UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS “ESPE”
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA
ENZIMOLOGÍA
RECUPERACIÓN
DE ENZIMAS
Procesos de aislamiento
INTEGRANTES NRC 2494
José Aguirre
Cristian Logroño
Odalis Quilumba
Cristina Aguayo
INTRODUCCIÓN
Enzimas como biocatalizadores tienen numerosas aplicaciones industriales
Ventajas
Gran especificidad Estereoselectividad Se evita reacciones
secundarias o
de sustrato Regioespecificidad subproductos no desados
Muy activos en condiciones suaves
La mayorìa de enzimas Dificulta su separaciòn
no son siempre estables y su reutilización
Separación y asilamiento
Separarlas de otros componentes celulares o del medio extracelular
Estudiar sus propiedades sin interferencias
Medir su actividad y regulaciòn en condiciones controladas
Aislamiento/Recuperación Purificación
Separar y eliminar
Extraer y concentrar la enzima contaminantes del extracto
Objetivo desde su fuente. crudo.
Pureza del
producto Baja o moderada Alta
Técnicas Disrupción celular, Cromatografía, precipitación,
utilizadas centrifugación, filtración. diálisis.
Nivel de Etapa inicial del proceso. Etapa posterior
procesamiento
Aplicación del Productos industriales donde Aplicaciones médicas o de
producto se toleran impurezas (e.g., investigación, donde se
detergentes). requiere pureza.
ENZIMAS ENZIMAS
INTRACELULARES EXTRACELULARES
Permanecen dentro de la Secretadas al medio
célula durante procesos de
Deben ser liberadas por fermentación o
disrupción celula. crecimiento.
Generalmente son más Más fáciles de recuperar
resistentes a condiciones Tienden a ser más
adversas. frágiles.
Ejemplo: Ejemplo:
Enzimas del ciclo de Amilasas
Krebs, como la secretadas por
isocitrato hongos como
deshidrogenasa. Aspergillus.
Para aislar eficientemente a una enzima, es necesario
comprender sus propiedades
Estructura y estabilidad
Su estructura terciaria es clave para su
actividad Enlaces de hidrógeno
Su estabilidad depende de interacciones Puentes disulfuro
débiles
Solubilidad Punto
Composición de aminoácidos y carga neta isoeléctrico
de proteína pH al cual su carga neta
El punto isoeléctrico es crucial para elegir es cero, debido a un
equilibrio entre cargas
condiciones. positivas y negativas en
sus grupos funcionales.
Actividad enzimática En este punto, la enzima
es menos soluble y
Conocer sus requerimientos específicos de tiende a precipitar.
cofactores
Estabilidad de la enzima
Temperatura: pH:
Rango específico de temperatura en el que Tomar en cuenta el pH óptimo de la enzima, en el cual los grupos funcionales
mantiene su estructura nativa y su actividad de los aminoácidos en su sitio activo están en la forma ionizada. Ya que una
catalítica, quecorresponde a la temperatura del alteración en la carga del sitio activo afecta la unión del sustrato y la
entorno del organismo de origen. catálisis.
Enzimas mesofílicas: Estables entre 20-40 °C pH óptimo pH ácido pH alcalino
(Escherichia coli).
Enzimas termofílicas: Resisten temperaturas
superiores a 60 °C
También afecta la solubilidad de impurezas no deseadas
TAMPONES CONTROL DE TEMPERATURA ENFRIAMIENTO RÁPIDO
Mantienen el pH estable durante la Uso de baños térmicos o cámaras de Al final de la extracción, el enfriamiento
extracción y purificación. Ejemplo: Tris- enfriamiento para evitar fluctuaciones rápido minimiza la descomposición
HCl o fosfato de sodio térmicas durante la extracción. enzimática
Origen o fuente de la enzima
y su impacto en el proceso de recuperación
Principales fuentes Requiere la Son abundantes
debido a su fácil extracción directa en frutas, raíces y
cultivo, rápida de tejidos hojas, y adaptadas
replicación y específicos, como a diversas
capacidad de órganos o condiciones
producción a gran glándulas ambientales, sus
escala. animales. condiciones de
cultivo importan
Ejemplo:
Proteasas Ejemplo: Ejemplo:
Celulasas Tripsina Papaína
Lipasas Quimotripsina Bromelina
Etapas del proceso
Caracterización Lisis Celular
Inmobilización
Recuperación
Visualización
Tras el proceso, este mismo se tiñe de un color
adecuado, el cual se visualiza por medio de luz
ultravioleta
APLICACIONES
Se utiliza en la separación de proteínas y de
diferentes moléculas.
Es útil para procesos en los cuales incluso se
verifica la pureza de la enzima por medio de su
tamaño molecular.
Esencial a la hora del estudio de las
isoenzimas, en las cuales se verifica las
actividades y el tamaño que estas mismas
presentan
La cromatografía en fase reversa separa moléculas según su hidrofobicidad,
utilizando una fase estacionaria hidrofóbica y una fase móvil compuesta de agua
y un solvente orgánico, como acetonitrilo.
Fase Estacionaria Fase Móvil
Partículas de sílica modificadas con cadenas Mezcla de solventes acuosos y orgánicos, ajustados
hidrofóbicas por propiedades de moléculas.
PROPIEDADES
Se desarrolla la preparación de la muestre, disolviendo el solvente e inyectgando en la
columna de cromatografía.
Se desarrolla la elución en donde la fase movil fluye por la columna y las moléculas se
separan por la interacción de la fase estacionaria, donde las moléculas más
hidrofóbicas se mantienen en la columna.
Se desarrolla la detección de la misma con absorbancia recogiendo sus fracciones
Se presenta como una técnica para separación de moléculas según su tamaño
y carga por medio del gel por medio del campo eléctrico.
Fase Estacionaria Fase Móvil
Gel de agarosa o poliacrilamida, actuando como Corriente Eléctrica aplicada al gel que impulsa las
matriz porosa moléculas hacia un extremo del gel
PROPIEDADES
La muestra se prepara con ayuda de un tampón Se añaden las muestras de pocillos de gel.
adecuado, cargando las moléculas. Aplicación del campo eléctrico.
Se añade el marcador de peso molecular para Se conecta la cámara a una fuente de alimentación
comparar el tamaño de las moléculas. para campo eléctrico.
Carga de gel
El gel se separa y se coloca en cámara de
electroforesis.
La lisis o disrupción celular es el proceso mediante el cual se rompe la membrana
de las células para liberar las enzimas u otros componentes intracelulares, se
busca un alto rendimiento sin pérdidas ni contaminación del producto.
Fundamento
Se parte de biomasa objetivo la cual
fue previamente caracterizada e
inmovilizada, la cual es sometida a
procesos de lisis celular que pueden
ser mecánicos, no mecánico o por lis
enzimática
El método mecánico de lisis celular utiliza fuerzas físicas para romper las células y
liberar su contenido intracelular, incluidas las enzimas. Este enfoque es ampliamente
usado en la industria debido a su eficiencia para tratar grandes volúmenes de
muestras.
Ventajas
Eficiente y versátil con los diversos tipos de
celular.
Aplicables en la industria por su
capacidad de procesamiento masivo
No requiere de agentes químicos
Homogenización a
alta presión
Desventajas
La lentitud de los métodos llega a ser
considerables e incluso inadecuados a
nivel industrial. Ultrasonido
Dependencia de los agentes externos.
Peligro de toxicidad.
No apto para todos los tipos de células,
sobre todo las resistentes Perla de Vidrio
Se emplea agentes químicos, térmicos, o enzimáticos para romper las membranas
celulares y liberar el contenido intracelular, sin utilizar fuerzas físicas directas. Es
utilizado principalmente cuando se necesita un proceso más suave o cuando las
células son difíciles de romper con métodos mecánicos.
Ventajas
Reduce el daño a las moléculas sensibles.
Presenta una mayor selectividad en
cuanto a la ruptura de las células.
Proceso más sencillo y económico
No requiere el uso de equipos o se reduce
el mismo
Homogenización a
alta presión
Desventajas
Coste energético alto.
Calor que puede provocar una Lisis Química
desnaturalización.
Se requiere mantenimiento constante
de los equipos
No es selectivo pudiendo contaminar las
muestras Lisis Térmica
Es un proceso en el cual enzimas específicas se utilizan para romper las membranas
celulares y liberar el contenido intracelular sin dañar otras estructuras importantes, el
proceso se basa en la acción de enzimas que descomponen los componentes de la
membrana celular, como la pared celular
Ventajas
Presencia de alta especificidad con un
bajo impacto térmico y es controlable.
Desventajas
Similar a los métodos no mecánicos,
presenta una velocidad incluso menor,
con un costo por las enzimas y la Lisozima
necesidad de condiciones especificas y a
veces discordantes.
Celulasa
El fundamento del mismo es actuar sobre las
diferentes estructuras de la célula, como
puede ser la pared celular, membrana lipídica
o proteínas de membrana Pectinasa
Lisozima
Actúa como una enzima que rompe la pared celular de
las bacterias GRAM positivas al atacar los enlaces de
los componentes del peptidoglicano
Celulasa
Especifica de plantas, ya que se encarga de
romper las paredes celulares de la planta, en
especifico de la celulosa
Pectinasa
Utilizada para descomponer la pectina de las paredes
celulares de la fruta.
Es el proceso empleado luego de la lisis celular, encargado de la separación y
concentración de enzimas específicas a partir de una mezcla compleja, como un
extracto celular o un medio de cultivo.
Fundamento
Se encarga de desarrollar la recuperación por medio de las propiedades
fisicoquímicas como puede su tamaño, carga eléctrica, solubilidad y afinidad por
diferentes compuestos
Centrifugación Filtración Precipitación
Técnicas de aislamiento
enzimático
El método más común es la Precipitación
con sal o salting out, se induce la
precipitación de proteínas
Económico
Se conserva la capacidad
enzimática
Se puede aplicar a gran escala
Un ajuste erróneo del pH puede
causar la pérdida de la enzima
de interes.
Industria alimentaria y farmaceútica
Técnicas de aislamiento
enzimático
Uso de etanol, metanol, acetona y
butanol, permite concentrar
enzimas o eliminar productos no
deseados
Ideal para enzimas hidrofóbicas
o con alta actividad
Económica
Dificil control de selectividad
Recuperación baja por pérdida
de actividad
Puede representar un riesgo
ambiental
Técnicas de aislamiento
enzimático
Permite separar y concentrar
componentes de una mezcla
líquida mediante membranas
semipermeables.
Reducción de obstrucción
Reutilización
Flexibilidad
Alta eficacia en separación
y concentración
Costo elevado
Industria alimentaria, La sensibilidad de las
industria farmacéutica membranas se puede ver
para la concentración de afectada
proteínas y enzimas
Se aplica en la extracción,
VENTAJAS separación, purificación y
Presenta una mayor enriquecimiento de proteínas,
selectividad y especificidad membranas, virus, enzimas,
Es ideal para trabajar con ácidos nucléicos
enzimas en la industria
farmacéutica
Técnica de
DESVENTAJAS
fraccionamiento líquido-
Algunas enzimas pueden no ser
solubles reduciendo su eficiencia líquido
Pueden ser costosos por el uso de
resinas, buffers o quipos
especializados.
Se componen por un polímero y
una sal, las proteínas se separan
al mostrar preferencia por una
de las dos fases.
Recuperación de
compuestos Enzimas intracelulares
bioactivos
Mecanismos fundamentales
Efecto térmico
Efecto mecánico
Efecto de cavitación
Lisis Celular
Ventajas sobre métodos tradicionales
Tiempos de extracción más cortos
Menor consumo de solventes
Mejor calidad del extracto
Metodología
Depende de la naturaleza
Solvente de la enzima
Agua destilada
Glicerol
Ethanol (10 - 20 %)
APLICACIONES (EJEMPLO)
Industria alimentaria
Eliminación de Compuesto
compuestos de biopeligrosos Carbonato de etilo
riesgo biológico Aminas biógenas
Nitrito
Microorganismos
Control de seguridad endógenos
Uretanasa (UH, EC [Link])
Carbonato de etilo Aislada/ recuperada
Lysinibacillus fusiformis
Lisis Celular Filtración, ultrfiltración
ATPS (Sistemas de Dos
Fases Acuosas)
Alimentos fermentados Amoniaco, dióxido UAE (Extracción asistida
de carbono y
por ultrasonido)
etanol
Semisíntesis del paclitaxel (Taxol®) mediante métodos enzimáticos
Enzimas en la producción industrial de antibióticos β-lactámicos
semisintéticos
Obtención de biodiesel mediante métodos enzimáticos
PERSPECTIVAS A FUTURO Reducción
ambiental
del impacto
Desarrollo de enzimas
Desarrollo de biocatalizadores artificiales y biosintéticas
más eficietes y económicos
que catalizadores químicos
Screeaing in sílico
Diseño de biocatalizadores mejorados
mediante evolución dirigida:
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