PCR

Reacción de la polimerasa en cadena

Reacción en Cadena de la Polimerasa

• Fue diseñada por el Dr.

Kary Mullis en la década
de 1980.

• Ganó el premio Nóbel de

Química en 1993.

• Utilizó la PCR para la

amplificación del gen de
-hemoglobina humana, y
lograr el diagnóstico
prenatal de la anemia
falciforme.
 Reacción de la polimerasa en cadena

• Replicaciones sucesivas en
una simple reacción permiten
obtener gran cantidad de un
segmento determinado de ADN,
con alto grado de pureza, a
partir de una cantidad no
detectable

[Link]
Reaccion de la Polimerasa en Cadena
Componentes de la reacción
ADN
cebadores o primers
nucleótidos
buffer de la Enzima
Enzima

La PCR normalmente se
realiza con un volumen de
reacción de 15-100 μL, en
pequeños tubos de 0.2-0.5 mL
que se colocan en un
termociclador automático.
Criterios para el diseño de Primers

– El diseño cuidadoso de primers es uno de los

aspectos más importantes de la PCR.

– Primers mal diseñados pueden amplificar otros

fragmentos de ADN: amplificación inespecífica.

– Que el producto tenga el tamaño correcto no

necesariamente indica que la secuencia es correcta, se
puede verificar por secuenciación.
Diseño de Primers

I – Tamaño del cebador. Cada primer debe contar con una longitud de 18-
24 bases.

II- Se debe mantener un contenido de G:C entre 40 y 60 %.

III – Los dos cebadores del par deben de tener temperatura de fusión
“Tm” cercanos, dentro de los 5 °C.

IV –El extremo 3’ debe ser una G o una C.

Diseño de Primers

IV – Complementariedad de Secuencias. Evitar regiones con

potencialidad para formar estructuras secundarias internas.
Sin complementariedad intra– o inter– primers.

* Complementariedad intra – primer (más de 3 bases):

Se pliega (estructuras de doble cadena) >
Interfiere con el anneling al ADN templado.

* Complementariedad inter – primer:

Dímeros disminuye la formación de productos por competencia (peor en
extremos 3’, donde se une la ADN polimerasa).
Diseño de Primers

I – Longitud del primer.

18 – 24 nucleótidos resultan en una Tm óptima.
Muy largos: Fallas en la hibridización: bajo rendimiento.

II – Tm (T melting).
Tm: Temperatura a la cual la mitad de las bases del primer están
apareadas con el ADN molde.

Tm = 2 (A + T) + (G + C) > Tm aumenta con la longitud del primer y el

contenido de (G + C).
Tm: 55 – 60 °C – 2 primers: Tm similares.

T hibridización (T annealing) depende de la Tm de los primers: 5 °C por

debajo de la Tm más baja del par de primer (T annealing: al menos 50 °C).
Diseño de Primers

Secuencias adicionales pueden ser agregadas en el extremo 5’ del primer (no

incluir cuando se estima la Tm del primer).
Se pueden agregar degeneraciones en algunas posiciones del primer:
- Se incrementa el riesgo de amplificación inespecífica.

- Código IUPAC/IUB:

A adenina R AoG
C citosina W AoT
G guanina S CoG
T timidina en el ADN Y CoT
uracilo en el ARN K GoT
N AoCoG oT H A o C o T; no G
M AoC B C o G o T; no A
V A o C o G; no T D A o G o T; no C
Diseño de Primers

Ejemplo de primers degenerados:

CTTCCTGAACTTGCTCTTCG
CTTCCTGAACTTGCTCTTCG
CTTCCTGAACTTGGTCTTCG
CTTCCTAAAATTGGTCTTCG
****** ** *** ******

5’ – CTT CCT RAA MTT GST CTT CG – 3’ (primer sentido)

R: G, A
M: C, A
S: C, G
 Fragmento Klenow T4 DNA DNA polimerasa
DNA polimerasa I
TIPO de DNA polimerasa I polimerasa dependiente de RNA
(E. coli)
(E. coli) (E. coli) (retrovirus)
5´-> 3´
Sí (baja) Sí (baja) Sí (medio) Sí
polimerasa
5´-> 3´
Sí No No Exorribonucleasa
exonucleasa
3´-> 5´
Sí (baja) Sí (baja) Sí (alta) Exorribonucleasa
exonucleasa

· Termoestables: Tª óptima de 74 ºC. Resiste durante 40-50´a 96ºC.

Taq DNA Taq DNA
Tipo Replicasa Tth polimerasa
polimeras (94 Kda) polimeras (61 Kda)
5´-> 3´
Sí Sí Sí Sí
polimerasa
5´-> 3´
Sí No ? ?
exonucleasa
3´-> 5´
No No No ?
exonucleasa

Tipos Taq Pwo Pfu Pfx

Fidelidad 1x 12x 30x 48x
Amplificación Máxima 1 Kb 4 Kb 5 Kb 12 Kb
U/Reacción 2.5 2.5 1.25-5 1.25-5

generalmente arqueas, son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus
litoralis (Vent) y Thermus termophilus (Tth). Generalmente se emplean mezclas de polimerasas muy procesivas
(Taq) con otras capaces de hacer corrección de errores (Pfu, Vent).
 La reacción se realiza en tres etapas

1. Separación de la doble hebra de ADN

molde

2. Unión de los cebadores por

reconocimiento de secuencias
complementarias a la cadena molde
que se quiere amplificar

3. Extensión a partir del primer con la

enzima Taq polimerasa

Cada etapa se corresponde con una TEMPERATURA

y las tres etapas constituyen un CICLO
Conceptos de la PCR

Sensibilidad: se refiere a la cantidad mínima de ADN necesaria para que se produzca

la amplificación, es decir, para obtener una banda.

Especificidad: se refiere a la obtención de un solo producto amplificado. Viene

determinada por los oligos y la especificidad con la que se unen al ADN molde. De esta
forma, si los oligos tienen más de un sitio al que se pueden unir aparecerá más de un
producto amplificado.

Eficiencia: se refiere a la amplificación máxima que se puede obtener en un número

determinado de ciclos.

Fidelidad: se refiere a los errores que comete la ADN polimerasa durante la

amplificación. Este concepto es de especial importancia en la secuenciación, pero en
otros casos no es tan importante.
Parámetros de la reacción
temperaturas del ciclo

tiempos

velocidad de los cambios de

temperatura

número de ciclos
 Optimización de la reacción:

Evitar contaminaciones con ADN extraño (falso positivo).

Controles positivos y negativos.

Buen diseño de cebadores.

Concentración de Cl2Mg (1.5 mM)

EL Mg++ es cofactor de la enzima, su carencia disminuye la actividad,
Y el exceso aumenta inespecificidad, reduce la fidelidad de la enzima.
Depende de la sec. de oligos y del templado.
Hacer una curva de rango 0,5 a 5 mM.

Se recomienda un primer paso a 95C por 2 min. para evitar la

formación de dímeros de cebadores e hibridización inespecífica.
“Hot start Taq”: la enzima se activa al aumentar la temperatura (la
polimerasa está unida a anticuerpos que la inactivan, al aumentar la
temp se desnaturalizan y se activa la enzima)
 Multiplex PCR

Son productos obtenidos en la misma

reacción con diferentes copias de
primers.

Tiene aplicación en problemas de

diagnóstico de rutina.
 Amplificación de RNA (RT-PCR)
Moloney Murine Leukemia Virus (37ºC) (M-MLV)
Avian-Myeloblastosis-Virus (42ºC) (AMV)

• Con ésta técnica se pueden analizar transcriptos de ARN o ARNs virales presentes
en bajísimas concentraciones.

• Con oligo(dT)-primers, es posible construir cDNAs completos

 Aplicaciones de la PCR
Detección y cuantificación de enfermedades infecciosas
virus latentes y activos
 PCR anidada (Nested)
Variante de la PCR convencional que comprende dos rondas de
amplificación con distintos pares de iniciadores o primers en cada
una

Primers

La ventaja de esta reacción es la de aumentar la

especificidad y la sensibilidad de la
amplificación
 Empleo de primers degenerados

Es una PCR estándar que utiliza una mezcla de iniciadores o

primers de secuencias degeneradas en vez de un par de
iniciadores de secuencia única.

• Cuando solo se conoce el gen de otras especies

(genes homólogos).
• Cuando se conoce solo la secuencia aminoacídica de
la proteina.
• Cuando la secuencia target presenta heterogeneidad.
Por ejemplo:
Amplificaciones de diversos subtipos del HIV.

Permite amplificar genes "nuevos" y/o familias multigénicas y

es un herramienta muy importante en estudios evolutivos a
nivel molecular
 Mutagénesis in vitro
Deleción
Los Primers tienen una parte
target-specífica y una parte
target- no specifica
Para una sustitución se
procede análogamente

Inserción
La manera más usada es la
simple inserción de los
nucleótidos en el primer
flanqueados por sitios de
restricción en los extremos
del segmento amplificado
útiles para una posterior
clonación.
 PCR Cuantitativa
Cuantificación de los ácidos nucleicos (por PCR ó RT-PCR)

Es de utilidad en la determinación y control de terapias de

enfermedades infecciosas. Ej.: HIV y en el campo de la oncología

teoria: N = N0•2n
Moléculas

Fase
exponencial

Ciclos
Problemas de la PCR:
 Se mide en el punto final de la reacción.
 Semicuantitativa, en el mejor de los casos.
 PCR vs real time PCR

Reacción de PCR que mide la formación de producto en cada ciclo. El producto

que se genera producirá fluorescencia, y se medirá la señal que éste genera.
 PCR en tiempo real
Principio:
• Se basa en el uso de un agente fluorescente (reporter)

• La PCR en tiempo real detecta la fluorescencia emitida en cada ciclo por medio
de un mecanismo que genera una señal fluorescente, proporcional a la cantidad
de ADN amplificado.

• El primer incremento significativo (detectable) de la fluorescencia (Ct) se

correlaciona con la cantidad inicial de diana (ADN)

A menor Ct, más

cantidad de producto
 PCR - cinética vs. Detección End point
100

90

80
Detección End point
70 (PCR convencional)

60

50 Detección cinética
(PCR cuantitativa )
40

30

20

10

0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
cycles
La primera curva tiene mayor cantidad de producto, ya que aparece la fluorescencia
antes. Por PCR convencional, las bandas hubieran sido todas iguales.
El umbral se establece previamente, donde corta esa línea encontramos el Ct, que es el ciclo
en el que empieza a visualizarse el producto (se ve la fluorescencia).
Ct: número de ciclos en el cual la fluorescencia emitida supera el umbral.
Esta inversamente correlacionado con el log. del número inicial de copias.
Sybr green, no es carcinogénico, se intercala en la doble hélice. El problema es
que se une a todo producto que se forme, como por ejemplo los dímeros de primer
(superposición y alargamiento de primers complementarios)
DETECCIÓN POR COMPUESTOS FLUORESCENTES INTERCALANTES

SYBR Green

Absorbe a 480 nm y emite a

520 nm.

Desventaja: se une a
cualquier DNA de doble
cadena de forma inespecífica
(dímeros de primers y/o
producto inespecífico.
Curva de melting: aumento Tº. Se forma un pico en la Tº de melting.

Me libero de los dímeros

de primers, ya que al ser
moléculas mucho más
pequeñas sus picos serán
a Tm mucho más bajos
Más usada en diagnóstico

Quencher: neutraliza la fluorescencia del reportero

Esta sonda es
específica, no se une a
dímeros de primers ni a
productos inespecíficos.
Son mucho más caras,
por lo que se usan
normalmente para
enfermedades o casos
particulares.
Tienen una estructura secundaria.
 Diferentes sondas fluorescentes
SYBRGreen®

• Es un marcador inespecífico
• Emite un fuerte señal al unirse al DNA
• Es una unión inespecífica
• Requiere una extensiva optimización
• Permite hacer análisis de curvas de fusión
• Amplicones largos generan señales mayores
• Es mucho mas económico que trabajar con
sondas
• Una buena opción para secreening o para
análisis en los que se conoce muy bien el tipo
de muestra.

Sondas de Hidrólisis: TaqMan

• Sondas de Reporter-Quencher
(no hidrólisis):
Molecular Beacons
Scorpion
Eclipse
 Curva de disociación de los productos
amplificados

Se realizan luego de la reacción.

Disminuye la fluorescencia, a medida que aumenta la
temperatura.
 Cuantificación relativa vs.
Cuantificación absoluta

• Cuantificación absoluta: curva standard

(número de copias)

• Cuantificación relativa: gen de referencia o

gen endógeno (“tantas veces…”)
 Curvas de cuantificación de
la fluorescencia generada
en cada reacción
Para poder compararlas, las curvas
deben tener la misma eficiencia

Distintos Ct para cada dilución, y de ello Absoluta: con curva estandar

obtengo la concentración de la muestra
 Quantificación Relativa
Gen endógeno (ARNr 18s)

Linfocito
activado
Ct Ct
Gen de interés
Ct Ct

Ct Ct
Linfocito

  Ct

2-   Ct = cambio en el nivel de expresión

Obtenemos un valor de cuántas veces más se produce un gen

 PCR en tiempo real
La cuantificación de los productos
amplificados se obtiene usando
cicladores térmicos que pueden
medir la fluorescencia en el
trascurso de la reacción
 Cross-section of rotary optics

Reaction Chamber
Detectio
n Filters

Lens

PMT
Detector
Assembly
LED Light
Tubes in Rotor
Source
Spin Past Optics
Assembly

Spindle/Moto
r Assembly

46
 Rotary optics 3D animation

rotor spins tubes

at 400 rpm filter set
(rotates for
each
channel) sensitive PMT
(photomultiplier)
lens
detector

LED light source

(rotates for each
channel)
47
 LAMP (Loop- mediated isothermal
amplification)

Amplificación isotérmica mediada por horquillas fue desarrollada en

Japón en el año 2000.

La amplificación se realiza a una única temperatura (60-65C).

Utiliza polimerasas con actividad de desplazamiento de hebras (ej. BST

polimerasa).

La amplificación es rápida.

Se pueden usar templados de ARN incluyendo un paso de

Transcripción Reversa.
 Tecnología LAMP
Se utilizan 4- 6 primers que se unen a diferentes regiones en
el ADN blanco. Es una reacción altamente específica.

Se genera una estructura de “Stem Loop” (Tallo-horquilla).

Se realizan ciclos de amplificaciones.

[Link]
LAMP: Estrategias para la detección del producto
1) Medir la formación de Pirofosfato de Magnesio (precipitado) por:
Turbidometría

2) Medir la concentración de Mg 2+ libre: a medida que progresa la reacción

disminuye la [Mg 2+] y se detecta por colorimetría por agregado de un
indicador de iones metálicos, por ej azul de hidroxinaftol(HNB)
En la mezcla de reacción se encuentra presente el HNB, un colorante
indicador que vira de color violeta a color azul cuando la reacción de
amplificación es positiva. Dicho viraje, se debe al cambio de concentración
del Mg2+ libre en solución conforme disminuyen los dNTPs y aumenta el
pirofosfato producto de la polimerización.
HBN es un indicador de color de iones metálicos, al unirse al Mg2+ cambia
de color

Otras:
Gel agarosa/Detección basada en fluorescencia (Syber Green)/
QUimiolumniscencia

Desventaja: baja
sensibilidad, puede dar
falsos negativos
 LAMP vs PCR
LAMP PCR
Reacción isotérmica Requiere ciclado térmico
Requiere 4-6 primers Requiere 2 primers
Rápida (30’- 1 h) Más lenta (2 h aprox.)
10-20 μg de producto 0,2 ug de producto
Es posible la detección No es posible la detección
visual visual
Más tolerante a los Menos tolerante a los
inhibidores presente en la inhibidores presentes en la
muestra muestra
Dificulta la “multiplex” Es posible realizar
“multiplex”