BACTERIAS COLIFORMES
Coliformes
• La denominación genérica de coliformes designa a un grupo
de especies bacterianas que tienen ciertas características
bioquímicas en común e importancia relevante como
indicadores de contaminación del agua y los alimentos.
• Coliforme significa con forma de coli, refiriéndose a la bacteria
principal del grupo, la Escherichia coli, descubierta por el
bacteriólogo alemán Theodor Escherich, en 1860.
• Escherich la bautizó como bacterium coli ("bacteria del
intestino", del griego κολον, kolon, "intestino").
• Con posterioridad, la microbiología sistemática nombraría el
género Escherichia en honor a su descubridor.
Coliformes:
características bioquímicas
Las bacterias coliformes :
• Son bacilos gram negativos, no esporulados
• Aerobios o anaerobios facultativos
• Oxidasa negativo
• Con capacidad de fermentar la lactosa, con producción de
ácido y gas.
• Son usados como indicadores de condiciones insalubres en la
producción de alimentos y bebidas.
Hábitat
• Las bacterias de este género se encuentran principalmente en
el intestino de los humanos y de los animales de sangre
caliente, es decir, homeotermos, pero también ampliamente
distribuidas en la naturaleza, especialmente en suelos,
semillas y vegetales.
• Los coliformes se introducen en gran número al medio
ambiente por las heces de humanos y animales. Por tal motivo
suele deducirse que la mayoría de los coliformes que se
encuentran en el ambiente son de origen fecal. Sin embargo,
existen muchos coliformes de vida libre.
Bacterias que integran el grupo
• Para su estudio, se dividen en dos grupos:
1. Coliformes totales
Comprende a todos los bacilos Gram-negativos aerobios o anaerobios facultativos,
no esporulados, que fermentan la lactosa con producción de ácido láctico y
dióxido de carbono gaseoso, en un lapso máximo de 48 h. a 35°C ± 1ºC. Este
grupo está conformado por 4 géneros principalmente: Enterobacter, Escherichia,
Citrobacter y Klebsiella.
La presencia de coliformes en el suministro de agua es un indicio de que el
suministro de agua puede estar contaminada con aguas negras u otro tipo de
desechos en descomposición.
Generalmente, las bacterias coliformes se encuentran en mayor abundancia en la
capa superficial del agua o en los sedimentos del fondo.
En la higiene de alimentos los coliformes no se consideran indicadores de
contaminación fecal sino solamente indicadores de calidad.
Los coliformes totales se usan para evaluar la calidad de la leche pasteurizada,
leche en polvo, helados, pastas frescas, fórmulas para lactantes, fideos y cereales
para el desayuno.
Bacterias que integran el grupo
2. Coliformes fecales
está constituido por bacterias Gram-negativas capaces de fermentar la
lactosa con producción de ácido láctico y dióxido de carbono
gaseoso, a las 48 h de incubación a 44.5 ± 0.1°C. Este grupo no incluye
una especie determinada, sin embargo la más importante es
Escherichia coli.
La presencia de E. coli es usada como indicador de contaminación fecal
en aguas o superficies vivas o inertes, en quesos frescos, cereales,
masas con relleno, alimentos infantiles, etc.
La prueba de coliformes totales y fecales también se utiliza para
determinar la calidad bacteriológica de los efluentes de los sistemas
de tratamiento de aguas servidas
Contaminación de la napa freática
Toma de muestras
para análisis microbiológico
• Para el análisis microbiológico del agua deberán tomarse
muestras representativas, previo flameado de la canilla para
eliminar bacterias presentes en la misma.
• Deberán usarse frascos estériles.
• El análisis debe comenzar antes de 6 horas desde el momento
de toma de muestras
• En casos excepcionales, las muestras pueden conservarse a
4°C no más de 24 hs para su análisis.
Tecnica del Número más probable
(NMP)
• La prueba estándar para el grupo coliforme puede realizarse
mediante una técnica de fermentación en tubos múltiple
• Los resultados del estudio de los tubos y diluciones replicados se
comunican en términos de NUMERO MAS PROBABLE (NMP) de
microorganismos existentes. Este numero basado en determinadas
formulas de probabilidad, es un calculo de densidad media de
coliformes de la muestra.
• El número de diluciones varía mucho, dependiendo del origen de la
muestra a tratar.
• Para la determinación del NMP de Coliformes Totales y Fecales en
aguas de pozo es necesario proceder a preparar diluciones
decimales de la muestra, debido a que se espera que la
concentración de coliformes sea superior en éstas que en un agua
potable.
Coliformes totales
A. Prueba presuntiva
Todas las operaciones deberán efectuarse en absolutas condiciones de asepsia
• Se prepara una serie de tubos con 10 ml de Caldo de Mc Conkey
• Se coloca un campanita Durham a cada tubo y algodón para
tapar el tubo
• Se esteriliza en autoclave ( 15´ a 120 °C)
• Se retira, se deja enfriar.
• Se agregan 10 ml de la muestra de agua a analizar a la primer
serie de 10 tubos (10-1); 1 ml a la 2da serie (10-2)y 0,1 ml a la 3er
serie (10-3).
• Se pone a incubar 24 – 48 hs; 37°C.
Técnica- Prueba presuntiva
Resultados
Contar los tubos positivos ( los
que tengan enturbiamiento,
cambio de color y/o burbujas de
gas en la campana de Durham
Prueba presuntiva. Tubos conteniendo caldo de Mc Conkey, izquierda tres
tubos negativos, derecha tres tubos mostrando gas en la campana de Durham
lo que se interpreta como resultado positivo.
Cálculos
- Se identifican los tubos
positivos de cada serie
- Ejemplo:
Luego se busca en la tabla el
número 2-1-0 =
15 coliformes por gr o ml
B. Prueba de confirmación
• Se realiza el recuento de coliformes a 45°C (Coliformes
fecales- Escherichia coli)
• Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido
durante la prueba presuntiva (caldo lauril sulfato de sodio) a
un tubo con caldo EC conteniendo campana de Durham.
• Agitar los tubos para su homogeneización.
• Incubar a 44.5 ± 0.1°C en incubadora o un baño de agua
durante 24 a 48 h.
• Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe
crecimiento y producción de gas después de un período de
incubación de 24 a 48 h.
• Consultar la tabla 1 ó 2 de NMP para conocer el número más
probable de organismos coliformes fecales/ 100 mL.
C. Identificación de Escherichia coli
• Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos en caldo
EC y sembrar por estría cruzada en agar Levine para su
aislamiento.
• Incubar las placas invertidas a 35°C por 18-24 h.
• Seleccionar dos colonias de cada placa con la siguiente
morfología colonial: Colonias con centro negro, planas con o
sin brillo metálico.
• Hacer un frotis y teñirlo por Gram.
• Observar al microscopio la presencia de bacilos Gram -
Identificación de Escherichia coli -
Pruebas IMViC
Este método incluye 4 pruebas:
Identificación de Escherichia coli -
Pruebas IMViC
Producción de INDOL
Se estudia si la bacteria puede producir la hidrólisis del triptofano,
con producción de Indol
• Inocular con ansa esteril una colonia aislada obtenida del agar
Levine, en agua peptonada.
• Incubarlo a 35°C por 24 ± 2 h.
• Adicionar entre 5 gotas de reactivo de Kovacs.
• La presencia de una coloración roja en la
superficie del tubo se considera una prueba +
IMViC
Rojo de metilo RM
Se estudia la fermentación de la glucosa por vía ácido mixta,
con producción de ácidos orgánicos.
- Inocular el cultivo en caldo MR-VP (medio de Clark y Lubs).
- Incubar a 35°C por 24- 48 ± 2 h.
- Adicionar 5 gotas de solución de rojo de metilo.
- Se considera:
prueba + cuando se desarrolla un color rojo (a PH 4)
Prueba – cuando da color amarillo (PH 6)
IMViC
Voges-Proskauer VP
Se estudia la fermentación de la glucosa por
vía butilén-glicólica, con producción de acetoína
como producto intermedio.
- Inocular un tubo con caldo MR-VP e incubar a 35°C por 48 ± 2
h.
- Adicionar 0.6 mL de solución VP1 (KOH)y 0.2 mL de solución
VP2 (alfa-naftol) y agitar.
- Dejar reposar hasta 1 hora, sin agitar el tubo
- Se considera:
Prueba + cuando se desarrolla un color rijo intenso en la
superficie.
Prueba -: amarillo
IMViC
Citrato
Se estudia si el organismo en cuestión utiliza citrato
como única fuente de carbono del medio. El medio tiene
bromotimol azul como indicador de pH.
- Sembrar un tubo con Agar Citrato de Simmons en agar pico de
flauta
- Incubar a 37°C por 24-48 h.
Prueba+: si el medio vira al azul
Prueba -: si se conserva verde
Resultados IMViC
BACTERIA TINCIÓN INDOL ROJO DE VOGES CITRATO
DE GRAM METILO PROSKAUER
E. Coli Bacilo + + - -
Gram -
Salmonella sp Bacilo - + - +
Gram -
Klebsiella Bacilo - - + +
Gram -
Enterobacter Bacilo - - + +
Gram -
