PRÁCTICA 4
OBSERVACIÓN
MICROSCÓPICA DE LAS
MEMBRANAS Y PARED
CELULARES.
1) INTRODUCCIÓN
La membrana celular y la pared celular son estructuras fundamentales en las células, pero desempeñan roles
diferentes. La membrana celular, también conocida como membrana plasmática, es crucial para la regulación
del paso de sustancias hacia el interior y exterior de la célula, permitiendo el intercambio selectivo de
nutrientes, iones y desechos, y contribuyendo a la comunicación celular. Está formada principalmente por una
bicapa lipídica con proteínas integradas. Por otro lado, la pared celular es una estructura rígida que rodea a
las células vegetales, bacterianas y fúngicas, proporcionando soporte, forma y protección frente a presiones
internas y externas. A diferencia de la membrana, la pared celular no es selectiva en cuanto al paso de
sustancias, pero es esencial para mantener la integridad estructural de la célula
Tinción Gram
La tinción de Gram es una técnica de laboratorio utilizada para clasificar las bacterias en dos grandes grupos:
Gram positivas y Gram negativas, según la composición de su pared celular. Esta tinción, desarrollada por el
bacteriólogo danés Hans Christian Gram en 1884, se basa en la capacidad de las bacterias para retener un
colorante cristal violeta durante un proceso de tinción diferencial. Las bacterias Gram positivas retienen el
colorante debido a su gruesa capa de peptidoglicano, mientras que las Gram n egativas, con una capa más
delgada de peptidoglicano y una membrana externa, no lo retienen y se tiñen de rosa al aplicar un contra-
tinción. Esta técnica es fundamental en microbiología clínica, ya que permite a los médicos identificar el tipo
de bacteria y seleccionar el tratamiento adecuado, ya que las bacterias Gram negativas suelen ser más
resistentes a ciertos antibióticos que las Gram positivas.
2) MATERIALES
• Portaobjetos (láminas de vidrio)
• Pipetas o goteros
• Microscopio (con lentes de alta resolución, como 100x)
• Mechero (si es necesario para calentar)
• Cristal violeta (colorante primario)
• Yodo (solución yodada, que actúa como mordiente)
• Safranina (colorante de contraste o contra-tinción)
Los alumnos deben traer:
• Bastoncillos de algodón o hisopos (para tomar la muestra)
• Guantes y batas de laboratorio (para seguridad)
• Agua destilada o solución salina (para enjuagar)
• Alcohol de farmacia
3) PROCEDIMIENTOS
3.1. Preparación de la muestra:
• Coloca una pequeña gota de agua destilada sobre un portaobjetos limpio.
• Toma una pequeña cantidad de la muestra bacteriana (usando un hisopo o asa bacteriológica) y
mézclala con el agua sobre el portaobjetos.
• Extiende la muestra formando una capa delgada y deja que se seque al aire.
3.2. Fijación de la muestra:
• Una vez que la muestra esté completamente seca, pasa el portaobjetos por la llama de un
mechero (de forma rápida) para fijar las bacterias a la superficie del vidrio, evitando que se
desprendan durante los siguientes pasos.
3.3. Aplicación del cristal violeta:
• Coloca una gota de cristal violeta sobre la muestra seca.
• Deja actuar el colorante durante 1 minuto. El cristal violeta tiñe todas las células bacterianas.
3.4. Aplicación del yodo (mordiente):
• Aplica una gota de solución yodada sobre la muestra teñida.
• Deja actuar durante 1 minuto. El yodo forma un complejo con el cristal violeta, lo que ayuda a
que el colorante se fije mejor en las células.
3.5. Decoloración:
• Después de enjuagar con agua destilada, aplica el decolorante (alcohol o acetona) sobre la
muestra durante 10-20 segundos. Este paso es crítico: las bacterias Gram positivas retendrán
el cristal violeta, mientras que las Gram negativas perderán el colorante debido a su pared celular
más delgada.
• Detén la decoloración inmediatamente cuando veas que la muestra deja de liberar colorante.
3.6. Aplicación de safranina (contra-tinción):
• Aplica una gota de safranina sobre la muestra y deja actuar durante 30 segundos a 1 minuto.
La safranina tiñe las bacterias que han perdido el cristal violeta (Gram negativas), dejándolas de
color rosa.
3.7. Enjuague y secado:
• Enjuaga nuevamente el portaobjetos con agua destilada para eliminar el exceso de safranina.
• Seca suavemente el portaobjetos con papel absorbente o deja que se seque al aire.
Observación:
• Coloca el portaobjetos bajo el microscopio con un objetivo de 100x (inmersión en aceite).
• Observa las bacterias bajo el microscopio. Las bacterias Gram positivas se verán morado o
violetas, mientras que las Gram negativas aparecerán rosadas o rojas.
4) CUESTIONARIO
• ¿Cuál es el objetivo principal de la tinción de Gram?
• ¿Qué diferencia a las bacterias Gram positivas de las Gram negativas?
• ¿Qué componentes de la célula bacteriana son responsables de la retención del cristal violeta en las
bacterias Gram positivas?
• ¿Qué papel desempeña el yodo en el proceso de tinción de Gram?
• ¿Por qué es importante el tiempo de decoloración durante la tinción de Gram?
• ¿Qué sucede si se deja actuar el decolorante durante demasiado tiempo?
• ¿Cómo se observa una bacteria Gram positiva bajo el microscopio después de la tinción?
• ¿Cómo se observa una bacteria Gram negativa bajo el microscopio después de la tinción?
• ¿Qué función tiene la safranina en la tinción de Gram?
• ¿Qué errores comunes podrían ocurrir durante la tinción de Gram y cómo pueden afectar los
resultados?
Mg Sc Jesús Curotto Z.
