Marta Guerrero Santos
examen teórico TGL
Parte 2: Lentes
1. Fuentes de luz
● Primarias: Emiten luz propia (Sol, bombilla, LED, láser).
● Secundarias: Reenvían o dejan pasar la luz de una fuente primaria.
● Monocromáticas: Emiten una sola longitud de onda (láser, LED).
● Policromáticas: Emiten varias longitudes de onda:
○ Radiación continua(Sol, bombilla incandescente).
○ Radiación discreta(lámparas espectrales).
○ Radiación mixta(tubos fluorescentes).
2. Dioptrios y espejos
● Dioptrio: Superficie entre dos medios con distinto índice de refracción. Puede ser plano,
esférico, cilíndrico, etc.
● Espejo: Dioptrio con un tratamiento reflectante.
3. Leyes de la Óptica Geométrica
● Propagación rectilínea: En medios homogéneos, la luz viaja en línea recta.
● Conservación del plano de incidencia: Rayos incidente, reflejado y refractado están en el
mismo plano.
● Reversibilidad de las trayectorias: La luz sigue el mismo camino en ambos sentidos.
4. Reflexión
● Ley de la reflexión: El ángulo de incidencia es igual al ángulo de reflexión (ε = ε’).
● Tipos de reflexión:
○ Especular: Superficies pulidas (espejos).
○ Difusa: Superficies rugosas.
○ Mixta: Intermedia (papel brillante, metal sin pulir).
5. Refracción
● Ley de la refracción: La luz cambia de dirección al pasar de un medio a otro con diferente
índice de refracción (n).
● Si n aumenta→ el rayo se acerca a la normal (ε > ε’).
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● Si n disminuye→ el rayo se aleja de la normal (ε < ε’).
● Ángulo límite y reflexión total: Si el ángulo de incidencia supera el ángulo límite, la luz se
refleja en la superficie.
● Ejemplo: Los objetos en el agua parecen más cercanos de lo que están.
6. Espejismos
● Inferior: Capas de aire caliente en la parte baja → la luz se curva y refleja el cielo.
● Superior: Capas de aire frío en la parte baja → la luz se curva y vemos objetos desplazados.
7. Lentes
● Lente: Sistema óptico con dos dioptrios, al menos uno curvo.
● Convexas (convergentes/positivas): Más gruesas en el centro, concentran la luz.
● Cóncavas (divergentes/negativas): Más delgadas en el centro, dispersan la luz.
● Imagen real: Se puede proyectar en una pantalla (rayos convergentes).
● Imagen virtual: No se puede proyectar, solo se percibe (rayos divergentes).
8. Potencia de una lente (P)
● Fórmula: P=1f’P = \frac{1}{f’} (en dioptrías, con f’ en metros).
Aberraciones
Las aberraciones ópticas son desviaciones entre la imagen real y la teórica en un sistema óptico. No
siempre son defectos de fabricación, sino que resultan de la forma en que la luz se refracta en las lentes.
Se dividen encromáticasygeométricas (monocromáticas).
1. Aberraciones cromáticas
Se debe a que el índice de refracción varía con la longitud de onda de la luz, causandodispersión.
Como resultado, los colores no se enfocan en el mismo punto, formando imágenes borrosas con franjas
de colores. Se corrigen con lentes acromáticas (dobletes de flint y crown).
2. Aberraciones geométricas (monocromáticas)
Ocurren incluso con luz monocromática. Tipos:
● Aberración esférica: Los rayos que pasan por los extremos de la lente no convergen con los
centrales, causando imágenes borrosas. Se corrige con diafragmas.
● Coma: Afecta puntos fuera del eje óptico, deformando la imagen con forma de cometa. Es la
peor aberración.
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● Astigmatismo: Diferentes direcciones (vertical/horizontal) se enfocan en planos distintos.
Ejemplo: los radios de una rueda pueden verse claros o borrosos.
● Distorsión: Deforma la imagen al cambiar la proporción del objeto.
○ Distorsión de corsé (positiva): La imagen se ensancha en los bordes.
○ Distorsión de barril (negativa): La imagen se contrae en los bordes.
○ Un sistema ortoscópicono presenta distorsión.
● Curvatura de campo: La imagen de un objeto plano se forma sobre una superficie curva,
deformando los bordes. Relacionada con el astigmatismo.
Otros fenómenos de la luz
1. Absorción
● Un cuerpo puedeabsorber, dispersar o reflejarla luz según su estructura atómica.
● Laabsorción selectivadetermina el color de los objetos.
● Absorción dispersiva: absorbe luz sin aumentar la temperatura.
● Infrarrojos: principales responsables del aumento de temperatura.
● Superficies negras: buenosabsorbedores y emisores(se calientan y enfrían rápido).
2. Transmisión
● La luz puedeatravesarun objeto según su material y el ángulo de incidencia.
● Tipos:
○ Directa: sin cambio en dirección ni calidad (vidrio, aire).
○ Difusa: desviación en varias direcciones (vidrio esmerilado).
○ Selectiva: deja pasar ciertas longitudes de onda (filtros, vidrios coloreados).
3. Interferencias
● Ocurre cuandose superponen ondas de igual longitud de onda.
● Tipos:
○ Constructivas: ondas en fase se suman.
○ Destructivas: ondas en desfase se restan (pueden anularse).
○ Casos intermedios según amplitudes.
4. Difracción
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● Se produce cuando la luzencuentra un obstáculo o rendijade tamaño similar a su longitud
de onda.
● Provocabandas de luz y sombraalternadas por interferencia.
● Afecta la resolución de lentes(objetos pequeños pueden verse borrosos o desaparecer).
● Disco de Airy: patrón de difracción con un centro brillante y anillos concéntricos.
○ Límite de resolución de sistemas ópticos.
○ Tamaño depende de lalongitud de onda y apertura numérica (AN).
○ Mayor AN → mejor resolución (discos de Airy más pequeños).
5. Polarización
● La luz oscila en todos los planos del espacio.
● Polarización: luz con oscilación en un solo plano.
Puede ocurrir por:
○ Reflexiónen ciertas superficies.
○ Filtros polarizadores: bloquean direcciones de vibración no deseadas.
● Usos:
○ Microscopios (énfasis en estructuras).
○ Medición de actividad óptica (sustancias levógiras/dextrógiras).
6. Interacción de la luz con la materia
Emisión de luz:
1. Incandescencia: luz por altas temperaturas (llama, metales calientes).
2. Luminiscencia: emisión de luz sin calor (luz fría).
○ Fotoluminiscencia: absorbe y emite luz.
○ Quimioluminiscencia: reacciones químicas.
○ Bioluminiscencia: procesos bioquímicos.
○ Radioluminiscencia: radiaciones ionizantes.
○ Electroluminiscencia: corrientes eléctricas.
○ Triboluminiscencia: golpes o roturas.
○ Sonoluminiscencia: ondas sonoras.
7. Fotoluminiscencia
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● Un compuestoemite luz tras absorber energía electromagnética.
● Tipos:
○ Fluorescencia: emite luz mientras recibe irradiación. Se apaga al cesar la fuente.
○ Fosforescencia: almacena energía y emite luz tras un tiempo.
8. Términos clave
● Cromóforo: da color a un compuesto (absorbe ciertas longitudes de onda).No relacionado
con fluorescencia.
● Fluoróforo: región molecular que causa fluorescencia.
● Fluorocromo: colorante fluorescente usado como marcador en microscopía.
Parte 3 A: microscopía
El estudio de las células y tejidos presenta dificultades debido a su tamaño reducido y su transparencia.
Para su observación se utilizan diversas técnicas, desde la macroscopía hasta la microscopía óptica y
electrónica, junto con la telepatología y archivos digitales.
1. Componentes del Microscopio
● Sistema de iluminación:emite luz o electrones para formar el rayo incidente.
● Sistema óptico:conjunto de lentes para ampliar y visualizar la muestra.
● Sistema mecánico:sostiene los elementos del microscopio y permite su ajuste.
● Accesorios:incluyen cámaras, filtros y luces adicionales.
2. Iluminación en Microscopía
● Transiluminación:la luz atraviesa la muestra. Utilizada en microscopios de campo claro,
presenta el problema de los discos de Airy, lo que afecta la resolución.
● Epi-iluminación:la luz incide oblicuamente sin atravesar la muestra, permitiendo
observaciones tridimensionales en microscopios estereoscópicos, de epifluorescencia, confocal
y electrónico de barrido.
3. Propiedades Ópticas del Microscopio
● Aumento:número de veces que se incrementa el tamaño del objeto, determinado por la
curvatura de la lente y su distancia focal.
● Poder de resolución:capacidad de distinguir entre dos puntos cercanos. Es inversamente
proporcional al límite de resolución.
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● Profundidad de foco:capacidad de enfocar correctamente objetos gruesos. Disminuye con el
aumento.
● Amplitud del campo:área observable en la muestra, que disminuye con el aumento del
microscopio.
Parte 3B. Óptica del microscopio
1. Sistema Mecánico
● Pie y columna: Base estable; contiene la fuente de luz y la columna (brazo).
● Mecanismo de enfoque:
○ Tornillo macrométrico: Enfoque grosero, rápido.
○ Tornillo micrométrico: Enfoque fino, preciso.
Platina: Sostiene la muestra y la mueve en X e Y con reglas graduadas: vernier y nonio.
● Revólver: Permite cambiar objetivos girándolos.
● Tubo: Conecta objetivos y oculares; puede ser monocular, binocular o trinocular.
2. Sistema Óptico
2.1. Objetivos
● Función: Formar imagen aumentada, real e invertida.
● Aumento total= Aumento del objetivo × Aumento del ocular.
● Aumento útil: Entre500× ANy1000× AN. Más, esaumento vacío(sin mejora en detalle).
● Resolución: Capacidad para distinguir puntos cercanos.
○ Mejora con menor longitud de onda (λ) y mayor apertura numérica (AN).
○ AN =n× sen(θ), dondenes el índice de refracción yθel ángulo de semiapertura.
● Tipos de objetivos:
○ Seco: Usa aire entre muestra y objetivo.
○ De inmersión: Usa aceite o agua para mejorar la AN y la resolución.
● Correcciones ópticas:
○ Acromáticos: Básicos, corrigen pocas aberraciones.
○ Fluorita: Calidad intermedia.
○ Apocromáticos: Mejor calidad.
2.2. Nomenclatura de los Objetivos
● Aumento: 4×, 10×, 40×, 100× (inmersión).
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● Apertura numérica (AN): Grabada en el lateral.
● Distancia de trabajo (WD): Espacio entre objetivo y muestra.
● Medio de inmersión: Indicado con color/código (oil,water).
3. Sistema Óptico del Ocular
● Función: Aumenta la imagen del objetivo y la convierte en virtual y derecha.
● Tipos de microscopios según oculares:
○ Monocular: Un solo ocular.
○ Binocular: Dos oculares, más cómodo.
○ Trinocular: Dos oculares + un tercer ocular para cámara.
3.1. Aumentos del Ocular
● Comunes: 5×, 10×, 15×, 20×.
● La combinación con el objetivo debe evitar aumento de vacío.
3.2. Lentes del Ocular
● Lente ocular: Aumenta la imagen.
● Lente colectora: Corrige aberraciones.
● Diafragma: Define el campo óptico y minimiza reflejos.
● Tipos de oculares:
○ Ramsden(positivo): Diafragma debajo de las lentes, usado en microscopios avanzados.
○ Huygens(negativo): Diafragma entre las lentes, para microscopios de laboratorio.
3.4. Campo del Microscopio
● Parte de la muestra que se observa. Mayor aumento = menor campo.
● Puede incluir escalas o retículas para medición.
3.5. Nomenclatura de los Oculares
● Aumento: 10×, 12.5×, 15×, 20×, 25×.
● Número de campo (NF): Diámetro del diafragma (18-26.5 mm).
● Otras inscripciones:
○ WF(campo amplio),UWF(ultraamplio),HE(punto focal alto),CF(sin aberración
cromática).
Fórmulas Clave
● Aumento total= Aumento del objetivo × Aumento del ocular.
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● Aumento útil:500 × AN ≤ Aumento ≤ 1000 × AN.
● Apertura numérica (AN)=n × sen(θ).
● Resolución (R) mejora cuando: ↓ λ (menor longitud de onda) o ↑ AN (mayor apertura
numérica).
Parte 4 B. Iluminación
Iluminación en Microscopía Óptica
● Fuente de luz:Puede ser tungsteno, halógena, lámpara de arco eléctrico, láser o LED.
● Filtros:Se usan para corregir colores no deseados en la iluminación.
Condensador
● Forma el cono de luz necesario para la visualización con objetivos de mayor aumento.
● Tipos:
○ Abbe:Básico, sin corrección de aberraciones.
○ Aplanático:Corrige aberraciones esféricas.
○ Acromático:Corrige aberraciones cromáticas (azul y rojo).
○ Aplanático-acromático:Máximo nivel de corrección, ideal para microfotografía y
objetivos de inmersión.
Diafragma
● Regula la cantidad de luz y el contraste.
● Su apertura depende del aumento del objetivo: cerrado para bajos aumentos, abierto para altos.
Iluminación Köhler
● Método propuesto en 1893 para mejorar la iluminación y optimizar el uso de lentes.
● Componentes:
○ Fuente de luz con lente colectora.
○ Condensador ajustable.
○ Dos diafragmas:
■ Campo:Regula el diámetro de iluminación.
■ Apertura:Ajusta el contraste.
Accesorios del Microscopio
● Medición y cuantificación:Uso de micrómetros, cámaras de recuento (Neubauer).
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● Captura de imágenes:Microfotografía con cámaras digitales.
● Filmación:Video Microscopía para procesos celulares.
● Dibujo:Uso de cámaras claras para ilustraciones científicas.
Uso del Microscopio Óptico
1. Ajuste inicial:
○ Sentarse correctamente.
○ Ajustar distancia interpupilar y compensación dióptrica.
2. Enfoque:
○ Comenzar con objetivo 4x.
○ Colocar la muestra en la platina y fijarla.
○ Subir la platina al máximo sin tocar el objetivo.
○ Enfocar con eltornillo macrométricoy luego con elmicrométrico.
○ Seleccionar la zona de interés y centrar.
○ Cambiar al aumento requerido (10x, 40x...) sin mover la platina.
Ajustar el condensador y el diafragma para mejorar el contraste.
Parte 4C. Fotónica especial
Técnicas avanzadas para mejorar la observación de muestras biológicas sin teñir, mediante el uso de
filtros, condensadores especiales y otras modificaciones ópticas.
1. Microscopía de Campo Oscuro
● Bloquea la luz central, iluminando la muestra con rayos oblicuos.
● Fondo oscuro, muestra brillante.
● Se usa para observar células vivas, microorganismos y procesos fisiológicos.
● Iluminación de Rheinberg: variante con filtros de colores.
2. Microscopía de Contraste de Fases
● Detecta diferencias en el índice de refracción de las muestras.
● Convierte variaciones de fase en diferencias de intensidad lumínica.
● Ideal para estudiar células vivas sin tinción.
3. Microscopía de Contraste de Interferencia Diferencial (DIC)
● Similar al contraste de fases, pero con luz polarizada y sin halos.
● Usa prismas de Wollaston para dividir y recombinar la luz.
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● Produce imágenes con efecto tridimensional.
● Aplicaciones: células vivas, fertilización in vitro.
4. Microscopía de Fluorescencia
● Usa fluorocromos que emiten luz de diferente color al ser excitados.
● Necesita luz intensa (mercurio, láser), filtros y espejos dicroicos.
● Inmunofluorescencia:
○ Directa (IFD): un solo anticuerpo con fluorocromo.
○ Indirecta (IFI): anticuerpo primario + anticuerpo secundario marcado.
● Aplicaciones: biología celular, inmunología, diagnóstico.
5. Microscopía de Luz Ultravioleta
● Usa luz UV (~200 nm) para mejorar la resolución.
● No se observa directamente, requiere fotografía o digitalización.
● Se usa en ciencia forense y estudios de ADN.
6. Microscopía de Polarización
● Estudia muestras birrefringentes (colágeno, músculos, cristales).
● Usa filtros polarizadores para manipular la luz.
● Aplicaciones: análisis de amiloidosis, estructuras intracelulares y extracelulares.
Parte 4 D. Microscopios ópticos
1. Microscopios con modificaciones
● Microscopio estereoscópico (lupa binocular):
○ Permite observar muestras entres dimensiones (3D)gracias a dos lentes con ángulos
distintos.
○ Usaluz reflejada (epi-iluminación), sin necesidad de cortes finos.
○ Aumentos entre10x y 80x, llegando en algunos casos hasta300x.
○ Tipos:
■ Con dos objetivos inclinados: más común, robusto y económico.
■ De objetivo principal común: usado en aplicaciones más avanzadas con
accesorios ópticos.
● Microscopio quirúrgico:
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○ Usado enmicrocirugíapara visualizar con precisión estructuras pequeñas (nervios,
vasos sanguíneos, etc.).
○ Algunos tienenpiezas automatizadas o robóticas.
● Microscopio invertido:
○ Fuente de luz y condensador arriba, objetivos debajo.
○ Se usa encultivos celulares y reproducción asistida.
○ Permite observar células vivas sin preparación previa.
2. Microscopio láser confocal (CLSM)
● Mejora la calidad de imagen al eliminar la luz fuera de foco mediante eldiafragma confocal
(pinhole).
● Iluminapunto por puntocon unláser, generando imágenes tridimensionales al combinar
cortes ópticos.
● Usafotomultiplicadores (PMT)para capturar fotones fluorescentes.
● Aplicaciones:
○ Colocalización molecular, reconstrucción3Dy video microscopía.
○ Estudio deprocesos celulares(fagocitosis, apoptosis, etc.).
○ Investigación enbiología celular, molecular, histología, inmunología y
biomedicina.
● Consideraciones:
○ Fototoxicidad: el láser puede dañar células.
○ Fotoblanqueo: fluoróforos pierden fluorescencia con exposición prolongada.
○ Se recomiendausar la menor potencia de láser posiblepara evitar daños.
Ejemplos de imágenes con CLSM incluyen estudios de células, tejidos y enfermedades con
fluorocromos para marcar estructuras específicas.
Resumen de la segunda parte del punto 4D
La microscopía de fluorescencia multifotónica presenta varias ventajas sobre la microscopía de
fluorescencia convencional. Utiliza longitudes de onda infrarrojas, lo que permite una mejor
penetración en muestras gruesas y minimiza la dispersión de la luz en tejidos biológicos. En
comparación con la microscopía confocal monofotónica, que solo puede alcanzar profundidades de
hasta 200 µm, la microscopía de dos fotones puede penetrar hasta aproximadamente 1 mm en el tejido
vivo.
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Sus principales beneficios incluyen:
● Mejor definición de imagen, ya que la excitación ocurre solo en el volumen focal.
● No requiere un pinhole, lo que simplifica el sistema óptico.
● Menor fotoblanqueo y fototoxicidad, lo que preserva la muestra por más tiempo.
● Mayor penetración en la muestra, lo que permite estudiar estructuras más profundas con
mayor claridad.
En resumen, esta técnica es ideal para la observación de tejidos biológicos vivos, proporcionando
imágenes más precisas y con menor daño a la muestra.
Parte 4 E. Electrónica
Lamicroscopía electrónicapermite obtener imágenes de laultraestructura celularcon una
resolución de hasta0,2 nm, unas40.000 veces mayorque un microscopio óptico. Utilizahaces de
electrones, los cuales son acelerados y dirigidos mediantelentes electromagnéticas.
1. Tipos de Microscopios Electrónicos
Microscopio Electrónico de Transmisión (MET o TEM)
● Los electronesatraviesanla muestra.
● Se requieren cortesultra finosen una rejilla de cobre.
● Permite visualizarestructuras internascon alta resolución (0,2 nm).
● Se forman imágenes enpantallas fluorescentes o películas fotográficas.
Procesamiento de muestras para MET
1. Fijación:con tetraóxido de osmio (OsO₄) y glutaraldehído.
2. Contraste:se utilizan metales pesados (acetato de uranilo, citrato de plomo).
3. Deshidratación:con alcoholes para evitar evaporación del agua.
4. Inclusión:en resinas epóxicas para formar un bloque sólido.
5. Corte ultrafino:con cuchilla de diamante (100 nm).
6. Interpretación:Regiones con metales pesados aparecenoscuras(electro-densas), las sin
metalesclaras.
Aplicaciones del MET
● Estudio de la ultraestructuracelular.
● Identificación de virusy estructuras moleculares.
● Histoquímica e inmunohistoquímicapara detectar compuestos.
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Microscopio Electrónico de Barrido (MEB o SEM)
● Los electronesNO atraviesanla muestra, sino que la escanean.
● Produce imágenestridimensionalesde la superficie.
● Resolución de10 nmy aumento de20.000x.
● La muestra emiteelectrones secundarios, que son detectados y transformados en imagen.
Procesamiento de muestras para MEB
1. Fijación:estándar.
2. Deshidratación:preferiblemente conCO₂(evita artefactos).
3. Contraste:recubrimiento congrafito o oro.
4. Observación y toma de imágenes.
Aplicaciones del MEB
● Morfología celular y tisular.
● Estudio de estructuras moleculares.
Componentes Principales del Microscopio Electrónico
1. Sistema de vacío:evita la dispersión de electrones.
2. Fuente de electrones:
○ Emisión termoiónica:tungsteno calentado libera electrones.
○ Emisión de campo:extrae electrones con un alto campo eléctrico.
3. Lentes electromagnéticas:
○ Lente condensador:concentra el haz.
○ Lente objetivo:determina la resolución.
○ Lente proyectora:proporciona el aumento final.
4. Detectores:convierten la señal electrónica en imagen.
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