FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 1

EVALUACIÓN DE LA FERMENTACIÓN CONTROLADA DEL GRANO DE

CAFÉ EMPLEANDO LEVADURAS MICROENCAPSULADAS POR MÉTODO
DE EXTRUSIÓN

Autores:

DAIRO BOLAÑOS CARDONA

SANTIAGO ROJAS SALAZAR

Directora:

CRISTINA RAMÍREZ TORO Ph.D.

Codirector:

JOSE LUIS PLAZA DORADO Ph.D.

Grupo de Investigación: MIBIA

Universidad del Valle

Facultad de Ingeniería

Escuela de Alimentos Programa de Ingeniería de Alimentos

Cali – Colombia

2023
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DEDICATORIA

Primeramente, quiero agradecer a Dios por permitirme haber llegado hasta

aquí; a pesar de las crisis y dificultades siempre me mantuvo firme con su
entusiasmo, misericordia y bondad, poniendo siempre a las personas correctas
para guiarme en este propósito y no decaer.
A mis padres, Dario y Elsa, por ser esos promotores de vida, de seguir luchando
sin importar los problemas y ser mi apoyo y sustento en todo momento. Gracias
por su esfuerzo, paciencia y motivación ya que sin ustedes no hubiera sido
posible ser lo que soy ahora, también a enseñarme infinidad de valores que me
forman como persona y por depositar esa confianza en mí.
A mi hermana Lina, por ser ese ejemplo que seguir, ser mi apoyo e inspiración
de que no hay que dejarse vencer a pesar de los obstáculos y demostrarme que
todo es posible si uno se lo propone.
A mi abuela Sabina y a mis tíos Martha y Alberto, por su paciencia, motivación
y consejos, enseñándome que hay que seguir con los propósitos que uno se
propone.
A Valeria Girón por estar siempre ahí, dándome apoyo moral cuando más lo
necesitaba y no dejarme decaer.
Todo ese apoyo inconmensurable de ustedes hoy ha dado sus frutos y por eso
quiero dedicarles este logro.

Dairo Bolaños Cardona

Dedico este trabajo de grado a mi familia, no sin antes, agradecerle a Dios por
darme la oportunidad de culminarlo, el cual me ha permitido ser lo que soy hoy
en día, guiándome por el camino de la bondad y misericordia, sin su gracia y
orientación este logro no sería posible.
Con gratitud y aprecio dedico este trabajo a mis padres Eliecer y Eliana, por el
apoyo incondicional y la influencia académica, sus consejos, amor y sacrificio
han sido el motor de mi motivación y perseverancia.
También quiero expresar este agradecimiento a mi madrina Alina y a mis
hermanos Víctor y Antonio, quienes siempre estuvieron a mi lado brindando
ánimo y aliento cuando más lo necesitaba.
A mis directores de tesis, los profesores Cristina Ramírez y José Luis Plaza, le
agradezco sus paciencia, sabiduría y orientación constante durante todo el
proceso de investigación. Sus conocimientos y dirección fueron cruciales para
llevar a cabo este trabajo de manera exitosa.
Este trabajo de grado es el resultado colectivo y el apoyo de muchas personas
especiales en mi vida. Gracias a todos por ser parte de este logro.

Santiago Rojas Salazar

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AGRADECIMIENTOS

Nos gustaría expresar nuestra más sincera gratitud a la Universidad del

Valle, por permitirnos llevar a cabo este proyecto de investigación. También por

su formación académica excepcional, el cual moldeo nuestro carácter y nos

preparó para convertirnos en ciudadanos comprometidos en beneficio de la

sociedad.

En este sentido, deseamos manifestar nuestro más sincero agradecimiento

al grupo de investigación MIBIA, que contribuyeron de manera significativa a la

realización de la investigación. Su apoyo, orientación y colaboración han sido

esenciales para el éxito de este proyecto.

De igual manera en esta travesía académica, hemos tenido el privilegio de

contar con la valiosa guía de nuestros distinguidos profesores Cristina Ramírez y

José Luis Plaza y demás profesores, egresados y estudiantes, que cuya experiencia

y conocimiento han sido un faro en cada paso de nuestro camino. Sus consejos y

direcciones han sido fundamentales para superar los desafíos que se presentaron.

También queremos agradecer, el inmenso apoyo brindado por nuestros

padres, familiares y amigos, quienes han estado de nuestro lado ofreciendo su

apoyo incondicional y aliento constante.

En conjunto, estas personas han sido pilares fundamentales en nuestro

viaje académico y profesional. Les estamos sinceramente agradecidos por su

confianza, amistad y compromiso.

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 4

Tabla de contenido
Resumen ..........................................................................................................................11

1. Introducción .................................................................................................................13

2. Planteamiento del Problema ........................................................................................16

3. Justificación .................................................................................................................18

4. Objetivos......................................................................................................................19

4.1. Objetivo General .................................................................................................. 19

4.2. Específicos ........................................................................................................... 19

5. Hipótesis ......................................................................................................................20

6. Marco teórico ...............................................................................................................20

6.1 Generalidades del café .......................................................................................... 20

6.1.1 Fisiología del cultivo ...................................................................................... 20

6.1.2 Morfología del fruto ....................................................................................... 21

6.2 Cafés especiales .................................................................................................... 22

6.2.1 Cafés de origen ............................................................................................... 22

6.2.2 Cafés sostenibles ............................................................................................ 23

6.2.3 Cafés de preparación ...................................................................................... 23

6.3 Fermentación del café ........................................................................................... 23

6.3.1 Sistemas de fermentación del café ................................................................. 24

6.3.2 Microorganismos asociados a la fermentación del café ................................. 24

6.4 Microencapsulación .............................................................................................. 29

7. Antecedentes................................................................................................................31
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8. Materiales y métodos ...................................................................................................35

8.1 Materiales .............................................................................................................. 35

8.1.1 Cultivos Iniciadores........................................................................................ 35

8.1.2 Medios de cultivo y mantenimiento de los microorganismos ........................ 35

8.1.3 Materiales de Microencapsulación ................................................................. 37

8.1.4 Materia prima ................................................................................................. 37

8.2 Métodos ................................................................................................................ 37

8.2.1 Pruebas preliminares para la elaboración del inóculo iniciador ..................... 37

8.2.2 Inhibición de hongos ...................................................................................... 39

8.2.3 Elaboración de microencapsulado .................................................................. 40

8.2.4 Caracterización del microencapsulado ........................................................... 41

8.2.5 Fermentación del café y porcentaje de inóculo .............................................. 42

8.2.6 Parámetros de fermentación ........................................................................... 43

8.2.7 Pruebas estadísticas ........................................................................................ 45

9. Análisis de resultados ..................................................................................................45

9.1 Cinética de crecimiento ........................................................................................ 45

9.1.2 pH ................................................................................................................... 47

9.1.3 ° Brix, azúcares totales y reductores .............................................................. 48

9.2 Inhibición de hongos ............................................................................................. 50

9.3 Microencapsulado (M. caribbica): ....................................................................... 52

9.4. Parámetros de fermentación ................................................................................. 58

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9.4.1 ° Brix, azúcares reductores y totales .............................................................. 58

9.4.2 pH y acidez ..................................................................................................... 60

9.4.3 Estabilidad microbiológica ............................................................................. 63

10. Conclusiones..............................................................................................................71

11. Referencias ................................................................................................................71

Anexos .............................................................................................................................84
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Lista de Tablas

Tabla 1. Antecedentes .................................................................................................... 32

Tabla 2. Medio a base de pulpa de café ......................................................................... 36

Tabla 3. Diseño completamente al azar para la levadura seleccionada. ........................ 43

Tabla 4. Caracterización del microencapsulado ............................................................ 53

Tabla 5. Coliformes fecales durante la fermentación. ................................................... 69

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Lista de Figuras

Figura 1. Morfología del fruto.. ..................................................................................... 22

Figura 2. Meyerozyma caribbica.. ................................................................................. 26

Figura 3. Pichia kluyveri. .............................................................................................. 27

Figura 4. Curva de calibración para azúcares totales. ................................................... 38

Figura 5. Curva de calibración para azúcares reductores. ............................................. 39

Figura 6. Método de microencapsulación. .................................................................... 41

Figura 7. Viabilidad reportada de Meyerozyma caribbica y Pichia kluyveri al cabo de 24

h.. .................................................................................................................................... 46

Figura 8. Evolución del pH durante la cinética de crecimiento. .................................. 47

Figura 9. Evolución de la cinética de los parámetros fisicoquímicos de los diferentes

medios EM y CF para las levaduras: 1 y 2. a) ºBrix, (b) azúcares reductores y (c) azúcares

totales durante la cinética de crecimiento. ...................................................................... 49

Figura 10. Evolución de la Meyerozima caribbica ante diferentes hongos: (a) Aspergillus

niger (b) Aspergillus flavus (c) Syncephalastrum racemosum (d) Cunninghamella spp (e)

Penicillium spp. .............................................................................................................. 50

Figura 11. Tiempo de liberación del ME (MLR). ......................................................... 56

Figura 12. Cinética de secado del ME. .......................................................................... 57

Figura 13. Evolución de los parámetros de fermentación de los tratamientos: a) ºBrix, (b)

azúcares totales y (c) azúcares reductores durante el proceso. ....................................... 58

Figura 14. Evolución de pH durante los días de fermentación. .................................... 61

Figura 15. Evolución de acidez durante los días de fermentación. ............................... 62

Figura 16. Estabilidad microbiológica de BAL durante la fermentación. Nota: puntos con

superíndices diferentes a los días son significativamente diferentes. ............................ 64

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 9

Figura 17. Estabilidad microbiológica de Levaduras durante la fermentación. Nota:

puntos con superíndices diferentes a los días son significativamente diferentes.. ......... 66

Figura 18. Estabilidad microbiológica de mesófilos aerobios durante la fermentación.

Nota: puntos con superíndices diferentes a los días son significativamente diferentes. 68

Figura 19. Análisis estadístico de ° Brix a los 0 días. ................................................... 84

Figura 20. Análisis estadístico de ° Brix a los 2 días. ................................................... 85

Figura 21. Análisis estadístico de ° Brix a los 4 días. ................................................... 85

Figura 22. Análisis estadístico de ° Brix a los 6 días. ................................................... 85

Figura 23. Análisis estadístico de azúcares reductores a los 0 días............................... 85

Figura 24. Análisis estadístico de azúcares reductores a los 2 días............................... 85

Figura 25. Análisis estadístico de azúcares reductores a los 4 días............................... 86

Figura 26. Análisis estadístico de azúcares reductores a los 6 días............................... 86

Figura 27. Análisis estadístico de azúcares totales a los 0 días. .................................... 86

Figura 28. Análisis estadístico de azúcares totales a los 2 días. .................................... 86

Figura 29. Análisis estadístico de azúcares totales a los 4 días. .................................... 86

Figura 30. Análisis estadístico de azúcares totales a los 6 días. .................................... 87

Figura 31. Análisis estadístico de pH a los 0 días. ........................................................ 87

Figura 32. Análisis estadístico de pH a los 2 días. ........................................................ 87

Figura 33. Análisis estadístico de pH a los 4 días. ........................................................ 87

Figura 34. Análisis estadístico de pH a los 6 días. ........................................................ 88

Figura 35. Análisis estadístico de bacterias lácticas a los 0 días. .................................. 88

Figura 36. Análisis estadístico de bacterias lácticas a los 2 días. .................................. 88

Figura 37. Análisis estadístico de bacterias lácticas a los 4 días. .................................. 88

Figura 38. Análisis estadístico de bacterias lácticas a los 6 días. .................................. 88

Figura 39. Análisis estadístico de levaduras a los 0 días. .............................................. 89

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 10

Figura 40. Análisis estadístico de levaduras a los 2 días. ............................................. 89

Figura 41. Análisis estadístico de levaduras a los 4 días. .............................................. 89

Figura 42. Análisis estadístico de levaduras a los 6 días. .............................................. 89

Figura 43. Análisis estadístico de mesófilos aerobios a los 0 días. ............................... 89

Figura 44. Análisis estadístico de mesófilos aerobios a los 2 días. ............................... 90

Figura 45. Análisis estadístico de mesófilos aerobios a los 4 días. ............................... 90

Figura 46. Análisis estadístico de mesófilos aerobios a los 6 días. ............................... 90

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 11

Resumen

El estudio se centra en la fermentación del café utilizando una levadura

microencapsulada. Para seleccionar la cepa más adecuada se realizó una cinética

de crecimiento de 24 h entre dos levaduras (Meyerozima caribbica y Pichia

kluivery) en dos medios de cultivo diferentes, uno comercial (extracto de malta) y

otro desarrollado en el laboratorio a base de café. De modo, que se evaluaron

parámetros claves como producción de biomasa, pH, ° Brix, azúcares totales y

reductores. Los resultados revelaron que la Meyerozima caribbica exhibió un

mejor rendimiento en el medio a base de café al cabo de las 20 h (7,40 Log

(UFC/g)), un pH de 4,35 y un mayor consumo de ° Brix, azúcares reductores y

totales en comparación con la otra cepa.

Posteriormente, se procedió a microencapsular la Meyerozima caribbica,

logrando un porcentaje de encapsulación de 85,84%. Con la levadura

microencapsulada, se llevó a cabo el análisis de la fermentación del café durante

6 días, donde se evaluaron diferentes tratamientos: un control sin levadura (0%),

concentraciones de 3% y 5% (Meyerozima caribbica), y un tratamiento

combinado que consistió en un 3% y 3% de levadura y bacteria láctica (L.

plantarum) microencapsuladas. En el que se obtuvo que el tratamiento del 5%

presentó mejores resultados en cuanto a pH (3,83), % acidez (0,45), y un mayor

consumo de ° Brix, azúcares reductores y totales, desarrollando una fermentación

más rápida respecto a los otros tratamientos. Por otro lado, los resultados

microbiológicos mostraron que había más presencia de levaduras y bacterias

lácticas cuando se agregaba inóculo y esto a su vez evito el crecimiento de hongos

y coliformes fecales. Lo anterior respaldan la viabilidad de utilizar la Meyerozima

caribbica como una alternativa prometedora para mejorar el proceso de la

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 12

fermentación del café lo cual conduce a la obtención de un producto de mayor

calidad sensorial, microbiológica y fisicoquímica.

Palabras clave: café, fermentación, levadura, microencapsulado.

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 13

1. Introducción

En la actualidad, el consumo del café ha tenido una evolución rápida hasta

el punto de ser la bebida más consumida en el mundo (solo superada por el agua)

(Ladino et al., 2016). Esta tendencia ha ido arraigada al crecimiento

socioeconómico de diversos países y las nuevas tecnologías de información, que

han generado cambios en las perspectivas del consumidor el cual ya no solo se

basa en el precio de un producto sino que también opta por su calidad,

conocimiento del proceso y experiencia de consumo, produciendo como

consecuencia la evolución de un mercado más exigente (López & Alvarez-

Herrera, 2017). En los últimos años ha surgido una oferta creciente de cafés de

alta calidad, especiales y orgánicos, cuyas cualidades dependen de su preparación

y sus etapas de procesamiento industrial. En estas etapas, la fermentación juega

un rol fundamental, ya que intervienen microorganismos que afectan el grano y

tienen gran repercusión en su calidad sensorial (Ladino et al., 2016).

En ese sentido, una de las especies más producidas de café es la Coffea

Arábica (café arábigo), que representa cerca del 90% de la producción mundial

(Serna et al., 2018). Esta es cultivada entre 1000 y 1200 metros sobre el nivel del

mar (msnm) en países alrededor de la línea ecuatorial, dentro de los cuales se

destaca Colombia por ser el tercer mayor productor (Rosero et al., 2015). Dentro

de esta especie, existe una variedad producida en el país colombiano denominada

variedad Castillo, la cual es producto de la variedad Caturra y el hibrido Timor.

Este café posee una condición genética que le ofrece características como la

estabilidad en sus propiedades agronómicas y la fácil adaptación en zonas que se

ven afectadas por la roya del cafeto (hongo Hemileia vastatrix) y en zonas donde

la enfermedad no posee mayor afectación. En consecuencia, los productores de

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 14

este cultivo, pueden obtener los mejores beneficios productivos de la siembra y

una buena granulometría en las cerezas (Alvarado et al., 2013).

En Colombia, el café es un importante producto agrícola de exportación,

con aproximadamente 12,6 millones de sacos de café verde exportados. Este

cultivo representa cerca del 15% del producto interno bruto (PIB) del país y de él

dependen más de 545.000 familias rurales, generando más de 2,5 millones de

trabajos directos e indirectos (MinAgricultura, 2020). Sin embargo, en el territorio

colombiano, se ha encontrado un vacío referente a los programas de desarrollo de

cafés especiales, ya que no hay un concepto claro en la estandarización y calidad

de los procesos del café, por lo que se requiere un avance en este sector para que

se logre una solución de esta problemática y así obtener unos mayores márgenes

de utilidad en los productos elaborados (Castro & Fajardo, 2016; Minciencias,

2021). Uno de esos factores que merece una mayor atención son los seguimientos

de los procesos de fermentación, puesto que representa una de las mayores

repercusiones en la calidad final del café, debido a que, se ha encontrado que las

levaduras y diversas bacterias desarrollan procesos metabólicos de interés en los

que convierten compuestos químicos, principalmente los azúcares, en sustancias

orgánicas más simples como el ácido láctico, butírico, etanol, entre otros

compuestos (Puerta, 2013b).

Investigaciones como las de Bressani et al. (2018), de Melo Pereira et al.

(2015), Samaniego (2019) han comprobado que la adición de inóculo de levaduras

junto con un buen control de proceso tienen una gran influencia en la fermentación

del fruto. En consecuencia, esto permite obtener un producto con perfiles

sensoriales distintivos y buenas cualidades organolépticas generando a su vez, una

bebida con alta calidad sensorial y mayor valor agregado. Asimismo, de acuerdo
 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 15

con Suárez Manzano (2019) se ha encontrado que es posible microencapsular

células de levaduras (Saccharomyces cerevisiae) como fuentes de probióticos, ya

que mediante su estudio pudo determinar una concentración adecuada la cual fue

capaz de competir con los microorganismos indeseables, siendo este método de

microencapsulación reconocido por darle estabilidad y supervivencia a distintos

microorganismos, por medio de capsulas poliméricas de tamaño micrométrico

(Pérez-Leonard et al., 2013; Tangarife, Arias, & Zapata, 2021).

Teniendo en cuenta lo anterior, el objetivo de este trabajo de investigación

fue elaborar microencapsulados (ME), preparados con adición de polímero

obtenido de bacterias lácticas (Weissella confussa), de levaduras seleccionadas

del proceso de fermentación del café variedad Castillo, de la zona de Trujillo,

Valle del Cauca; con el fin de realizar una fermentación controlada, habiendo

establecido las condiciones de fermentación de las levaduras microencapsuladas

y después evaluado el efecto del porcentaje de inóculo del ME en la fermentación

del grano. (Ríos, 2021).

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 16

2. Planteamiento del Problema

En Colombia, la industria cafetera es de gran importancia ya que aporta

uno de cada tres empleos rurales, generando 631.000 empleos al año de los cuales

alrededor de 2.000.000 de personas que viven directamente de su producción

(Minciencias, 2021). En ese sentido, en los últimos años se ha observado un

descenso en los precios del café convencional debido a que estos son fijados por

el mercado bursátil, afectando principalmente a los pequeños caficultores, debido

a que no siempre hay una garantía en la homogeneidad de la calidad del café ya

que las practicas no son estandarizadas implicando la mayoría de las veces lotes

de baja calidad con elevados costos de producción y una disminución en el margen

de utilidad (Castro & Fajardo, 2016).

En el proceso de elaboración del café, la calidad del grano y la consistencia

son factores críticos para obtener un café de alta calidad. Por ende, la uniformidad

del grano es esencial para el proceso de fermentación, ya que durante esta etapa

se producen una serie de procesos bioquímicos a través de la acción de

microorganismos, los cuales contribuyen a las características de calidad y a las

propiedades organolépticas del café, como su aroma, sabor y fragancia.(Sanchez

De La Cruz, 2018). Además, en el transcurso de la fermentación, que tiene lugar

tras el proceso de despulpado en el método de procesamiento húmedo,

predominan los efectos de autolisis de la pulpa provocados por la acción de

enzimas pectolíticas, de tal manera que emplear procesos que involucran altos

contenidos de humedad favorecen el crecimiento de los hongos hidrofílicos como

los Aspergillius, Penicillium y Clasdosporum. Dentro de las especies de los

Aspergillius, algunas son precursores de ocratoxinas, de estas se encuentra la

ocratoxina A (OTA), la cual es la forma más relevante y prevalente de este grupo

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 17

(Maman et al., 2021). Esta ocratoxina presenta actividad nefrotóxica,

hepatotóxica, embriotóxica, teratogénica, neurotóxica, inmunotóxica, genotóxica

y cancerígena, además de que este es un contaminante abundante en alimentos y

piensos y generalmente se detecta con frecuencia en cereales y subproductos,

aunque también es común encontrarla en café, cacao, uvas, entre otros (Young et

al., 2019).

En relación con lo anterior, los caficultores siguen un proceso rudimentario

para determinar el tiempo de la fermentación, teniendo como consecuencia

márgenes de error en el tiempo lo cual genera defectos en la calidad del grano. Por

ende, si sobrepasan los tiempos de fermentación se obtiene condiciones

indeseables (Puerta & Echeverry, 2015). Cuando los tiempos de fermentación son

relativamente prolongados, y no se lleva un proceso controlado y estandarizado,

el resultado suele ser la obtención de lotes de calidad inferior. Esto, a su vez,

conlleva un aumento en los costos de producción y una disminución en los

márgenes de beneficio, impidiendo garantizar una compra perdurable (Sanchez

De La Cruz, 2018). Por consiguiente, se requiere emplear un método que permita

controlar el proceso de fermentación y con facilidad de manejo en campo,

proponiéndose la microencapsulación de inóculos masivos de levaduras

microencapsuladas de modo que se tenga control sobre el proceso.

De acuerdo con lo anterior, se formula la siguiente pregunta de

investigación ¿Cuál sería el impacto de los microencapsulados de levaduras en el

proceso de fermentación del café?

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 18

3. Justificación

Las nuevas dinámicas y tendencias comerciales sumado a las nuevas

motivaciones del consumo de alimentos y bebidas, donde la experiencia del

consumidor es importante y el aumento de la creciente demanda de cafés

especiales, invitan a revisar la oferta nacional y su evolución respecto a estos

nuevos tipos de alimentos (Arias et al., 2018). En relación con lo anterior, un café

es considerado especial cuando es percibido y valorado por una característica que

lo diferencie de los cafés convencionales; esta puede ser su aroma, sabor,

suavidad, lugar de origen, entre otros; a diferencia de los cafés convencionales,

estos fijan su precio por fuera del mercado bursátil, pero requieren procesos más

estandarizados con mayores controles dentro de los mismos, de los cuales la

fermentación es uno de los más importantes (Minciencias, 2021).

La fermentación del grano de café es crucial debido a que, a las

condiciones de higiene, los controles de clasificación, la temperatura y el tiempo

dependerá si la bebida producida contiene aromas y sabores dulces, cítricos,

frutales y tostados o, por el contrario, si se sobrepasa el tiempo y no se controlan

los factores de la fermentación, se tendrá un producto con defectos en el grano y

sabores agrios y a fermento en la bebida. Por lo tanto, es importante emplear

controles que permitan atribuirle una calidad al grano de café diferenciadora del

tradicional y esto es posible mediante la aplicación de levaduras (Camizán

Jaramillo, 2020). De acuerdo con lo anterior, estudios como el de Sanchez De La

Cruz (2018), en la utilización de la levadura Saccharomyces sp controlando el

tiempo de fermentación en el café (Coffea arabica) comprueba que es posible

realizar un proceso a menor tiempo (12 h) comparado con el tradicional (±80h) y

con características sensoriales similares, incluso mejores. Además, de acuerdo

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 19

con la investigación de Melo Pereira et al. (2015) en la fermentación controlada

de granos de café por cultivos iniciadores de la levadura Pichia fermentans YC5.2

ha permitido demostrar que este tipo de especies otorgan un sabor distintivo y una

alta calidad sensorial en la bebida de café.

Teniendo en cuenta lo anterior, con esta propuesta se pretende aplicar

levaduras seleccionadas, provenientes del proceso de fermentación del café

variedad Castillo de la zona de Trujillo, Valle del Cauca; que proporcionen calidad

microbiológica y aromas deseables en el grano, esto por medio del proceso de

microencapsulación, el cual ha sido identificado como un mecanismo que permite

dar estabilidad y supervivencia a distintos microrganismos, además, de facilitar el

manejo en campo y protección a condiciones ambientales o procesos industriales

que involucren temperatura, presión, oxigeno, luz, humedad, entre otros (Pérez-

Leonard et al., 2013). De acuerdo con las consideraciones anteriores, este estudio

va orientado a mantener la estabilidad del grano durante el proceso de

fermentación y calidad del producto final, con el fin de estandarizar el proceso.

4. Objetivos

4.1. Objetivo General

Evaluar el proceso de fermentación controlada del café mediante la adición

de una cepa de levadura microencapsulada seleccionada.

4.2. Específicos

• Establecer las condiciones de fermentación con aplicación de

levadura microencapsulada.

• Evaluar la influencia del porcentaje de inóculo de levadura

microencapsulada sobre la calidad microbiológica y las características

fisicoquímicas del grano de café.

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 20

5. Hipótesis

H0: el porcentaje de inóculo de levaduras microencapsuladas no tiene efectos en

las características fisicoquímicas y microbiológicas de la fermentación del café.

H1: el porcentaje de inóculo de levaduras microencapsuladas tiene efectos en las

características fisicoquímicas y microbiológicas de la fermentación del café.

6. Marco teórico

6.1 Generalidades del café

El café es una planta perenne tropical, perteneciente al género Coffea de la

familia Rubiáceas. Actualmente se reconocen más de 103 especies, existen tres

que tienen mayor importancia económicamente a nivel global: arábica,

cenophora y libérica. La variedad arábica constituye el 90% de café que se

comercializa internacionalmente, además es una de las variedades mejor

catalogadas por los consumidores, debido a sus excepcionales características

organolépticas. Por otra parte, el café cenophora y libérica corresponde al 9% y

1% del comercio internacional, respectivamente (Serna-Jiménez et al., 2018).

6.1.1 Fisiología del cultivo

Una de las variedades más sembradas en Colombia es el café Castillo con

un 24% en los diferentes terrenos del país, debido a que posee unas características

fisiológicas que le permiten adaptarse bien a las zonas tropicales de la región

andina y, no es tan susceptible a otras enfermedades y plagas producidas por las

variaciones climáticas (Fernández-Cortés et al., 2020). En el caso de que se

presentan períodos secos, la variedad Castillo presenta mejor resistencia frente a

la clorilisis (envejecimiento prematuro) y pérdida de follaje. Por otro lado, si

presenta condiciones de neblina y lluvias prolongadas, esta variedad no es tan

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 21

susceptible de presentar el crecimiento del hongo Mycena citricolor, también

conocido como “ojo de gallo”, en las hojas el cual ocasiona debilitamiento en la

planta y por ende una caída de los frutos.

6.1.2 Morfología del fruto

El fruto del café es una drupa monoespérmico lo que significa que contiene

una sola semilla en su interior, del cual es color verde al principio y cuando

alcanza su estado de maduración adquiere una tonalidad roja o púrpura y

raramente amarilla. Dentro de la morfología del fruto se encuentra los siguientes

tejidos (Santos, 2023):

o Pericarpio: Adquiere un tono rojo cuando la fruta madura, actúa

como una envoltura protectora para las demás estructuras del fruto

o Mesocarpio: Es el mucílago y posee una consistencia gelatinosa,

se encuentra ubicado por encima de la capa de pectina.

o Endocarpio: Es la cascarilla o pergamino de color crema que

envuelve a la semilla y tiene un color que varía de crema a marrón.

o Espermoderma: Recubrimiento plateado que envuelve a la

semilla.

o Endospermo: Es la semilla o grano del café previamente

constituido.

o Embrión: Se localiza en la parte saliente o convexa de la semilla

y está constituido por el hipocótilo y dos cotiledones.

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 22

Figura 1. Morfología del fruto. Fuente: (Yara, 2016).

o Capa de pectina: se encuentra en las paredes de la semilla y está

constituida principalmente de ácido poligalacturónico, que ayuda en la

fermentación (Guerra González & Rueda Silva, 2021).

6.2 Cafés especiales

De acuerdo con la Federación Nacional de Cafeteros, el café especial se

denomina así debido a que es percibido por los consumidores por alguna cualidad

que lo diferencia de un café convencional, aumentando su valor agregado. Por otra

parte, la Specially Coffee Asociatión of America, describe el café especial, como

aquel que presenta un tamaño y un secado característico que le otorgue un atributo

distintivo (Velásquez-Agudelo & Trávez-Velásquez, 2019).

Dentro de los cafés especiales se dividen 3 grupos:

6.2.1 Cafés de origen

Los cafés de origen suelen ser cafés especiales con notas distintivas,

provenientes del lugar de fabricación y no son mezclados con otras cualidades o

cafés de otras regiones, de tal manera, la importancia para estos consumidores

radica más en el origen que en la marca (Duarte Serrano, 2016).

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 23

6.2.2 Cafés sostenibles

Los cafés sostenibles cumplen con certificación y estándares muy altos,

dado que estos deben ser sostenibles con el medio ambiente, libres de

agroquímicos y cumplir con la certificación UTZ Rainforest Alliance (Velásquez-

Agudelo & Trávez-Velásquez, 2019).

6.2.3 Cafés de preparación

Estos cumplen con condiciones especiales de tamaño y apariencia dividido

en 3 subcategorías:

o Caracol: es característico por su acidez y por sus dimensiones

anormales (Prado et al., 2015).

o Supremo: los granos de café son más grandes respecto al

convencional (Velásquez-Agudelo & Trávez-Velásquez, 2019).

o Premium: obtienen esta categoría debido a que sus evaluaciones

sensoriales como color, aroma, sabor y entre otros, son mejores respecto a las

demás (Serna et al., 2018).

6.3 Fermentación del café

Durante el proceso de elaboración de café, la fermentación es una de las

etapas concluyentes sobre la calidad del grano, dado que durante esta etapa el

grano sufre diferentes reacciones bioquímicas derivadas de levaduras y bacterias

del mucílago. A lo largo de la fermentación los microorganismos oxidan los

azúcares, teniendo como resultado energía en forma de ATP y otros compuestos

como alcoholes, ácidos, aldehídos, cetonas, ésteres y dióxido de carbono. Estos

productos tienen un impacto en los cambios físicos y químicos como: el color,

olor, densidad, acidez, pH, actividad de agua, los cuales son influyentes sobre la
 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 24

calidad del grano, y todos estos factores están directamente relacionados con el

tiempo de la fermentación (Castro & Fajardo, 2016).

6.3.1 Sistemas de fermentación del café

• Fermentación en estado sólido (FES): Este proceso consiste en

recrear los sustratos necesarios ricos en nitrógenos y sales mineralizadas, bajo

ciertas condiciones específicas de humedad, pH y aireación permitiendo un mejor

desarrollo del microorganismo (Borrás-Sandoval & Torres-Vidales, 2016). En el

proceso del café, la FES, se realiza en un fermentador. En este entorno, el

mucílago actúa como sustrato para el crecimiento del microorganismo, además se

controla el desagüe del fermentador evitando derrames del mucílago, con el fin de

controlar la fermentación, manteniendo el mucilago lo más cerca del café, lo que

es esencial para el desarrollo de sabores y aromas en el grano del café (Puerta &

Echeverry, 2015).

• Fermentación en estado líquido (FEL): en este tipo de

fermentación los inóculos se encuentran sumergidos y los sustratos se encuentran

en la superficie del agua en forma líquida, por consiguiente, los microorganismos

se desarrollan libremente de forma suspendida o en cúmulos en el volumen del

recipiente (Paucar Barreno, 2016). Esta técnica permite tener mejor control en la

agitación, pH, humedad, temperatura, entre otras y por ende se desarrollan

procesos más estandarizados y mejor producción de biomasa respecto a la FES

(Vega-Oliveros et al., 2022).

6.3.2 Microorganismos asociados a la fermentación del café

A continuación, se describen algunos microorganismos presentes en la

fermentación del café:

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 25

[Link] Bacterias acido lácticas (BAL)

Las BAL han sido reconocidas como microorganismos esenciales en el

procesamiento del café, de las cuales se encuentran la Weissella, Lactococcus,

Lactobacillus y Leuconostoc que han sido catalogadas como dominantes en la

fermentación, debido a que son utilizadas como cultivos iniciadores en los

procesos de fermentación (Cruz O’Byrne, 2021).

[Link] Levaduras

Las levaduras también juegan un papel importante en el proceso de la

fermentación y además se ha demostrado que promueve la producción de bebidas

del café de alta calidad, dentro de este grupo se encuentran: Pichia, Candida,

Saccharomyces y Hanseniaspora, dentro de las que destacan Saccharomyces,

como género líder en la fermentación, debido a su importancia económica al

influir en las bebidas atributos dulces, florales y frutales (Cruz O’Byrne, 2021).

La Saccharomyces cerevisiae es una levadura que constituye el grupo de

microorganismos más íntimamente asociado al progreso y bienestar de la

humanidad, es una levadura heterótrofa, que obtienen la energía a partir de la

glucosa y tiene una elevada capacidad fermentativa. Puede aislarse con facilidad

en plantas y tierras, así como en el tracto gastrointestinal y genital humano

(Suárez-Machín et al., 2016).

• Meyerozyma caribbica: Esta levadura pertenece a la familia de

Debaryomycetaceae y al género de Meyerozyma, sus células se

caracterizan por ser ovaladas y esféricas con una membrana celular que

los rodea (ver Figura 2). Algunas de las características principales es su

versatilidad de consumir diferentes compuestos durante la fermentación

para producir compuestos como xilosa y xilitol, y en fermentar diferentes

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 26

compuestos, como la glucosa y la xilosa, además de su gran capacidad de

producir xilitol (Ayu et al., 2021; Tadioto et al., 2022).

Figura 2. Meyerozyma caribbica. Fuente: Elaboración propia.

• Pichia kluyveri: Es una especie de levadura que pertenece al género

Pichia y a la familia Pichiaceae, sus células son ovaladas y esféricas y un

poco alargadas (ver Figura 3), es una levadura fermentadora facultativa,

lo que significa que obtiene energía a través de la fermentación como de

la respiración aeróbica. Una de las características principales es su alto

potencial en tecnología vitivinícola, principalmente por su aporte al aroma

del vino, glicerol y rendimiento etanólico (Riquelme Toledo, 2023;

Vicente et al., 2021).

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 27

Figura 3. Pichia kluyveri. Fuente: Elaboración propia.

[Link] Hongos

Los hongos son organismos eucariotas que poseen su propio núcleo,

membrana celular, retículo endoplasmático y un aparato secretor. Muchos hongos

son aerobios obligados o facultativos, ser caracterizan por su tipo de reproducción

sexual y asexual, a su vez estos organismos son heterótrofos por ende depende de

otros organismos que les proporcione nutrientes para su crecimiento ya que no

pueden fabricar su propia fuente de carbono mediante la fotosíntesis (Menco

Tapia, 2020).

• Aspergillus níger: Es un hongo filamentoso que pertenece al

generó Aspergillus, es un microorganismos saprófito y ubicuo que

se encuentra en el suelo, aire y alimentos. Formas esporas

aerotransportadoras altamente pigmentadas que tienen paredes

celulares gruesas y baja actividad metabólica lo que le permite

soportar condiciones adversas (Cortesão et al., 2020). Otra

característica de este microorganismo es su influencia en la

producción de ocra toxina A (OTA), el cual es un metabolito

secundario que contamina una amplia gama de alimentos (Durand

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 28

et al., 2009). Estudios como Al-Ghouti et al. (2020) en la

determinación de aflatoxinas en el grano de café encontró que de

los géneros de hongos dominantes asociados con los granos de café

fueron del género Aspergillus spp. donde el que muestra mayor

incidencia sobre los granos de café es el A. niger.

• Aspergillius flavus: Es un hongo saprófito del suelo que infecta y

contamina antes y después de la cosecha con el metabolito

secundario cancerígeno llamado aflatoxina (Amaike & Keller,

2011). Hasta ahora se han identificado cuatro tipos de aflatoxinas

producidas por este hongo (B1, B2, G1 y G2); donde estudios

demuestran que la B1 es la más potente puesto que causa efectos

mutagénicos, cancerígenos y teratogénicos, por lo cual es conocido

como el agente genotóxico (Domijan et al., 2019).

• Penicillium spp. Es un hongo filamentoso de la familia

Trichomaceae, del orden de los eurotiales se caracteriza por

producir conidios granulares de bordes lisos verdes y amarillos

(Osaba et al., 2021). Algunas especies de Penicillium pueden

producir micotoxinas, puesto que estudios como el de Ramos

(2019) sobre el control de micotoxigénicos en queso maduro,

afirman que este hongo es uno de los contaminantes más

importantes en quesos maduros dado su capacidad de crecer en

condiciones húmedas y pH entre 5,0 y 7,0, así como en presencia

de oxígeno(Ramos, 2019).

• Syncephalastrum spp. Es un género de hongo filamentoso que

pertenece a la familia Syncephalastraceae y al orden de los

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 29

mucorales este se caracteriza por tener una estructura micelial que

se ramifica en forma de árbol. Se encuentra presente en distintos

tipos de sustratos orgánicos preferentemente en el suelo y estiércol

de zonas tropicales y subtropicales (Cruz-Choappa & Vieille,

2021). También se ha demostrado que algunas especies de

Syncephalastrum pueden producir micotoxinas, como la patulina

el cual es un potencial carcinógeno (Carranza-Mesén et al., 2022).

• Cunninghamella spp. Es un hongo filamentoso que pertenece a la

familia Cunninghamellaceae, del orden de los mucorales, esta

especie se destaca por ser saprófitas y se encuentran comúnmente

en alimentos, en restos de vegetales y excrementos de herbívoro

(Oyarzo & Choappa, 2020). Además, es un patógeno oportunista

causante de las infecciones mucormicosis, las cuales se

caracterizan por su gravedad y su alta tasa de mortalidad (Arellano

Galicia, 2019).

6.4 Microencapsulación

La microencapsulación se describe como una tecnología de encapsulación

de materias sólidas, líquidas y gaseosas con proporciones de nano escala que

abarcan los diámetros de 0.2-5000 µm, las cuales tienen como objetivo liberar su

contenido a ciertas velocidades bajo unas condiciones específicas (Esquivel‐

González et al., 2015). El proceso de microencapsulación se puede realizar de

diferentes maneras como por ejemplo la coacervación, co-cristalización,

polimerización artificial, gelificación iónica, incompatibilidad polimérica,

atrapamiento por lipomasas e inclusión molecular. De igual manera este proceso

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 30

se puede realizar mediante procesos mecánicos tales como la aspersión,

liofilización y extrusión (Jiménez González, 2017).

Una de las técnicas más empleadas en la microencapsulación es el método

de extrusión debido a su proceso el cual es relativamente menos complejo y más

económico respecto a los otros procesos, puesto que este método consiste en que

el material activo a encapsular pasa en forma de gotas por el extrusor a alta

presión, y este es recibido sobre un recipiente con alginato de calcio el cual es

comúnmente utilizado como material de recubrimiento para diferentes enzimas,

ácidos grasos y prebióticos debido a que genera cápsulas menos porosas que el

secado por aspersión (Reyna et al., 2015).

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 31

7. Antecedentes

En la literatura científica se evidencian trabajos relacionados con la

fermentación controlada del café mediante inóculo de levaduras, de los cuales se

ha tenido como fin evaluar el efecto de la fermentación asistida en la calidad del

grano y el perfil sensorial de la bebida. Es de anotar que no se encuentran

investigaciones asociadas a la inoculación mediante microencapsulación. A

continuación, en la Tabla 1 se presentan los artículos encontrados:

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 32

Tabla 1. Antecedentes

Autores y Producto Condiciones de proceso Resultados

año
Melo Pereira Café Levadura - Las cepas seleccionadas mostraron buen uso
et al. (2015) (Coffea Pichia fermentans YC5.2., potencial como cultivos iniciadores durante el
arabica cv. Fermentación espontánea (no procesamiento húmedo del café, otorgándole
Catuaí) inoculado), inoculado e perfiles sensoriales distintivos de los procesos
inoculado con sacarosa 2% tradicionales y con capacidad de dominar el
(p/v). mismo.
- Las levaduras tuvieron un impacto favorable en
las características químicas del grano.
- Se comprobó que es posible desarrollar bebidas
con alta calidad sensorial, alta acidez y sabores
distintivos a partir de la cepa utilizada.
Bressani et Café Método de inoculación: balde - Los cultivos iniciadores resultaron una alternativa
al. (2018) (Coffea (homogeneizado en cubetas de prometedora y viable económicamente para
arabica cv. poliestireno), directo (rociado mejorar la calidad sensorial de la bebida del café y
Catuaí sobre la cereza). así aumentar su valor de producto final
Amarelo) Levaduras: Saccharomyces - El método de inoculación dependió de la levadura
cerevisiae CCMA 0543, seleccionada.
Candida parapsilosis CCMA - La S. cerevisiae CCMA 0543 presentó una
0544 y Torulospora diferencia significativa en el análisis sensorial,
delbrueckii CCMA 0684. mostrando un mejor resultado en el método por
balde y adicional otorgó sabores característicos
como a plátano y marañón.
Cruz & Café cereza Fermentación: abierta y - Las levaduras y bacterias ácidos lácticas (BAL)
Pivaral (Coffea cerrada. mostraron mejor crecimiento en la fermentación
(2018) arabica L. abierta.
 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 33

var. Tipo de inóculo: sin levadura, - Todos los tratamientos obtuvieron un perfil final
Catuaí) cepa L2, L´ORO y Fermipan. de taza mayor a 84 puntos, lo cual los clasifica
dentro de la categoría de cafés especiales.
- La utilización de la Saccharomyces cerevisiae
L’ORO otorgó sabores distintivos (tamarindo,
arándanos y bayas) y de alto perfil sensorial, y,
asimismo, desarrolló perfiles de azúcares y
proximales que permiten diferenciar el producto
resultante del obtenido por el sistema de
fermentación tradicional.

Sanchez De Café Tiempo de fermentación: 4, 8 y - Hubo un impacto positivo en la calidad del

La Cruz (Coffea 12 h. producto asociado a la fermentación controlada.
(2018) Arabica) Dosis de Saccharomyces - El mejor tratamiento fue la adición de 60 mL de
cerevisiae: 20, 40 y 60 mL Saccharomyces sp con un tiempo de 12 h ya que el
producto resultante obtuvo las mejores
características fisicoquímicas y mejor perfil
sensorial.
- La adición de levadura permitió completar un
proceso en menor tiempo (12 h) con cualidades
sensoriales semejantes al proceso habitual (±80).

Samaniego Café Tiempo de fermentación: 48 y - La asistencia con inóculo de Saccharomyces

(2019) (Coffea 60h. cerevisiae afectó positivamente los atributos
Arabica Fermentación: con inóculo de sensoriales del café
var. Saccharomyces cerevisiae y - La aplicación de CO2 aumentó los atributos de
Geisha) sin inóculo. balance y cuerpo del grano, aumentando su puntaje
Inyección de CO2: sí y no. final en el perfil final de taza.
 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 34

- La utilización de CO2, el tipo y tiempo de

fermentación tuvieron impacto sobre la cafeína, el
contenido de grasa y los ácidos clorogénicos del
producto.
- En el recuento final de microorganismos de la
fermentación, las levaduras presentaron mayor
concentración, seguida de las BAL y hongos.

Betancur & Café Tipo de fermentación: lavado o - La fermentación asistida influyó positivamente la
Zurita (2020) (Coffea natural calidad final del café sin depender del tratamiento
Arabica Fermentación: con inóculo de (lavado o natural).
var. Saccharomyces cerevisiae, sin - La adición de inóculo de Saccharomyces
Caturra) inóculo y sin fermentación. cerevisiae mejoró satisfactoriamente la calidad del
café húmedo.
- No se identificaron diferencias en los recuentos
de hongos y levaduras.
- Hubo una reducción de temperatura, pH en la
fermentación controlada y una disminución de los
sólidos solubles en los tratamientos inoculados.
Fuente: elaboración propia.
 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 35

8. Materiales y métodos

8.1 Materiales

8.1.1 Cultivos Iniciadores

Para la elaboración de cultivos iniciadores se utilizaron levaduras

autóctonas del grano de café provenientes de tres fincas cafeteras provenientes de

la región Trujillo de Valle del Cauca. Estos microrganismos fueron seleccionados

de acuerdo con su caracterización morfológica y bioquímica, formación de

biomasa y perfil aromático en el laboratorio de Microbiología y Biotecnología

aplicada (MIBIA) de la Facultad de Ciencias Exactas de la Universidad del Valle

dentro del proyecto “Fortalecimiento de la competitividad de los cafés especiales

del centro del Valle del Cauca” - CAFINNOVA VALLE en vinculación con

Minciencias.

8.1.2 Medios de cultivo y mantenimiento de los microorganismos

Para el crecimiento y mantenimiento de las levaduras que se emplearon

como cultivos iniciadores se utilizaron los siguientes medios: medio YPD con

modificaciones utilizando pulpa de café (zona de Trujillo del Valle del Cauca) y

otros nutrientes (ver Tabla 2) y medio comercial de extracto de malta. Estos

microrganismos fueron mantenidos en crioconservación a -20 °C y en tubos

inclinados a 5 °C para uso inmediato y activación. Además, se usaron medios de

cultivo VRB (enterobacterias), PDA (hongos) y MRS (BAL) para la estabilidad y

evolución microbiológica de la fermentación en café.

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 36

Tabla 2. Medio a base de pulpa de café

Material Dosificación (%)

Pulpa de café 91,91
Glucosa anhidra 0,37
Extracto de levadura 2,76
Peptona 0,92
Pectina cítrica rápida 0,92
Fructosa 0,37
Fuente: (Hawaz et al., 2023; Judakova et al., 2023).

[Link] MRS (Man, Rogosa y Sharpe)

Medio enriquecido con nitrógeno, carbono y otros elementos necesarios

para el crecimiento de BAL (Torres, 2018). Este se preparó con agua destilada a

una concentración de 52.2 g/L, una vez esterilizado, se le adicionó azul de anilina

con el objetivo de diferenciar bacterias acido lácticas. Finalmente se almacenó a

5°C hasta su uso (Muhialdin et al., 2020).

[Link] Extracto y caldo de Malta

Se utilizó extracto y caldo de malta para incubar las levaduras basándose

en el método de Correa (2019) en su estudio de “Caracterización del crecimiento

in vitro del hongo Neofabraea vagabunda”.

[Link] VRB (Entéricas)

Se utilizó el medio VRB para el cultivo de microrganismos entéricos,

empleando el método seguido por Chiara (2019) en su artículo de “Aislamiento,

identificación y evaluación microbiana de la Escherichia coli en pollos de

engorde”.

[Link] PDA (Hongos)

Se usó el medio PDA para el cultivo de hongos empleando el método

seguido por Correa (2019).

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 37

8.1.3 Materiales de Microencapsulación

Se utilizó almidón de maíz de la variedad waxy (Ingredion Colombia S.A),

alginato de sodio (con D–manurónico y L-gulurónico, con un peso molecular de

entre 80.000 – 120.000 g/mol) (Sigma-Aldrich) (Steinhein, Alemania),

exopolisacárido producido por la bacteria Weisella confusa y cloruro de calcio

(Agenquímicos) (Cali, Colombia) (Briceño-Veléz, 2020).

[Link]. Exopolisacárido (EPS)

Se empleó exopolisacárido obtenido del microrganismo láctico W.

Confusa, esta es una bacteria ácido-láctica, de alto rendimiento y gran productora

de EPS (Du et al., 2022). Este microorganismo pertenece a la colección de cepas

del laboratorio MIBIA.

8.1.4 Materia prima

Se utilizó café de la variedad Castillo obtenido de las fincas de la región

de Trujillo, Valle del Cauca.

8.2 Métodos

8.2.1 Pruebas preliminares para la elaboración del inóculo iniciador

Se efectuaron ensayos preliminares sobre el desarrollo de las levaduras

entregadas (P. kluiveri y M. caribbica) en los medios de cultivo citados en el ítem

8.1.2, verificando su viabilidad y reportándose la formación de UFC/g en los

medios de cultivo. Las verificaciones se hicieron desde que se añadieron las

levaduras a los medios, en intervalos de 4 h hasta llegar a las 24 h. Esto determinó

la afinidad del microorganismo para su desarrollo en el sustrato propuesto.

Basándose en los resultados obtenidos se definió la formulación del medio y la

levadura para el microencapsulado y las pruebas de fermentación.

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 38

[Link] pH

La determinación del pH se realizó en un pH-metro (Orion, 710-A) a 20

°C, tomando 10 mL del medio de cultivo homogenizado previamente (Bozkurt &

Erkmen, 2002).

[Link] Consumo de azúcares totales y reductores

Para la cuantificación del consumo de azúcares totales y reductores, se

siguieron los métodos de antrona y DNS (ácido 3,5-dinitrosalicílico) propuestos

por Moran-Mejía et al. (2021), respectivamente. En la Figura 4 y Figura 5 se

presentan las curvas de calibración correspondientes.

1,000
0,900 y = 0,3926x - 0,0912
R² = 0,9705
0,800
Absorbancia (nm)

0,700
0,600
0,500
0,400
0,300
0,200
0,100
0,000
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00
Disolución (mL)

Figura 4. Curva de calibración para azúcares totales. Fuente: Elaboración

propia
 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 39

0,800

0,700 y = 0,7461x - 0,0099

0,600 R² = 0,9988

Absorbancia (nm) 0,500

0,400

0,300

0,200

0,100

0,000
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
-0,100
Disolución (mL)

Figura 5. Curva de calibración para azúcares reductores. Fuente: Elaboración

propia.

[Link] Biomasa

Se tomó 1mL de cada medio con su levadura correspondiente hasta

llevarlo a una dilución de 106 para posterior siembra en extracto de malta e

incubación a 37.5°C. Finalmente, al cabo de los 2 días se realizó un conteo

microbiológico de las cajas Petri con el fin de identificar que levadura produjo

mayor biomasa y cuál fue el tiempo óptimo de mayor crecimiento.

8.2.2 Inhibición de hongos

De acuerdo con los resultados de biomasa se eligió la M. caribbica como

levadura seleccionada para las pruebas de fermentación. Previamente, a esta

levadura se le hizo la prueba de inhibición de hongos con cinco cepas aisladas de

la fermentación del café de las fincas de la zona del Trujillo. Después de aislar los

hongos, se sembraron en tubos de agar de PDA inclinado mediante un movimiento

en zigzag. Una vez que el cultivo alcanzó un crecimiento óptimo, se agregó una

solución de agua peptonada para obtener una disolución de 10-1, que luego se llevó
 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 40

a 10-3 para extraer 100 µL y sembrarlos en cajas Petri de PDA, conjuntamente,

mediante un isopo estéril se extendió el inóculo hasta su absorción total.

Adicionalmente, en otra caja Petri con extracto de malta se adicionó la

levadura hasta alcanzar su pico de crecimiento. De este medio, se tomó un botón

con un diámetro de 6 mm, asegurándose de que la cara donde se encuentre el

microorganismo este en contacto con la caja del hongo previamente extendido,

finalmente se dejó crecer aproximadamente por 48 horas para su posterior análisis.

8.2.3 Elaboración de microencapsulado

Se siguió el modelo de Briceño-Veléz (2020), el cual se basa en la

modificación del método de extrusión sugerido por Turhan et al. (2017) y

Shaharuddin & Muhamad (2015). Las cepas de levaduras se activaron en el medio

escogido de la cinética de crecimiento (medio a base de pulpa de café) a 35°C

durante 20 h, posteriormente se centrifugó el caldo de crecimiento a 4000 rpm

durante 10 min (Gandomi et al., 2016). El sobrenadante fue retirado y luego

lavado el botón con peptona al 0.1%, en el cual se acumulara hasta obtener

suspensiones que contengan 9 log UFC/mL. La verificación se efectuó mediante

el ajuste a la lectura en escala de McFarland.

Por otro lado, el almidón de maíz, el EPS y alginato de sodio descrito en

los ítems 8.1.3 y [Link] se sometió a esterilización en autoclave (Market Forget

STM-EL, USA) a 121°C durante 15 minutos. Posteriormente, la solución de

almidón, EPS y alginato de sodio se mezclaron en una plancha de agitación

(Benchmark, H3760-H, USA) con una suspensión celular activa de 10 mL. Las

suspensiones se sometieron a un proceso de aspersión utilizando un aspersor

(Discover LN-I; mini compresor Discover TC-06, USA) con un diámetro de

boquilla de 0.5 mm, recibiéndose en una solución estéril con 0.1 M de cloruro de
 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 41

calcio (CaCl2) como solución de endurecimiento. Después de 15 minutos de

gelificación en CaCl2, el material se centrifugó a 4000 rpm durante 10 minutos, y

se secó en un horno de convección natural a 40°C durante 3 horas. Seguidamente,

el material fue molido y empacado para posterior uso como inóculo iniciador. En

la Figura 6, se muestra el procedimiento para la microencapsulación.

Figura 6. Método de microencapsulación. Fuente: Briceño-Vélez (2020).

8.2.4 Caracterización del microencapsulado

En la caracterización de los ME se emplearon los siguientes métodos

planteados por Briceño-Veléz (2020):

[Link] Porcentaje de microencapsulación (PM)

Para calcular el porcentaje de ME, se usó la siguiente ecuación (ver

Ecuación 1).

N
%PM = ∗ 100 Ecuación 1
N0
 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 42

Donde N es el número de células ME liberadas de las microcápsulas Log

(UFC/g) microcápsulas y N0 es el número de células liberadas añadidas a la

mezcla encapsulante durante la producción de microcápsulas Log (UFC/g).

[Link] Viabilidad del ME

Para el recuento de células viables se utilizó el método seguido por

Briceño-Velez (2020).

[Link] Tiempo de liberación para los Microencapsulados de Rápida

Liberación (MRL)

Se determinó tomando en cuenta que la formulación propuesta era de

mecanismo de rápida liberación, ya que se requería que la M. caribbica tuviera

efecto en la fermentación desde el primer momento.

8.2.5 Fermentación del café y porcentaje de inóculo

Se usó un diseño completamente al azar en donde se evaluaron tres

porcentajes de inóculo de M. caribbica en el ME (porcentaje de inóculo de

levadura: 0, 3 y 5%) (ver Tabla 3). Cada tratamiento se realizó por triplicado. Las

variables de respuesta fueron los siguientes parámetros de fermentación: azúcares

totales y reductores, características fisicoquímicas (pH, temperatura y acidez total)

y la calidad microbiológica (conteo de hongos, levaduras, bacterias lácticas,

mesófilos aerobios, coliformes y colonias entéricas) del grano fermentado de café.

Adicionalmente, se hizo un tratamiento combinado de 3% levadura más 3% de la

bacteria láctica Lactobacillus plantarum.

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 43

Tabla 3. Diseño completamente al azar para la levadura seleccionada.

Variables de proceso Niveles Variables de respuesta

% de Inóculo de levadura 0% Azúcares totales y reductores

en ME
3% Características fisicoquímicas

5% Calidad microbiológica

3%+3%

Fuente: elaboración propia.

La fermentación del café se realizó en frascos estériles de 1L (Schott), a

los cuales previo al inicio del proceso, se le agregaron 100 g de semilla de café,

45 mL de agua más los ME. Los frascos se mantuvieron en una cámara climática

Memmert ICH 750 con temperatura de 20 ± 0,5 °C y humedad relativa de 70 ±

5%.

8.2.6 Parámetros de fermentación

Se evaluaron los parámetros de fermentación y, la estabilidad y evolución

microbiológica del proceso antes del ME, en proceso con el ME y al finalizar. Lo

anterior se hizo con el fin de determinar el efecto del porcentaje de inóculo de

levadura en el café.

[Link] Azúcares totales y reductores

Para determinar el consumo de azúcares totales y reductores, se siguieron

los métodos de antrona y DNS (ácido 3,5-dinitrosalicílico) propuestos por Moran-

Mejía et al. (2021), respectivamente. Para las curvas de calibración se utilizaron

las descritas en el ítem [Link]

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 44

[Link] Características fisicoquímicas

[Link].1 pH

Se tomaron 10 mL del licor de café homogenizado para posterior medición

de pH mediante un pH metro (Orion, 710-A) a 20 °C.

[Link].2 Temperatura

Se registraron los datos resultantes por la cámara climática Memmert ICH

750.

[Link].3 Acidez total

Se pusieron 10 mL del licor de café en un erlenmeyer, al cual se le añadió

una gota de fenolftaleína y luego se tituló con NaOH al 0.1N hasta obtener una

solución con coloración rosada. La acidez se calculó como ácido acético acorde

con lo descrito por Granados et al. (2013).

[Link] Estabilidad y evolución microbiológica de la fermentación en café

Los recuentos que se realizaron se presentan a continuación:

[Link].1 Recuento de colonias (entéricas, lácticas, hongos y levaduras)

Se tomó 1 mL de muestra al que se le adicionó 9 mL de agua peptona a fin

de elaborar una mezcla homogénea mediante un homogeneizador

(Intersciencie/minimix®PCC® 100 mL) durante 10 minutos. Posteriormente se

realizaron diluciones de 1 mL de la mezcla mediante tubos de ensayos hasta llegar

a la sexta dilución. Seguidamente, se tomaron 100 μL de las tres últimas diluciones

para sembrarlas en medio de cultivos MRS con azul de Anilina (bacterias lácticas)

(Britania Lab), VRB (entéricas), PDA (hongos) y extracto de malta (levaduras).

Finalmente, para el conteo se incubaron a 37.5°C (Kryoven) durante 48 h para las

bacterias lácticas y entéricas, y 60 h para los hongos y levaduras.

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 45

[Link].2 Recuento de coliformes totales

Se tomó 1 mL de las tres primeras diluciones nombradas anteriormente

para inocularlos por separado en tubos de 9 mL de caldo Sulfato Lauryl, a los

cuales se les adicionó la campana de Durham para verificar la producción de gas.

Posteriormente, se dejaron en incubación a 37.5° C por 48 h (Kryoven). En caso

de observar presencia de gas (burbuja en la campana), se le hacía prueba de Indol

usando el reactivo de Kovacs con el fin de verificar si hay existencia de

Escherichia coli, la cual indica un anillo de color rojo en el tubo (prueba positiva)

o color verde (prueba negativa).

8.2.7 Pruebas estadísticas

Se empleó el programa estadístico MiniTab versión 20,3, donde se realizó

el ANOVA para el diseño experimental mencionado anteriormente (ver Tabla 3)

con un nivel de significancia o rechazo (α = 0,05).

9. Análisis de resultados

9.1 Cinética de crecimiento

9.1.1 Biomasa

Inicialmente se realizó un análisis preliminar mediante una cinética de

crecimiento de las dos levaduras recibidas, Pichia kluyveri (1) y Meyerozyma

caribbica (2), en dos medios de cultivo, extracto de malta (EM) y medio a base

de pulpa de café (CF). Los datos se encuentran en la Figura 7.

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 46

8,00 CF1 CF2 EM1 EM2

7,50

Levaduras Log(UFC/g)
7,00
6,50
6,00
5,50
5,00
4,50
4,00
0 4 8 12 16 20 24
Tiempo (horas)

Figura 7. Viabilidad reportada de Meyerozyma caribbica y Pichia kluyveri al

cabo de 24 h. Fuente: elaboración propia.
De la Figura 7 se observa que el medio EM con la levadura 2 se obtiene

la mayor cantidad de biomasa a partir de las 8 horas aproximadamente donde

posterior a este tiempo adquiere un comportamiento constante, dado que al

emplear un medio comercial como el EM que es generalmente nutritivo y

compuesto de azúcares simples (enfocado para el crecimiento de

microorganismos), se tienen mejores resultados (Palacio & Ramírez, 2020).

Adicionalmente, estudios recientes como el de Kaur et al. (2023), sobre la

evaluación potencial de producción de xilitol en paja de arroz, han demostrado

que la Meyerozima Caribbica puede producir cantidades de biomasa

considerables en condiciones óptimas, por lo que tiene gran capacidad para crecer

rápidamente, tal como sucede en la cinética de los dos medios.

De igual manera se observa en la Figura 7 que al cabo de las 20 horas

empleando el medio CF con la levadura 2, se tiene un comportamiento semejante

al extracto de malta con esta levadura, debido a que el medio a base de café, es

una modificación del medio YPD el cual contiene extracto de levadura y peptona

que aportan vitaminas, nutrientes, aminoácidos, péptidos y proteínas que

estimulan el crecimiento (Hawaz et al., 2023). Asimismo, como complemento de

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 47

fuente de energía, se suele usar glucosa dextrosa, sin embargo, durante la

investigación se usó glucosa anhidra debido a que es un compuesto estable y

fácilmente disponible, adicional a esto, se agregó pectina cítrica, fructosa y pulpa

de café, como estimulantes en la acidez (Judakova et al., 2023).

Por lo tanto, del estudio de viabilidad realizado se encontró que la levadura

2 tiene un crecimiento más rápido que la 1 (ver Figura 7), asimismo que tiene un

desarrollo óptimo a las 20 h y que no tiene gran diferencia en el número de

colonias desarrolladas en los dos medios al cabo de ese tiempo.

9.1.2 pH

De la Figura 8 se observa que a medida que transcurre el tiempo las

levaduras reducen el pH de los medios.

7,00 CF1 CF2 EM1 EM2

6,50

6,00
pH

5,50

5,00

4,50

4,00
0 4 8 12 16 20 24
Tiempo (horas)

Figura 8. Evolución del pH durante la cinética de crecimiento. Fuente:

elaboración propia.
Este fenómeno se debe a la capacidad de las levaduras de consumir los

azúcares presentes en los medios y producir ácidos orgánicos tales como málico,

acético, láctico, entre otros, que contribuyen a disminuir el pH del medio o

generalmente el de una fermentación (Rosero et al., 2015). De igual manera

empleando un medio CF se obtienen valores de 4,50 cercanos a una fermentación

del café, donde Mahingsapun et al. (2022) en su estudio acerca de la mejora de la

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 48

calidad del café Arábica bajo fermentación controlada, obtuvo en la muestra

control un pH de 4,61 al cabo de 24 h.

9.1.3 ° Brix, azúcares totales y reductores

En la Figura 9 (a) se observa como las levaduras van transformando los

sólidos solubles del medio de cultivo CF, donde se aprecia que en este medio la

tendencia es decreciente el cual es un comportamiento ideal dado que las

levaduras tienen la capacidad de consumir los azúcares como la glucosa y

fructosa, para la producción de energía (Hawaz et al., 2023). Por otro lado, en los

medios EM se difiere el comportamiento, donde una de las posibles causas es la

hidrólisis del extracto de malta donde los carbohidratos presentes en él se

descomponen en unidades más pequeñas de azúcares simples como la maltosa y

glucosa, liberando más azúcares, y a su vez estas levaduras las consumen para

producir alcohol y CO2 (Figueroa Acedo, 2019). Es de destacar, que este medio

está compuesto por extracto de malta (en composición, 75-80% ° Brix y 50-65%

azúcares reductores), dextrina, glicerina, peptona de gelatina, y agar lo cual le

rinda condiciones óptimas de crecimiento a los microorganismos para el cual fue

diseñado, en este caso levaduras (Palacio & Ramírez, 2020).

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 49

7,0 0,080
CF1 CF2 CF1 CF2

Azucares reductores (g
6,0 EM1 EM2 0,070
0,060 EM1 EM2

Glucosa/mL)
5,0
0,050
4,0
°Brix

0,040
3,0
0,030
2,0 0,020
1,0 0,010
0,0 0,000
0 4 8 12 16 20 24 0 4 8 12 16 20 24
Tiempo (horas) Tiempo (horas)
(a) (b)
0,200 CF1 CF2
EM1 EM2
Azucares totales (g

0,150
Glucosa/mL)

0,100

0,050

0,000
0 4 8 12 16 20 24
Tiempo (horas)
(c)
Figura 9. Evolución de la cinética de los parámetros fisicoquímicos de los
diferentes medios EM y CF para las levaduras: 1 y 2. a) ºBrix, (b) azúcares
reductores y (c) azúcares totales durante la cinética de crecimiento. Fuente:
elaboración propia.

Del mismo modo, en las demás figuras (b) y (c) se observan los cambios

de los azúcares reductores y totales, los cuales permiten estudiar la actividad

metabólica de los microorganismos y su capacidad de utilizarlos como fuentes de

energía. En ese orden de ideas, los reductores se degradan mediante hidrólisis en

el medio ácido y luego se oxidan parcialmente por las levaduras y bacterias ácidos

lácticas con el fin de producir etanol, ácido láctico, dióxido de carbono y otros

compuestos (Puerta, 2013a). De este modo, se obtiene un comportamiento similar

a los º brix donde al inicio coincide con la cantidad de nutrientes que poseen los

medios diluidos en agua y con el pasar de las horas se va evidenciando, como

estos, son consumidos por las levaduras a medida que se van produciendo los

ácidos resultantes y se disminuye el pH (ver Figura 8) (Rodríguez, 2015).

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 50

Por lo tanto, de los datos obtenidos del análisis preliminar se concluyó que

la levadura a utilizar para el microencapsulado fue la M. caribbica debido a que

tuvo un mejor crecimiento que la P. kluyveri conforme pasaba el tiempo,

asimismo, que se empleó el medio de café ya que presento una viabilidad similar

al cabo de las 20 horas y es un medio menos costoso para su utilización.

9.2 Inhibición de hongos

Consecutivamente, en la Figura se observa la evolución de la M. caribbica

en la prueba de hongos realizada con las cepas aisladas de la fermentación del

café.

(a) (b) (c)

(d) (e)

Figura 1. Evolución de la Meyerozima caribbica ante diferentes hongos: (a)

Aspergillus niger (b) Aspergillus flavus (c) Syncephalastrum racemosum (d)
Cunninghamella spp (e) Penicillium spp. Fuente: elaboración propia.
 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 51

Una cereza de café contiene entre 50-55% humedad y una aw entre 0,97-

0,98, por lo que posee un riesgo de ser afectado por alteraciones microbiológicas,

entre ellas enfermedades fúngicas que pueden disminuir su producción y

rendimiento (Moran Carpio, 2023). Entre los principales hongos que se han

encontrado después de 48 horas de fermentación, géneros como el Aspergillus,

Penicillium, Fusarium y Cladosporium representan un 42.6% de su aparición,

asimismo, pueden presentarse mohos de los Rhizopus, Trichoderma y Mucor

(Puerta et al., 2015). Es por ello, que deben emplearse buenas prácticas de

manufactura y de sanitización en el procesamiento agrícola del café.

Por otro lado, estudios relacionados con el potencial inhibitorio de

fitopatógenos por parte de la M. caribbica; Bautista-Rosales et al. (2013) ha

comprobado que la levadura presenta mecanismos de acción aptos para

contrarrestar el fitopatógeno Colletotrichum gloeosporioides que afecta la

postcosecha del mango, inhibiendo en un 86,7% el hongo. De igual forma, Xu et

al. (2013) en su investigación sobre la pudrición en la postcosecha de duraznos

generada por Rhizopus ha demostrado que el biocontrol con M. caribbica reduce

significativamente las lesiones producidas por el hongo. En este sentido, ambos

estudios indican que la cepa tratada proporciona un mecanismo de competencia

por espacio y nutrientes óptimo para el tratamiento de infecciones

causadas por estos fitopatógenos en frutas y hortalizas, ya que se

ha demostrado que estas levaduras forman muescas en el micelio de los hongos,

distorsionándolo y eventualmente causando rupturas en sus células; a través

de las enzimas glucanasa, quitinasa y proteasa.

En relación con lo anterior, en la Figura se observa como la M. caribbica

inhibe todas las cepas en el punto de origen donde fue sembrada, por lo que aparte
 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 52

de tener una buena producción de biomasa puede combatir gran variedad de

hongos que afectan el procesamiento del café y así obtener mejores rendimientos

en su producción. En ese orden de ideas, estudios como el de Cruz & Pivaral

(2018) explica que la utilización de levaduras como cultivos iniciadores crea un

ambiente de competitividad de espacio y nutrientes, entre ellas y los

microorganismos patógenos, disminuyendo la presencia de hongos y obteniendo

productos muchos más inocuos y estables en términos de calidad, por lo que al

añadir más concentración de levaduras se reduce el riesgo de producción de

toxinas micóticas, ya que actúan con un efecto antagónico (Samaniego, 2019).

9.3 Microencapsulado (M. caribbica):

A partir del microencapsulado realizado se hizo la caracterización de este,

para conocer con qué condiciones se trabajaba antes de la fermentación. Los datos

se registraron en la Tabla 4.
 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 53

Tabla 4. Caracterización del microencapsulado

aw %CHbh Viabilidad %Microencapsulado Solubilidad (%) Humectabilidad (s) Densidad (g/mL)

0,479 1,299 1,25E+07 85,84 51,76 34,22 3,85

Fuente: elaboración propia

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 54

De los datos de Tabla 4 se tiene un porcentaje de microencapsulado de

85,84% para la levadura en cuestión, indicando que el proceso utilizado en el

estudio ha demostrado ser efectivo, puesto que otros autores como Martins et al.

(2022) en su investigación sobre “microencapsulación de levaduras epífitas del

café mediante secado por aspersión” obtuvieron un rendimiento inferior al 50%,

dado que la tolerancia de temperatura de la levadura se sitúa alrededor de los 28-

30°C y al emplear temperaturas relativamente altas, estas inhiben su crecimiento.

Respecto a la aw del microencapsulado se obtuvo un valor de 0,479, altamente

beneficiosa, ya que contribuye a la conservación y calidad del producto, puesto

que delimita la proliferación de microorganismos no deseados, además que, al

reducir la disponibilidad de agua, se ralentizan los procesos de deterioro y se

prolongan la vida de útil del producto (Velez et al., 2021). El valor obtenido de aw

en el microencapsulado es relevante en el contexto de la literatura científica pues

otros autores como Köprüalan et al. (2022) y Velez-Erazo et al. (2021) obtuvieron

una aw de 0,21 y 0,288 respectivamente, destacando los beneficios de una aw baja

en la conservación y calidad del producto.

En relación con la humectabilidad del microencapsulado se tiene un valor

de 34,22 s el cual indica que hay una buena interacción entre el líquido circundante

y el microencapsulado, teniendo una liberación controlada de la levadura. En

comparación con otros estudios Köprüalan et al. (2022) reportó un valor de 57,48

s al microencapsular extracto oleoso de cúrcuma, del cual deducen que el tiempo

es bajo es debido a que el polvo obtenido es hidrófilo gracias a la maltodextrina.

En el caso del microencapsulado obtenido en la investigación, el almidón waxy

utilizado es altamente hidrofílico debido a su alto contenido de amilosa, por

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 55

consiguiente se tiene un producto con buena humectabilidad (Arboleda-Murillo et

al., 2022).

Por otra parte, para la solubilidad se obtuvo un valor de 51,76%

corroborando que el producto obtenido es soluble en agua. Asimismo, otra de las

causas por cual se tiene buena afinidad con el agua, es la correlación que existe

con el tamaño de partícula de los polvos, cuanto menor su tamaño, mayor será la

superficie de hidratación. No obstante, a pesar de que los microencapsulados

tienen tamaños pequeños, este porcentaje se ve afectado por la aglomeración de

las partículas. Comportamiento semejante a Nthimole et al. (2022), quienes

encapsularon jugo de frambuesa utilizando maltodextrina, goma arábiga y almidón

waxy como agentes encapsulantes, reportando solubilidades de 60.83±0.08%, 60.25

± 0.14% y 54.52 ± 0.03%, respectivamente. Del cual mencionaban que la solubilidad

era afectada por la aglomeración de los polvos.

Adicionalmente, se hizo una prueba del tiempo de liberación del

microencapsulado, teniendo en cuenta que la composición de los componentes

con que se realizó era para obtener un producto de liberación rápida. Este tiempo

de liberación depende de varios factores como lo son el tipo y geometría de la

partícula, la difusión del compuesto volátil a través de la matriz, la transferencia

de la matriz al medio ambiente, y la degradación/disolución del material de la

matriz. En ese sentido, tener una liberación controlada del proceso contiene

múltiples beneficios, ya que permite tener los ingredientes activos durante

periodos prolongados de tiempo a velocidades adecuadas, evitar o reducir

pérdidas de nutrientes durante el procesamiento, además de que se pueden separar

componentes reactivos o incompatibles (Cruz de la Cruz, 2018). En ese sentido,

como se observa en la Figura 10 la primera cápsula se libera a los 5 min y se

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 56

mantiene mayor a 6 Log UFC/g durante el tiempo; este tiempo es adecuado para

la fermentación del café puesto que según Castro & Fajardo (2016) en su

investigación relacionada con los procesos tradicionales de fermentación del café

en Nariño, al usar los tiempos de fermentación definidos por los caficultores de

17 fincas diferentes de la región, se encontraron tiempos de fermentación

promedio de 18,94±3,4 horas para la cereza de café variedad Caturra y Castillo,

respectivamente. Sin embargo, no se hallaron diferencias significativas entre las

variedades, pero si por los clústeres agroclimáticos (clúster A≤1650 y B≤1651–

2100 msnm) en los tiempos de fermentación. En ese orden de ideas, acorde con

Puerta, (2015) explica que el tiempo de fermentación debe ser un parámetro

establecido por cada finca, según la altura de la zona, la temperatura del lugar, el

grado de madurez del fruto, el tipo de fermentación, entre otros factores; de modo

que se evite la sobre fermentación del grano, que puede afectar los aspectos

sensoriales del producto. Por lo tanto, se necesita que el microencapsulado actúe

de manera rápida y finalmente su tiempo de liberación cumple con esta condición

(5 minutos).

7
M. caribbica Log(UFC/g)

6
5
4
3
2
1
0
0 3 6 9 12 15
Tiempo (min)

Figura 10. Tiempo de liberación del ME (MLR). Fuente: elaboración propia.

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 57

Por último, en la Figura 11 se tiene la curva de secado del

microencapsulado donde se observa que a las 2:10h se tiene un peso casi que

constante, lo cual es un tiempo bajo para obtener un producto con condiciones de

conservación favorables (ver Tabla 4).

15,0
14,0
13,0
12,0
Peso (g)

11,0
10,0
9,0
8,0
7,0
6,0
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Tiempo (min)

Figura 11. Cinética de secado del ME. Fuente: elaboración propia.

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 58

9.4. Parámetros de fermentación

9.4.1 ° Brix, azúcares reductores y totales

En la Figura 12 (a), (b) y (c) se observa la evolución de los ° Brix, azúcares

totales y reductores, respectivamente, durante los días de fermentación empleando

diferentes concentraciones de la M. caribbica microencapsulada.

0% 3% 5% 3%+3%
7,2
a
6,9
6,6
6,3
°Brix

b
6,0
5,7
5,4 a
a
5,1 c b b
a c
4,8
0 1 2 3 4 5 6
Tiempo (días)
(a)
0,240 0,220
0% 3% 5% 3%+3% Finca 0% 3%
Azucares reductoes (g Glucosa/mL)

0,220 0,200 a 5% 3%+3%

Azucares totales (g Glucosa/mL)

a
0,200 b 0,180 Finca
0,180 c 0,160 a
0,160 0,140
0,140 0,120
0,120 b
0,100
0,100
0,080
0,080 d
a a 0,060
0,060 c
b a 0,040
0,040 c
0,020 bc 0,020 a a
d d d
0,000 b b
0,000 c
0 2 4 6 0 2 4 6
Tiempo (días) Tiempo (días)

(b) (c)
Figura 12. Evolución de los parámetros de fermentación de los tratamientos: a)
ºBrix, (b) azúcares totales y (c) azúcares reductores durante el proceso. Nota:
puntos con superíndices diferentes a los días son significativamente
diferentes. Fuente: elaboración propia.

En relación con los 2 días de tratamiento se obtiene un aumento progresivo

en los ° Brix y azúcares totales para las concentraciones de 3%, 5% y 3% + 3%

con diferencias significativas durante los días (ver Figura 18, Figura 19, Figura
 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 59

20 y Figura 21 de Anexos), pero siguiendo el mismo comportamiento conforme

aumenta la cantidad de inóculo. Este comportamiento está asociado al mucílago

del fruto, el cual varía de acuerdo con su madurez, en promedio 10,4% para un

fruto maduro, tal como fueron las cerezas tratadas, y su composición química es

de 85-91% de agua y 6,2 a 7,4% de azúcares (principal componente de su materia

seca), de los cuales el 63% son aproximadamente reductores (Ríos, 2021). Dado

que este es una sustancia viscosa que se encuentra en la pulpa del fruto y contiene

debajo una capa de pectina que posee gran cantidad de azúcares, al solubilizarse

al cabo del tiempo, permite que las bacterias y levaduras degraden y fermentan

sus proteínas, azúcares, lípidos y ácidos que luego son transformados en otros

ácidos, alcoholes, ésteres, cetonas y azúcares más simples para después

consumirlos (Salazar et al., 2022). Por ende, al estar presente en los primeros días

en el fruto y no disuelta en el agua, las levaduras no van a poder consumir los

azúcares presentes en la pulpa hasta que se encuentre una concentración idónea

para realizar sus procesos metabólicos.

Posterior al día cero, los compuestos del mucílago como los biopolímeros

(pectina, arabinogalactana y xilana), proteínas, azúcares y lípidos se encuentran

disueltos en el agua aumentando los azúcares disponibles y así la disponibilidad

de estos compuestos a las levaduras, que, por medio de sus enzimas, como la

glucosa oxidasa y glucosa isomerasa, las cuales desempeñan un papel catalítico,

mejoran la conversión de los azúcares simples como la glucosa y fructosa en

alcohol, conllevando una reducción de los ° Brix y azúcares después del día 2, en

el que observa un desarrollo más rápido de la fermentación en los tratamientos

3%+3% y 5% (Sunmonu & Sanusi, 2022). Lo anterior coincide con el estudio de

Betancur & Zurita (2020) relacionado con la fermentación controlada del café
 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 60

adicionando Saccharomyces cerevisiae, donde se obtuvo que los tratamientos

inoculados presentaron una disminución de ° Brix al cabo del tiempo y que a su

vez es influenciado por la temperatura externa, asimismo concuerda con la

investigación de Titisunta Vaca (2023) en la influencia de diferentes tipos de

fermentación, en el que encontró que un tratamiento con agua tiene una

degradación de azúcares más rápida que uno sin agua. Del mismo modo, la

evolución de ° Brix de los tratamientos con inóculo al día 2, coincide con los

rangos que indica Puerta (2013a) para una fermentación de sustrato sumergido en

sistema abierto con alrededor de 30% de agua, los cuales oscilan entre 5,8 y 7,9%,

pese a que se les adicionó 15% más de líquido y no tienen sacarosa añadida como

la muestra en finca. Por tanto, se puede finalizar la fermentación en ese día.

9.4.2 pH y acidez

Seguidamente se procedió a evaluar la evolución del pH para los diferentes

tratamientos empleados donde los resultados obtenidos se muestran en la Figura

13, de la cual se observa la variación del pH a medida que transcurre el proceso

de fermentación. Estos resultados son de gran importancia ya que este es un

parámetro crucial que infiere en los diversos aspectos de la fermentación como la

producción de compuestos aromáticos y el tiempo óptimo de este proceso.

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 61

4,98 a
0% 3% 5% 3%+3% Finca
4,78

4,58

4,38
pH

4,18

3,98
a a
a
3,78
b b b
3,58 c
0 1 2 3 4 5 6
Tiempo (días)

Figura 13. Evolución de pH durante los días de fermentación. Nota: puntos con
superíndices diferentes a los días son significativamente diferentes. Fuente:
elaboración propia.
Respecto a los tratamientos empleados, la adición de las levaduras

disminuyó más el pH comparado con el 0% al cabo de 2 días, donde se observan

diferencias significativas del 0% respecto a los otros tratamientos (ver Figura 31

de Anexos), posterior a este tiempo adquiere una tendencia constante finalizando

con unos valores de 3,8 y 3,7 para los tratamientos, sin embargo la fermentación

se puede detener entre los días 2 y 4 ya que durante este periodo se tienen

resultados óptimos para detener este proceso, puesto que según autores como

Medina-Cruz (2018) afirma que rangos entre 3,7 y 4,1 son considerados

adecuados para interrumpir la fermentación y llevar acabo el lavado del café. Este

decrecimiento está asociado a la actividad metabólica de la levadura, que

metaboliza los azúcares presentes en el medio y produce varios compuestos como

alcohol, CO2 y ácidos orgánicos como el acético, láctico y clorogénico; teniendo

como efecto la inhibición de microorganismos no deseados que no toleren

ambientes ácidos (Ramirez, 2021).

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 62

Conjuntamente, en la Figura 14 se evidencia la evolución de acidez del

licor de café al cabo del tiempo.

1,20 0% 3% 5% 3%+3% Finca

1,00

0,80
Acidez (%)

0,60

0,40

0,20

0,00
0 1 2 3 4 5 6
Tiempo (dias)

Figura 14. Evolución de acidez durante los días de fermentación. Fuente:

elaboración propia.
La fermentación de café puede afectar la acidez del café, así como los

atributos sensoriales. Estudios como el de Muñoz et al. (2019) que evaluaron las

propiedades organolépticas y fisicoquímicas del café fermentado con rumen y

Saccharomices cerevisiae han encontrado que la acidez del café fermentado tiene

una calificación hedónica entre los atributos sensoriales de la bebida, otros

estudios como el de Rivas Hermann (2006), determinaron y cuantificaron los

ácidos carboxílicos presentes en el mucílago del café arábica mediante HPLC, del

cual la presencia de estos ácidos ha sido relacionada, por un lado, con la aparición

de sabores adversos y, por otro lado, con la manifestación de perfiles sensoriales

distintivos.

Respecto a la Figura 14 se aprecia la variación de la acidez en un rango

de 0 a 6 días para los tratamientos empleados. Al cabo de los 2 días, la acidez

aumenta debido a la disolución del mucílago en el medio acuoso, dado que cuando

se diluye el mucilago durante el proceso de la fermentación, los ácidos solubles

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 63

presentes se dispersan en un mayor volumen, por ende, la concentración de estos

ácidos aumenta en comparación con el mucilago original (Pardo et al., 2022). De

igual manera, en el estudio de Pardo et al. (2022) encontraron que el efecto de

fermentaciones prolongadas de mucilago de café tiene un efecto directo en el

aumento de la acidez que a su vez conlleva en la generación de atributos

sensoriales únicos en la bebida. Seguidamente, al cabo de los 2 días la acidez

empieza a disminuir a causa del consumo de los ácidos orgánicos por parte del

microorganismo puesto que estudios como el de Peñuela-Martínez et al. (2018)

en la evaluación de diferentes métodos de fermentación café, encontraron que en

las condiciones del biorreactor, los tratamientos a 17°C mostraron una ligera

disminución de ácido quínico, sugiriendo que en estas condiciones, los

microorganismos utilizan este compuesto como sustrato, para sus procesos

metabólicos.

9.4.3 Estabilidad microbiológica

Consecutivamente, se midieron los parámetros microbiológicos (BAL,

levaduras, mesófilos aerobios, coliformes totales y hongos) del licor de café de

los tratamientos.

[Link] Bacterias lácticas (BAL)

Las BAL son organismos microaerófilos con forma cocoide o bacilar,

grampositivos, no pigmentados, no formadores de esporas, no productores de

catalasa, ni reductoras de nitritos, que exhiben una amplia variedad de

características genéticas (Ladino, 2016). Estas poseen enzimas que les permite

desdoblar polisacáridos, lípidos, proteínas y otros compuestos para su posterior

transformación en alcoholes, azúcares simples y ácidos (láctico, acético, butírico,

cítrico y málico), que influyen en los aromas y sabores agradables del café.
 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 64

Asimismo, pueden sobrevivir a concentraciones inferiores al 10% de O2 y cuando

la presencia de este es casi nula, fermentan los azúcares iniciando el proceso de

fermentación (Samaniego, 2019).

En la Figura 15 se refleja la evolución de las BAL en los tratamientos,

donde posterior al día 0 los tratamientos presentan diferencias significativas (ver

Figura 35 de Anexos).

0% 3% 5% 3%+3% Finca
8,40
8,00 a
b a
7,60 c b a
BAL Log(UFC/g)

b
7,20 d
c c
6,80
6,40
6,00
5,60 a
5,20
0 1 2 3 4 5 6
Tiempo (dias)

Figura 15. Estabilidad microbiológica de BAL durante la fermentación. Nota:

puntos con superíndices diferentes a los días son significativamente
diferentes. Fuente: elaboración propia.
De la figura anterior se observa que a partir del día 2, el tratamiento

3%+3% contiene la carga microbiana más alta de BAL, seguida del 0%, esto

debido a que posee parte de estos microorganismos encapsulados y que hay menos

diferencias significativas conforme pasa el tiempo. De igual forma se evidencia

como los tratamientos con más inóculo adicionado alcanzan un pico máximo de

crecimiento y después de este, los microrganismos empiezan a morir por la

competencia de nutrientes. Por otro lado, dentro las causas que afectan el

crecimiento de las BAL está la temperatura interna del grano, pH inicial y final

del sustrato, y el tipo de sistema de fermentación empleado, ya que el café puede

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 65

estar expuesto al clima y a la colonización microbiana de ambientes invadidos por

aire, agua, suelo e insectos que actúan como vectores de microorganismos (Cruz

& Pivaral, 2018).

En otro sentido, estudios como el de Samaniego (2019) en la inyección de

CO2 y adición de levaduras, explican que en el crecimiento de BAL los factores

que más influyen es el CO2 y el tiempo, ya que durante este proceso se producen

alcoholes, ácidos y CO2 en cantidades significantes hasta alcanzar una

concentración definida de modo que inhiben su crecimiento, asimismo, que la

inyección de CO2 ocasionaba recuentos más bajos. En esa secuencia, Cruz &

Pivaral (2018) observaron que la fermentación con sistema abiertos tenía mayor

crecimiento microbiano que un sistema cerrado, ya que las temperaturas

alcanzadas internamente podrían alcanzar hasta los 45°C y así limitar las

condiciones de crecimiento de las BAL. No obstante, en ambos estudios se

identifica que el tipo de cepa de levadura no es un factor significativo en el

crecimiento de las BAL.

[Link] Levaduras

Del mismo modo, se realizó el seguimiento de la evolución de las levaduras por

Log (UFC/g) al cabo del tiempo. Los datos se registran en la Figura 16.
 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 66

0% 3% 5% 3%+3% Finca

8,30
a
a

Levaduras Log(UFC/g)
7,90 a b
7,50

7,10 b b
c c
c d d
6,70

6,30 a

5,90
0 1 2 3 4 5 6
Tiempo (dias)

Figura 16. Estabilidad microbiológica de Levaduras durante la fermentación.

Nota: puntos con superíndices diferentes a los días son significativamente
diferentes. Fuente: elaboración propia.
Como se observa en la gráfica de levaduras Log (UFC /g) vs tiempo (días),

los tratamientos con adición de levadura muestran mayor concentración de

microorganismos a partir de los 2 días, donde se observan diferencias

significativas para los diferentes tratamientos (ver Figura 39 de Anexos), esto es

atribuido al uso del medio sólido de extracto de malta (análisis microbiológico)

que posee azúcares simples como la maltosa, glucosa y fructosa que son utilizadas

como fuente de energía, facilitando su crecimiento respecto al 0%. En particular,

el tratamiento de 5% exhibe una alta concentración microbiana, por motivo de una

mayor concentración de levaduras que proporciona un mayor número de

metabolitos y enzimas que facilitan la degradación de sustratos y, por lo tanto,

promueven un mayor crecimiento, favoreciendo la fermentación (Elhalis et al.,

2021). Posterior al día 4 se aprecia un descenso para todos los tratamientos

empleados, lo cual puede deberse a la falta de sustratos disponibles, lo que

conlleva a competir a los microorganismos entre sí por los pocos nutrientes,

generando la muerte de algunos de ellos (Lucero, 2015).

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 67

Por otro lado, investigaciones demuestran que existen diferentes factores

para el crecimiento y rendimiento óptimo de las levaduras, uno de ellos es el de

Anglès et al. (2019) sobre la evaluación de diferentes fuentes de azúcar para la

segunda fermentación de vinos espumosos. Este estudio ha mostrado que al

adicionar una fuente de azúcar simple es posible una correcta fermentación de la

botella, uno de estos es la glucosa, que, debido a su fácil estructura química,

permite una fácil metabolización por parte de los microorganismos. De igual

manera, otro de los factores que afectan el crecimiento de estos microorganismos,

son las fuentes de carbono y nitrógeno, dado que Barajas-Solano et al. (2020)

encontró que al ajustar las fuentes de concentración de carbono y nitrógeno en

microalgas, es posible aumentar la producción de biomasa en una cepa de

Scenedesmus sp., dado que estos nutrientes le permiten sintetizar nuevos

componentes celulares y mantener un metabolismo activo.

[Link] Mesófilos aerobios y coliformes totales

Los mesófilos aerobios son microorganismos que se pueden encontrar en

alimentos y otros materiales orgánicos, estos se caracterizan por que su

crecimiento óptimo se da en temperaturas moderadas (30-37°C) y en presencia de

oxígeno. El recuento de este tipo de microorganismo permite conocer el grado de

contaminación de una muestra (Ramirez Cruz, 2017). En la Figura 17 se registró

la evolución de estos microorganismos durante la fermentación.

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 68

0% 3% 5% 3%+3% Finca
9,00

Mesófilos aerobios Log(UFC/g)

8,50 a
8,00
a
a
b b
7,50 c b
c d
7,00
a c
6,50
6,00
5,50
0 1 2 3 4 5 6
Tiempo (dias)

Figura 17. Estabilidad microbiológica de mesófilos aerobios durante la

fermentación. Nota: puntos con superíndices diferentes a los días son
significativamente diferentes. Fuente: elaboración propia.

Los coliformes totales son un grupo de bacterias que se encuentran en el medio

ambiente, estas bacterias son indicadores de la calidad microbiológica del agua y

de los alimentos (Vallejo & Castro, 2018). Por otro lado, los coliformes fecales

son un subgrupo de las coliformes totales; la presencia de estos microorganismos

es un indicador de contaminación fecal ya que estas bacterias pueden causar

enfermedades gastro intestinales (Zegarra & Benavente, 2011). En la Tabla 5, se

observa los resultados obtenidos para los coliformes totales y fecales para todos

los tratamientos empleados en el rango de 0 a 6 días de fermentación

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 69

Tabla 5. Coliformes fecales durante la fermentación.

Tratamiento
Días 0% 3% 5% 3%+3%
0 2400> + 2400> + 2400> + 2400> +
2 2400> + 210 + 120 + 150 +
4 <3 - 7,3 - <3 - <3 -
6 <3 - 6,2 - <3 - <3 -
Finca 2400> +

Nota: (+): positivo; (-): negativo. Fuente: elaboración propia.

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 70

En relación con la Figura 17 se observa que al cabo de los 2 días la

actividad microbiana aumenta donde alcanza un punto máximo para todos los

tratamientos, presentando diferencias significativas (ver Figura 43 de Anexos), el

cual es atribuido por varias razones como la presencia adecuada de temperatura y

nutrientes que favorece y multiplica su crecimiento. En ese sentido, en los

tratamientos 3%, 5% y 3+3% se presenta un aumento por la adición de inóculo,

esto es debido a que tanto las bacterias como levaduras son mesófilas (Ramirez

Cruz, 2017), asimismo, el medio empleado para este análisis como el PCA (Plate

Count Agar) favorece su crecimiento al tener los sustratos idóneos. Este

comportamiento también puede verse reflejado en la Tabla 5 donde se muestra los

resultados obtenidos para coliformes fecales dado que al cabo de los 2 días se

muestra positivo para todos los tratamientos empleados indicando la presencia de

coliformes fecales, posterior a estos días se tienen resultados negativos dado que

la presencia de levaduras más bacterias lácticas puede competir con otros

microorganismos, incluido los coliformes fecales, por nutrientes. Además, las

levaduras pueden producir sustancias antimicrobianas como ácidos orgánicos y

péptidos que tienen propiedades inhibitorias sobre estos microorganismos (Susá

Gomez, 2015).

Por otro lado, durante la práctica se observaba gas en las campanas de

Durham, al adicionar el reactivo Indol (confirmación de presencia de E. coli). Sin

embargo, se obtenía un resultado negativo puesto que el gas formado era CO2

generado por las levaduras.

En otro sentido, en el recuento de hongos no se encontró crecimiento al

cabo de los 5 días en los tratamientos inoculados con M. caribbica, esto confirma
 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 71

el uso potencial de esta levadura como control fitopatógeno de diferentes especies

que pueden afectar el procesamiento del café, tal como se describió en el ítem 9.2.

10. Conclusiones

✓ Se eligió la levadura M. Caribbica de acuerdo con los parámetros de crecimiento

(biomasa, pH, ° Brix, azúcares totales y reductores) presentados.

✓ Se encontró que el medio a base de pulpa de café funciona como un reemplazo

óptimo del extracto de malta, en el crecimiento de la M. caribbica .

✓ La M. Caribbica resultó una levadura óptima a encapsular, dado el gran porcentaje

de está que queda después del proceso, además de su solubilidad y humectabilidad

que le permiten un tiempo de liberación de 5 minutos para la fermentación.

✓ La adición de la levadura M. caribbica en la fermentación del café demostró tener

una influencia positiva en términos de tiempo de fermentación, condiciones

fisicoquímicas y estabilidad microbiológica. Estos hallazgos respaldan el uso de

esta levadura como una opción prometedora para mejorar el proceso de

fermentación del café y obtener un producto de mayor calidad sensorial.

✓ La viabilidad económica de llevar a cabo la microencapsulación es un asunto que

requiere un análisis detallado, sin embargo, adoptar esta nueva tecnología

permitirá a los caficultores beneficios significativos en términos de mejora en la

calidad sensorial del café, facilidad de manejo en campo de los cultivos y la

eficiencia en la fermentación.

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Anexos

A continuación, se presentan los análisis estadísticos realizados en MiniTab versión 20,3

de los distintos factores en cada tiempo:

- ° Brix

Figura 18. Análisis estadístico de ° Brix a los 0 días.

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 85

Figura 19. Análisis estadístico de ° Brix a los 2 días.

Figura 20. Análisis estadístico de ° Brix a los 4 días.

Figura 21. Análisis estadístico de ° Brix a los 6 días.

- Azúcares reductores

Figura 22. Análisis estadístico de azúcares reductores a los 0 días.

Figura 23. Análisis estadístico de azúcares reductores a los 2 días.

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 86

Figura 24. Análisis estadístico de azúcares reductores a los 4 días.

Figura 25. Análisis estadístico de azúcares reductores a los 6 días.

- Azúcares totales:

Figura 26. Análisis estadístico de azúcares totales a los 0 días.

Figura 27. Análisis estadístico de azúcares totales a los 2 días.

Figura 28. Análisis estadístico de azúcares totales a los 4 días.

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 87

Figura 29. Análisis estadístico de azúcares totales a los 6 días.

- pH

Figura 30. Análisis estadístico de pH a los 0 días.

Figura 31. Análisis estadístico de pH a los 2 días.

Figura 32. Análisis estadístico de pH a los 4 días.

 FERMENTACION DEL GRANO DE CAFÉ 88

Figura 33. Análisis estadístico de pH a los 6 días.

- Bacterias lácticas (BAL)

Figura 34. Análisis estadístico de bacterias lácticas a los 0 días.

Figura 35. Análisis estadístico de bacterias lácticas a los 2 días.

Figura 36. Análisis estadístico de bacterias lácticas a los 4 días.

Figura 37. Análisis estadístico de bacterias lácticas a los 6 días.

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- Levaduras

Figura 38. Análisis estadístico de levaduras a los 0 días.

Figura 39. Análisis estadístico de levaduras a los 2 días.

Figura 40. Análisis estadístico de levaduras a los 4 días.

Figura 41. Análisis estadístico de levaduras a los 6 días.

- Mesófilos aerobios

Figura 42. Análisis estadístico de mesófilos aerobios a los 0 días.

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Figura 43. Análisis estadístico de mesófilos aerobios a los 2 días.

Figura 44. Análisis estadístico de mesófilos aerobios a los 4 días.

Figura 45. Análisis estadístico de mesófilos aerobios a los 6 días.