Universidad de Córdoba
FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD
DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGÍA
TALLER N°4.
FUNDAMENTOS DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
INTRODUCCIÓN
La rección en cadena de la polimerasa (PCR) es una prueba que permite diagnosticar
enfermedades infecciosas y cambios genéticos de una forma sensible y especifica en el menor
tiempo posible. Para la realización de esta prueba se requiere pequeñas cantidades de muestras
que se pueden conseguir por medio de métodos como cepillado, aspiración, biopsia e incluso a
partir de material de archivo fijado o embebido en parafina. Este método se basa en el uso de la
enzima DNA polimerasa para sintetizar una nueva hebra de DNA a partir de un DNA patrón que
funciona como molde, permitiendo amplificar pequeñas regiones específicas de dicho DNA. De
esta forma, un segmento de DNA se multiplica n veces, facilitando su detección1.
OBJETIVO: Conocer la fundamentación teórica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y
sus variantes.
METODOLOGÍA: Trabajo independiente, socialización en aula dirigida por el docente.
Fecha: 29 de abril.
1. Mencione tres características de la PCR como prueba diagnóstica.
La PCR como prueba diagnóstica es una herramienta ampliamente utilizada para detectar
diversas enfermedades
● Esta prueba tiene una alta sensibilidad y puede detectar incluso pequeñas cantidades de
material genético específico, esta es unas de sus ventajas ya que puede detectar ADN o
ARN de un patógeno en una muestra clínica, lo cual permite la detección temprana de
una enfermedad. Incluso si la carga viral o bacteriana es muy baja.
● Es una prueba altamente específica, mencionado anteriormente, detecta específicamente
el material genético del patógeno, ya sea ADN o ARN, esto gracias a los cebadores que
incluyen lo cual hacen que la amplificación sólo ocurra en presencia del material genético
específico.
● A diferencia de muchas otras pruebas moleculares diagnósticas, la PCR es una prueba que
puede proporcionar resultados en un corto periodo de tiempo, lo que resulta útil en
situaciones donde se requiere un diagnóstico rápido para iniciar un tratamiento adecuado
o tomar medidas de control de enfermedades infecciosas
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2. ¿Qué es la PCR?
● PCR son las siglas por las que se conoce a la reacción en cadena de la polimerasa (en
inglés Polymerase Chain Reaction). Este método se basa en el uso de la enzima DNA
polimerasa para sintetizar una nueva hebra de DNA a partir de un DNA patrón que
funciona como molde, permitiendo amplificar pequeñas regiones específicas de dicho
DNA. De esta forma, un segmento de DNA se multiplica n veces, facilitando su detección.
3. ¿Cuáles son los componentes de una mezcla de reacción de PCR? Describa cada uno de
ellos
● Muestra de DNA: esta muestra contiene la región target que se desea amplificar. Son las
cadenas de ADN que se separan y funcionan como molde para que la enzima sintetice las
nuevas cadenas que llevan la secuencia blanco de interés.
● Cloruro de magnesio: es un cofactor enzimático que influye en la especificidad de la
reacción. Debe tener una concentración adecuada para que no afecte el rendimiento de la
Taq polimerasa.
● DNA polimerasa: se encarga de la catálisis de la reacción, sintetizando las nuevas cadenas
de ADN que llevan la secuencia blanco. La enzima más usada con frecuencia se llama Taq
ADN polimerasa, que proviene de una bacteria termófila llamada Thermus aquaticus. El
rasgo que distingue a esta enzima bacteriana de otras ADN polimerasas de otros
organismos es su capacidad para mantener su funcionalidad a temperaturas altas, por lo
que se le considera una enzima termoestable.
● Primers: es una secuencia sintética de nucleótidos que se usa para reconocer, por
apareamiento complementario, secuencias blanco en una muestra de DNA, el cual
consiste generalmente de DNA genómico. En una reacción típica de PCR se usan un par de
cebadores para definir los extremos del producto que va a amplificarse, y a partir de ellos
la DNA polimerasa inicia la adición de nucleótidos en dirección 5'-3'. Estos cebadores son
denominados forward (iniciador hacia adelante) y reverse (iniciador reverso) según los
extremos con que hibridan en la secuencia molde.
● Deoxinucleotidos: los dNTP’s son los ladrillos o bases nitrogenadas con los que la Taq
polimerasa construye las nuevas cadenas de ADN. Son factores importantes que
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contribuyen a la especificidad de la reacción, por ello es importante que su concentración
sea la adecuada ya que de lo contrario pueden afectar la función de la Taq polimerasa.
● Buffer: cumple varias funciones importantes:
❖ Mantenimiento del pH: ayuda a mantener un pH óptimo para la actividad de la enzima
ADN polimerasa, que suele ser alrededor de pH 8.0. Esto es crucial para garantizar que la
enzima funcione de manera eficiente y produzca resultados precisos.
❖ Estabilidad de la enzima: proporciona condiciones estables para la enzima ADN
polimerasa, lo que ayuda a mantener su estructura y actividad óptimas durante el proceso
de PCR. Esto es esencial para asegurar una amplificación eficiente y específica del ADN
objetivo.
❖ Mantenimiento de la fuerza iónica: ayuda a mantener la fuerza iónica adecuada en la
reacción de PCR. Esto es importante para favorecer la estabilidad de la doble cadena de
ADN, así como para optimizar la especificidad de la hibridación entre los cebadores y el
ADN molde.
❖ Protección del ADN: Algunos buffers de PCR pueden contener agentes quelantes o
protectores que ayudan a prevenir la degradación del ADN durante la reacción de PCR, lo
que garantiza la integridad de la muestra y la precisión de los resultados.
4. ¿Cuáles son las tres etapas de los ciclos térmicos de la PCR? Explique la finalidad de cada
uno de ellos.
Desnaturalización (96°C): la reacción se calienta bastante para separar, o desnaturalizar, las
cadenas de ADN. Esto proporciona los moldes de cadena sencilla para el siguiente paso.
Templado (55-56°C): la reacción se enfría para que los cebadores puedan unirse a sus secuencias
complementarias en el molde de ADN de cadena sencilla.
Extensión (72°C): la temperatura de la reacción se eleva para que la Taq polimerasa extienda los
cebadores y sintetice así nuevas cadenas de ADN
5. ¿Qué estrategia utilizamos para el análisis de un producto de amplificación en la PCR
convencional?
Electroforesis en gel de agarosa: Después de la amplificación mediante PCR, el producto se
puede separar por tamaño utilizando electroforesis en gel de agarosa. El ADN amplificado se
carga en pocillos en un gel de agarosa y se aplica una corriente eléctrica. El ADN se mueve a
través del gel y se separa según su tamaño. Esto permite visualizar y confirmar la presencia del
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producto de amplificación, así como determinar su tamaño aproximado comparándolo con
marcadores de peso molecular.
6. ¿Cuál es el principio de la PCR en tiempo real?
El objetivo de la PCR en tiempo real es detectar y cuantificar las secuencias específicas de ácidos
nucleicos mediante el uso de reporteros fluorescentes en la reacción. El término en tiempo real
se refiere a que la detección de los productos amplificados sucede en cada ciclo de la reacción. A
través de esta técnica es posible cuantificar la cantidad de ADN en la muestra en tiempo real. En
tiempo real el producto de amplificación es monitoreado conforme transcurre la reacción sin que
haya la necesidad de que sea manipulado en un gel de agarosa para conocer si la reacción fue
exitosa como sucede en la PCR punto final.
La PCR cuantitativa en tiempo real (o real-time qPCR) es una variante utilizada para amplificar y
simultáneamente cuantificar el producto de la amplificación del DNA. En muchos casos, el molde
empleado puede ser DNA complementario (cDNA) obtenido mediante retrotranscripción, y
permite determinar indirectamente los niveles de ácido ribonucleico mensajero (mRNA) de una
proteína de interés. Esta cuantificación es posible gracias a la adición de una molécula
fluorescente que permite medir la tasa de generación de uno o más productos específicos en un
termociclador provisto de detectores para fluorescencia (4). Las mediciones de la fluorescencia se
realizan después de cada ciclo de amplificación, y por esto se le denomina PCR en tiempo real;
mientras que la parte cuantitativa o semicuantitativa depende de medir simultáneamente el
mRNA de un gen de referencia que servirá para reportar la cantidad del mRNA de la proteína de
interés, con respecto al mRNA de la proteína de referencia
7. ¿Cómo se da la detección de productos de amplificación utilizando SYBR Green?
Los productos de amplificación de cada ciclo es proporcional a la fluorescencia emitida y esta
refleja el número de copias de ADN de doble cadena obtenidas en cada ciclo de la PCR. SYBR
Green es utilizado justamente para detectar estos productos.
SYBR Green es una molécula cargada positivamente que, mientras esté en solución sin unirse al
ADN de doble cadena, prácticamente no emite fluorescencia; sin embargo, cuando se une al
surco menor del ADN incrementa hasta 1,000 veces su fluorescencia. Esta molécula fluorescente
rica en anillos aromáticos interacciona con DNA bicatenario, al momento de la desnaturalización
esta molécula no interacciona con el DNA, sin embargo cuando el primer híbrida con la molécula
de DNA, esta molécula puede interaccionar con el pequeño surco bicatenario. Al momento de la
elongación se obtiene verdaderas cadenas bicatenarias y una mayor concentración puede
interaccionar con DNA, esto puede suceder dentro de un termociclador que también es capaz de
radiar la reacción con una longitud de onda de 498 nm que es el espectro donde el SYSBR Green
tiene una absorción máxima, al excitar sus electrones estos emiten fluorescencia a una longitud
de 522 nm donde el termociclador cuantificara la señal. Es decir por cada ciclo hay un paso de
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elongación donde las moléculas de SYSBR Green se unirán y estas serán las únicas que podrán
fluorescer y ser registradas.
8. ¿En qué consiste la transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET)?
FRET se basa en el hecho de que un colorante donante (por ejemplo, CFP) en un estado excitado puede
transferir una parte de su energía por acoplamiento dipolo-dipolo no radiante a una molécula aceptora
como YFP. La tecnología implica la fusión de proteínas fluorescentes donantes y aceptoras a moléculas de
interés. La coexpresión de constructos de fusión en células vivas permite estudiar su interacción en tiempo
real de manera cuantitativa. La emisión desde el aceptor puede detectarse tan pronto como ambos
colorantes están en estrecha proximidad, por ejemplo, cuando ha tenido lugar la interacción entre dos
proteínas.
Esto de aquí es para que lo lean , pero la respuesta real es la del principio
La transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) es una técnica especial para medir la
distancia entre dos cromóforos, llamado par donante-aceptor. Es un proceso físico dependiente de la
distancia mediante el cual la energía se transfiere de forma no radiativa desde un fluoróforo molecular
excitado (el donante) a otro fluoróforo (el aceptor) mediante un acoplamiento intermolecular dipolo-dipolo
de largo alcance. FRET puede ser una medida precisa de la proximidad molecular a distancias de
angstrom (10-100 Å) y muy eficiente si el donante y el aceptor se colocan dentro del radio de Förster (la
distancia a la que la mitad de la energía de excitación del donante se transfiere al aceptor, normalmente de
3 a 6 nm). La limitación de FRET es que este proceso de transferencia es efectivo sólo cuando la distancia
de separación del par donante-aceptor es menor de 10 nanómetros. Sin embargo, FRET es un fenómeno
altamente dependiente de la distancia y, por lo tanto, se ha convertido en una herramienta popular para
medir las actividades dinámicas de moléculas biológicas a nanoescala.
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9. Describa el principio de una PCR en tiempo real utilizando sondas de hidrólisis y sondas
de hibridación.
Principio de la PCR en tiempo real utilizando sondas de hidrólisis: se basan en sondas
fluorescentes de oligonucleótidos etiquetados con un reportero fluorescente y un «quencher»,
ambos se encuentran en estrecha unión mientras la sonda no hibride a su secuencia blanco.
Cuando híbrida, ocurren cambios conformacionales en el reportero y el quencher, lo cual permite
que la actividad exonucleasa 5’-3’ de la Taq polimerasa rompa esta unión, logrando que la
fluorescencia emitida por el reportero sea liberada y capturada por el equipo. Estos métodos son
muy seguros, ya que mientras no haya unión de la sonda a su blanco, no habrá amplificación y
tampoco señal de fluorescencia; es por eso que la especificidad es muy alta. Un ejemplo de estos
sistemas son las sondas comerciales conocidas como TaqMan12 , aunque existen otras en el
mercado.
Principio de la PCR en tiempo real utilizando sondas de hibridación: Los métodos por hibridación
consisten en una sonda unida a un reportero fluorescente que está en estrecha proximidad con
un aceptor fluorescente unido a otra sonda. Tanto el reportero como el aceptor presentan un
espectro de excitación y de emisión similar, de tal forma que cuando las dos sondas hibriden a su
templado blanco, el reportero es excitado y la señal emitida es transferida al aceptor, generando
un incremento en la cantidad de fluorescencia. Un ejemplo de este método son las sondas
molecular Beacons13 que también son comerciales.
10. ¿Como se captura la señal de fluorescencia en la PCR en tiempo real?
● El método basado en tinte fluorescente utiliza un tinte que emite fluorescencia cuando se
incorpora al ADN bicatenario. La señal de fluorescencia aumenta en cada ciclo de PCR a
medida que se generan más moléculas de ADN de doble cadena. El tinte más
comúnmente utilizado para la detección basada en tintes fluorescentes es SyBr Green.
El tinte SyBr Green funciona como un agente intercalante que emite fluorescencia
detectable cuando se une al ADN bicatenario.
A medida que avanza la PCR y aumenta la cantidad de ADN bicatenario, se une más tinte a
los productos de la PCR y, por tanto, aumenta la intensidad de la señal.
11. ¿En qué consiste la cuantificación absoluta y la relativa?
● En la cuantificación absoluta utilizando el método de la curva estándar, se cuantifican
incógnitas basándose en una cantidad conocida. Primero creas una curva estándar; luego
comparas las incógnitas con la curva estándar y extrapolas un valor. Por ejemplo Número
de copia viral correlacionado con un estado de enfermedad. Por otro lado, en la
cuantificación relativa, se analizan los cambios en la expresión genética en una muestra
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determinada en relación con otra muestra de referencia (como una muestra de control no
tratada). Ejemplo: Medición de la expresión genética en respuesta a un fármaco.
12. Elabore un cuadro comparativo de los diferentes tipos de PCR como: PCR en tiempo real,
convencional, PCR anidada (nested), Transcripción Reversa-PCR, Multiplex PCR. Tenga en cuenta
sus características, aplicaciones, ventajas y desventajas.
Tipo de Características Aplicaciones Ventajas Desventajas
PCR
PCR - Utiliza una sola reacción Se utiliza principalmente - Relativamente - Sensibilidad
Convencio de amplificación para la identificación de simple de realizar limitada a bajo
patógenos y el clonaje de número de copias
nal
- Detecta amplificación al - Equipamiento
genes.
final del ciclo con geles de básico requerido - Mayor riesgo de
agarosa contaminación
PCR en - Monitoriza la Ampliamente utilizado - Alta sensibilidad y - Costoso y
Tiempo amplificación en tiempo en la cuantificación de especificidad requiere
Real real ácidos nucleicos, equipamiento
- Menor riesgo de específico
(qPCR) diagnóstico de
- Detecta señales contaminación
enfermedades
fluorescentes en cada ciclo - Requiere
infecciosas y análisis de - Alto rendimiento y capacitación para
- Permite cuantificación expresión génica. rapidez análisis de datos
mediante curva estándar
- Reacción de amplificación
en tiempo real
PCR - Utiliza dos pares de Útil para la detección de - Aumenta la - Aumenta el riesgo
Anidada cebadores en dos rondas patógenos con baja sensibilidad frente a de contaminación
de amplificación concentración, análisis la PCR
(Nested)
- Requiere mayor
forense y detección de
- Mayor sensibilidad al - Reduce la tiempo de diseño
mutaciones genéticas.
evitar amplificaciones amplificación de de cebadores
productos no
deseados
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Transcripc - Convierte ARN en ADN Utilizado en el análisis de - Permite - Mayor
ión antes de la PCR expresión génica, amplificación de complejidad en el
diagnóstico de ARN protocolo
Reversa-P
- Requiere una etapa previa
CR enfermedades virales y
de transcripción reversa - Mayor sensibilidad - Mayor riesgo de
estudio de regulación
(RT-PCR) a ARN que PCR contaminación
- Amplifica ADNc generado genética.
convencional
a partir de ARN - Puede requerir
validación para
cada gen
Multiplex - Amplifica múltiples Detección de múltiples - Ahorro de tiempo - Mayor
PCR secuencias en una sola patógenos en una y reactivos probabilidad de
reacción muestra, identificación interferencias
de especies y diagnóstico - Reduce el riesgo entre cebadores
- Utiliza varios pares de de contaminación
prenatal.
cebadores y sondas - Requiere
optimización de
- Permite la detección de condiciones
múltiples secuencias
PCR de - Utilizado para generar - Secuenciación de genes - Permite la - Requiere una
secuencia amplicones que luego y regiones genómicas. determinación etapa adicional de
ción serán secuenciados para precisa de la secuenciación
determinar la secuencia de - Identificación de secuencia de para obtener la
nucleótidos de una región mutaciones genéticas. nucleótidos de una información
específica de ADN o ARN. región específica. completa.
- Se puede combinar con - Útil para la - Requiere
PCR convencional o qPCR caracterización equipamiento y
para generar productos genética y la tecnología
amplificados para investigación en específicos para la
secuenciación. biología molecular. secuenciación.
13. Realice la lectura del artículo: “Easy and inexpensive molecular detection of dengue,
chikungunyaand zika viruses in febrile patients”.
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BIBLIOGRAFÍA
1. Hurtado González D, Rueda Angelica, De la Vega Sánchez. Introducción al diseño de
oligonucleótidos para la PCR en tiempo real. Revista de Educación Bioquímica. 2023 [Internet]
42(1):44-45. Available from:
https://www.medigraphic.com/pdfs/revedubio/reb-2023/reb231d.pdf
2. Fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real. Tamay de
Dios L, Ibarra C, Velasquillo C.
https://www.medigraphic.com/cgi-bin/new/resumen.cgi?IDARTICULO=44427
3. Calvo EP, Sánchez-Quete F, Durán S, Sandoval I, Castellanos JE. Easy and inexpensive
molecular detection of dengue, chikungunya and zika viruses in febrile patients. Acta Trop.
2016 Nov;163:32-7. doi: 10.1016/j.actatropica.2016.07.021. Epub 2016 Jul 28. PMID:
27477452.
VIDEOS
https://youtu.be/mslMRgxbdOA
https://youtu.be/C_luFY8mG2g
https://youtu.be/Lkjr6RFOBY4
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