BIOLOGÍA
GRADO EN QUÍMICA Y PCEO
Tema 1
Métodos de estudio de células y tejidos. Microscopios
ópticos y electrónicos.
Índice
NIVELES DE ORGANIZACIÓN
NIVELES DE ORGANIZACIÓN BIÓTICOS
LA ESCALA DE LA VIDA
MÉTODOS DE ESTUDIO CÉLULAS Y TEJIDOS EN BIOLOGÍA CELULAR
EL MICROSCOPIO COMO HERRAMIENTA DE ESTUDIO
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Niveles de organización
Biosfera
Químico
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Niveles de organización
Tema 1. Métodos de estudio de células y tejidos. Microscopios ópticos y electrónicos.
Niveles de organización
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Niveles de organización
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Niveles de organización
EL PRECIO QUE HAY QUE PAGAR POR PASAR A UN NIVEL ORGANIZATIVO
SUPERIOR “AUMENTO DE LA COMPLEJIDAD” “CREAR ORDEN” ES EL
APORTE CONTINUO DE ENERGÍA.
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Niveles de organización
Atributos más sobresalientes que caracterizan a la materia viva:
Grado de organización Complejidad estructural
La segunda Ley de la Termodinámica establece que los procesos físicos y químicos tienden
a aumentar el desorden, el caos en el universo, es decir, su entropía.
Los seres vivos parecen ser capaces de crear orden a partir del desorden
Especial habilidad
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Niveles de organización
¿Cómo consiguen los seres vivos construir y mantener sus intrincadas estructuras?
Los seres vivos absorben de su entorno una forma de energía para construir sus propias
y complejas estructuras (energía libre) y devuelven al ambiente una cantidad
equivalente de energía (calor) contribuyendo de esta manera a aumentar el desorden o
entropía del mismo.
El aumento del orden en las células vivas se compensa con un aumento mayor del
desorden en su entorno (cumpliendo con la segunda Ley de la Termodinámica).
LOS SERES VIVOS SON SISTEMAS ABIERTOS
(INTERCAMBIAN MATERIA Y ENERGÍA CON SU ENTORNO)
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Niveles de organización bióticos
Complejos supramoleculares
Moléculas orgánicas
Macromoléculas (membranas y orgánulos
simples
celulares)
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Escala de la vida
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Escala de la vida
Organismo Tamaño Rama de la Ciencia
Órganos > 0’2 mm Anatomía
Tejidos 100-10 µm Histología
Células 10-0’1 µm Citología
Orgánulos celulares 200-1 nm Biología Celular
Moléculas < 1 nm Biología Molecular
Átomos 0,1 nm Química
Histología: composición, estructura y características de los tejidos orgánicos
Citología: morfológica y composición de la célula
Biología celular: propiedades, estructura y funciones de las células, su interacción con el
ambiente y su ciclo vital
Biología molecular: composición molecular y funcionamiento de las moléculas
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Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
Para el estudio morfológico de las células, tejidos y órganos (histología) se recurre a una
serie de herramientas técnicas que resuelven dos problemas en el caso de las células:
1. Su pequeño tamaño
2. Que son translucidas
El microscopio óptico, para estudiar la morfología de los tejidos y las células, lo que
llamamos la estructura.
El microscopio electrónico, que nos permite conocer como es el interior de la célula y
cómo son los componentes de la matriz extracelular que la rodea, lo que llamamos la
ultraestructura.
Microscopio Electrónico de Transmisión (MET)
Microscopio Electrónico de Barrido (MEB)
Microscopio Fuerza Atómica (MFA): Superficie y propiedades
Resolución atómica -Propiedades mecánicas (adhesión, rigidez, dureza, elasticidad)
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Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
Tema 1. Métodos de estudio de células y tejidos. Microscopios ópticos y electrónicos.
Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
Lo más importante es aprender a interpretar los resultados
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Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
• La mayoría de los estudios celulares y tisulares se
realizan en condiciones “post-mortem”.
• Los tejidos frescos son química y físicamente
inestables, blandos y translúcidos.
• La observación microscópica se realiza en
secciones delgadas.
CONDICIÓN PROCESO
SER PRESERVADO LA FIJACIÓN
ENDURECIDO LA INCLUSIÓN
LA CONFECCIÓN DE UN
CORTADO: OBTENCIÓN DE
BLOQUE Y LA MICROTOMÍA
SECCIONES MUY DELGADAS
(microtomo)
TENER CONTRASTE ÓPTICO LA TINCIÓN
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Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
• El procesamiento de las muestras para su estudio con el microscopio óptico y el
microscopio electrónico presenta las mismas etapas.
• Las diferencias en los reactivos utilizados y condiciones técnicas son debidas a la
distinta naturaleza de la observación con uno u otro microscopio.
Fijadores simples Mezclas fijadoras
Etanol, metanol, acetona Líquido de Bouin
Ácido acético Solución de Clarke
Ácido pícrico Carnoy
Formaldehído Mezclas con formaldehído
Glutaraldehído Glutaraldehído-tetróxido de osmio
Tetróxido de osmio
Osmolaridad
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Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
La técnica histológica ORGANISMO
VIVAS FIJACIÓN MUESTRA
Células Órganos, Tejidos
Frotis Química Física
Inmersión Congelación
DESHIDRATACIÓN
INCLUSIÓN
Parafina, Resinas y Plásticos
BLOQUE
CORTE
Microtomo, Ultramicrotomo Criostato
SECCIÓN
MONTAJE
TINCIÓN
Colorante, Fluorocromos, Contraste
MONTAJE
M. Contraste MO. Preparación ME. Rejilla
de fase OBSERVACIÓN
MICROSCÓPICA
M. Luz, M. Fluorescencia, M. Electrónico
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Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
Tipos de microscopio óptico y su aplicación
ORGANISMO
1. Campo claro
2. Contraste de fases VIVAS FIJACIÓN MUESTRA
3. Microscopia confocal Células Órganos, Tejidos
4. Fluorescencia
Frotis Química Física
5. Campo oscuro
6. De luz polarizada Inmersión Congelación
DESHIDRATACIÓN
INCLUSIÓN
Parafina, Resinas y Plásticos
BLOQUE
CORTE
Microtomo, Ultramicrotomo Criostato
SECCIÓN
MONTAJE
TINCIÓN
Colorante, Fluorocromos, Contraste
MONTAJE
M. Contraste MO. Preparación ME. Rejilla
de fase OBSERVACIÓN
MICROSCÓPICA
M. Luz, M. Fluorescencia, M. Electrónico
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Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
Microscopía óptica de contraste de fase
Fundamento:
Variaciones en la λ que atraviesa distintas estructuras celulares.
Debido a las propiedades de difracción del interior de la célula, la luz se retrasa al
atravesar la materia orgánica de diferente densidad.
Aplicación: estudios in vivo Diferencia de fase
Cultivos celulares y microorganismos
Se estudian las células vivas sin coloración
Índice de refracción
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Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
Fijación ORGANISMO
VIVAS FIJACIÓN MUESTRA
Objetivo de la fijación: Células Órganos, Tejidos
• Mantener los tejidos en un estado lo más próximo
Frotis Química Física
posible al estado vivo. Inmersión Congelación
DESHIDRATACIÓN
• Mantener su estructura y composición química. INCLUSIÓN
Parafina, Resinas y Plásticos
BLOQUE
CORTE
No existe un fijador universal, debemos escoger aquel Microtomo, Ultramicrotomo Criostato
SECCIÓN
que mejor se adapte al estudio que deseamos realizar TINCIÓN
MONTAJE
(MO o ME). Colorante, Fluorocromos, Contraste
MONTAJE
M. Contraste MO. Preparación ME. Rejilla
de fase OBSERVACIÓN
MICROSCÓPICA
Proceso de fijación: M. Luz, M. Fluorescencia, M. Electrónico
Para el estudio microscópico-óptico, pequeños fragmentos de 1 cm3
del órgano se introducen en los casettes de inclusión, para ser fijados
durante 24 horas.
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Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
ORGANISMO
La deshidratación
VIVAS FIJACIÓN MUESTRA
Para eliminar el agua de las células y tejidos, se Células Órganos, Tejidos
sumerge la muestra en concentraciones Frotis Química Física
crecientes de etanol en agua (70%, 96% hasta
el etanol 100%). Inmersión Congelación
DESHIDRATACIÓN
Sustituimos en las células el agua por alcohol.
INCLUSIÓN
Parafina, Resinas y Plásticos
Aclaramiento: solventes orgánicos y BLOQUE
aromáticos (p. ej., xileno) CORTE
Microtomo, Ultramicrotomo Criostato
SECCIÓN
MONTAJE
TINCIÓN
Colorante, Fluorocromos, Contraste
MONTAJE
Preparar la muestra para la inclusión en M. Contraste MO. Preparación ME. Rejilla
parafina de fase OBSERVACIÓN
MICROSCÓPICA
M. Luz, M. Fluorescencia, M. Electrónico
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Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
Inclusión en parafina
• Es la más utilizada de manera rutinaria para los estudios de MO.
• Ofrece muchas ventajas prácticas:
Es químicamente neutra
Es soluble en muchos disolventes
Es fácil de cortar con cuchilla.
Impregnación
La parafina debe estar 2ºC por encima de su punto de fusión
(60 ºC).
Generalmente, las muestras se someten a varios baños de
parafina pura líquida (en estufa) hasta que se elimina
totalmente el disolvente.
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ORGANISMO
VIVAS FIJACIÓN MUESTRA
Células Órganos, Tejidos
Frotis Química Física
Inmersión Congelación
DESHIDRATACIÓN
INCLUSIÓN
Parafina, Resinas y Plásticos
BLOQUE
CORTE
Microtomo, Ultramicrotomo Criostato
SECCIÓN
MONTAJE
TINCIÓN
Colorante, Fluorocromos, Contraste
MONTAJE
M. Contraste MO. Preparación ME. Rejilla
de fase OBSERVACIÓN
MICROSCÓPICA
M. Luz, M. Fluorescencia, M. Electrónico
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Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
Confección del bloque
Las muestras se retiran de los cassettes de inclusión y se
inmovilizan, con la orientación deseada, en bloques de parafina
realizados con los moldes adecuados.
La parafina solidifica por cristalización al bajar la temperatura y
una vez endurecida, se procede al desmolde del bloque.
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Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
Confección del bloque
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Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
Confección del bloque
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Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
Confección del bloque
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Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
Cortes en parafina
El microtomo consta de un soporte para el bloque de parafina
móvil y orientable, un soporte fijo y también orientable para la
cuchilla y un sistema mecánico sencillo de rotación para el
avance automático del bloque.
El microtomo de parafina permite la obtención de secciones
delgadas seriadas (3-5 µm) que deberán ser uniformes en grosor
y homogéneas en su superficie, sin desperfectos.
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Cortes en resina
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Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
El corte y la importancia de la orientación de la muestra, al confeccionar el bloque
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El corte y la importancia de la orientación de la muestra, al confeccionar el bloque
B
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El criostato ORGANISMO
VIVAS FIJACIÓN MUESTRA
Células Órganos, Tejidos
Frotis Química Física
Inmersión Congelación
DESHIDRATACIÓN
INCLUSIÓN
Parafina, Resinas y Plásticos
BLOQUE
CORTE
Microtomo, Ultramicrotomo Criostato
SECCIÓN
MONTAJE
TINCIÓN
Colorante, Fluorocromos, Contraste
MONTAJE
M. Contraste MO. Preparación ME. Rejilla
de fase OBSERVACIÓN
MICROSCÓPICA
M. Luz, M. Fluorescencia, M. Electrónico
-30 o -40 ºC
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El criostato
La congelación de los tejidos es una manera rápida de endurecerlos sin necesidad de
inclusión.
Esto tiene una serie de ventajas:
a) La preservación molecular es máxima
b) Las muestras congeladas pueden cortarse en secciones finas (5-15 µm), y más gruesas
del orden de cientos de µm.
c) Es manera más rápida de obtener secciones puesto que es posible congelar la
muestra sin necesidad de fijación y cortarla de inmediato, como las biopsias.
Para preservar correctamente la estructura del tejido ha de ser una congelación muy
rápida (isopentano enfriado con nitrógeno líquido), evitando la formación de cristales de
hielo que deterioran las estructuras celulares.
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Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
Técnicas de tinción
ORGANISMO
Las técnicas de tinción están basadas en
VIVAS FIJACIÓN MUESTRA
reacciones químicas.
Células Órganos, Tejidos
Tienen por objeto aumentar el contraste Frotis Química Física
de las estructuras biológicas, de acuerdo
con su afinidad por los colorantes a Inmersión Congelación
utilizar. DESHIDRATACIÓN
INCLUSIÓN
Parafina, Resinas y Plásticos
TIPOS BLOQUE
CORTE
• Técnicas histológicas generales o de rutina: Microtomo, Ultramicrotomo Criostato
SECCIÓN
Muestran la topografía general del corte de una TINCIÓN
MONTAJE
muestra. Colorante, Fluorocromos, Contraste
Histología Animal: Hematoxilina-Eosina (H-E) MONTAJE
MO. Preparación ME. Rejilla
Histología Vegetal: Hematoxilina-Verde Iodo M. Contraste
de fase OBSERVACIÓN
(H-VI) MICROSCÓPICA
M. Luz, M. Fluorescencia, M. Electrónico
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Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
Técnicas de tinción
ORGANISMO
• Técnicas histológicas especiales: Añaden
VIVAS FIJACIÓN MUESTRA
nuevos datos, al colorear estructuras, dentro
o fuera de las células que resultan invisibles Células Órganos, Tejidos
con una tinción de rutina. Frotis Química Física
Inmersión Congelación
Dentro de esta categoría tenemos métodos DESHIDRATACIÓN
de tinción que permiten observar y INCLUSIÓN
caracterizar compuestos o radicales Parafina, Resinas y Plásticos
BLOQUE
químicos, presentes en los tejidos, que son el
CORTE
producto de una reacción química. A estas Microtomo, Ultramicrotomo Criostato
técnicas se las denomina TÉCNICAS SECCIÓN
MONTAJE
HISTOQUÍMICAS. TINCIÓN
Colorante, Fluorocromos, Contraste
MONTAJE
glúcidos M. Contraste
de fase
MO. Preparación ME. Rejilla
OBSERVACIÓN
PAS proteínas MICROSCÓPICA
nucleótidos M. Luz, M. Fluorescencia, M. Electrónico
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Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
Microscopia óptica de campo claro
10x Lentes
4x
10x - Macrómetro
20x - Micrómetro
40x
100x
Diagrama
Condensador
Fuente de Luz
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Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
Tinción de rutina (Tejidos animales)
Músculo
Tráquea
Tejido nervioso
Hueso
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Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
Tinción de rutina (Tejidos vegetales)
Tallo de hiedra
Acícula de pino
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Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
Técnicas especiales
Intestino. Células caliciformes (H-E) Localización de
mucosustancias
HISTOQUIMICA
(PAS)
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Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
Técnicas especiales
Localización de enzimas
Fosfatasa alcalina en riñón
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Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
Técnicas especiales
IMMUNOCITOQUÍMICA
Productos químicos que
absorben la luz de
longitudes de onda
diferente.
Fluoresceína
Dos tipos de anticuerpos:
Policlonales: producidos por animales inmunizados
Monoclonales: producidos por líneas celulares inmortalizadas
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Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
Microscopía de fluorescencia
Fundamento:
Las sustancias fluorescentes al ser iluminadas por una radiación de l corta captan
energía y emiten luz de l mayor, cambiando de color.
Marcadores
Fluorescentes
(fluorocromos)
Lámpara de mercurio
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Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
Microscopía de fluorescencia
Aplicaciones:
Se estudian las células vivas o muertas.
Localización intracelular de componentes o sustancias.
Análisis de parámetros funcionales.
Cultivo celular:
Células en mitosis
Cerebro:
Neuronas y astrocitos
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Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
Microscopía electrónica
• Permite estudiar los detalles de las estructuras biológicas (ultraestructura)
• Resolución de imágenes = 3 nm (aumento máximo x 120 mil)
• Gran diversidad de técnicas
Tipos:
Microscopio Electrónico de Transmisión (TEM)
Se estudian secciones
Estructura celular interna
Microscopio Electrónico de Barrido (Scanning) (MEB o SEM)
Se observa la pieza completa
Visión tridimensional
Se estudia la superficie
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Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
Microscopio Electrónico de Transmisión (TEM): Muestras
• Siempre “post-mortem”
• Fragmentos de 1 mm3: poco poder de penetración de los reactivos
• Preservadas y estabilizadas (fijadas)
•Endurecidas para poder cortarlas (bloque)
• Secciones ultrafinas (200 nm – 10 nm ): poder de penetración de los e-
• Desecadas (deshidratadas)
• Han de tener contraste: Grados de electrodensidad (metales pesados)
• Sometidas a alto vacío dentro del TEM
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Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
Microscopio Electrónico de Transmisión (TEM): Procesado
1. Fijación
Preservar
Detener procesos vitales antes de autolisis
Fijadores: glutaraldehído, tetraóxido de osmio
(afinidad por lípidos de membrana)
2. Deshidratación
Eliminación del agua (alcoholes, acetona)
3. Inclusión
Consistencia dura para cortar y conservación
Bloque (polímeros: resinas epoxi, metacrilato)
4. Corte ultrafino
Sección con cuchillas de vidrio o diamante.
grosor apropiado (50 nm- 200 nm)
Tema 1. Métodos de estudio de células y tejidos. Microscopios ópticos y electrónicos.
Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
Microscopio Electrónico de Transmisión (TEM): Procesado
5. Montado
Sobre rejillas metálicas de 3 mm (Cu, Ni)
6. Contraste
Sales de metales pesados
Acetato de uranilo: cromatina nuclear
Citrato de plomo: concentración de proteínas
Tema 1. Métodos de estudio de células y tejidos. Microscopios ópticos y electrónicos.
Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
Microscopio Electrónico de Transmisión (TEM): Procesado
Tema 1. Métodos de estudio de células y tejidos. Microscopios ópticos y electrónicos.
Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
Microscopio Electrónico de Transmisión (TEM): Columna central de T.E.M. (Alto vacío)
Altura 2 m
Fuente de electrones
(filamento de tungsteno)
Haz de electrones
Electroimán condensador
Muestra
Electroimán objetivo
Electroimán ocular
Pantalla fluorescente
λ no visible → mayor λ visible
Tema 1. Métodos de estudio de células y tejidos. Microscopios ópticos y electrónicos.
Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
Microscopio Electrónico de Transmisión (TEM)
Fundamento:
La energía cinética acumulada en los electrones en su caída se transforma en luz (fotones)
al chocar con la pantalla fluorescente.
Solo chocarán los que no hayan encontrado metales pesados en su trayectoria.
Tema 1. Métodos de estudio de células y tejidos. Microscopios ópticos y electrónicos.
Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
Microscopio Electrónico de Transmisión (TEM)
Célula Procariótica. Bacteria Escherichia coli
Célula Eucariótica Animal. Melanocito de la piel con
gránulos de melanina
Tema 1. Métodos de estudio de células y tejidos. Microscopios ópticos y electrónicos.
Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
Microscopio Electrónico de Barrido (MEB): Muestras
Fundamento:
Los microscopios electrónicos de barrido sirven para observar superficies tisulares.
Los electrones no atraviesan la muestra sino que interaccionan con su superficie y rebotan
(máscara de metales)
La muestra se barre con el haz de electrones y los electrones reflejados por un punto de la
superficie son captados por una pantalla receptora que creará una imagen en una pantalla
digital.
Scanning
Tema 1. Métodos de estudio de células y tejidos. Microscopios ópticos y electrónicos.
Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
Microscopio Electrónico de Barrido (MEB): Muestras
• Mineral, Manufactura o Biológica (Siempre “post-mortem”)
• Muestra completa (no se corta)
• Muestras biológicas: Estabilizadas (fijadas)
• Extremadamente limpia
• Desecadas (especialmente la muestra biológica)
• Conductiva. (Muestra biológica con metalización: Cubiertas de oro, platino)
• Sometidas a alto vacío dentro del MEB
• Una orden de magnitud menor que el MET
Tema 1. Métodos de estudio de células y tejidos. Microscopios ópticos y electrónicos.
Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
Microscopio Electrónico de Barrido (MEB): Esquema
Se recogen los electrones dispersados que salen de la muestran.
Tema 1. Métodos de estudio de células y tejidos. Microscopios ópticos y electrónicos.
Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
Microscopio Electrónico de Barrido (MEB): Esquema
Información analítica
Se recogen los electrones dispersados que salen de la muestran.
Tema 1. Métodos de estudio de células y tejidos. Microscopios ópticos y electrónicos.
Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
Microscopio Electrónico de Barrido (MEB)
CABINA DE METALIZACIÓN
Tema 1. Métodos de estudio de células y tejidos. Microscopios ópticos y electrónicos.
Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
Microscopio Electrónico de Barrido (MEB)
Tema 1. Métodos de estudio de células y tejidos. Microscopios ópticos y electrónicos.
Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
Microscopio Electrónico de Barrido (MEB)
Tema 1. Métodos de estudio de células y tejidos. Microscopios ópticos y electrónicos.
Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
Criofractura
Técnica utilizada en microscopía electrónica que permite describir la estructura molecular
de las superficies internas de la membrana celular.
Pasos:
1. Congelación rápida de la muestra
2. Corte o fractura de la misma a muy baja
temperatura
3. Sombreado metálico de la superficie de corte de la
muestra
4. Eliminación del tejido subyacente mediante
detergentes
5. Observación de la réplica con un microscopio
electrónico de transmisión.
Tema 1. Métodos de estudio de células y tejidos. Microscopios ópticos y electrónicos.
Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
Criofractura
Se fractura por la zona
más débil
Membrana celular
½ Exterior
½ Interior
Sombreado metálico
Se trata con ácido para que
desaparezca la materia orgánica
Réplica metálica
Proteínas transmembranales de las
membranas celulares
Tema 1. Métodos de estudio de células y tejidos. Microscopios ópticos y electrónicos.
Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
Criofractura
Núcleo
Citoplasma
Envoltura nuclear. Poros nucleares
Tema 1. Métodos de estudio de células y tejidos. Microscopios ópticos y electrónicos.
Métodos de estudio de células y tejidos (Biología Celular)
Interpretación de los resultados
