Eduardo Itza Casero
3º Farmacia y NHD
Tema 8. Secuenciación de DNA
1. Métodos de secuenciación de DNA
2. Método de Sanger
a. Terminadores de cadena
b. Síntesis de la cadena de DNA
c. Reacciones
d. Gel de secuenciación
e. Marcaje
f. Marcadores radioactivos
g. Marcadores fluorescentes
3. Estrategias de secuenciación
a. Secuenciación en dos direcciones
b. Cebadores anidados: chromosome walking
4. Secuenciación del genoma
a. Historia del desarrollo tecnológico
5. Bases de datos
1. Métodos de secuenciación de DNA
Distinguimos dos métodos de secuenciación de DNA:
➢ Método químico:
• Fue creado por Allan Maxam y Walter Gilbert en 1977
• Está basado en la ruptura química de la molécula de DNA
• Ganó el Premio Noble de Química en 1980
➢ Método enzimático: Implica el uso de una enzima (la DNApolimerasa)
• Fue creado Frederick Sanger en 1977
• Está basado en la síntesis de DNA mediada por la DNA polimerasa, que es una
enzima que, a partir de una cadena DNA molde, da lugar a la complementaria
del molde (cDNA), que es la que se lee en la secuenciación.
• Ganó el Premio Noble de Química en 1980 (su 2º)
2. Método de Sanger
El método de Sanger requiere de dos componentes esenciales: La DNA polimerasa y
terminadores de cadena:
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a. Terminadores de cadena:
➢ 2’, 3’ Didesoxirribonucleótidos (ddNTPs)
• Carecen del OH 3’ además del 2’: Al perder el grupo -OH, la DNA polimerasa ya
no puede incorporar ninguna base más
• No pueden formar enlace fosfodiéster 3’-5’
• La cadena queda terminada
cuando se incorporan
b. Síntesis de la cadena de DNA:
Diseño experimental de la secuenciación:
➢ Enzima que realice la síntesis: DNA polimerasa
➢ Molde para digerir la síntesis de la cadena complementaria: Da igual
si la cadena molde es bicatenaria porque se puede desnaturalizar
para obtener hebras monocatenarias
➢ Cebador que indica dónde comienza la síntesis: Los nucleótidos se
incorporan en su extremo 3’.
➢ Precursores nucleotídicos (dNTPs)
Estos son los componentes necesarios para que la DNA polimerasa funcione
Método de Sanger:
➢ Es un método para ver crecer la cadena sintetizada base a base: Se sintetiza nucleótido
a nucleótido a partir del cebador. Permite monitorizar la secuenciación base a base
➢ Detener la síntesis tras cada nueva base incorporada: Cuando entra un nucleótido
normal la secuenciación continúa, pero si entra un ddNTPs (terminador), la
secuenciación acaba.
➢ Conjunto de nuevas cadenas cada una, una base más larga que la anterior: Los ddNTPs
permiten obtener todas las posibilidades de terminación, es decir, todos los posibles
tamaños de cadena
➢ Ordenar esas cadenas por tamaño de menor a mayor: Como la diferencia de las cadenas
será de un nucleótido, podremos ordenarlas por tamaño
➢ Identificar en qué base (A, T, G, C) se ha parado cada una
➢ El orden es la secuencia de la hebra sintetizada 5’ → 3’: Se lee en esa dirección
➢ La secuencia comienza a partir del extremo 3’ del cebador
➢ Se corresponde con la secuencia complementaria del molde
c. Reacciones:
➢ Emparejamiento DNA molde/cebador (desnaturalización/renaturalización)
➢ Cuatro reacciones separadas
➢ Proporciones adecuadas de los cuatro dNTPs y un ddNTP ([dNTPs]>[ddNTP])
➢ La incorporación aleatoria del ddNTP genera cadenas terminadas
➢ Habrá cadenas terminadas en todas las A, G, C o T según reacción
➢ Todas tienen el mismo origen
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En primer lugar, para hacer una secuenciación, hay que
emparejar el DNA molde con el cebador, de manera que el
cebador queda emparejado con una de las dos cadenas del
DNA molde, el cual suele ser bicatenario. Una vez juntados,
se separa la mezcla en 4 partes (4 tubos eppendorf) idénticas.
Todos los tubos contienen la mezcla de los 4 dNTPs y, en cada
uno de ellos, añadimos un ddNTP terminador.
Posteriormente, se añade la DNA polimerasa y se produce la
reacción catalizada por la polimerasa. A la hora de visualizar
el sistema necesitamos un sistema de máxima sensibilidad
(no podemos usar Bromuro de Etidio). Este sistema serán
isotopos radioactivos o fluorocromos.
El marcaje radiactivo se puede hacer en uno de los nucleótidos del cebador o terminador, con
lo cual todas las cadenas de síntesis van a ser radioactivas o uno de los 4 dNTPs que hay en la
mezcla de reacción. Por pura probabilidad en el momento en el que entren 4-5 nucleótidos, 1
de ellos estará marcado. Por tanto, las cadenas que sintetizamos las podremos visualizar
PROCESO: De los 4 tubos explicaremos lo que pasa en uno de ellos y el proceso será aplicable
para todos:
Tubo con el terminador de la Citosina: Cuando tenemos nuestro cebador, que es la secuencia
en rojo, si el primer nucleótido que se une es una C terminadora termina la secuencia. Si, por el
contrario, entra una C normal entonces continua la entrada de los correspondientes dNTPs
complementarios a la cadena molde. Se añaden dNTPs hasta que vuelve a producirse la entrada
de una C que puede ser nuevamente un terminador y provocar el cierre de la cadena.
Esta situación se repite para cada uno de los casos en los que puede entrar la C. Por tanto, unas
pocas moléculas se terminarán antes y otras muchas continuarán. Esto permite obtener un
continuo de todas las posibilidades de terminaciones hasta 2000 nucleótidos. Para que esto
suceda, la proporción de dNTPs tiene que ser mucho mayor que la de los terminadores.
En este caso, para 5 posibles localizaciones de G, habrá 5 posibilidades de entrada de una C
terminador. El tamaño de la cadena será el tamaño del cebador (7 nt) más el tamaño de los
nucleótidos que han entrado. Entonces, en el tubo con el terminador de ddCTP identificamos
todas las posibles cadenas de terminación para C.
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Lo mismo ocurre para los distintos terminadores con sus respectivos nucleótidos
complementarios.
Todas estas moléculas terminadas, si somos capaces de separarlas electroforéticamente, las
podremos ordenar en función del tamaño.
Siempre va a estar favorecida la entrada del dNTP normal (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) sobre la
entrada de los terminadores (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP). Con esto conseguimos un ‘pool’ de
moléculas cuya suma de sus fragmentos sea distinta al resto
d. Gel de secuenciación:
➢ La separación de las cadenas en el gel es por tamaños: La separación se produce del polo
positivo al negativo
➢ Se usa un gel de acrilamida de alta resolución (1 nt)
➢ Cada reacción se carga en una calle: Se cargan en el gel los 4 tubos, cada uno con su
marcador específico
➢ Una vez hecha la separación electroforética, con una película
radioactiva, aparecen estas bandas. La cadena de menor
tamaño es la que está más abajo y se va contando en función
de la altura de las líneas (de abajo a arriba). La letra indica la
última base incorporada. Así:
▪ Cebador +1 = 1ª base: C
▪ Cebador + 2 = 2ª base: G
▪ Cebador +3 = 3ª base: T
▪ ……………………………………
▪ Cebador + N = Nª base: N
La secuencia se lee en dirección 5’-3’. La cadena que se lee
corresponde a la cadena sintetiza y la cadena complementaria a esta será la secuencia
molde. Así quedaría de esta forma
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Estas cadenas se corresponden a las cadenas del apartado
de reacciones, pero ordenadas por tamaño una vez
resueltas.
e. Marcaje:
➢ Las cadenas sintetizadas deben estar marcadas para su detección
➢ El marcaje se incorpora durante la síntesis: Tres posibilidades
▪ Inclusión de un precursor marcado (dNTP): Marcaje extensivo a lo largo de la
cadena sintetizada. Se marca uno de los 4 dNTPs. Cuando el isotopo está en uno
de los dNTPs, el marcaje es proporcional al número de nucleótidos que entra al
molde
▪ Utilización del cebador marcado: Marcaje puntual en el extremo 5’ de la cadena
sintetizada, ya que se marca el extremo 5’ del cebador. Sólo se tiene un átomo
radioactivo en el cebador, pero es suficiente para marcar las moléculas.
Además, será homogéneo para todas las moléculas, es decir, todas las
moléculas tienen la misma intensidad de radioactividad
▪ Utilización de un terminador marcado (ddNTP): Marcaje puntual en el extremo
3’ de la cadena sintetizada. En este caso también se tiene un único isotopo
porque solo entra un terminador por molécula. El marcaje, en cuanto a señal,
equivale a la del cebador
➢ Marcaje radiactivo: Isotopos clásicos de marcaje → 32P, 33P o 35S. La reactividad da
siempre es de color negro. Con lo cual, hay que cargar los 4 tubos de la secuenciación
separados en el aparato porque si no, no se distinguirían las cadenas. Los isotopos se
pueden poner:
▪ Precursor (dNTP), marcado en el fosfato en posición α
▪ Cebador, marcado en el extremo 5’ (PNK más [γ – 32P]ATP)
➢ Marcaje fluorescente: Varios fluorocromos de colores distintos. Estos marcadores
surgieron para sustituir los marcadores radioactivos (podían ser peligrosos por la
radioactividad). Funcionan igual que los isotopos de radioactividad, ya que se pueden
marcar cebadores, precursores o terminadores
▪ Los fluorocromos van unidos a un grupo amino de un nucleótido
▪ Puede usarse un solo color o un color para cada nucleótido (A, T, G, C): Los
distintos colores van a permitir tener la muestra, en vez de en 4 tubos con el
marcaje radiactivo, a 1 tubo
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f. Marcadores radioactivos:
[α-33P]dCTP/[α-32P]dCTP: El marcaje es en el P de la posición alfa,
ya que es el que queda unido en el enlace fosfodiéster cuando se va
formando la cadena. Los otros dos P se eliminan. Las muestras en
amarillo representan 4 ejemplos de dNTPs que han entrado
radioactivamente.
[γ-32P]dCTP: El marcaje es en la posición gamma. Este marcaje se
usa cuando se quiere marcar en el cebador. Se usa una enzima, la
polinucleótido quinasa para añadir el fosforo marcado al cebador
(ver tema 2). En este caso se marca el cebador y, por tanto, todas
las cadenas sintetizadas quedan marcadas
g. Marcadores fluorescentes:
Hay marcadores que dan distintas versiones de colores.
- Puede ser que los cuatro dNTPs estén marcados con el mismo fluorocromo de manera
que hay que usar 4 cadenas sintetizadas, es decir, 4 tubos distintos.
- Puede ser que cada ddNTP esté marcado con un fluorocromo diferente. Entonces la
reacción se puede tener en un único tubo
El marcaje fluorescente ha permitido la automatización. Secuenciadores automáticos:
➢ Geles:
▪ Un solo color: Cuatro calles/reacción
▪ Cuatro colores: Una calle/reacción
➢ Capilares (20 – 200 μm Ø)
▪ Cargado automático
▪ Rápidos y reutilizables: Son resinas que, después de la electroforesis, se pueden
lavar y reutilizar
▪ Procesado continuo de muestras
▪ Mucha mayor capacidad (n x 107/día)
▪ Proyectos genoma
Las cadenas conforme van corriendo pasan por un detector laser el cual estimula al DNA que
pasa por esa posición provocando que el fluorocromo emita un color y, por tanto, que sea
detectado. Una vez es detectado, un programa informático va a leer la secuencia
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Ejemplos de los dos resultados clásicos:
- Autorradiograma correspondiente a un gel manual radiactivo
- Cromatograma de un secuenciador automático
El método de Sanger permite secuenciar DNA molde bicatenario:
- Permite obtener la secuencia de ambas hebras: En tubos distintos independientes se
puede realizar la secuenciación, por un lado, de la cadena molde (cebador sentido) y,
por otro lado, la cadena complementaria (cebador antisentido). Una vez hecho esto, se
podrá completar el “puzzle”, es decir, deducir la secuencia bicatenaria.
- Diseño del cebador determina qué hebra es leída
- Cebadores opuestos emparejan en hebras complementarias: La cinética de
emparejamiento es siempre más rápida la del cebador
- Dos reacciones en direcciones opuestas dan la secuencia de ambas hebras y permiten
cubrir regiones de mayor tamaño entre las dos.
3. Estrategias de secuenciación
a. Secuenciación en dos direcciones
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Consiste en el uso de dos cebadores en orientaciones opuestas que dan lugar a un único clon
Cuando queremos clonar una secuencia, si esta es desconocida, el inserto se clona en un vector
plasmídico, el cual tiene todos los elementos necesarios para las aplicaciones posteriores que
vamos a hacer. El inserto puede clonarse en una orientación sentido o en la dirección opuesta.
Entonces, para clonar estas secuencias desconocidas, se diseñan unos cebadores
complementarios a secuencias que sí conozcamos, es decir, complementarios a secuencias del
vector. Por tanto, a partir de estos cebadores basados en la secuencia que forma parte del
vector, yo podré introducir cualquier inserto en el vector
Para que la DNA polimerasa funcione es
necesario que el cebador se empareje con su
molde y, a partir de ese cebador, la polimerasa
será capaz de sintetizar. El cebador 1 será
complementario a la hebra sentido del plásmido
y el 2 es complementario a la hebra antisentido
del plásmido. Estas secuencias pueden ser:
- Secuencias promotoras
- Secuencias cebador universal/reverso universal (la de la imagen).
Con el cebador 2 se sintetiza la cadena complementaria a la cadena B y con el 1 se obtiene la
cadena complementaria a la cadena A
Con esta estrategia, cualquier fragmento de DNA clonado en un vector puede ser secuenciado.
La forma de iniciar la secuenciación de cualquier inserto clonado es con cebadores periféricos.
b. Cebadores anidados: Chromosome walking
Una vez se ha introducido el cebador en el inserto, es difícil que en una sola secuenciación se
lea todo el inserto clonado. Por eso, para poder conseguir la secuenciación completa se hace
una secuenciación por partes:
A partir de un cebador original, tiene lugar una reacción que cubra un tercio del inserto. Una vez
secuenciada esta parte desconocida, en la parte más distal de la secuencia conocida, se sintetiza
un nuevo cebador. De nuevo, si no llegaba hasta el extremo del inserto se repite el proceso. Así
hasta que llegue hasta el final de la secuencia. Esta estrategia se conoce como paseo
cromosómico. Finalmente se combinan las secuencias para obtener el inserto secuenciado.
Resumen de cebadores:
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4. Secuenciación del genoma:
Sanger logro secuenciar en 1977 un
bacteriófago relativamente pequeño
(5386 pb) en 2 años. Desde ese
momento hasta la década de los 80-
90 el número de pb que se
secuenciaba se mantuvo constante.
Sin embargo, a partir del impulso del
proyecto genoma humano (HGP) se
ve un aumento del tamaño en las
secuenciaciones. Desde este
momento, se considera ya la era de
la genómica, es decir, estamos en un
momento en el que podemos secuenciar a gran escala con técnicas de alto rendimiento y la
automatización de los procesos
a. Historia del desarrollo tecnológico:
Hasta el 2005 la secuenciación se
basaba en el método de Sanger:
Primero en sistemas de geles y,
luego, en sistemas capilares. Sin
embargo, a partir de 2005 se ponen
en marcha métodos de
secuenciación a gran escala y en el
2008 se secuenció el primer genoma
humano.
Ya no interesa la secuencia de los
genomas base a base, sino que ya interesa replicar los nucleótidos del genoma que están o no
metilados. Ahora se sabe que los estados de metilación son los que controlan si un gen se
expresa o no.
Eduardo Itza Casero
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5. Bases de datos (bancos de secuencias):
International Nucleotide Sequence Database Collaboration
- Acceso libre de los científicos a todos los datos
de estas bases
- Libre de cargas
- Las secuencias enviadas al INSD permanecen
permanentemente accesibles
La secuenciación del clon sirve para saber si la secuencia del nucleótido es exactamente la que
pensamos que tiene que ser. Todo proceso de clonación acaba con una secuenciación, cualquier
modificación de ac. Nucleicos siempre tiene que continuar con una secuenciación. Desde el
punto de vista de la manipulación del vector recombinante, la secuenciación actúa como control
de calidad
