TINCION DE GRAM REVISION N
CITOLOGÍA E HISTOLOGÍA CODIGO: CHA-311(P)
APLICADA BIOSEGURIDAD
VIGENCIA: 2025
UNIVERSIDAD PRIVADA FRANZ TAMAYO
CIENCIAS DE SALUD BIOQUÍMICA Y FARMACIA
POE : BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO
Nombre: Alejandra Ayde Espejo Quelca
Doctor: Juan Edson Carrillo Segales
Semestre : 3 ro
Fecha: 22/02/2025
VIGENCIA: 2025 REVISION N
CODIGO: CHA-311(P)
CITOLOGÍA E HISTOLOGÍA
APLICADA BIOSEGURIDAD
TINCIÓN GRAM
1. OBJETIVO GENERAL
Incrementar el contraste y facilitar la observación de microorganismos utilizando la
técnica de tinción de Gram, identificando la morfología y diferencias estructurales
de las bacterias Gram positivas y Gram negativas.
2. OBJETIVO ESPECIFICO
Comprender la base teórica de la tinción de Gram y su relevancia en
microbiología.
Realizar la tinción Gram correctamente y analizar los resultados obtenidos
mediante microscopía óptica.
Diferenciar bacterias Gram positivas y Gram negativas según la composición
de sus envolturas celulares.
3. ALCANCE
El procedimiento está diseñado para identificar y categorizar bacterias en función
de su afinidad por los colorantes, contribuyendo al diagnóstico microbiológico y al
entendimiento de sus características estructurales.
4. RESPONSABILIDADES
Realizar los pasos del procedimiento con precisión y cuidado.
Manejar adecuadamente los equipos y materiales utilizados, asegurando la
seguridad en el laboratorio.
Interpretar correctamente los resultados obtenidos bajo el microscopio.
Dejar el ambiente limpio como se encontro
5. MARCO TEORICO
La tinción de Gram, desarrollada por Hans Christian Gram en 1884, es una de las
técnicas más fundamentales y ampliamente utilizadas en microbiología. Este
método permite diferenciar bacterias basándose en las propiedades químicas y
estructurales de sus paredes celulares, dividiéndolas en dos grupos principales:
bacterias Gram positivas y bacterias Gram negativas.
FUNDAMENTO DE LA TINCIÓN DE GRAM
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El procedimiento utiliza cuatro soluciones clave: cristal violeta, lugol, alcohol-
acetona y safranina o fucsina básica. Las bacterias Gram positivas poseen una
pared celular rica en peptidoglicano (hasta el 90 % de su composición), lo que les
permite retener el colorante primario, cristal violeta, incluso después de ser
tratadas con alcohol-acetona. Por el contrario, las bacterias Gram negativas tienen
una pared con menor proporción de peptidoglicano (alrededor del 10 %), además
de una membrana externa rica en lipopolisacáridos, que facilita la pérdida del
colorante inicial durante el tratamiento con el agente decolorante y permite que se
tiñan con el colorante de contraste (safranina), adquiriendo un tono rosado.
MPORTANCIA DE LA TÉCNICA
La tinción de Gram es esencial en el diagnóstico clínico porque ayuda a identificar
la naturaleza del microorganismo causante de infecciones, guiando así la elección
de tratamientos antimicrobianos adecuados. Por ejemplo:
Las bacterias Gram positivas suelen ser sensibles a ciertos antibióticos como las
penicilinas, que actúan inhibiendo la síntesis de peptidoglicano.
Las bacterias Gram negativas, debido a su membrana externa, pueden ser más
resistentes y requieren tratamientos específicos, como cefalosporinas de tercera
generación o antibióticos de amplio espectro.
ASPECTOS PRÁCTICOS Y TÉCNICOS
En el laboratorio, la tinción de Gram se realiza sobre muestras bacterianas de
cultivos en fase exponencial, ya que en la fase estacionaria algunas bacterias Gram
positivas pueden mostrar resultados falsos (aparentes Gram negativas). Es un
método rápido, económico y de alta precisión si se realiza correctamente, siendo
indispensable en la investigación, la docencia y la práctica clínica.
APLICACIONES
Además de su uso diagnóstico, la tinción de Gram tiene aplicaciones en la
investigación microbiológica, como:
Clasificación taxonómica de bacterias.
Evaluación de efectividad de tratamientos antimicrobianos.
Estudio de la estructura celular bacteriana y de sus mecanismos de resistencia.
LIMITACIONES
No todas las bacterias pueden clasificarse usando la tinción de Gram. Algunas,
como las bacterias del género Mycoplasma, carecen de pared celular, lo que impide
que se tiñan con este método. Asimismo, bacterias ácido-alcohol resistentes (como
las del género Mycobacterium) requieren técnicas específicas como la tinción de
Ziehl-Neelsen.
6. PROCEDIMIENTO
Colocar una pequeña gota
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de agua en un portaobjetos
limpio
Con el asa flameada,
transferir una pequeña
cantidad del cultivo sólido
a la gota y mezclar hasta
obtener una suspensión
homogénea.
Dejar secar al aire o usar
un ventilador; evitar calor
directo.
4. Fijar las bacterias
pasando el portaobjetos
por la llama tres veces y
dejar enfriar.
6.1 EQUIPOS . INSTRUMENTOS
6.2 DESARROLLLO DE LA METODOLOGIA
PREPARACIÓN DEL FROTIS BACTERIANO
Seleccionar un portaobjetos limpio y asegurarse de que esté
completamente seco para evitar interferencias durante la
observación microscópica.
Colocar una pequeña gota de agua en el centro del portaobjetos
utilizando una pipeta o instrumento adecuado para garantizar
precisión en el volumen aplicado.
Si el material bacteriano proviene de un medio sólido, flamear
previamente el asa de siembra para esterilizarla. Luego, tomar una
pequeña cantidad de cultivo bacteriano y transferirla a la gota de
agua en el portaobjetos.
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Mezclar la muestra con movimientos circulares suaves para obtener
una suspensión bacteriana homogénea. Extender la mezcla en una
capa fina que cubra aproximadamente la mitad del portaobjetos.
En el caso de utilizar bacterias provenientes de un medio líquido, este
paso puede omitirse y simplemente se coloca y extiende una pequeña
muestra de la suspensión bacteriana directamente sobre el
portaobjetos.
Permitir que la película de líquido se evapore completamente al aire
libre o acelerar el proceso utilizando un ventilador o secador de aire
frío. Evitar el uso de calor directo, ya que puede alterar la forma y
estructura celular de las bacterias.
Fijar las bacterias al portaobjetos utilizando calor controlado. Para
ello, pasar el portaobjetos rápidamente por la llama del mechero
Bunsen tres veces, permitiendo que enfríe entre cada pase. Este paso
asegura que las células bacterianas queden adheridas al vidrio para
los pasos posteriores.
2. PASOS PARA LA TINCIÓN GRAM
Comenzar con la tinción primaria utilizando cristal violeta. Aplicar
varias gotas para cubrir completamente la muestra y dejar actuar
durante un minuto. Este colorante básico interactúa con las
estructuras celulares cargadas negativamente.
Lavar el portaobjetos con abundante agua para eliminar el exceso de
colorante, asegurándose de que no quede líquido residual en los
bordes.
Cubrir la muestra con Lugol (solución de yodo o yodo de Gram), que
actuará como mordiente, aumentando la afinidad entre el colorante y
las células bacterianas. Dejar actuar durante un minuto.
Enjuagar nuevamente el portaobjetos con agua para eliminar el
exceso de Lugol.
Decolorar con alcohol-acetona, aplicando el agente por
aproximadamente 30 segundos o hasta que la muestra deje de
desprender color. Este paso es crítico para diferenciar las bacterias
Gram positivas de las Gram negativas.
Lavar de nuevo con agua para retirar completamente el disolvente
orgánico y evitar que afecte la contratinción posterior.
Contratiñar la muestra con safranina o fucsina básica, aplicando
varias gotas para cubrir la superficie del portaobjetos y dejando
actuar durante un minuto. Este colorante dará el tono rosado
característico a las bacterias Gram negativas.
Realizar un último lavado con agua para eliminar el exceso de
colorante de contraste.
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Secar el portaobjetos con aire libre o un secador suave para
garantizar que la muestra esté lista para la observación microscópica.
Examinar la muestra utilizando un microscopio óptico. Utilizar un
objetivo de inmersión para maximizar la resolución y observar la
morfología y coloración de los diferentes tipos bacterianos en
estudio.
7 CUESTIONARIO
8 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
