos como Cryptosporidium)
Bacterias con envolturas compuestas de ácidos grasos de cadenas largas (ácidos micólicos) actúan
como una barrera que impide el ingreso del cristal violeta y otros colorantes básicos.
Por calentamiento o uso de detergentes puede penetrar el colorante primario; una vez que ingresa
por la fuerza, la bacteria no puede ser decolorada por la mezcla alcohol ácido y queda pintada.

Métodos de rutina
1) Simple
Materiales: solución hidroalcohólica de azul de metileno
Técnica: extendido, secado y fijado clásicos
Coloración: azul de metileno 1 min. Lavado con agua, secado y observación
Interpretación: todas las bacterias se tiñen con colorante aplicado

2) Pasos tinción GRAM

Colorante principal: cristal violeta (violeta de genciana)
Mordiente: solución de Lugol
Decolorante: alcohol acetona
Colorante secundario: safranina
Técnica: extendido, secado y fijado clásicos
Coloración: 1ero cristal violeta (1 min); lavo con agua; lugol (1 min); lavo con agua; alcohol acetona
(10 seg); lavo con agua; 2do colorante safranina (45 seg); lavo con agua, secado y observación.
Interpretación: positivos color violeta, negativos color rojo.

3) Ziehl Neelsen
Colorante principal: fucsina fenicada de Ziehl (agregado de ácido fénico)
Decolorante: alcohol ácido
Colorante secundario: solución acuosa de azul de metileno
Técnica: extendido, secado y fijado clásicos
Coloración: 1ero fucsina fenicada de Ziehl (en caliente, con hisopo largando llama hasta hasta
desprendimiento de vapores*) tres veces en 5 min; lavado con agua; alcohol ácido 2 min; lavado con
agua; azul de metileno 1 min; lavado con agua, secado y observación.
Interpretación: positivos color rojo, negativos color azul

*
4) Kinyoun (técnica que se realiza en frío, positivos rojo y negativos azul)

Métodos especiales
1) Hiss (para visualizar la cápsula bacteriana)
Colorante: violeta de genciana
Solución de lavado: solución de sulfato de cobre
Técnica: extendido, secado al aire, fijado no por calor
Coloración: 1ero violeta de genciana (calentar con hisopo hasta emisión de vapores blancos);
sulfato de cobre al 20% (lavado por arrastre); secado con papel de filtro y observación.
Interpretación: cápsulas como halos color celeste, bacterias color azul violeta

2) Moeller (tinción de esporas)

Colorante principal: fucsina fenicada de Ziehl
Mordiente: solución de ácido crómico
Decolorantes: solución de ácido sulfúrico al 5%. Alcohol
Colorante secundario: azul de metileno
Técnica: extendido, secado y fijado clásicos
Coloración: 1ero ácido crómico (en caliente) 5 min; lavado con agua; fucsina de Ziehl (en caliente)
10 min; lavado con agua; ácido sulfúrico al 5% (lavar por arrastre); alcohol (lavar por arrastre); lavado
con agua; azul de metileno 1 min; lavado con agua, secado y observación.
Interpretación: esporos color rojo y bacterias color azul

3) Dorner (esporas rojo, bacterias casi incoloras sobre fondo gris oscuro)

4) Gray (cilias)
Colorante principal: fucsina fenicada de Ziehl
Mordiente
Técnica: extender una gota de agua destilada cubriendo aprox 2 cm2. A partir de un cultivo joven,
tomar parte de una colonia con una aguja de inyecciones y tocar la gota de agua en varios puntos,
mezclando con inclinaciones suaves del portaobjetos. Secar el aire sin calentar.
Coloración: 1ero mordiente (10 min); lavado suave con agua; fucsina de Ziehl (5-10min); lavado con
agua, secado al aire y observación
Interpretación: bacterias y cilias rojo

5) Casares Gil (bacterias y cilias rojo)

6) Giemsa (clamidias y rickettsias, elementos parasitarios intracelulares obligados)

Materiales
Solución madre de Giemsa
Solución buffer fosfato ácido de sodio
Solución buffer fosfato disódico
Agua amortiguada (pH 7,2)
Solución de trabajo de Giemsa
Técnica: extendido o impronta de tejidos según método clásico; secado al aire; fijado con alcohol
etílico absoluto durante 5 min.
Coloración: solución de trabajo de Giemsa 1 h; lavado rápido con alcohol etílico 95%; secado y
observación.
Interpretación: cuerpos de inclusión clamidiales de color rojo púrpura.

7) Stamp (cuerpos elementales clamidiales color rojo)

8) Coloración de Dienes o PPLO (mycoplasmas con centro azul oscuro y periferia azul claro)

9) Auramina-rodamina (bacterias ácido-alcohol resistentes de manera rápida y eficaz sobre fondo

oscuro)
Colorante principal: solución de auramina-rodamina
Decolorante: ácido clorhídrico al 3% en alcohol etílico de 70°
Colorante secundario: permanganato de potasio al 0,5%
Técnica: extendido y secado, fijado por calor durante 2 h a 65°C
Coloración: solución de auramina-rodamina 15 min; lavado con agua; ácido clorhídrico de 2 a 3 min;
lavado con agua; permanganato de potasio 2 a 4 min; lavado con agua, secado al aire libre y
observación en microscopio de fluorescencia.
Interpretación: bacterias de color amarillo-anaranjado

10) Naranja de acridina (bacterias y hongos fluorescencia roja, otras células fluorescencia
amarillo-verdoso)

TOMA DE MUESTRAS
Para correcta identificación del microorganismo responsable de la patología existen pasos básicos:
- Toma de muestra
- Identificación tintorial
- Aislamiento y cultivo del microorg
- Identificación bioquímica
- Identificación serológica
- Determinación de la sensibilidad a antimicrobianos o antibiograma
- Estudios complementarios de identificación (fagotipificación, PCR, inoculación, etc)
(cae alguien con otitis, el médico toma un hisopado, va al laboratorio, se hace una observación en
fresco, se lo colorea, lo cultiva, identificamos la bacteria con pruebas bioquímicas, y se hace un
antibiograma para ver qué antibiótico usar)
Infección: presencia de microorg en un organismo hospedador. Cuando un microorganismo es
capaz de causar una infección, es un microorg patógeno.
Virulencia: agresividad con que el microorg patógeno provoca daño en el organismo.
Respuesta local: la extensión de la infección no sobrepasa los límites del sitio infectado, originando
infecciones del tipo agudo, crónico y granulomatoso.
Respuesta generalizada o sistémica: cuando el compromiso del organismo es total.
Origen de muestra
Según el área del cual provienen:
Muestras de áreas normalmente estériles las que por lo general no presentan bacterias
(sangre, orina, líquidos peritoneal, sinovial y LCR)
Muestras de áreas normalmente colonizadas las que contienen bacterias que corresponden a la
microbiota nativa de la zona* (tractos respiratorios, digestivo, genital y auditivo, piel).
*Conjunto de bacterias saprófitas (no patógenas) normalmente existentes en puntos determinados
del organismo; Microbiota patógena es la conformada por bacterias ocasionales en el organismo y
cuya aparición desencadena enfermedad.

Materiales para la recolección de muestras

- Hisopo: no aconsejable para bacterias anaerobias
- Jeringa: se adquiera ya estéril, para muestras que deben tomarse por punción y posterior
aspiración.
- Bisturí: para muestras donde debe efectuarse la punción y posterior drenaje (en abscesos x
ej)

Recipientes
La muestra puede ser conservada dentro del instrumento utilizado para su extracción (jeringa x ej) o
en un recipiente a la espera de su procesado, que conviene sea inmediato.
Cápsulas o placas de Petri (también se las emplea para cultivo)
Culturette (equipo descartable aeróbico o anaeróbico formado por tubo que incluye hisopo y una
ampolla con medio de transporte).
Las muestras que se remiten al laboratorio no deben contener preservadores, porque provoca la
muerte de bacterias, hongos y virus (ninguna muestra para cultivo debería someterse a
congelamiento).
Medios de transporte (medios de mantenimiento)
Mantienen pH adecuado, evitan deshidratación del material clínico y fuera del organismo facilitan la
sobrevida de bacterias susceptibles a la desecación, sin favorecer su multiplicación. Medios Stuart,
de Amies, de Cary y Blair (mantiene más tiempo la sobrevida bacteriana), y el medio T.A.B.
Existen sustancias que añadidas oportunamente alargan la vida bacteriana, como el gel de sílice
(sílica gel), que mantiene en sobrevida los Streptococcus del grupo A por 3 días.
Muestras que requieren medio de transporte: todas las muestras en hisopo (heridas, exudado vaginal
o uretral, faríngeo, exudado ótico y conjuntival). Se conservan a temp. ambiente hasta 24hs.
Muestras que no requieren medio de transporte: semen, líquidos de punción, anaerobios. Se
conservan a temp. ambiente hasta 12hs.
Muestras que no requieren medio de transporte: punta de catéter, orina, lavado bronquial, materia
fecal, biopsias. Se conservan en heladera a 4°C hasta 24hs. Sangre y líquido cefalorraquídeo se
conservan en estufa de 37°C.

Remisión de muestras al laboratorio

Remisión para procesado inmediato: muestras con bacterias sensibles a cambios de T° (x ej
microorg que pueden hallarse en LCR); muestras que sospechan de bacteria anaerobia recolectadas
con hisopos de algodón.
Remisión para procesado en horas: muestras con abundante carga bacteriana que pueden
conservarse refrigeradas a 5°C durante varias horas antes de ser cultivadas (orina, materia fecal,
hisopados de diversos orígenes, y secreciones bronquiales); muestras recolectadas con hisopos de
algodón sin sospecha de bacteria anaerobia.
Remisión a distancia para procesado diferido: envío bajo refrigeración (para diagnóstico viral)

Muestras para cultivo anaerobio (aislamiento obligado del O2 ambiental)

Selección de muestra: cultivo en anaerobiosis cuando hay heridas profundas o mordeduras, tejidos
necrosados, líquidos procedentes de zonas estériles obtenidos por punción, abscesos en tejidos
blandos o en órganos, etc.

Recolección anaeróbica de la muestra: se aconseja no utilizar hisopo (de hacerlo, se toma la muestra
con el método de dos tubos; uno con el medio de transporte y otro para contener la muestra en CO2
libre de oxígeno, con la condición de realizar el cultivo lo más rápido posible; la bio-bag anaeróbica
permite el transporte del material en perfectas condiciones de anaerobiosis), sino aspirar con aguja y
jeringa con la finalidad de minimizar la contaminación por la microbiota normal anaerobia de la zona.
Los elementos que deben recolectarse de esta forma son pus, líquido pleural, orina, secreciones
pulmonares, líquido peritoneal y material del sector sinusal.

Transporte anaeróbico de la muestra:

-Tubo desgasificado: tubo con tapón de goma y tapa a rosca, contiene medio de transporte no
nutritivo con cisteína y resazurina, previamente reducido con CO2
-Tubo anaeróbico Bellco: consta de tapa doble y contiene una atmósfera de N2 o de CO2 con
ausencia total de oxígeno; la muestra se inyecta a través del tapón de goma.
-Bio-bag anaeróbica: facilita transporte de jeringas, hisopos en tubos sin medio de transporte, trozos
tisulares en tubos o ampollas estériles.
-Transporte anaeróbico Vacutainer: incluye sustancias reductoras
-Culturette anaeróbico: produce atmósfera anaerobia favorable y contiene medio de transporte que
no permite desecación de la muestra.
Cultivo anaeróbico de la muestra
Existen posibilidades físicas: ebullición, reemplazo de gases ambientales y vacío;
Químicas: sustancias reductoras atóxicas (podemos agregarlas al medio de cultivo, como glucosa y
tioglicolato), sustancias reductoras tóxicas (no pueden agregarse al medio de cultivo, así que están
cerca pero no dentro).
Biológico: con bacterias aerobias (para anaerobias aerotolerantes).
Los métodos conocidos son la cámara anaeróbica, tubo PRAS, caja con guante y el más
adecuado para su manejo en el laboratorio es el frasco o jarra anaeróbica (GasPak) que posee un
catalizador y puede emplearse con sobres de mezclas reductoras o gases como nitrógeno, gases
inertes o CO2.

Cultivo microaerófilo
Para crear condiciones microaerófilas (cuando se apaga la vela se considera que hay un 10% de
CO2 en el interior del frasco).

CULTIVO BACTERIANO
Cultivo: proceso que consiste en propagar microorganismos brindándoles las condiciones
ambientales adecuadas. Necesitan el aporte de todas las sustancias necesarias para realizar su
metabolismo.
El medio de cultivo es está mezcla equilibrada de componentes nutricionales que permiten su
desarrollo, contiene una fuente de carbono (materia orgánica), nitrógeno y azufre (materia
inorgánica), una fuente mineral, y factores de crecimiento.
- Finalidades de un medio de cultivo: aislamiento de microorganismos en colonias puras; estudio de
características culturales; estudios de actividades metabólicas; preparación de vacunas y antígenos;
etc.

Colonia: agrupación de un conjunto de microorganismos de un mismo tipo. Cuando una bacteria

crece sobre un medio de cultivo sólido no puede moverse y al multiplicarse las sucesivas
generaciones de bacterias quedan ubicadas unas sobre otras hasta hacerse visibles
macroscópicamente. Este crecimiento originado a partir de una sola bacteria en medio sólido se
denomina colonia y presenta aspectos particulares de acuerdo con el género y especie bacteriana
(forma, tamaño, color, bordes, altura y aspecto).

Población: es el desarrollo bacteriano en medios de cultivos líquidos, dónde no pueden

diferenciarse entre sí los distintos microorganismos (características como turbidez, espesor, cantidad
de velo superficial y presencia de sedimento).

Aislamiento microbiano
- Diseminación (la primer estría posee gran cantidad de bacterias, se esteriliza el ansa en las
siguientes distribuciones menos en la última pasada y ahí se forma la colonia pura y aislada).

Factores que influyen sobre crecimiento bacteriano:

- Temperatura: existe una T° óptima de crecimiento en dónde el microorganismo adquiere una
velocidad máxima de reproducción. Por encima de esta temperatura máxima las bacterias se
alteran y mueren; por debajo de la temperatura óptima enlentecen su metabolismo pero
siguen creciendo hasta que a una temperatura menor detienen su desarrollo. Clasificados en
psicrófilos (entre 10 y 20°C como bacterias marinas), mesófilos (entre 20 y 40°C),
termófilos (entre 50 y 60°C, los adaptados a la temperatura corporal del hombre y animales)
y termotolerantes con una temperatura óptima en el rango de los mesófilos pero que toleran
hasta 50°C.
 - pH: crecen en rangos cercanos a la neutralidad (6,8 a 7,4). Hongos prefieren pH bajos como
5 o 6. Para mantener el pH de los medios de cultivo cuando las bacterias son sensibles, se
requieren buffers (bicarbonato o fosfatos inorgánicos).
- Actividad del agua: el agua disponible es fundamental para las reacciones bioquímicas,
muchos microorganismos no crecen en ambientes de hiperosmolaridad cómo soluciones
azucaradas o hipersaladas. Algunas bacterias resisten concentraciones altas de sal
(Estafilococos).
- Nutrientes: calidad y cantidad disponibles influyen en la velocidad del crecimiento bacteriano
y su carencia es un factor limitante del desarrollo.

Composición y propiedades de los medios de cultivo:

- Peptonas (hidrolizados proteicos que aportan la fuente de nitrógeno y carbono).
- Cloruro de sodio (nivela presión osmótica).
Un medio de cultivo óptimo contiene como mínimo carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales
inorgánicas. En muchos casos se necesitan vitaminas x ej.
- Indicadores de cambios de pH.
- Para solidez en el medio se agrega agar (solidificante).
La esterilización del medio de cultivo se realiza en autoclave, vapor fluente o filtración. 121°C a 15
min.

Clasificación de los medios de cultivo

- Por su consistencia: a) Líquido (caldo) posee elementos nutricionales esenciales disueltos
en agua destilada.
b) Semisólido se obtiene agregando agar al caldo en 0,7%. Se fracciona en tubos de
hemólisis para siembra en puntura.
c) Sólido se le agrega agar al 2%. Se fracciona en placas de Petri.
- Por su finalidad: a) Medio de transporte (no tiene nutrientes, sino agua, sales y un
amortiguador de pH). Líquido o semisólido y permite el mantenimiento de la muestra clínica.
b) Medio de enriquecimiento, líquido selectivo que permite el crecimiento preferencial de
ciertas bacterias patógenas. Por ej caldo selenito o caldo tetrationato para materia fecal
(como medio preliminar en aislamiento de salmonela), crecen bacterias mejor adaptadas e
inhibe el crecimiento de enterococos.
c) Medio mínimo, contiene la mínima cantidad de nutrientes necesarios
d) Común o simple, reúne elementos mínimos y permite el desarrollo de la mayor parte de
bacterias no exigentes
e) Enriquecido, medio simple con agregado de sustancias que aumentan el poder nutritivo
(sangre, suero, vitaminas, etc). Para bacterias exigentes como estreptococos o micoplasmas.
f) Selectivo, permite seleccionar ciertos organismos frenando el desarrollo de otros, se logra
con el agregado de sustancias inhibidoras como antibióticos, ciertos colorantes, sales
biliares, etc. Ej medio hipersalado de Chapman para estafilococos (soportan elevada
 concentración de cloruro de sodio). También la T° de incubación hace selectivo a un medio
de cultivo. Medio Mc Conkey agar para E. coli (se agrega un inhibidor de gram+ y se
desarrollan las gram-).
g) Diferencial, permite diferenciar bioquímicamente a las bacterias por su acción metabólica
(por acción sobre un sustrato ej azúcares o aminoácidos y genera variación del pH o alguna
actividad enzimática que cambia aspecto del medio). Ej agar EMB que permite ver actividad
bacteriana sobre la lactosa, agar sangre que evalúa hemolisinas. Medio Kligler.
h) Especial, cumple con exigencias vitales de determinados microorganismos que
únicamente ellos pueden desarrollar en forma óptima.

MARCHA BACTERIOLÓGICA
Serie ordenada de pasos que se deben seguir para identificar correctamente una bacteria
responsable de infección.
1) Decisión de realizar el estudio bacteriológico (existe la presunción de que la enfermedad es
de origen bacteriano)
2) Recolección de muestra y transporte
3) Observación en fresco y microscópica
4) Coloración
5) Cultivo (para la mayoría de las muestras se usan dos medios enriquecidos, agar sangre y
agar chocolate, y un medio diferencial y selectivo para gramnegativos como EMB o CLDE; si
se buscan anaerobios se usa el caldo tioglicolato para el primoaislamiento)
6) Tipificación bioquímica (identificación de bacterias que siendo morfológicamente similares
presentan actividad bioquímica distinta, se usan medios de cultivos diferenciales que
permiten evaluar actividades metabólicas de microorganismos sobre diferentes sustratos
como azúcares, aminoácidos, etc)
7) Serotipificación (cuando se requiere saber el serotipo de la bacteria, pruebas de aglutinación,
floculación, etc, enfrentando a la bacteria aislada con sueros específicos contra componentes
estructurales como Ag flagelares, somáticos o capsulares)
8) Estudios complementarios (para llegar a una identificación mucho más exacta de la bacteria,
PCR x ej)
9) Antibiograma (estudio de sensibilidad de las bacterias a los antibióticos)
10) Serodiagnóstico (evalúa respuesta humoral, o sea mediada por Ac)
11) Informe e interpretación de los análisis

Métodos fenotípicos
Los esquemas tradicionales de identificación fenotípica bacteriana se basan en las características
«observables» de las bacterias, como su morfología, desarrollo, y propiedades bioquímicas y
metabólicas. El cultivo es el método diagnóstico de elección; permite el aislamiento del
microorganismo implicado, su identificación, el estudio de sensibilidad a los antimicrobianos y facilita
la aplicación de marcadores epidemiológicos. En el cultivo es esencial la correcta elección del medio
de crecimiento y las condiciones de incubación.
Dentro de pruebas bioquímicas se destacan las:
Características microscópicas
Características macroscópicas: morfología y hemólisis;
Cultivo: Medios de cultivo y requisitos de crecimiento en relación a atmósfera, temperatura y
nutrición.
Pruebas bioquímicas, diferenciando:
1) Pruebas que se utilizan en la identificación preliminar y con lectura inmediata como la catalasa y
oxidasa;
2) otras pruebas rápidas, con lectura en menos de 6 h tal y como la hidrólisis del
hipurato, la -galactosidasa (ONPG), las aminopeptidasas, la ureasa y el indol;
3) pruebas lentas, con lectura de 18 a 48 h que incluirían la óxido-fermentación, reducción de
nitratos, rojo de metilo, Voges-Proskauer, Agar hierro de Kligler, fermentación de azúcares, hidrólisis
de la esculina, coagulasa, fenilalanina-desaminasa, DNasa, hidrólisis de la gelatina, decarboxilasas,
lipasa, lecitinasa, utilización de citratos, utilización de malonato, y prueba de CAMP entre las más
frecuentes, y
4) pruebas basadas en caracteres de resistencia a ciertas sustancias tal y como optoquina,
bacitracina, solubilidad en bilis, y crecimiento en caldo hipersalino.

ANIMALES DE LABORATORIO

La ciencia de los animales de laboratorio permite la obtención de datos reproducibles, confiables e

informativos. Incluye el estudio de la biología de estos animales, su manejo y requerimientos
ambientales, prevención y tratamiento de enfermedades, etc.

Animal de laboratorio: cualquier tipo de ser vivo, con independencia de su categoría filogenética o
taxonómica, tanto vertebrado como invertebrado, que se utilice como instrumento de medida con
fines científicos.
Se da uso a esta ciencia en áreas de:
- estudios biológicos
- aplicaciones para medicina humana y veterinaria
- diagnóstico y prevención de enfermedades o alteraciones de la salud
- educación y formación
- otros
El animal de laboratorio se considera un reactivo biológico (aquel animal en experiencia, en función
del tema de estudio, capaz de dar una respuesta confiable y reproducible). Por otra parte, la
posibilidad de reproducir las experiencias esta limitada por su propia variabilidad; es decir que sobre
esta base, el empleo de animales homogéneos asegura la confiabilidad de la respuesta esperada.
Nace así el concepto de estandarización del reactivo biológico.

Bioterios: unidades donde se producen o mantienen bajo experiencia los animales de laboratorio.
Tienen como función producir animales para ser utilizados como reactivos biológicos de alta calidad y
mantener especies o cepas bajo experiencia aplicando metodologías que estén de acuerdo con las
recomendaciones internacionales.

Los animales más utilizados en experimentación son los roedores (ratones y ratas), ya que existe
gran cantidad de datos biológicos relativos a ellos, por lo que representan, desde el punto de vista de
su anatomía, fisiología, genética, patología y comportamiento, individuos definidos y estandarizados.
Le siguen los cobayos, conejos, hamsters y gerbils.

Bienestar animal (Teoría de Russell y Burch)

Concepto de las 3 R: refinamiento, reducción y reemplazo como base fundamental para el empleo
responsable de los animales en experimentos.
Refinamiento: en referencia a condiciones y calidad de vida que se le otorga al animal en cautiverio
(desde caja o jaula, condiciones ambientales, de manejo, anestesia, toma de muestras, inoculación
de sustancias, etc).
Reducción: en referencia a disminución del número de animales que se necesitan para un
experimento determinado.
Reemplazo: en referencia a la sustitución del empleo de animales por un procedimiento alternativo
que produce el mismo resultado sin la utilización de animales vivos.

Calidad microbiológica de los animales de laboratorio

Se desarrollaron técnicas que se aplican para producir y mantener animales de los que
selectivamente se han eliminado ciertos microorganismos. Así se obtienen animales
microbiológicamente definidos de acuerdo con la siguiente clasificación:
a- Convencionales: criados y mantenidos en condiciones ambientales no definidas; eventualmente
pueden ser portadores de infecciones pero no de zoonosis.
b- Libres de patógenos específicos: se obtienen por histerectomía aséptica y se crían y mantienen
bajo barreras sanitarias.
c- Libres de gérmenes o axénicos: animales donde no se detectan microorganismos, incluyendo los
de la microbiota normal. Criados y mantenidos en ambientes totalmente estériles (aisladores por ej)
d- Gnotobiotes: animales libres de gérmenes que se han puesto en contacto con cultivos puros de
microorganismos. Es decir que en estos animales se conoce totalmente la carga microbiana
presente.

Biología y manejo de las especies más comunes de laboratorio

Ratón
Más utilizado en pruebas. Pequeño tamaño, vida relativamente corta, alta eficiencia reproductiva,
adaptación a la explotación en grandes colonias, conocimiento completo de su genoma, amplia
variabilidad genética, susceptibilidad a agentes químicos y microbianos. Su investigación aplica a
disciplinas como embriología, etología, genética, gerontología, microbiología, oncología, etc.
Amplia distribución mundial y está asociado al hábitat humano.
Taxonomía (todas las cepas de ratones de laboratorio existentes derivan de una cría selectiva del
Mus musculus tipo salvaje)
Clase: mamífero
Orden: Rodentia
Familia: Muridae
Género: Mus
Especie: musculus
Se adapta a condiciones ambientales.
Es de hábitos nocturnos.
Agudo sentido de la audición y responde a un amplio rango de secuencias ultrasónicas.
sentido del olfato muy desarrollado.
visión muy pobre, no perciben colores.
se mantienen en grupos sin inconvenientes.
Producción
Ratones se alojan en cajas metálicas como de material de plástico provistas de tapa de alambre
galvanizado o de acero inoxidable.
Uso de viruta de madera de álamo.
T° entre los 18 y 25°C.
Iluminación tiene importancia en ciclo estral y reproductivo, 12hs luz/12 hs oscuridad.
Programa reproductivo
Sistemas reproductivos empleados:
1) Sistema reproductivo monogámico: macho y hembra siempre permanecen juntos en una misma
caja. Las crías se destetan a los 21 días. Como ventajas se aprovecha estro posparto, se obtiene un
mayor número de camadas, permite un correcto control y evaluación de la producción de cada
hembra. Como desventaja se necesita un elevado número de machos, desgaste prematuro de la
hembra, mayor cantidad de espacio requerido e incremento de trabajo para el personal.
2) Sistema reproductivo poligámico: se aparea a un macho con 2 a 6 hembras. Antes del parto, las
hembras se llevan a cajas individuales, lo que naturalmente impide aprovechar el estro posparto.
Como consecuencia la hembra se desgasta menos y hay mayor viabilidad y tamaño de crías
destetadas. Como desventaja hay menor número de camadas por hembra, mayor trabajo a
desarrollar en cada caja y el agotamiento de los machos.

Rata
Se adapta a condiciones ambientales.
Puede ser solitaria o vivir en grupo.
Sentidos del olfato y audición muy desarrollados.
Visión pobre.
Receptores táctiles bien desarrollados en cabeza, hocico, pulpejos plantares y palmares, cola.
Acostumbra a repetir estímulos (se entrena para tolerar procedimientos no placenteros cómo
inyecciones).
Vida reproductiva dura hasta los 14 meses y en dicho tiempo pueden producir entre seis y diez
camadas.

Cobayo
Taxonomía:
Clase mamífero
Orden Rodentia
Familia Cavideae
Género Cavia
Especie porcellus
Son sociables.
Se utilizan jaulas en estantes fijos, de metal y plásticas con piso de alambre y bandeja inferior
recolectora; o racks móviles.
Incapaz de sintetizar vitamina C por lo que requiere una dosis alimentaria diaria exógena de 10 mg
por kg de peso vivo de ácido ascórbico.
Periodo de luz/oscuridad debe ser de 12 a 16hs luz/ 12 a 8hs oscuridad.
Edad optima de apareamiento a los 3 meses. Duración de gestación de 68 días aprox.
Paren entre 1 a 4 crías.
Crias nacen bien desarrolladas.

Conejo
Taxonomía:
Clase mamífero
Orden Lagomorpha
Familia Leporidae
Género Oryctolagus
Especie cuniculus
Amplio rango de visión.
Sentido de audición y olfato bien desarrollados.
Hábito de cecotrofia (ingestión de pellets de materia fecal blanda tomada directamente del ano),
debido a que presenta en el ciego bacterias productoras de vitamina B.
Hembra alcanza madurez sexual entre los 4 y 6 meses y los nacimientos ocurren durante todo el año
pero en primavera prevalecen.
Alojamiento apropiado a su tamaño y peso.
 Importancia en malla de alambre del piso de las jaulas que la separación debe ser de 26mm para
evitar problema en los tarsos.
Conejos que alcanzan la pubertad pueden ser agresivos, en consecuencia a partir de los 3 meses se
alojan en jaulas individuales.

Hamster
Más usado como animal de laboratorio.
Taxonomía:
Clase mamífero
Orden Rodentia
Familia Cricetidae
Género Mesocricetus
Especie auratus
Presentan abazones en zona de la articulación mandibular en forma de bolsas, que sirven para el
estudio de problemas relacionados con la microcirculación.
Presenta condiciones inmunológicas particulares por lo cual se lo utiliza en estudios de transplantes
tumorales.
También se pueden producir experimentalmente caries dentarias por lo que son buen modelo en
odontología.

ESTERILIZACIÓN
Esterilidad: indica ausencia total de formas viables de microorganismos. Término absoluto.
Esterilización hace referencia a los procedimientos que conducen a la destrucción de toda forma de
vida macro o microscópica.
Desinfección: consiste en la destrucción de microorganismos patógenos en estado vegetativo que se
encuentran sobre elementos inertes.

CALOR Seco Directo Mechero Llama del mechero de Bunsen. Esterilizar tijeras y
pinzas. Puede destruir muchas sustancias en el
proceso.

Indirecto Horno (estufa) Aire caliente a 160°C durante 2hs o 170°C durante 1h.
Para elementos de vidrio (placas Petri, pipetas) o de
metal. Puede variar el tamaño del vidrio en el
horneado. Mata todas las formas de vida. Elimina
pirógenos de bact. gram -.

Húmedo Con presión Autoclave* Mata todas las formas de vida, incluyendo esporas.
(121°C 15min Autoclave de tipo Chamberland. Constituido por
a 1 atm) caldera de cobre batido y estañado interiormente,
sostenido por una cámara metálica. En parte inferior
posee una fuente calórica, gas o electricidad. En parte
superior lleva una tapa que posee un termómetro
indicador de T° (entre los 100 y 200°C), un manómetro
 indicador de presión, una espita que elimina aire
durante calentamiento (purga) y una válvula de
seguridad que permite escape del vapor a presión. En
su interior posee un enrejado y una lámina cribada
sobre el cual se apoya el material a esterilizar.
En el ciclo de esterilización existe un tiempo de
calentamiento (20min) desde 20°C a 121°C; tiempo de
penetración (depende del volumen del material, tiempo
que tarda el calor en llegar a todo el objeto) a 121°C;
tiempo de muerte y de seguridad (15min) a 121°C y
tiempo de enfriamiento desde 121°C hasta 60°C.
Método de control químico (se introducen papeles
adhesivos que cambian de color a determinada T°) y
biológicos (se introduce un tubo con papel de filtro
embebido en un cultivo de un microorganismo
esporulado, luego de la esterilización el papel se lleva a
un medio de cultivo y se incuba por 24hs a 56°C, la
falta de desarrollo indica una correcta esterilización;
este mismo papel viene encerrado en ampollas que
tienen indicador púrpura de bromocresol que vira al
amarillo si el microorganismo es capaz de crecer); y
físico (termocuplas, registra en un gráfico la
temperatura en función del tiempo de esterilización).

Sin presión Ebullición Método rápido para disminuir la carga bacteriana en

jeringas, instrumental quirúrgico, etc (destruye formas
vegetativas de la mayoría de bacterias excepto esporas
y ciertos virus).
Ebullición intermitente (100°C 3 veces con intervalo de
enfriamiento) mata esporas bacterianas.

Vapor fluente

Tindalización Consiste en 3 calentamientos de 60-80°C por 30min,

separados por dos incubaciones a 37°C por 24hs; con
el primer calentamiento se destruyen formas
vegetativas, con la incubación las esporas presentes
pasan a ser vegetativas y se destruyen en el segundo
calentamiento.
Se usa sobre elementos en los cuales la T° puede
modificar sus propiedades (H de C o leche).

Pasteurización No es una técnica de esterilización ya que elimina

solamente formas vegetativas (reduce carga de
microorganismos). Se utiliza en la industria de la
alimentación.

FILTRACIÓN Filtros de Discos o

poro placas tipo
deformable Seitz

Filtros de Membranas
poro fijo (celulosa)

Filamentos
orgánicos

Membranas
nucleares
RADIACIONES Ionizantes Rayos alfa, Las radiaciones ionizantes son poco específicas en sus
beta y efectos pero tienen alto poder de penetración
gamma (esterilización fría), y se utilizan como método en el
laboratorio. Los rayos gamma son los más usados.
Longitud de onda más corta. Para esterilizar objetos
sensibles al calor como jeringas de plástico. Se debe
contar con una fuente de radiaciones adecuada y
controlada.

Rayos x Letales para microorganismos y formas superiores de

vida pero es de difícil manejo. Se aplican en sustancias
sensibles al calor y en industrias farmacéuticas y
alimenticias.

No Rayos Causan mayor daño en los ácidos nucleicos. Poca

ionizantes ultravioletas capacidad de penetrar la materia.

Rayos
infrarrojos

Calor: el tiempo requerido para la esterilización esta universalmente relacionado con la T° de

exposición. Tres parámetros se usan para indicar el grado de resistencia al calor que tienen los
microorganismos:
-Punto térmico letal: T° más baja en la cual muere una población en determinado tiempo (10min).
-Tiempo térmico letal: el menor tiempo necesario para matar el 100% de una población a
determinada T° bajo condiciones específicas del medio.
-Reducción decimal de tiempo: tiempo en minutos necesario para matar el 90% de la población. Es
una modificación del tiempo térmico letal.

Frío: A T° inferior de la óptima disminuye la actividad microbiana junto con el metabolismo. Las bajas
temperaturas son útiles para preservar cultivos (4° a 7°C).

*
 VIROLOGÍA

Los virus son agentes infecciosos de amplia distribución en la naturaleza, que tienen como
característica ser parásitos intracelulares obligados (solo pueden multiplicarse dentro de una célula) y
para ser considerados virus en su constitución deben tener solamente un tipo de ácido nucleico (ADN
o ARN, nunca los dos).
Mucho más pequeños que las bacterias. El tamaño varía desde 18nm (Parvovirus) hasta 250nm
(Poxvirus, viruela).
Estructura: consta de un solo ácido nucleico (bicatenario o monocatenario y de confirmación lineal o
circular; ARN puede estar fragmentado), recubierto por una cápside de naturaleza proteica
(nucleocápside), ésta puede presentar simetría icosaédrica (20 lados, 12 vértices y 30 aristas),
helicoidal (estructura cilíndrica, forma de bala) o compleja (forma de ladrillo).
Algunos virus poseen exteriormente una estructura lipoproteica llamada envoltura (virus envueltos)
que en algunos casos presenta proteínas como las hemaglutininas que tiene importante función
aglutinando glóbulos rojos de ciertas especies, o neuraminidasas. Deriva de membrana
citoplasmática. Es inmunógena y necesaria para la infectividad.
Virus desnudos presentan fibras en su superficie con propiedades hemaglutinantes.
El conjunto de ácido nucleico y de proteínas íntimamente relacionadas (transcriptasas) se denomina
core.
Para la codificación de una cápside intervienen sólo uno o dos tipos proteicos estructuralmente
idénticos repetidas n veces que al unirse se las denomina capsómeros (las subunidades que forman
la cápside).
Clasificación:
Según por la afinidad del hospedador (animales, vegetales o bacteriofagos), de acuerdo con el
tropismo de células que atacan (neurotropos o epiteliotropos), según los órganos que afectan
(entéricos, respiratorios), por su forma de diseminación (aerogenos, vectores).
Actualmente se utiliza un sistema numérico de uso poco habitual, y otro que ordena a los virus de
manera taxonómica en Familias y Géneros, teniendo en cuenta tipo de ácido nucleico, simetría de
cápside, envuelto o no, proceso de replicación, tipo de liberación celular y diámetro de hélice o
número de capsómeros.
Propiedades: son sin excepción sensibles al calor. Virus envueltos son termolábiles en comparación
con los desnudos y sensibles a solventes orgánicos como éter o cloroformo. Una T° de 60°C por
30min inactiva a la mayoría de los virus. La estabilidad del virus aumenta cuando decrece la T°. Para
enviar muestras para aislamiento a 4°C sobreviven 1 o 2 días, a -20°C por una semana, a -70°C
sobreviven varios meses.
Ciclo de infección de un virus: cuando un virus infecta una célula se produce la replicación del
ácido nucleico y la expresión de la información contenida en él. Replicación del ácido nucleico viral (7
estrategias posibles).
Pasos
1) Adsorción o fijación: el virión por medio de una proteína o glicoproteína (hemaglutinina) se
adsorbe a la membrana celular de la célula blanco. La ausencia de receptores celulares para
el virus impide la adsorcion por lo cual hay resistencia a la infección. Esta unión se debe a
tipos de uniones químicas (puentes de hidrógeno, fuerzas de Van Der Waals, fuerzas
electrostáticas). Estas fuerzas son necesarias ya que los virus y células tienen cargas
negativas y por lo tanto se repelen.
2) Penetración: puede producirse por endocitosis (virión es englobado cómo vacuola fagocitica),
fusión de membranas o penetración directa.
3) Escape o decapsidación: una vez que el virus está dentro de la célula comienza la liberación
del ácido nucleico infeccioso a efectos de lograr su expresión. Es distinto según el tipo de
virus, ácido nucleico puede o no liberarse totalmente y el proceso puede tener lugar en la
membrana celular misma, en el citoplasma, en los poros de la membrana nuclear o en los
lisosomas.
4) Eclipse: una vez que el virus libera su ácido nucleico pierde su infectividad para otras células
y dura hasta que sea posible hallar nuevas partículas virales dentro de la célula. En la fase
de eclipse suceden momentos como los de transcripción, traducción, replicación, ensamble y
maduración viral.
5) Ensamble: etapa en la que el ácido nucleico viral entra en contacto con su cápside.
6) Egreso o liberación: se produce por lisis celular, por gemación a través del reticulo
endoplasmático, a través de membrana celular o membrana nuclear.
Bacteriofagos
T-par de E. coli. Poseen dos tipos de simetría, helicoidal en la cola e icosaedrica en la cabeza. La
cola está constituida por un tubo hueco central, a través del cual pasa el ácido nucleico desde el fago
a la bacteria infectada, una vaina que rodea al tubo central, contracti, que va desde el cuello del fago
hasta la placa basal, y la placa basal de forma hexagonal con una punta en cada uno de sus
extremos conectada a seis fibras terminales que son los órganos de unión del bacteriofago a la pared
de la bacteria hospedadora.
Rickettsias y Clamidias
No se consideran organismos virales pero habitualmente son estudiados por virólogos, debido a que
solo pueden cultivarse en células vivas (parásitos intracelulares obligados). Son procariotas con ADN
y ARN ribosomas, siendo el tamaño celular variable.
Rickettsias asociadas con artrópodos que las transmiten, se parecen en su composición a bacterias
gramnegativas con ácido muramico en su pared celular.