Determinación de plomo en sangre - Método de cámara de grafito
Espectrofotometría de absorción atómica
MTA/MB-011/R92
Palabras clave: Plomo, sangre, espectrofotometría de absorción atómica.
PRESENTACIÓN
El Reglamento para la prevención de riesgos y protección de la salud de los trabajadores por la presencia de plomo metálico y sus
(1)
compuestos iónicos en el ambiente de trabajo (O.M. 9 de Abril de 1986, BOE 24-2-1986 ), en su artículo 11.1 indica que "la
determinación de los niveles de plomo en sangre se realizará con una fiabilidad (a un nivel de confianza del 95 por 100), de ± 15 por
100 ó ± 6 µg/100 ml para valores inferiores a 40 µg/100 ml".
El método "Determinación de plomo en sangre. Método de cámara de grafito/Espectrofotometría de Absorción Atómica" es un
MÉTODO RECOMENDADO por el Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo (INSHT). Como MÉTODO
RECOMENDADO se entiende un método evaluado por el INSHT según determinados criterios de validación y que ha sido
suficientemente probado mediante ensayos de colaboración entre distintos laboratorios del INSHT.
El método que se presenta se ha estudiado siguiendo el protocolo de validación (9.11) establecido por el INSHT que incluye la
realización de pruebas interlaboratorio.
Índice
1. OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN
2. FUNDAMENTO DEL MÉTODO
3. REACTIVOS
3.1. Agua destilada o desionizada
3.2. Octil-fenoxi-polietoxietanol (Tritón X-100)
3.3. Dihidrógeno fosfato (V) de amonio (NH4)H2PO4
3.4. Pirrolidinditiocarbamato de amonio (APDC)
3.5. Triclorometano (Cloroformo).
3.6. Nitrato de plomo (II)
3.7. Disolución de Pirrolidinditiocarbamato de amonio de 10 g/I
3.8. Disolución de Tritón X-100 al 0,1% (V/V)
3.9. Disolución patrón de plomo de 1 000 µg/ml.
3.10. Modificador de matriz
4. APARATOS Y MATERIAL
4.1. Tubos de polietileno
4.2. Cubiletes desechables de poliestireno
4.3. Tubos de grafito pirolizados
4.4. Agitador homogeneizador
4.5. Pipetas automáticas y dosificadores
4.6. Material de vidrio
4.7. Cámara de grafito
4.8. Espectrofotómetro de absorción atómica
5. TOMA DE MUESTRAS
6. PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS
6.1. Limpieza de material
6.2. Preparación de la muestra
6.3. Preparación de patrones y curva de calibración
6.4 Determinación
7. CÁLCULOS
7.1. Determinación de la concentración de plomo en la curva de calibración
7.2. Determinación de la concentración de plomo presente en la muestra
8. PRECISIÓN
8.1. Coeficiente de variación
8.2. Sesgo del método
8.3. Límite de detección
9 BIBLIOGRAFÍA
ANEXO A
1. OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN
Este método especifica el procedimiento a seguir y el equipo necesario para la determinación de plomo (Nº CAS 7439-92-1) en sangre
por espectrofotometría de absorción atómica, en un intervalo de concentración de 5 a 100 µg de Pb/100 ml de sangre (0,24 a 4,82
µmol/litro) aplicable al seguimiento de poblaciones laborales potencialmente expuestas a plomo metálico y sus compuestos iónicos.
La interferencia espectral provocada por la absorción inespecífica, que tiene lugar a la longitud de onda de trabajo, hace necesario el
uso de un sistema corrector de la radiación de fondo.
2. FUNDAMENTO DEL MÉTODO
Las muestras de sangre se recogen en tubos de polietileno conteniendo EDTA-K2 (sal dipotásica del ácido etilendiaminotetracético)
como anticoagulante.
La sangre se diluye con un tensoactivo para facilitar su hemólisis. La cuantificación del plomo presente se efectúa por
espectrofotometría de absorción atómica a 283,3 nm, utilizando cámara de grafito con plataforma de L'vov y modificación de matriz
(9.1), frente a una curva de patrones acuosos.
3. REACTIVOS
Durante el análisis, se utilizarán únicamente reactivos "para análisis".
3.1. Agua destilada o desionizada
El agua será de grado 2 de pureza como mínimo, de acuerdo con ISO 3696 (9.6). El contenido en plomo será menor de 0,01 µg/ml.
3.2. Octil-fenoxi-polietoxietanol (Tritón X-100)
3.3. Dihidrógeno fosfato (V) de amonio (NH4)H2PO4
3.4. Pirrolidinditiocarbamato de amonio (APDC)
3.5. Triclorometano (Cloroformo).
(2)
PRECAUCIÓN. SUSTANCIA NOCIVA. Frases (R): 20, Frases (S): 2-24/25. Real Decreto 2216/1985 (9.5).
3.6. Nitrato de plomo (II)
(2)
PRECAUCIÓN. SUSTANCIA NOCIVA. Frases (R) 20/22-23; Frases (S): 13-20/21. Real Decreto 2216/1985 (9.5).
3.7. Disolución de Pirrolidinditiocarbamato de amonio de 10 g/I
Se pesa 1 g de APDC (3.4) y se disuelve en agua (3.1) completando hasta 100 ml.
3.8. Disolución de Tritón X-100 al 0,1% (V/V)
Se depositan 0,5 ml de Tritón X-100 (3.2) en un matraz aforado de 500 ml y se completa este volumen con agua (3.1)
3.9. Disolución patrón de plomo de 1 000 µg/ml.
Se seca nitrato de plomo (II) a 120°C durante 4 horas y se deja enfriar en desecador. Se pesan 1,598 g y se disuelven en ácido nítrico
a 1% (V/V) hasta completar 1 litro de disolución.
3.10. Modificador de matriz
Se disuelven 5 g de dihidrógeno fosfato (V) de amonio (3.4) en la disolución de Tritón X-100 al 0,1% (V/V) (véase 3.8) hasta completar
500 ml (9.1).
Se vierte esta disolución en un embudo de decantación de 1 litro de capacidad, se añade 1 ml de la disolución de APDC de 10 g/l (3.7)
y se agita vigorosamente. Se añaden 20 ml de cloroformo y se agita de nuevo para extraer las trazas metálicas que pueda aportar el
dihidrógeno fosfato (V) de amonio. Se deja decantar y se elimina la fase orgánica. Esta operación ha de repetirse las veces que sean
necesarias para eliminar las trazas de plomo (generalmente 2 ó 3).
La disolución así preparada se conservará en botella de vidrio o polipropileno para su posterior utilización.
4. APARATOS Y MATERIAL
4.1. Tubos de polietileno
Tubos de polietileno de 5 ml, exentos de plomo, conteniendo EDTA-K2 (sal dipotásica de árido etilendiaminotetracético) como
anticoagulante.
4.2. Cubiletes desechables de poliestireno
Cubiletes desechables de poliestireno, de fondo cónico, de 2 ml de capacidad.
4.3. Tubos de grafito pirolizados
Tubos de grafito pirolizados, de 28 mm de longitud y 6 mm de diámetro interno, con plataforma de L'vov (9.1 y 9.2).
4.4. Agitador homogeneizador
Agitador homogeneizador para las muestras de sangre.
4.5. Pipetas automáticas y dosificadores
Pipetas automáticas y dosificadores que cumplan los requisitos recogidos en ISO 8655 (9.7).
4.6. Material de vidrio
Material de vidrio. de borosilicato 3.3 de acuerdo con ISO 3585 (9.8).
4.7. Cámara de grafito
Cámara de grafito capaz de satisfacer el programa de análisis propuesto en 6.4.2.
4.8. Espectrofotómetro de absorción atómica
Espectrofotómetro de absorción atómica equipado con lámpara de plomo y corrector de absorción inespecífica.
5. TOMA DE MUESTRAS
La muestra de sangre venosa extraída con jeringa de polietileno o poliestireno se recoge en tubos de polietileno de 5 ml conteniendo
EDTA-K2 como anticoagulante, mezclándola cuidadosamente.
Las muestras se conservarán a 4 °C hasta el momento del análisis (véase Tabla 1 del Anexo A).
6. PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS
6.1. Limpieza de material
6.1.1. Todo el material de vidrio utilizado en el análisis después de su lavado con un detergente, debe mantenerse sumergido varios
minutos en ácido nítrico al 50% (V/V) y ser después cuidadosamente enjuagado con agua (3.1).
6.1.2. Los tubos de grafito nuevos y los usados, tras un período fuera de uso, deben acondicionarse siguiendo las recomendaciones
del fabricante.
6.1.3. Las ventanas de cuarzo de la cámara de grafito deben limpiarse periódicamente para eliminar las salpicaduras que sobre ellas
se depositan.
6.1.4 Los conos de plástico para las micropipetas y los cubiletes de poliestireno deben mantenerse en sus bolsas de origen hasta el
momento de su uso, para evitar cualquier contaminación.
6.2. Preparación de la muestra
6.2.1. La sangre se homogeneiza perfectamente en un agitador (4.4) una vez alcanzada la temperatura ambiente.
6.2.2. [Link] 600 µl del modificador de matriz preparado según 3.10, en un cubilete de fondo cónico (4.2).
6.2.3. Se añaden 50 µl de sangre con pipeta automática y con el mismo cono de plástico utilizado se remueve el contenido del cubilete
hasta conseguir una completa homogeneización. La muestra así preparada está lista para su introducción directa en el horno de grafito.
6.3. Preparación de patrones y curva de calibración
6.3.1. Disoluciones de trabajo. A partir de la disolución patrón de plomo de 1.000 µg/ml (3.9) y con las diluciones pertinentes se
preparan las disoluciones de trabajo de 0,2; 0,4; y 0,8 µl de Pb por ml de agua (3.1)
6.3.2. Se pipetean 600 µl de modificador de matriz (3.10) en los cubiletes de fondo cónico (4.2) en los cuales se van a preparar los
patrones.
6.3.3. Se añaden 50 µl de cada una de las disoluciones de trabajo preparadas según 6.3.1 a los cubiletes que contienen modificador de
matriz (6.3.2) y se agita el contenido del cubilete tal como se indicó para las muestras.
6.3.4. Blanco de reactivos. Corresponde a la adición de 50 µl de agua destilada (3.1) a 600 µl de modificador de matriz. Su lectura se
restará de la obtenida para patrones y muestras antes de construir la curva de calibración.
6.3.5. Curva de calibración. De las lecturas, en área de pico, obtenidas para los patrones preparados según 6.3.2 y que
corresponderán finalmente a concentraciones de 0,2; 0,4; y 0,8 µl Pb/ml de sangre, se resta la lectura, en área de pico también,
obtenida para el blanco de reactivos definido según 6.3.4.
Se representan los valores corregidos de área de pico frente a sus correspondientes concentraciones, obteniéndose así la curva área
de pico-concentración.
Las concentraciones propuestas para los patrones son orientativas. Los patrones deben cubrir el intervalo de concentración de las
muestras a analizar y a su vez encontrarse dentro de la región lineal de la gráfica de calibración.
6.4 Determinación
NOTA - MEDIDA DE SEGURIDAD
No debe mirarse directamente al tubo de grafito durante el proceso de atomización para evitar posibles lesiones oculares debidas a
radiación.
6.4.1 Se introducen 10 µl de patrones y muestras, preparados como se indicó en 6.2 y 6.3, en el horno de grafito con una pipeta
automática o bien con un introductor automático si se dispone de él.
6.4.2 El análisis se efectuará con un programa de temperaturas y tiempos (9.4) lo más similar posible al siguiente
ETAPA TEMP(°C) RAMPA(s) ISOTERMA(s) ESPECIFICACIONES
1 110 10 10 secado
2 200 10 10 secado
3 800 10 10 mineralización
4 850 5 5 mineralización
5 1700 0 3 (int. flujo) atomización
6 2600 1 3 limpieza
7 20 1 4 recuperación
6.4.3. Se mide el área del pico registrado, durante la etapa de atomización, a 283,3 nm. Es imprescindible utilizar corrección de la
absorción no específica. Las determinaciones de muestras y patrones deben efectuarse al menos por duplicado.
6.4.4. El elevado número de variables que intervienen en la determinación y la dificultad en controlarlas todas ellas de forma precisa y
continua, hace necesaria la introducción de muestras de sangre de concentración conocida entre las muestras reales.
6.4.5. Es importante en orden a obtener unos resultados reproducibles, asegurarse del buen estado de conservación de los contactores
de grafito (cilindros), limpiándolos periódicamente de acuerdo con las instrucciones del fabricante y cambiándolos cuando su grado de
deterioro así lo aconseje.
7. CÁLCULOS
7.1. Determinación de la concentración de plomo en la curva de calibración.
La concentración de plomo en sangre de cada muestra, expresada en microgramos por mililitro, se determina directamente por
interpolación de la lectura obtenida, restado el blanco 6.3.4, en la curva de calibración.
7.2. Determinación de la concentración de plomo presente en la muestra.
Los resultados, expresados en microgramos de plomo por cien mililitros de sangre, se obtienen mediante la siguiente expresión:
C = c x 100
donde
C es la concentración de Pb en µg/100 ml de sangre.
c es la concentración de Pb en µl/ml leída en la curva de calibración.
NOTA.- Si el resultado quiere expresarse en micromoles por litro de sangre µmol/l se divide el resultado calculado en µg Pb/100 ml
entre 20,72.
8. PRECISIÓN
8.1. Coeficiente de variación
El coeficiente de variación del método calculado a partir de los datos intralaboratorio resultó ser inferior al 3% en el intervalo de
concentraciones ensayado (véase Tabla 2 del Anexo A).
La repetibilidad (r) y la reproducibilidad (R) han sido evaluadas según la Norma ISO 5725 por medio de una prueba interlaboratorios
cuyos resultados se recogen en la Tabla 3 del Anexo A. Los valores de r y R obtenidos en el intervalo de concentraciones ensayado
son los siguientes:
Concentración
Repetiblidad Reproducibilidad
µg Pb/100ml
absoluta relativa absoluta relativa
32,32 1,77 5,49 7,93 24,54
58,12 2,92 5,02 8,98 15,45
77,86 4,30 5,53 13,40 17,21
La relación funcional encontrada entre r y R con la concentración c se ajusta al modelo r(R)= a + bx. La Figura 1 muestra la
representación gráfica de las relaciones funcionales encontradas.
La diferencia entre dos resultados analíticos obtenidos en condiciones de repetibilidad (ó reproducibilidad) no deberá exceder, con una
probabilidad del 95%, los valores de r y R obtenidos en las relaciones funcionales establecidas, para cada concentración.
FIGURA 1
8.2. Sesgo del método
El sesgo del método, evaluado mediante la utilización de Materiales de Referencia Certificados del B.C.R. (Oficina de Referencia de la
Comunidad Europea) resultó ser no significativo (p < 0,05) en todo el intervalo de concentraciones ensayado. La Tabla 2 del Anexo A
muestra los resultados de esta prueba.
8.3. Límite de detección
El límite de detección calculado para el método, utilizando una muestra real de concentración próxima al blanco, de acuerdo con la
definición de la I.U.P.A.C. es de 1,5 µg Pb/100 ml de sangre (n=8; K=3) (9.9 y 9.10).
El intervalo de aplicación del método está comprendido entre 5 (K=10) y 100 µg Pb/100 ml de sangre.
9 BIBLIOGRAFÍA
9.1. Voelkopf, V.; Grobenski, Z; Schlemmer,G.; and Weiz,B. Determination of trace elements in biological samples using
stabilized temperature platform furnace. Atomic Spectroscopy. Application study 683. Perkin Elmer.
9.2. Cooksey, M.; Bamett, W. and Grobenski, Z., Techniques for analyzing difficult samples with the HGA graphite furnace,
Atomic Spectroscopy, Application study 660. Perkin Elmer.
9.3. Fernández, F.J.; Micromethod for lead determination in whole blood by atomic absorption with use of the graphite
furnace. Clinical Chemistry 21, 4, 588-561 (1975).
9.4. Determinación de plomo en sangre, método de espectrofotometría de absorción atómica por horno de grafito/STPF.
Documento de trabajo AA/CB/21. Laboratorios Contox, S.A.
9.5. Real Decreto 2216/1985 de 23.10 (Presid., [Link].E. 27.11.1985, rect. 9.5.1986) "Reglamento sobre declaración de
sustancias nuevas y clasificación, envasado y etiquetado de sustancias peligrosas". Modificado por Real Decreto
(2)
725/1988 ([Link]. Cortes [Link].E. 9.7 rect. 4.8.1988) y Orden de 7.9.1988 ([Link]. Cortes, B.O.E. 13.9.1988).
9.6. ISO 3696, Agua para uso en laboratorio - Especificaciones.
9.7. ISO 8655. partes 1 a 4, aparatos volumétricos de pistón y/o émbolo (POVA).
9.8. ISO 3585, Instalaciones de vidrio, tuberías y ajustes. Propiedades del vidrio borosilicatado 3.3
9.9. International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC). Compendium of analytical nomenclature. Pergamon Press.
1978.
9.10. Analytical Methods Commitee of the Royal Society of Chemistry of London. Recomendations for the definition, estimation
and use of the detection limit. Analyst, 112,199-204 (1987).
9.11. Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo. Protocolo de validación para determinaciones en muestras
biológicas (sangre y orina) de interés en Higiene Industrial. MTA/PV-III/90.
9.12. International Standard Organization."Precision of test methods, Determination of repeatability and reproducibility for a
standard test method by interlaboratory tests". International standard ISO 5725 (1986).
ANEXO A
En este anexo se presentan las tablas de los resultados obtenidos en el desarrollo de las pruebas descritas en el Protocolo de
validación para determinaciones en muestras biológicas (sangre y orina) de interés en Higiene Industrial (9.11) para la validación de un
método analítico.
TABLA 1
Pruebas intralaboratorio. Estudio de la estabilidad y conservación de las muestras.
Concentración 1
*Concentración C.V. Diferenc.
Fecha análisis Temperatura
µg Pb/100 ml (%) (%)
Inmediato ambiente 46,6 1,4
ambiente 46,9 3,6 +0,5
3 días
4oC 47,3 1,4 +1,4
ambiente 51,1 2,9 +9,5
15 días
4oC 46,6 3,1 0
*Cada resultado es el promedio de seis muestras analizadas.
Concentración 2
*Concentración C.V. Diferenc.
Fecha análisis Temperatura
µg Pb/100 ml (%) (%)
Inmediato ambiente 60,0 1,4
ambiente 61,5 5,2 +2,4
3 días
4oC 60,9 3,9 +1,4
ambiente 65,4 2,4 +9,0
15 días
4oC 61,3 2,4 +2,0
* Cada resultado es el promedio de seis muestras analizadas.
TABLA 2
Prueba Intralaboratorio. Cálculo del sesgo y de la presión intralaboratorio.
Resultados obtenidos
Concentrac. certificada
Material de de referencia * Concentrac. C.V.
(µg/Pb/100 ml) **Sesgo.
(ug/Pb/100ml) (%)
CRM no 194 12,6 ± 0,4 13,1 2,5 N.S.
CRM no 195 41,6 ± 0,9 41,8 1,3 N.S.
CRM no 196 77,2 ± 1,1 77,9 0,9 N.S.
* Cada resultado es el promedio de seis muestras analizadas.
** Los valores obtenidos para el sesgo resultan ser no significativos (N. S.) (p < 0, 05).
TABLA 3
Prueba Interlaboratorios. Resultados obtenidos por todos los participantes en µg Pb/100 ml de sangre.
Concentración
Laboratorio
NIVEL 1 NIVEL 2 NIVEL 3
30,00 57,00 73,00
30,00 56,00 77,00
1
29,00 57,00 75,00
30,00 54,00 76,00
28,90 54,50 68,60
30,20 53,90 68,40
2
29,80 54,50 69,60
28,40 52,80 66,10
36,40 40,40 51,30
35,80 54,80 57,50
3
35,20 48,80 38,50
29,80 46,80 35,90
32,40 61,20 81,70
31,30 58,80 80,60
4
32,60 59,20 81,30
32,70 58,30 84,10
37,70 59,30 79,80
37,50 60,70 79,20
5
37,40 60,60 81,90
36,60 61,00 77,60
34,20 62,80 84,80
33,90 62,70 81,00
6
34,20 63,20 78,70
33,80 63,50 81,30
31,80 55,80 76,50
31,30 56,90 76,70
7
30,00 58,00 76,90
30,20 56,70 75,50
66,00 86,40 102,60
57,10 82,70 101,00
8
52,40 83,80 90,00
51,90 74,40 101,00
34,00 59,20 80,30
34,40 58,30 80,90
9
34,80 60,30 79,40
34,60 61,70 80,30
29,70 54,50 79,70
31,40 56,30 79,50
10
31,20 55,70 80,20
30,20 55,40 80,40
32,00 54,50 69,00
29,50 55,50 68,00
11
22,50 49,00 63,00
30,00 56,00 59,00
Para cualquier observación o sugerencia en relación con este Método puede dirigirse al
Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo
Centro Nacional de Verificación de Maquinaria
Camino de la Dinamita, s/n Monte Basatxu-Cruces - 48903 BARACALDO (VIZCAYA)
Tfn. 944 990 211 - 9 44 990 543 Fax 944 990 678
Correo electrónico.- cnvminsht@[Link]
ADENDA
Revisión normativa
Las disposiciones siguientes han sufrido modificaciones después de la edición de este método en formato papel:
(1) O.M. 9 de Abril de 1986, BOE 24-2-1986: Derogada por el Real Decreto 374/2001, BOE núm. 104 de 1 de mayo de 2001.
(2) Real Decreto 2216/1985: Derogado por el Real Decreto 363/1995
Advertencia © INSHT
