Informes práctica de laboratorio de Bioquímica- 201103

Presentado por:
Diana Carolina Sanabria Reyes
Código: 40340741
Julieth Tatiana Hernández Herrera
Código: 1121963019
Yenci Viviana Cardona Ibata
Código: 1121824317

Presentado a:
Nira Esther Díaz Rodríguez

Universidad Nacional Abierta y a Distancia - UNAD

Escuela de Ciencias Básicas, Tecnología e Ingeniería
Noviembre, 2024
PRÁCTICA NO. 1. BIOSEGURIDAD
MARCO TEÓRICO

Procedimiento a desarrollar:

Objetivo de la practica:
Conocer e identificar las normas de bioseguridad e higiene para aplicarlas en la práctica
de laboratorios en general.
1. Para el desarrollo de esta práctica el estudiante debe observar el video de normas
de seguridad en el laboratorio: https://www.youtube.com/watch?
v=P61HBXO8DIs

2. Se hará la discusión sobre las normas de seguridad antes descritas y las que se
encuentran en la Reglamentación y Normas de Bioseguridad en los Laboratorios
de la UNAD y Otras Disposiciones.
3. Realice las siguientes actividades:
a. Identifique la señalización que encuentra en el laboratorio, fotografíe o
dibuje los pictogramas y elementos de seguridad que encuentre (Duchas,
extintores, cámaras extractoras, etc.) describa en el informe de laboratorio su
significado o uso según corresponda.

Imagen Clasificació Significado Uso

n
Ruta de Salida
evacuación especial
Pictograma que es
utilizada
para evacuar
en casos de
accidentes
Zona de Realizar
acceso actividades
Pictograma limitado por específicas
razones de bajo una
seguridad supervisión.

Pictograma Prohibido Uso

ingreso a informativo
mujer en
gestación
Pictograma Prohibido Uso
arrojar informativo
sustancias
químicas y
residuos
sólidos por
el vertedero
Pictograma Prohibicione Uso
s de informativo
actividades
que no se
pueden
realizar
dentro del
laboratorio
 Pictograma Elementos Uso
de uso informativo
dentro del
laboratorio

Pictograma Señalización Uso

de la ruta de informativo
evacuación y que indica la
salida ruta a seguir
para la salida
de
emergencia.

Pictograma Señalización Uso

que indica informativo
peligro de y de
alta seguridad
temperatura

Elementos Cabina de Máquina

de seguridad seguridad para
biológica protección
del personal
al momento
de manipular
sustancias
muy fuertes.
Elementos Extintor CO2 Extintor para
de seguridad apagar fuego
de tipo B y C
Tipo B:
producidos
por líquidos
y gases
combustibles
.
Tipo C:
generado por
descargas o
corrientes
eléctricas.
Elementos Kit de Elementos
de seguridad derrame necesarios
para contener
un derrame
mínimo de
algún
Fuente imágenes propias. material
Nota: el laboratorio de prácticas no cuenta con lava ojos en caso de una emergencia.
b. Defina Riesgo biológico y Riesgo químico

Riesgo biológico: Se define el Riesgo Biológico como la posible exposición a

microorganismos que puedan dar lugar a enfermedades, motivada por la
actividad laboral. Su transmisión puede ser por vía respiratoria, digestiva,
sanguínea, piel o mucosas; los mecanismos de contaminación son por
inhalación, ingestión a través de heridas en la piel, acu punción entre otras.

Riesgo químico: son los daños causados por exposición no controlada a los
agentes químicos, sean compuestos o sustancias. Existen varios tipos de riesgo
químico como:
 Inflamables: son las sustancias que reaccionan consigo misma y son
altas en la generación de gases tóxicos como el etanol.
 Explosivos: son los que reacción rápidamente a la combustión,
generando cantidades enormes de calor, luz y energía cinética
(movimiento) o de fácil esparcimiento como la nitroglicerina.
 Comburentes: son sustancias capaces de generar oxidación violenta en
sustancias inflamables o combustibles, es decir generar fuego o retrasa la
extinción como el oxígeno.
 Corrosivos: estás reaccionan mediante oxido-reducción ante la materia
orgánica, es capaz de producir quemaduras y deterioro sin necesidad de
flama como el ácido clorhídrico.
 Irritantes: son más livianos que los corrosivos, producen lesiones
reversibles en la piel o en las mucosas como el carbonato de sodio.
 Tóxicos: tienen propiedades moleculares que los hacen reactivos con el
organismo causando efectos impredecibles en el mismo como el
monóxido de carbono.
 Radiactivos: son sustancias inestables atómicamente donde sus
moléculas emiten partículas (neutrones, protones) constantemente a
medida que se descomponen en otro elemento estable, ocasionado daño y
deterioro en los tejidos y alteraciones en el código genético como el
Coblato-60.

c. Escoja uno de los reactivos utilizados en el componente práctico y

conteste las siguientes preguntas:

El reactivo seleccionado es el ácido acético C2H4O2 es un ácido débil; es

utilizado en procesos de fermentación como los vinos o en ciertas frutas, es
una sustancia orgánica presente en la composición del vinagre, responsable
de su sabor agrio y olor.

 Propiedades físicas: es cristalino cuando se encuentra con su ion acetato

(usando sal o éster del ácido), su punto de fusión es de 16,6 ⁰C y un punto de
ebullición de 117,9 ⁰C; se puede separar del agua mediante el proceso de
destilación.
Su densidad es de 1049 kg/m3 y una acidez moderada de 4.8 pKa.
Es inflamable y corrosivo es capaz de irritar gravemente la piel, los ojos, y el
tracto digestivo (por ingestión) o respiratorio (por inhalación).
  Propiedades químicas: pertenece a los ácidos carboxílicos (caracterizados por
la presencia de un grupo químico funcional carboxilo: -COOH), y se lo suele
ubicar en las clasificaciones entre el ácido fórmico o metanoico (que posee un
único átomo de carbono) y el ácido propanoico (que posee ya una cadena de tres
átomos de carbono). Es de interés para la química orgánica como reactivo, para
la química inorgánica como ligando, y para la bioquímica como metabolito
(activado como acetil-coenzima A). También es utilizado como sustrato, en su
forma activada, en reacciones catalizadas por las enzimas conocidas como acetil
transferasas, y en concreto histona acetil transferasas.
Mencione posibles riesgos que representa la sustancia para la salud:
 Por ingestión: Dolor de garganta, vómito, diarrea, dolor abdominal, sensación
de quemazón en el tracto digestivo.
 Por inhalación: Dolor de garganta, dificultad respiratoria, tos.
 Contacto con la piel: irritación, graves quemaduras.
 Ojos: Irritación, visión borrosa, quemaduras profundas.
Indique cual es el equipo o la vestimenta de seguridad necesaria para manipular la
sustancia:
 Equipo respiratorio adecuado para manipularlo en lugar que no esté bien
ventilado.
 Guantes
 Gafas anti salpicaduras
 Delantal sintético
 Respirador de vapor (si es necesario).
 En caso de que se produzca un derrame debe contar con un equipo de
respiración autónomo y también debe usar un traje de protección completo para
mayor seguridad.
Referentes bibliográficos:

Ácido_acético . (Dakota del Norte). Quimica.es. Recuperado el 4 de noviembre de

2024, de https://www.quimica.es/enciclopedia/%C3%81cido_ac%C3%A9tico.html

Álvarez, D. O. (n.d.). Riesgo Químico - Concepto, clasificación y características.

Retrieved November 4, 2024, from https://concepto.de/riesgo-quimico/

Reglamentación, Y., De Bioseguridad, E., Los, L., De, L., Unad, De Medios, V., &
Pedagógicas, Y. (n.d.). UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA 2020.
https://academia.unad.edu.co/images/laboratorios/2020/Reglamentaci
%C3%B3n_Normas_Bioseguridad_Laboratorios_UNAD_2020-final.pdf
 PRÁCTICA NO. 2. IDENTIFICACIÓN DE LÍPIDOS

MARCO TEÓRICO

Procedi
miento a desarrollar
Registro de datos y evidencia fotográfica:
Parte I. Emulsificación.
Procedimiento Imagen
a. Tome dos tubos de ensayo y
agregue a cada uno 5 ml de agua.
Posteriormente, en uno de los
tubos agregue 10 gotas de aceite
vegetal de cocina y en el otro tubo
10 gotas de aceite de oliva.
b. Agitar fuertemente, observar y
registrar cuánto tiempo dura la
emulsión.

Foto: Julieth Hernández, (Laboratorio CEAD

Acacias, 2024)

Análisis
En base a las dos muestras de aceite, para el de
cocina la emulsión se dio en 30 Segundos y
como se puede observar fue más turbia en
comparación con el aceite de oliva que tardo
solo 25 segundos y evidentemente al agitar la
muestra queda mas clara.

Parte II. Saponificación.

Procedimiento Imagen
a. En un tubo de ensayo adicionar
10 gotas de aceite de oliva, en
otro tubo adicionar 10 gotas de
aceite vegetal, y en otro adicionar
manteca.
b. A cada tubo adicionar 3 ml de
NaOH al 20%
c. Llevar a calentamiento en un
baño maría durante 3-5 minutos.
Sumergiendo el tubo de ensayo
con ayuda de las pinzas para tubo
de ensayo.

Foto: Julieth Hernández, (Laboratorio CEAD

Acacias, 2024)
d. Separar el precipitado formado,
decantando la solución sobrante
en otro tubo de ensayo, lo cual
representa el exceso de hidróxido
de sodio que no reaccionó.

Foto: Julieth Hernández, (Laboratorio CEAD

Acacias, 2024)
e. Agregar a cada uno de los tubos
con el precipitado 3 ml de agua
destilada. Agitar y observar.

Foto: Julieth Hernández, (Laboratorio CEAD

Acacias, 2024)
f. Agregar a cada uno de los tubos
cloruro de sodio (NaCl) a
saturación, aproximadamente lo
que se mida con la punta de la
espátula.

Foto: Julieth Hernández, (Laboratorio CEAD

Acacias, 2024)
g. Agregar 3 ml de agua destilada,
agitar y observar si se disuelve y
forma espuma jabonosa.

Foto: Julieth Hernández, (Laboratorio CEAD

Acacias, 2024)

Análisis
De acuerdo con lo trabajado de las diferentes
muestras (aceite comercial, vegetal y manteca
de cerdo) en laboratorio se puede concluir que
La que obtuvo mejor precipitado fue la de
aceite de oliva pues esta al disolverse formo la
mayor cantidad de espuma jabonosa, en
comparación con el aceite comercial y la
manteca de cerdo que, aunque lograron
disolverse no se logra observar un mayor
precipitado, evidenciándolo en la cantidad de
espuma que formaron.
Parte III. Índice de Yodo.
Procedimiento Imagen
a. Tomar 3 tubos de ensayo y
colocar a cada uno de ellos 2 ml
de etanol y 0,5 g de una muestra
de lípido si es sólida, o 0.5mL si
es líquida (muestra de lípido:
manteca, aceite de cocina y
aceite de oliva).
b. Someter a calentamiento en
baño maría por un minuto cada
tubo y dejar enfriar.
c. Agregar 5 gotas de lugol a cada
tubo de ensayo y mezclar.
d. Agitar y observar el resultado
anotando cuáles son los cambios Foto: Julieth Hernández, (Laboratorio CEAD
para cada una de las muestras. Acacias, 2024)

Análisis
El aceite de oliva tiene el mayor contenido de
ácidos grasos insaturados, especialmente en
forma de ácido oleico, lo que lo convierte en
una opción más saludable en comparación
con el aceite comercial y la manteca de cerdo.
Así podemos decir que incorporar grasas
insaturadas en la dieta de manera equilibrada
puede ofrecer numerosos beneficios para la
salud, especialmente en lo que respecta a la
salud cardiovascular y el bienestar general. Es
importante recordar que, aunque son
saludables, deben consumirse en cantidades
adecuadas dentro de una dieta balanceada.

Referentes bibliográficos:
Cárdenas, J. A., & Rojas, M. (2015). "Estudio de emulsiones de aceite de palma y
agua utilizando diferentes emulsificantes." Revista Facultad de Ingeniería, Universidad
de Antioquia, 76, 55-64.
González, M. (2014). "Producción de jabón a partir de aceites residuales: análisis de la
saponificación." Revista de Ciencias Ambientales, Universidad de Caldas, 12(2), 45-58.
Martínez, C., & Salazar, M. (2019). "Evaluación de métodos de saponificación
en la producción de jabones artesanales." Revista Colombiana de Ciencias
Químico-Farmacéuticas, 48(1), 33-40.

PRÁCTICA NO. 3. EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN

ESPECTROFOTOMÉTRICA DEL ADN
MARCO TEÓRICO

Procedimiento a desarrollar
Resultados de laboratorio:
Parte I. Extracción de ADN
a. En un vaso de precipitado prepare una solución
de Lisis, a partir de la mezcla de 50ml de agua
destilada 1ml de jabón líquido y 2 gramos de
cloruro de sodio (NaCl).

b. Para ello debe pesar los gramos de NaCl,

adicionar el agua y agitar con ayuda de la varilla de
agitación hasta disolver completamente el sólido.

c. Luego adicione el jabón líquido y agite sin

formar burbujas hasta que se disuelva
homogéneamente.

Foto: Yenci Cardona, (Laboratorio

CEAD Acacias, 2024)

d. Una vez preparada la solución de Lisis. Con el

bisturí pele y corte la espinaca en pequeños trozos.

e. Coloque los trozos de espinaca en un mortero, y

macere la espinaca adicionando poco a poco la
solución de Lisis preparada anteriormente. Macerar
suavemente evitando la formación de burbujas.

f. Realice este procedimiento durante 10 minutos.

Foto: Yenci Cardona, (Laboratorio
 CEAD Acacias, 2024)
g. Filtre la solución obtenida hasta obtener
aproximadamente 5mL de filtrado en un tubo de
ensayo, y con la ayuda del embudo de filtración de
gravedad y papel de filtro.

Foto: Yenci Cardona, (Laboratorio

CEAD Acacias, 2024)
h. Transfiera 3mL del filtrado anterior a otro tubo
de ensayo y adicione 1mL de zumo de piña (recién
obtenido y filtrado).

Foto: Yenci Cardona, (Laboratorio

CEAD Acacias, 2024)
i. Agite suavemente el tubo de ensayo, evitando que
las paredes del tubo se impregnen de la solución.

Foto: Yenci Cardona, (Laboratorio

CEAD Acacias, 2024)
j. Incline el tubo de ensayo 45° y con ayuda de una
pipeta Pasteur adicione lentamente alcohol
isopropílico frío hasta formar una capa sobre la
muestra, aproximadamente 1.5 mL.

Foto: Yenci Cardona, (Laboratorio

CEAD Acacias, 2024)
k. Observar la formación de las hebras del ADN, las
cuales tienen un aspecto blanco.

Foto: Yenci Cardona, (Laboratorio

CEAD Acacias, 2024)

Parte II. Cuantificación

espectrofotométrica
a. Retire el botón de ADN y rehidrátelo
en 2mL de agua destilada en un tubo de
ensayo, agite suavemente hasta que no
observe el botón obtenido de la muestra
de ADN vegetal.(fresa)

Foto: Yenci Cardona, (Laboratorio CEAD

Acacias, 2024)

b. Programe el espectrofotómetro para

realizar la lectura a una absorbancia de
260 nm

c. Llene una cubeta para medición

espectrofotométrica con agua destilada,
tenga en cuenta que debe ser la misma
utilizada para la rehidratación del ADN.

d. Utilice esta muestra como muestra

blanco, introdúzcala en el
espectrofotómetro y realice el
blanqueamiento del equipo.

Foto: Yenci Cardona, (Laboratorio CEAD

Acacias, 2024)
Transfiera la solución de ADN a otra
cubeta para medición
espectrofotométrica.

f. Realice la medición de la muestra a la

absorbancia de 260 nm,
registre los datos de absorbancia.

Foto: Yenci Cardona, (Laboratorio CEAD

Acacias, 2024)
g. Retire la cubeta con la muestra, y
cambie la longitud de onda de medición
a 280nm.

h. Realice nuevamente el
blanqueamiento del espectrofotómetro,

Foto: Yenci Cardona, (Laboratorio CEAD

Acacias, 2024)
i. Retire la muestra blanco e introduzca
la cubeta con la muestra de ADN y
realice la lectura.

Foto: Yenci Cardona, (Laboratorio CEAD

Acacias, 2024)
j. Obtenga con sus compañeros los
datos de 4 muestras adicionales.

Foto: Yenci Cardona, (Laboratorio CEAD

Acacias, 2024)
 Foto: Yenci Cardona, (Laboratorio CEAD
Acacias, 2024)

Los resultados obtenidos en la muestra de

los compañeros.

260 nm= 0.372 abs

280 nm=0.006 abs
k. Realice los cálculos para obtener la En la muestra obtenida por nuestro grupo:
relación A260/A280 para cada muestra.
260 nm: blanco: 2.71 muestra:3.000 ab ( si
hay ADN).

280 nm: blanco:-0.00 , muestra: 0.72 ab.

l. Consulte el significado de la relación Indica la relación entre la absorbancia de la

A260/A280 e interprete los resultados cantidad de ADN medida a 260 nm sobre
obtenidos en las 5 muestras. la cantidad de proteína medida a 280 nm,
siendo esta relación utilizada para evaluar
la pureza de un extracto de ADN.

Interpretación de la relación A260/A280:

 Para ADN o ARN puro:
o La relación A260/A280
ideal para ADN o ARN
puro es aproximadamente
1.8 para ADN y 2.0 para
ARN. Esto indica que la
muestra tiene una buena
pureza y no está
contaminada con
proteínas o compuestos
fenólicos.
 Valores por debajo de los rangos
ideales:
o Si la relación A260/A280 es
baja (por ejemplo, <1.8
para ADN o <2.0 para
ARN), esto sugiere que hay
contaminación por
proteínas u otros
compuestos absorbentes
 como los fenoles. Esto
podría indicar que la
muestra contiene impurezas
que afectan la cuantificación
del ácido nucleico.

Análisis de los resultados obtenidos:

Al analizar la muestra en el espectrómetro,

se realizó la medición del ADN que
presenta absorbancia con un determinado
tipo de luz uV a 260 nm de longitud, lo que
nos indica que esta muestra dio como
resultado 3.000 ab, la cual presenta la
máxima absorbancia, teniendo una buena
pureza y sin contaminación, ya que la
cantidad de luz absorbida por la muestra
depende de la concentración en la solución.

Sin embargo, al cambiar la longitud de

onda de medición a 280 nm, presenta el
siguiente resultado 0,72, lo que se observa
que tiene menor absorbancia, lo que indica
una posible contaminación por compuestos
aromáticos con proteínas.

Preguntas:

En el desarrollo del informe debe dar respuesta a las siguientes preguntas:

● ¿Cuál es la función de los componentes de la solución de Lisis?

-Jabón Líquido: Su función es romper las membranas celulares (tanto la membrana

plasmática como la nuclear) al desorganizar los lípidos y proteínas que las componen, lo
que permite la liberación del ADN y otros componentes celulares.

-El cloruro de sodio o sal de cocina: Ayuda a separar algunas proteínas que están
unidas al ADN. También mantiene las proteínas disueltas en la capa acuosa de forma a
impedir que estas precipiten también con el alcohol, junto con el ADN.

-Alcohol: Disminuye la constante dieléctrica de la solución acuosa. El etanol frio

provoca que el ADN se separe del agua y precipite. Cuando el ADN se separa de la
solución acuosa, tiende agruparse, lo que hace que sea visible. Las largas cadenas del
ADN se enrollarán alrededor de la varilla al revolver la interface entre las dos capas.
● ¿Para qué se usa el zumo de piña, ¿cuál es el compuesto clave y su función
durante el proceso de extracción de ADN?

El zumo de piña se utiliza en la extracción de ADN debido a su contenido de una

enzima llamada bromelina. La bromelina es una proteasa que descompone las
proteínas, especialmente las que se asocian con el ADN. Durante el proceso de
extracción, la bromelina ayuda a eliminar las proteínas unidas al ADN, lo que permite
obtener un ADN más puro.
La función de la bromelina es:
 Descomponer las proteínas y enzimas que podrían interferir con la obtención del
ADN.
 Facilitar la liberación del ADN de las estructuras celulares.

● Explique las diferencias de solubilidad del ADN en medio salino y alcohólico.

En medio salino: En presencia de sal (generalmente NaCl), el ADN se mantiene en

solución en el agua. La sal ayuda a neutralizar las cargas negativas del ADN, lo que
estabiliza la estructura del ADN y lo mantiene disuelto en solución acuosa. Este
ambiente también facilita la separación del ADN de las proteínas, que son solubles en
agua.

En medio alcohólico: El ADN es insoluble en alcoholes. Cuando se añade alcohol al

ADN en solución acuosa, el ADN se precipita porque el alcohol deshidrata las
moléculas, disminuyendo la solubilidad del ADN. Este cambio en las condiciones hace
que las moléculas de ADN se agrupen y formen un precipitado visible. Esta propiedad
es aprovechada para precipitar y aislar el ADN de la solución.

● ¿Qué significa la relación A260/A280 en la cuantificación de muestras de ADN?

Indica la relación entre la absorbancia de la cantidad de ADN medida a 260 nm sobre la

cantidad de proteína medida a 280 nm, siendo esta relación utilizada para evaluar la
pureza de un extracto de ADN.
Interpretación:
 Una relación ideal de A260/A280 para ADN puro es aproximadamente 1.8.
 Una relación menor a estos valores indica contaminación por proteínas o
fenoles, mientras que una relación más alta puede sugerir contaminación por
fenoles u otros compuestos que absorben a 280 nm.

● ¿Qué procedimientos se pueden utilizar para purificar el ADN?

Extracción con fenol-cloroformo: Utiliza fenol y cloroformo para separar las proteínas
y otros contaminantes del ADN, que se encuentra en la fase acuosa.

Uso de columnas de centrifugación (kits comerciales): Los kits de purificación de

ADN emplean columnas con material de sílice que se une al ADN en condiciones
específicas, permitiendo la eliminación de impurezas mediante lavados y el posterior
aislamiento del ADN.

Precipitación con etanol o isopropanol: El ADN se precipita al añadir alcoholes

(etanol o isopropanol) a la solución que contiene ADN, lo que permite separarlo de la
mayoría de las impurezas.
Extracción con sal: Utiliza una solución salina para precipitar las proteínas y otros
contaminantes, dejando el ADN en solución.

● Consulte dos métodos de extracción de ADN

Uso de resinas de intercambio iónico: Para la extracción del ADN se han creado
resinas que son capaces de formar complejos con el ADN. Al usar las resinas
hidrocarbonadas el ADN. Al usar las resinas hidrocarbonadas con est con estructuras
rígidas en tres dimensiones rupturas rígidas en tres dimensiones permite que el área se
encuentre cargada con alguna sustancia como el dietilaminoetilo que puede protonarse
en medio ácido y quedar cargado positivamente por lo que interacciona con los grupos
fosfatos del ADN. Es decir, que esto es un método directo, que puede realizarse en un
solo tubo y rápido, pero, sin embargo, tiene inconveniente que aíslan las cadenas
sencillas de ADN.

Incubación del lisado para su uso: Una forma de aislar el ADN genómico es incubar
el lisado crudo a temperatura entre 90- 100°C y usarlo directamente. Mediante este
método el ADN obtenido es de pureza baja y con aplicación muy reducidas, por lo que
no es útil para almacenar el ADN pues los contaminantes pueden degradar las
moléculas de ADN

REFERENTES BIBLIOGRÁFICOS
Ampligen. (2022, September 21). Ácidos Nucleicos y Nucleótidos del ADN y ARN.
Ampligen. https://www.ampligen.es/adn-genetica/acidos-nucleicos/
Bertani, G., & Ruiz, J. (2016). "Purification of DNA from bacterial cells." Methods in
Enzymology, 152, 163-169. DOI: 10.1016/0076-6879(87)52008-5
EDICIÓN No 32. (n.d.).
https://www.porquebiotecnologia.com.ar/Cuadernos/El_Cuaderno_32.pdf

10 métodos de Extracción de ADN | Wako. (s. f.).

https://www.wakolatinamerica.com/blog-reactivos/noticias-wako/post/10-metodos-de-
extraccion-de-adn/

PRÁCTICA NO. 4. EXTRACCIÓN DE LA CASEÍNA, DETERMINACIÓN DEL

PUNTO ISOELÉCTRICO Y PRECIPITACIÓN SALINA DE PROTEÍNAS.
MARCO TEÓRICO

Procedimiento a desarrollar
Objetivo de la práctica:
Extraer y determinar el punto isoeléctrico de la caseína a través de procedimientos
químicos
Registro de datos y evidencia fotográfica:
Parte I. Extracción de la Caseína.
Procedimiento imagen
 Caliente en un vaso de
precipitado 150 ml de agua
destilada a 38ºC, Añada 50mL de
leche y luego gota a gota, con
agitación, adicione ácido acético
1M hasta que observe que se
forma un precipitado (la leche se
corta).
 Deje sedimentar y filtre sobre
papel de filtro usando un embudo.
Guarde el filtrado para realizar la
Parte IV de esta práctica.

 Lave el precipitado con 20mL de

etanol en el mismo filtro.
 Seque el precipitado colocando
varios pliegues de papel de filtro.

 Coloque el precipitado en un vaso

de precipitado pequeño
previamente pesado, vuelva a
pesar el vaso con el precipitado y
luego adicione 5mL/g de éter
etílico.
 Filtre nuevamente.
 Deseche el líquido quedando un
precipitado blanco de fácil
manipulación que es la caseína.
Imágenes propias

Datos obtenidos del peso:

Peso del vaso 49,98g
Peso del vaso + caseína 56,26g
Peso del precipitado final 6,58g
Parte II. Preparación de la solución de caseína
Procedimiento
 Coloque aproximadamente 250 mg de caseína en un vaso de 50mL.
 Agregue 20ml de agua destilada y 5 mL de NaOH 1N; agite hasta lograr una
solución total de la caseína
 Una vez disuelta la caseína, se vierte en un matraz aforado de 50 ml, adicione 5
mL de ácido acético 1N y diluya con agua destilada hasta 50mL y mezcle bien.
 La solución debe ser clara y limpia y si no es así, debe volver a filtrar.

Parte III. Determinación del punto Isoeléctrico de la caseína.

a. En diez tubos de ensayo, limpios y secos adicione exactamente los volúmenes de
los reactivos según la siguiente tabla:

b. medir experimentalmente el pH de todos los tubos, que debe cubrir un rango

aproximado semejante al teórico (3 a 6,5). Anotar los valores reales en la Tabla, que
deben ser semejantes a los expresados y en todo caso crecientes.
c. Añadir 1 mL de disolución de caseína preparada en la parte II a cada tubo.
d. Agitar suavemente cada uno de los tubos y esperar aproximadamente 3 minutos.
e. Medir la absorbancia de cada muestra a 640 nm.
TABLA 1. De disoluciones añadir 1 ml de disolución de caseína a cada tubo.
Medición
pH resultante
TUBO Acetato 0.1N Acético 0.1N Acético 0.01 N del pH en Absorbancia
(aprox.)
practica
1 0,5 9,5 - 3,2 3,28 0,021
2 1 9 - 3,6 3,53 0,019
3 1,5 8,5 - 3,8 3,6 0,018
4 2 8 - 4,0 3,84 0,009
5 3 7 - 4,2 3,89 0,013
6 4 6 - 4,5 4,3 0,014
7 6 4 - 4,7 4,68 0,017
8 8 2 - 5,1 5,15 0,014
9 6 - 4 5,5 4,45 0,013
10 8 - 2 6,1 4,85 0,015
f. Graficar la absorbancia frente al pH, y determinar el punto Isoeléctrico experimental
para los datos obtenidos

Gráfico 1 de la absorbancia Vs el pH experimental:

MEDICION DEL
ABSORBANCI
PH EN
A
PRACTICA
Absorbancia Vs pH
0,021 3,28 0.025
0,019 3,53 0.02 0.021
0.019 0.018
0,018 3,6 0.017
Absorbancia

0.015 0.014 0.013 0.015

0,009 3,84 0.013 0.014
0,013 3,89 0.01 0.009
0,014 4,3 0.005
0,017 4,68
0 0
0,014 5,15 0 2 4 6 8 10 12
0,013 4,45 pH
0,015 4,85

Gráfico 2 de la absorbancia Vs pH resultante:

 ABSORBANCI pH resultante
A (aprox.) Absorbancia Vs pH resultante
0,021 3,2 0.025
0,019 3,6 0.02 0.021
0.0190.018
0,018 3,8 0.017

Absorbancia
0.015 0.0140.0130.015
0,009 4,0 0.0130.014
0,013 4,2 0.01 0.009
0,014 4,5 0.005
0,017 4,7
0 0
0,014 5,1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
0,013 5,5 pH resultante
0,015 6,1

Análisis:
Teniendo en cuenta que el punto isoeléctrico de la caseína se da cuando el pH de la
leche es de 4,6 y es cuando la carga neta de la caseína es cero y sus cargas negativas y
positivas se equilibran, debido a que es sometida a un ácido en este caso se utilizó el
ácido acético 1N y es como observamos el precipitado como resultado.
 En el gráfico 1 de la absorbancia Vs pH experimental podemos evidenciar que el
punto isoeléctrico se encuentra en un pH de 4 a 4,5 con una absorbancia de
0,009.
 En el gráfico 2 de la absorbancia Vs pH resultante se puede observar el punto
isoeléctrico con una absorbancia de 0,009 y un pH de 4 a 5.
Podemos concluir que para los dos gráficos nos arroja una similitud en los datos.

g. Consultar el punto isoeléctrico teórico de la caseína y compárelo con el punto

isoeléctrico experimental obtenido. En caso de presentarse variaciones cuales podrían
ser las causas de las diferencias entre los puntos isoeléctricos teórico y experimentales.
 El punto isoeléctrico (pI) de todas las caseínas está alrededor de 4,6. Donde la
caseína con este pH se encuentra en un punto de menor solubilidad, se reduce y
precipita.
 Como se puede observar en los gráficos no hubo una mayor diferencia en la
representación de los datos experimentales y teóricos.

Parte IV. Precipitación salina de Proteínas

 Procedimiento imagen
 Prepare 10 mL de una solución saturada
de sulfato de amonio.
 Tome dos tubos de ensayo adicione a
cada uno 1,5 mL de la solución de
sulfato de amonio saturada
 A uno de los tubos adicione 1,5 mL del
filtrado que guardo en la parte I de esta
práctica. Al otro tubo adicione un 1,5
mL de la solución de caseína preparada
en la parte II.
 Centrifugue y observe si se forma un
pellet.
 En caso de no observar precipitado
adicione más solución saturada de
sulfato de amonio e incube en un baño
hielo hasta observar el precipitado.
Preguntas:
1. ¿Qué sucedería si se representa la transmitancia vs pH en lugar de
absorbancia?
Teniendo en cuenta que la transmitancia es la que mide la cantidad de luz que se
transmite y la absorbancia mide la cantidad de luz que absorbe cuando viaja en
un material; si se graficara la transmitancia Vs el pH cuando este aumenta o
disminuye la transmitancia daría resultado contrario a la absorbancia.

2. ¿Cuál es el punto isoeléctrico de la caseína?

El punto isoeléctrico (pI) de todas las caseínas está alrededor de 4,6.

3. ¿Por qué las proteínas tienen solubilidad mínima en el pI?

Porque en este punto es donde las proteínas tienen carga neta cero y esto hace
que disminuya su solubilidad.
4. Explique cuál es el fundamento de la precipitación salina y por qué aparece
un precipitado en el filtrado obtenido durante la extracción de la caseína.
El fundamento de la precipitación salina es separar proteínas mediante la adición
de sales logrando que están precipiten mediante el aumento de la fuerza ionice
del medio. Teniendo en cuenta que la caseína es una proteína y que al añadir
sulfato de amonio (sal) a la caseína este reduce la solubilidad lo que conlleva a
coagularse y al ser filtrado se puede obtener un precipitado.
Conclusiones:
 Con esta práctica identificamos el paso a paso para la extracción de caseína;
conocimos e identificamos las distintas proteínas que forman parte de la leche.
 Comprendimos el punto isoeléctrico de la caseína y su pH que es crucial para ser
soluble.
 Determinamos el fundamento de la precipitación y su reacción frente a las
proteínas.
Referentes bibliográficos:
Caseina | FEDNA. (n.d.). Www.fundacionfedna.org.
https://www.fundacionfedna.org/ingredientes_para_piensos/caseina‌
La absorbancia y la transmitancia son dos medidas utilizadas en la espectroscopía.
(2022, December 20). Diferencias.cc; Diferencias.cc.
https://www.diferencias.cc/absorbancia-transmitancia/
Padilla Doval, J., & Zambrano Arteaga, J. C. (2021). Estructura, propiedades y genética
de las caseínas de la leche: una revisión. CES medicina veterinaria y zootecnia, 16(3),
62–95. https://doi.org/10.21615/cesmvz.5231

PRÁCTICA NO. 6. HIDRÓLISIS DEL ALMIDÓN

MARCO TEÓRICO

PROCEDIMIENTO A DESARROLLAR

Parte I hidrólisis de almidón en medio

ácido
a. Coloque 10 mL de una solución de
almidón al 1% en un tubo de ensayo
grande.

b. Añadir 1 mL de HCl concentrado al

tubo. Agitar bien y luego colocar el tubo
en un baño de agua hirviendo durante 1
hora con cuidado de no quemarse.

c. Realice simultáneamente, la prueba de

yodo y la prueba de benedict (vea
numeral e), desde el tiempo cero y
sucesivamente cada 10 minutos durante
la hora del tiempo de incubación.

d. Para la prueba de yodo, en un tubo de Prueba de Yodo, resultados cada 10

ensayo adicione 2 mL de agua destilada, minutos durante 1 hora:
2 gota de solución de yodo y 0,5 ml de la
solución de almidón que se está 10 min: color azul (baja presencia de
hidrolizando en el baño maría a almidón)
ebullición, registre el resultado de la
prueba en cada tiempo de evaluación. 20 min: marrón (reducción significativa
de almidón)

30 min: marrón amarillento (más

reducción)

40 min: marrón claro (almidón casi

ausente)

50 min: casi incoloro (poco almidón)

60 min: incoloro (almidón

 completamente hidrolizado)

Análisis:

Durante la prueba de yodo, se evidencia

que la solución al principio presenta un
color azul oscuro, indicando la presencia
de almidón. A medida que avanza el
tiempo, la intensidad del color azul irá
disminuyendo y eventualmente se tornará
marrón, en función de la conversión del
almidón en azúcares simples
(monosacáridos) debido la hidrólisis en
medio ácido.
e. Para la prueba de Benedict. Tome 0,5 Prueba de Benedict, resultados cada 10
mL de la solución de almidón minutos durante 1 hora:
hidrolizado, 1 mL de NaOH 0,4 M (para
neutralizar el ácido) y 2 mL de reactivo 1. hora: 13:25 pm
de Benedict. Incubar por 2 minutos en
agua hirviendo. Anotar y analizar los
resultados

10 min: azul (sin cambios)

2. hora: 13:35 pm

20 min: azul (sin cambios)

3. hora: 13:45 pm
30 min: marrón (primera evidencia de
azúcares)

4. hora: 13:55 pm

40 min: rojo (más azúcares presentes)

5. hora: 2:05 pm

50 min: rojo intenso (mayor cantidad

de azúcares)

6. hora: 2:15 pm

60 min: marrón oscuro (altas

concentraciones de azúcares)

Análisis:

Para la prueba de Benedict, el resultado

 es un cambio de color que nos indica la
presencia de azúcares reductores:

 Al inicio, la solución se tornó de

color azul lo que significa que no
hubo acción de hidrólisis.
 Al avanzar el tiempo, a medida
que se forman azúcares simples y
se neutraliza la solución con
NaOH, el color cambiará de azul
a rojo brick, indicando la
presencia de monosacárido.

Parte II hidrólisis enzimática del

almidón
f. Tome cuatro tubos de ensayo y
márquelos del 1 al 4. Y a los tubos 1 a 3
agregue 2 mL de solución de almidón al
1%
g. Al tubo 1 adicione 1 mL de saliva y
llévelo a baño maría a 37° durante 5
minutos. Opcional: puede usar una
solución de amilasa pancreática en lugar
de amilasa salival.

(color Amarillo claro)

h. Al tubo 2 agregue dos gotas de lugol,

observe y reporte el resultado.

(color negro)
i. Al tubo 3 adicione 2 mL de reactivo de
Benedict y póngalo a baño maría en
ebullición. Agite suavemente y observe
los cambios que se presentan.

(color azul turquesa)

j. Pase la mitad del contenido del tubo. 1
al tubo 4. Al tubo Nº. 1 agréguele 2 gotas
de lugol. Observe y explique el resultado.

k. Al tubo 4 agréguele 2 mL de reactivo

de Benedict y póngalo en el baño de
María en ebullición. Observe y explique
el resultado. (color Azul turquesa)

Resultados de los 4 tubos de ensayo:

Los cambios en los tubos de ensayo

indican claramente un proceso de
hidrólisis de almidón en el tubo donde
se añadió saliva.

Resultados de los 4 tubos de ensayo:

 Tubos 1: Al iniciar el baño de

María (37°C) presentó un color
amarillo claro, indicando que la
amilasa ha comenzado a actuar
sobre el almidón, produciendo
azúcares simples.

 Tubo 2: Después de añadir lugol,

 el color negro señala la presencia
de almidón, ya que este reactivo
forma un complejo azul con el
almidón no digerido.

 Tubo 3: La prueba de Benedict

produjo un color azul turquesa, lo
que sugiere que no se han
formado azúcares reductores
significativos, pero han
comenzado los primeros cambios.

 Tubo 4: Al mezclar el contenido

corporal del tubo 1, se observó el
mismo color azul turquesa,
debido a que el almidón ha sido
parcialmente digerido por la
amilasa. Sin embargo, todavía
puede haber almidón no digerido.

Preguntas

En el desarrollo del informe debe dar respuesta a las siguientes preguntas:

1. Compare los resultados entre los dos ensayos de hidrólisis del almidón.

La hidrólisis en medio ácido muestra un gradual desplazamiento del color azul a

incoloro en la prueba de yodo y un incremento de la posibilidad de azúcares reductores
en la prueba de Benedict, reflejando un proceso de descomposición química del
almidón. En comparación, la hidrólisis enzimática da como resultado una rápida
transformación del almidón a azúcares, que se evidencia en los colores generados en las
pruebas de yodo y Benedict, mostrando una digestión más eficiente y selectiva del
almidón por la acción de la saliva.

2. Explique bioquímicamente las diferencias en el tiempo de hidrólisis entre los dos

ensayos

La hidrólisis ácida se basa en un proceso de descomposición química donde los

enlaces glucosídicos del almidón son rotos por protones en un medio ácido, lo cual es
menos específico y suele requerir tiempos más prolongados. En cambio, la hidrólisis
enzimática ocurre por la acción de la saliva, que tiene un sitio activo con alta
especificidad y eficiencia para romper enzimáticamente los enlaces en el almidón,
produciendo azúcares simples rápidamente y en tiempo ligeros en condiciones óptimas,
como la temperatura y pH del medio. Esto explica la diferencia en el tiempo y en la
naturaleza del producto final en cada ensayo.
Referentes bibliográficos:
Hammer, D. P. (2021, May 21). Digestión: las enzimas juegan el papel central.
BIOMES - Feel Better.
https://biomes.world/es/cosas-a-saber/intestino/salud-intestinal/intestino-sano/encimas-
digestivas/
‌ han Academy. (2020). Repaso de enzimas (artículo). Khan Academy.
K
https://es.khanacademy.org/science/ap-biology/cellular-energetics/environmental-
impacts-on-enzyme-function/a/hs-enzymes-review

PRÁCTICA NO. 7. EFECTOS DE LA TEMPERATURA Y EL PH SOBRE LA

ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
MARCO TEÓRICO

PROCEDIMIENTO A DESARROLLAR
Parte I. Efecto del pH sobre la actividad
amilasa salival.
1. Prepare una solución de amilasa salival
diluida, para esto tome 1
mL de saliva y adicione 9 mL de agua
destilada, agite
cuidadosamente hasta formar una solución
homogénea.

2. Tome tres tubos de ensayo y adicione:

● Tubo 1: 2 mL de HCl 0,1N + 2 mL de
solución de almidón al
2%
● Tubo 2: 2 mL de NaOH 0,1N + 2 mL de
solución de almidón
al 2%
● Tubo 3: 2 mL de agua destilada + 2 mL
de solución de
almidón al 2%
3. Adicione 2 mL de solución de amilasa
salival diluida a cada tubo de
ensayo.

4. Agite bien y mida rápidamente el pH de

cada tubo, para esto utilice
cinta indicadora de pH, compare el color
obtenido con el de la Resultados del Ph:
escala.

TUBO 1 PH=1
TUBO 2 PH= 12
TUBO 3 PH=6
5. Coloque los tres tubos en baño de maría
a 37°C durante 15 minutos.

6. Transcurridos los 15 minutos, por cada

una de las tres condiciones
evaluadas (HCL 0,1N, NaOH 0,1N y Agua
destilada) tome dos tubos
de ensayo y transfiera 1 mL de la solución.

7. En un tubo, realice el ensayo de yodo,

por adición de 2 gotas de
Lugol y en el otro adicione 2 mL de
reactivo de Benedict y lleve a
baño maría a ebullición

Resultados:
 -Tubo 1 yodo: azul oscuro
-Tubo 2 yodo: Se volvió más
transparente
-Tubo 3 yodo: Tomo un color amarillo
intenso
-Tubo 4 yodo: Quedo más transparente
-Tubo 5 yodo: Amarillo pálido
-Tubo 6 yodo: Amarillo

-BENEDICT: No tuvo ningún cambio

al agregar todos los elementos.

Parte II. Influencia de la temperatura en

la velocidad enzimática
1. Prepare 8 tubos: cuatro de ellos con 2 mL
de almidón 2% y los otros cuatro con 2 ml
de saliva diluida

2. Colocar durante 15 minutos dos tubos,

uno conteniendo almidón
y la otra saliva, a cada una de las cuatro
temperaturas siguientes
(marque cada pareja de tubos según la
temperatura a la que
se ensaya).

i. Baño de hielo (0ºC, ponga hielo en un

vaso de precipitado y
añada un poco de agua, si dispone de nevera
coloque todo el
montaje a 4° para garantizar la temperatura
durante el
ensayo)
ii. Temperatura ambiente (20ºC)
iii. Baño maría a 37ºC B

iv. Baño maría a ebullición (100ºC).

3. Añadir al tubo que contiene el almidón el

contenido del tubo que
tiene la saliva, agitar bien y dejar que siga a
su temperatura
correspondiente

4. Empiece a contar el tiempo (los tubos 1 minuto:

deben mantenerse bien
inmersos en los respectivos baños para que
la acción de la amilasa
tenga lugar a las temperaturas indicadas).
Transcurridos 1, 2, 3,
4, 6 y 8 minutos tomar una muestra de 0,5
ml de cada tubo y 2 minuto:
transferirlo a un tubo de ensayo y realizar la
prueba de yodo.

3 minuto:
4 minuto:

5 minuto:

6 minuto:

7 minuto:

8 minuto:
 5. Analice los cambios de coloración y
realice las comparaciones entre
las cuatro condiciones de temperatura
evaluadas.

Tablas de registro de datos obtenidas de las prácticas de laboratorio:

T (°C) Min Resultado
0°C fi No hay cambios
0°C 2 No hay cambios
0°C 3 No hay cambios
0°C 4 Aclaro un poco
0°C 5 Aclaro un poco
0°C 6 Aclaro un poco
0°C 7 Aclaro un poco
0°C 8 Aclaro un poco

T (°C) Min Resultado

20°C fi No hay cambios
20°C 2 No hay cambios
20°C 3 No hay cambios
20°C 4 Aclaro un poco
20°C 5 Aclaro un poco
20°C 6 Aclaro un poco
20°C 7 Aclaro un poco
20°C 8 Aclaro un poco

T (°C) Min Resultado

37°C fi No hay cambios
37°C 2 No hay cambios
37°C 3 No hay cambios
37°C 4 Aclaro un poco
37°C 5 Aclaro un poco
37°C 6 Aclaro un poco
37°C 7 Aclaro un poco
37°C 8 Aclaro un poco
 T (°C) Min Resultado
100°C fi No hay cambios
100°C 2 No hay cambios
100°C 3 No hay cambios
100°C 4 Cambio a oscuro
100°C 5 Cambio a oscuro
100°C 6 Cambio a oscuro
100°C 7 Cambio a oscuro
100°C 8 Cambio a oscuro

Análisis de los resultados obtenidos:

No se pudieron observar algún cambio significativo en la coloración en la solución de

almidón entre los 3 minutos primeros.

A partir del 4 minuto, se pudo observar un ligero aclaramiento de la solución, lo

que nos indica una posible actividad enzimática de la amilasa salival a esta temperatura.

PH a 20°c:

Se obtuvo unos resultados parecidos al de los 0°c, eso sí, con un ligero aclaramiento a
partir del minuto 4 de la solución de almidón.

PH a 37°c:
A esta temperatura se pudo observar un patrón similar al de la solución de almidón,
también a partir del minuto 4, lo que nos indica actividad de la amilasa salival, aunque
puede ser que el aclaramiento quedo más pronunciado en comparación con las
temperaturas bajas.

PH a 100°c:
A esta temperatura no se observaron cambios significativos en los 3
minutos primeros en la solución de almidón, pero a partir del minuto 4, ahí sí, comenzó
a oscurecerse la solución, lo que nos indica que en esta temperatura elevada
hay una posible una inactivación de la amilasa salival.

La influencia de la temperatura en la velocidad enzimática.

A 0°c. 20° c. 37°c:

En estas temperaturas no se pudieron observar cambios significativos en la solución de

almidón a esta temperatura entre los 3 primeros minutos.
Conclusiones:

parte 1:

Activación y desactivación de la amilasa: Los resultados muestran que la amilasa salival

es altamente sensible al pH. En un entorno ácido (pH 1), se observó un color azul
oscuro en la prueba con yodo, lo que indica que el almidón se mantuvo sin ser digerido.
Esto sugiere que la actividad enzimática es significativamente inhibida en condiciones
ácidas. Por otro lado, en un entorno alcalino (pH 12), la amilasa tuvo una menor
actividad, como lo indica el cambio de color en la prueba de yodo hacia la
transparencia, sugiriendo que la enzima no mantiene su actividad óptima en condiciones
altamente básicas. En el tubo con agua destilada (pH 6), hubo un cambio moderado
hacia el amarillo intenso, indicando una producción parcial de maltosa.

pH óptimo: La actividad de la amilasa salival parece ser más efectiva cerca del pH
neutro (6) y se desactiva en condiciones muy ácidas o alcalinas. Esto avala la idea de
que la amilasa salival tiene un pH óptimo cercano a la neutralidad, lo cual es relevante
en el contexto del ambiente bucal.

parte 2:

Inactividad a bajas temperaturas: A temperaturas de 0 °C y 20 °C, no se observaron

cambios significativos en la solución de almidón durante los primeros 3 minutos, lo que
indica que la actividad enzimática es reducida a temperaturas bajas. A pesar de que
hubo un ligero aclaramiento en las pruebas después de 4 minutos, este no fue suficiente
para confirmar actividad significativa de la amilasa.
Actividad óptima a 37 °C: A 37 °C, la actividad enzimática de la amilasa comenzó a ser
más evidente, aunque el aclaramiento fue gradual. Este hallazgo sugiere que esta
temperatura se asemeja a la temperatura corporal, donde la amilasa salival muestra su
máxima eficiencia en la digestión del almidón.
Desnaturalización a altas temperaturas: A 100 °C, no se observaron cambios en los
primeros 3 minutos, pero a partir del minuto 4, la solución de almidón se oscureció, lo
que implica que a esta temperatura la amilasa pudo haber comenzado un proceso de
desnaturalización, resultando en la pérdida de su actividad. Esto indica que temperaturas
extremas pueden provocar la inactivación de la enzima por desnaturalización.

Referentes bibliográficos:

Berg, J. M., Tymoczko, J. L., & Stryer, L. (2012). Biochemistry (7th ed.). W.H.
Freeman and Company.

Nelson, D. L., & Cox, M. M. (2017). Lehninger Principles of Biochemistry (7th ed.).
W.H. Freeman and Company.

Voet, D., & Voet, J. G. (2011). Biochemistry (4th ed.). John Wiley & Sons.