XVI FORUM DE CIENCIA Y TÉCNICA
Centro Nacional de Biopreparados
Departamento de Investigaciones de Medios de Cultivo
Desarrollo a ciclo completo de un nuevo
diagnosticador (CromoCen AE) para la detección y
el recuento de especies de Aeromonas
Autores: Diana Rosa Viera Oramas
Claudio Rodríguez Martínez
Raisa Zhurbenko
Ana Luisa Cabrera González
Tamara Lobaina Rodríguez
Mayabeque
2014
Resumen
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Título: Desarrollo a ciclo completo de un nuevo diagnosticador (CromoCen AE) para la detección y
el recuento de especies de Aeromonas.
Autores: Diana Rosa Viera Oramas 30 %; Claudio Rodríguez Martínez 25 %, Raisa Zhurbenko
15 %, Ana Luisa Cabrera González 10 %, Tamara Lobaina Rodríguez 10 %.
Colaboradores: Alberto Varela Llanes, Ana María Esponceda, Mabel Alfonso, Sandra Osorio,
Mercedes Vernera, Lourdes Martínez, Raquel Cabrera, Maylen Tibau, Yanet Llamas, Daymara
Dutto, Vivian San Germán Rodríguez, Jorge Luis Campos Muñoz.
Introducción: El control y seguimiento de las enfermedades infecciosas es uno de los principales
retos que enfrentan los países en vías de desarrollo. En Cuba, las condiciones climáticas
favorecen la aparición de enfermedades diarreicas agudas las cuales constituyen la segunda
causa de atención médica. Las bacterias involucradas con mayor frecuencia en las diarreas son:
Salmonella, Shigella, Aeromonas. En particular, las especies de Aeromonas poseen un papel
importante como patógeno primario en el tracto gastrointestinal. La baja especificidad de
identificación de los métodos y técnicas convencionales conlleva a un elevado consumo de tiempo,
por lo que se hace necesario implementar nuevos métodos de identificación, más rápidos y
confiables para resolver esta problemática. Objetivo: Desarrollo e introducción del medio
cromogénico CromoCen AE destinado para la detección y el recuento de especies de Aeromonas.
Materiales y Métodos: Se seleccionó como material biológico un conjunto de cepas certificadas y
aisladas pertenecientes a especies representativas de varios géneros microbianos. Se realizó un
estudio de inhibidores para microorganismos Gram positivos variando las concentraciones de los
mismos entre 0,003 y 1,0 g/L. A la composición definida se le evaluó un conjunto de parámetros de
calidad tanto organolépticos como fisicoquímicos. Se ensayó la capacidad funcional del medio de
cultivo a partir de la diferenciación de las especies de Aeromonas según las características
cromogénicas desarrolladas por las colonias aisladas en el medio. Resultados: Todas las
combinaciones de inhibidores empleadas en el medio permitieron una adecuada recuperación de
las especies de Aeromonas ensayadas y suprimieron el desarrollo de las bacterias Gram positivas.
La evaluación organoléptica y fisicoquímica del medio de cultivo mostró características
satisfactorias para este tipo de producto. La combinación de sustratos cromogénicos para detectar
la actividad β-galactosidasa posibilitó la diferenciación de las especies de Aeromonas.
Conclusión: Se obtuvo un diagnosticador que permite lograr una mayor productividad y
recuperación de las especies de Aeromonas, lo que favorece sus indicadores de calidad.
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1. INTRODUCCIÓN
El control y seguimiento de las enfermedades infecciosas es uno de los principales retos que
enfrentan los países en vías de desarrollo. En Cuba, las condiciones climáticas favorecen la
aparición de enfermedades diarreicas agudas constituyen la segunda causa de atención médica.
Las bacterias involucradas con mayor frecuencia en las diarreas son: Salmonella, Shigella,
Aeromonas. En particular, las especies de Aeromonas poseen un papel importante como patógeno
primario en el tracto gastrointestinal. La baja especificidad de identificación de los métodos y
técnicas convencionales conlleva un elevado consumo de tiempo, por lo que se hace necesario
implementar nuevos métodos de identificación, más rápidos y confiables para resolver esta
problemática.
El objetivo de nuestro trabajo es el desarrollo e introducción del medio cromogénico CromoCen AE
destinado para la detección y el recuento de especies de Aeromonas.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 Materiales
2.1.1 Materias primas
Las materias primas empleadas en las etapas de laboratorio, piloto e industrial fueron: peptona
de bacteriológica P (5 g/L, Firma BioCen, Lote 1000001), Extracto de levadura S (4,0 g/L, Firma
BioCen, Lote 0000002), Triptona (4,0 g/L Firma BioCen, Lote 1000004), rojo neutro (0,03 g/L
Firma Merck, Lote K42683469), X-gal (0,05 g/L Firma Apolo, Lote 111285), Mangenta glc (0,125
g/L Firma Apolo, Lote 111287), tierra silicea (2,0 g/L Firma Merck, Lote TA1642710), leche
descremada (10,0 g/L Firma Applichem, Lote 1Z006682), desoxicolato de sodio (0,2 g/L Firma
Applichem, Lote 1E007207), sulfito de sodio (0,8 g/L Firma Applichem, Lote 0V006054), Agar
(15,0 g/L Firma Mex, Lote AB080671). Como medio control empleamos la Base de Medio
CromoCen AGN de la Firma BioCen, Lote 1500003.
2.1.2 Material Biológico: Se empleó como material biológico durante las diferentes etapas de
desarrollo las cepas de colección clasificadas según la American Type Culture Collection (ATCC),
procedentes del cepario central de BioCen, tales como: Salmonella Typhimurium 14028,
Escherichia coli 25922, Shigella sonnei 25931, Shigella flexneri 12028, Proteus vulgaris 13315
Citrobacter freundii 8090, Enterobacter aerogenes 13048, Serratia marcescens 13880, Serratia.
marcescens 14576), Klebsiella pneumoniae 13883, Pseudomonas aeruginosa 27853,
Pseudomonas aeruginosa 9027, Aeromonas bestiarium ATCC 51108, Aeromonas eucrinophila
NCIMB74, Aeromonas culinicicola ATCC 3249, Aeromonas trota ATCC 49657, Aeromonas
hidrophila ATCC 7966, Aeromonas poppoffi LMG 17541, Aeromonas caviae ATCC 15468,
Aeromonas veronii ATCC 35624, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus aureus
ATCC 6538, Staphylococcus haemoliticus ATCC 29770, Staphylococcus xylosus ATCC 29771,
Staphylococcus saprofiticus ATCC 15305, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Enterococcus
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faecalis ATCC 19433, Enterococcus faecium ATCC 19434, Enterococcus casseliflavus ATCC
700327, Enterococcus avium ATCC 14025, Enterococcus hirae ATCC 10541, Streptococcus
pyogenes ATCC 9959, Streptococcus agalactiae ATCC 12136.
2.2 Métodos
2.2.1. Desarrollo del medio
[Link] Etapa de laboratorio
[Link].1 Estudio de inhibidores
Para seleccionar el inhibidor de la microbiota Gram-positiva y que no interfiriera en el
crecimiento del microorganismo diana se realizó un estudio variando las concentraciones de
diferentes inhibidores. El mismo se llevó a cabo calculando el índice de recuperación de la
microbiota Gram-negativa (mayor del 70 %) por el método de siembra por diluciones. En la
tabla 1 se muestran los inhibidores empleados así como las concentraciones ensayadas.
Tabla 1. Combinaciones y concentraciones de inhibidores.
Inhibidores Variantes, g/L
V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9 V10
Desoxicolato 0,05 0,05 0,05 0,05 0,2 0,2
de sodio
Sales biliares 0,65 0,65
Solución de 0,025 0,003
Verde
brillante
Solución de 0,01 0,001
Cristal
violeta
Lauril sulfato 0,8 0,6
de sodio
Sulfito de 0,8
sodio
[Link] Etapa piloto
El lote piloto 13P1 de 1 Kg se confeccionó con la variante V 10, donde la combinación de inhibidores
fueron desoxicolato de sodio y sulfito de sodio a concentraciones de 0,2; 0,8 g/L, respectivamente.
[Link] Etapa industrial
Se preparó toda la documentación para introducir tres lotes de 3 Kg cada uno en la Planta de
Medios de Cultivo. Para que los tres lotes (3010100, 3020100, 3030100) de la Base de Medio
CromoCen AE cumpla con la calidad requerida y sus características organolépticas estén acorde
a las demás casas productoras de medios de cultivo, se le realiza a las materias primas un
tratamiento previo antes de pesarlo y mezclarlo.
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2.2.2 Evaluación del medio
[Link] Métodos de evaluación organoléptica
A los lotes piloto e industriales se le determinó de forma visual y sensorial un conjunto de
características organolépticas (color del polvo, transparencia, color de la solución), tanto al polvo
como a la solución del medio.
[Link] Métodos de evaluación fisicoquímica
Se le determinó el valor de pH por el método potenciométrico y la pérdida por desecación mediante
el método gravimétrico a los lotes industriales.
[Link] Métodos de evaluación microbiológica
[Link].1 Comprobación de la productividad del lote
En el lote piloto se evaluó la capacidad inhibitoria del desoxicolato de sodio y el sulfito de sodio
sobre la microbiota Gram-positiva. Por otra parte se calculó la productividad del diagnosticador
frente a las 8 cepas de Aeromonas, existente en el laboratorio. Los lotes industriales fueron
evaluados según las cepas especificadas en la ESP 4524, Año 2014.
[Link].2 Preparación de la suspensión microbiana
El inóculo se preparó a partir de un cultivo puro en Caldo Triptona Soya (BioCen, Cuba)
incubado durante 24 h a 35 ± 2 °C. Se añadieron alícuotas del mismo a un tubo con solución
salina estéril, al 0,85 % (p/v). La densidad microbiana se ajustó al 75 % de transmitancia según
la escala de MacFarland, lo que corresponde a 3,0 x 10 8 células/mL, aproximadamente, a una
longitud de onda de 550 nm, utilizando el espectrofotómetro Genesys 10S UV-VIS, Termo
Scientific, USA.
[Link].3 Métodos de inoculación microbiana
Para la evaluación microbiológica se empleó el método de siembra por diluciones.
[Link] Evaluación del desempeño
La evaluación del desempeño de los tres lotes industriales de la Base de Medio CromoCen AE se
realizó de forma interna en los Laboratorio de Control de la Calidad del BioCen. (Ver Anexo 2)
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1 Resultados del estudio de inhibidores en la Base de Medio CromoCen AE para los
microorganismos Gram-positivos.
La Tabla 2 muestra los resultados del estudio de inhibición de los microorganismos Gram-positivos
en la Base de Medio CromoCen AE, así como el porcentaje de recuperación de las especies de
Aeromonas en comparación con la Base de Medio CromoCen AGN.
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Tabla 2. Resultados del estudio de inhibición de los microorganismos Gram-positivos y el
porcentaje de recuperación de las especies de Aeromonas
Variante Recuperación de Aeromonas, % Crecimiento hasta la dilución de la
CromoCen AE CromoCen AGN flora Gram-(+)
CromoCen AE CromoCen AGN
V1 72,9 1,80 10-7 Inhibido
V2 52 1,80 10-5 Inhibido
V3 19,3 1,80 Inhibido Inhibido
V4 Inhibe Inhibe Inhibido Inhibido
-6
V5 82,3 39,2 10 Inhibido
V6 58,1 24,6 10-6 Inhibido
-6
V7 95,8 24,6 10 Inhibido
V8 46,5 8,39 10-6 Inhibido
V9 90,7 34,6 Inhibido en la Inhibido
-2
dilución 10
V10 95,8 30,5 Inhibido en la Inhibido
-2
dilución 10
Los resultados mostrados en la tabla 2 demuestran que las concentraciones de inhibidores en las
variantes V1 (0,05 g/L desoxicolato de sodio), V2 (0,65 g/L sales biliares), V5 (0,01 g/L cristal violeta),
V6 (combinación entre el desoxicolato de sodio y el verde brillante 0,05 y 0,003 g/L
respectivamente), V7 (combinación entre el desoxicolato de sodio y el cristal violeta 0,05 y 0,001
g/L respectivamente) y V8 (lauril sulfato de sodio 0,8 g/L), empleadas para confeccionar el medio
CromoCen AE, no son suficientes para la inhibición de los microorganismos Gram positivos porque
crece hasta la dilución 10-7, no siendo así en el CromoCen AGN donde las especies de
Enterococcus, Streptococcus y Staphylococcus están completamente inhibidas porque la
concentración del inhibidor desoxicolato de sodio empleada es de 1 g/L. Por otra parte la
recuperación de las especies de Aeromonas en todas estas variantes se encuentran entre un 40-
95 % siendo mayor su crecimiento con respecto al medio CromoCen AGN (1-26 %), estos
resultados demuestran que las concentraciones de desoxicolato de sodio empleadas en el medio
utilizado como control afecta el crecimiento de los microorganismos diana.
En las variantes V3 (combinación entre el desoxicolato de sodio y sales biliares 0,05 y 0,65 g/L,
respectivamente) y V4 (verde brillante 0,025 g/L) las bacterias Gram-positiva se encontraron
completamente inhibida, siendo estas variantes las de mejor resultados en cuanto a la inhibición,
sin embargo la recuperación de Aeromonas de interés clínico en V3 está por debajo del 20 % y en
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V4 no crecen, por lo que estas dos variantes salen del estudio porque los inhibidores empleados
son tóxicos para la familia Aeromoneaceae.
Las concentraciones empleadas en las combinaciones de inhibidores de las variantes V9 y V10
fueron efectivas para inhibir en la dilución 10 -2 a la microbiota Gram-positiva. La composición
obtenida en estas variantes hizo posible que la recuperación las especies de Aeromonas estuviera
mayor del 90 % mientras que en el CromoCen AGN estaba alrededor del 30 %.
A pesar de que las variantes V 9 y V10 se comportaron de igual forma en la recuperación de
Aeromonas, la formulación seleccionada para confeccionar el lote piloto fue la variante V 10
(combinación entre el desoxicolato de sodio y sulfito de sodio 0,2 y 0,8 g/L, respectivamente)
porque la actividad β-galactosidasa, presente en Aeromonas se define mejor y son capaces de
desarrollar un halo grande y transparente con mejor precisión producto a la actividad proteolítica.
3.2 Características organolépticas del lote piloto y los industriales
En la Tabla 3 (Ver Anexo 1) se puede apreciar los resultados del análisis organoléptico del lote
piloto y los lotes introducidos de la Base de Medio CromoCen AE, definiéndose de forma general,
como un polvo de color beige rosado, fino, fluido, homogéneo, que al ser restituido al 2 % (p/p),
proporciona opalescencia con precipitado en el medio. Estas características son similares a las del
control empleado Base de Medio CromoCen AGN BioCen (Cuba); y se encuentran dentro de los
parámetros establecidos en la especificación del producto terminado (ESP 4524, Año 2014).
3.3. Pérdida por desecación y pH de los industriales
Figura 1. Valores de pérdida por desecación y pH de los lotes industriales.
La Figura 1 muestra los valores de pérdida por desecación de los lotes introducidos oscilaron entre
2,76-2,95 %, encontrándose por debajo del límite establecido (≤ 7 %) en la especificación del
producto (ESP 4524, Año 2014). Según los reportes de las diferentes casas comerciales que
desarrollan medios de cultivo deshidratado el límite de aceptación de este indicador, puede
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establecerse de un 5 % hasta un 8 %, puesto que una excesiva humedad provoca el
apelmazamiento del polvo debido a su higroscopicidad y esto hace que disminuya el tiempo de vida
útil de los mismos.
La correcta homogeneización se comprobó al determinar los valores de pH del medio, oscilando los
mismos desde 7,22-7,25 con un valor promedio de 7,23 encontrándose dentro de los límites
establecidos en la especificación del producto terminado, ESP 4524 para este tipo de producto.
3.4 Inhibición de la microbiota Gram-positiva en el lote piloto Base de Medio CromoCen AE
Los resultados de la capacidad inhibitoria del sulfito y el desoxicolato de sodio sobre la microbiota
Gram-positiva en el CromoCen AE se observan en la Tabla 4.
Tabla 4. Capacidad inhibitoria del sulfito y el desoxicolato de sodio sobre la microbiota Gram-positiva
en el CromoCen AE
Microorganismo ATCC Lote Dilución
10-1 10-2 10-3
Enterococcus feacalis 29212 13P1 INC NC NC
Enterococcus faecalis 19433 INC NC NC
Enterococcus faecium 19434 INC NC NC
Enterococcus casseliflavus 700327 INC NC NC
Enterococcus avium 14025 INC NC NC
Enterococcus hirae 10541 INC NC NC
Staphylococcus aureus 25923 INC NC NC
Staphylococcus aureus 6535 INC NC NC
Staphylococcus saprophyticus 15305 INC NC NC
Staphylococcus haemolyticus 29770 INC NC NC
Staphylococcus xylosus 29771 INC NC NC
Streptpcoccus pyogenes 9959 INC NC NC
Streptococcus agalactiae 12136 INC NC NC
INC – incontable; NC – no crecimiento
La concentración alcanzada de 1 g/L entre los inhibidores sulfito y el desoxicolato de sodio en el
CromoCen AE, permitió la inhibición de los microorganismos evaluados de los géneros de
Enterococcus, Streptococcus y Staphylococcus en la dilución 10-2 (Tabla 4). Estos resultados
corroboran lo expresado por Herzberg y Sherman en 1966, de que el desoxicolato de sodio actúa
sobre la lisis mitocondrial de las células bacterianas, fundamentalmente sobre las bacterias Gram-
positivas, inhibiendo el desarrollo de los mismos.
3.5 Recuperación de las especies de Aeromonas en la Base de Medio CromoCen AE.
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La Figura 2 muestra la recuperación de las cepas de Aeromonas ATCC empleadas en el estudio en
el medio CromoCen AE con respecto al CromoCen AGN.
Figura 2. Recuperación (%) de las especies de Aeromonas evaluadas en el medio CromoCen AE y
AGN.
Las especies de mayor y menor recuperación en el medio piloto CromoCen AE fueron A. caviae con
un 98 % y A. hydrophila con 55,9 %. Sin embargo, en comparación con el medio CromoCen AGN la
cepa de Aeromonas de menor recuperación fue A. trota 15 %. Esta diferencia en el porcentaje de
recuperación se debe a que en el medio CromoCen AGN los niveles de desoxicolato de sodio son
muy elevados (1 g/L) con respecto al CromoCen AE (0,2 g/L). Este reactivo empleado para inhibir a
los microorganismos Gram-positivos, ejerce un efecto tóxico sobre las especies de Aeromonas.
Por otra parte la combinación del sustrato cromogénico para la detección de actividad
β-galactosidasa, presente en Aeromonas, con un sustrato (de origen proteico) para la detección de
actividad proteolítica, hizo posible la diferenciación entre ellas.
3.5 Evaluación microbiológica de los lotes industriales
En la figura 3 se muestran los resultados de la evaluación microbiológica de los industriales del
medio CromoCen AE.
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Figura 3. Evaluación microbiológica del medio CromoCen AE.
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En la figura 3 se muestran los resultados de la evaluación microbiológica de los 3 lotes industriales
del medio CromoCen AE. La combinación de nutrientes en el medio, conjuntamente con
inhibidores para los microorganismos Gram-positivos, permitió el adecuado crecimiento y
recuperación de las especies de Aeromonas de interés clínicos. El porcentaje de recuperación de
todas las especies evaluadas fue mayor del 70 %, estos resultados concuerdan con lo
especificado, ESP 4524, Año 2014.
4. Evaluación Económica
Los cálculos de la ficha de costos de este producto se realizaron teniendo en cuenta todas las
partidas de costo en que se incurren en cada paso tecnológico y el resumen del costo de
producción total del medio de cultivo resultó ser de 293,75 CUC (1 kg).
En el mercado internacional existe el medio Base de Agar Selectivo m-Aeromonas de la casa
comercial BioLife. Este medio no es cromogénico por lo que no diferencia a las especies de
Aeromonas porque todas crecen de color amarillo, además lleva un antibiótico como suplemento
para inhibir tanto a la microbiota Gram-negativa y positiva que no son de interés, por lo que su
valor se incrementaría.
Un 1 kg de la Base de Agar Selectivo m-Aeromonas cuesta 185,91 CUC, para poder preparar esa
cantidad de producto hace falta 54 bulbos del suplemento de ampicillin que cuesta 406,08 CUC por
lo que el costo unitario del medio sería 592,04 CUC.
Nuestro país ahorría 298,29 CUC por cada 1 Kg si BioCen produce este medio de cultivo.
5. Conclusiones
1. La concentración de inhibidores de la microbiota Gram-positiva a emplear en la
composición de la Base de medio CromoCen AE fue de desoxicolato de sodio 0,2 g/L y
sulfito de sodio 0,8 g/L.
2. Los indicadores fisicoquímicos de calidad del lote piloto y los industriales cumplen con las
especificaciones del producto terminado.
3. El porcentaje de recuperación de las especies de Aeromonas se encuentra por encima del
70 %.
4. Los resultados de la validación del diseño en los laboratorios de aseguramiento de la
calidad fueron satisfactorios.
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Referencias Bibliográficas
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Zhurbenko R, Rodríguez Martínez C. Bases nutritivas para el cultivo de los microorganismos: Parte
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Zhurbenko R, Rodríguez Martínez C, Lobaina Rodríguez T, López Hernández OD, Viera Oramas
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SIIC. 2012 Septiembre 21 [citado 21 Ene 2013]. Disponible en:
[Link]
Rodríguez Martínez C, Zhurbenko R, Quesada Muñiz VJ, Lobaina Rodríguez T, Tsoraeva A, Díaz
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