TEMA 24.
0. PREGUNTAS SOBRE EL ADN. RECORDATORIO
MÉTODOS 1. De cuántas cadenas consta el ADN
El ADN se compone de dos cadenas
GENÉTICOS PARA EL 2. ¿Cuáles son los didesoxinucleótidos que integran el
ADN?¿Cómo se emparejan?
ANÁLISIS DE Adenina-Timina a través de dos puentes de hidrógeno y la
MICROORGANISMOS Y SUS
Citosina-Guanina a través de tres puentes de hidrógeno.
3. ¿Qué carga eléctrica tiene el ADN?¿Por qué?
METABOLITOS (I)
Tiene carga negativa debido a la presencia de grupos fosfato
que se encuentran en la cara externa de la hélice.
FUNDAMENTOS DE LAS
4. Como se puede visualizar el ADN
Mediante geles de agarosa. Se utiliza un compuesto
TÉCNICAS GENÉTICAS
intercalante denominado bromuro de etidio que se intercala en
la doble hélice del ADN genera fluorescencia (buscar bromuero
APLICADAS A LA DETECCIÓN
de…??) cuando se ilumina con luz UV.
5. ¿Qué son las enzimas de restricción?
DE MICROORGANISMOS DE Son enzimas que reconocen secuencias específicas en el ADN y
cortan a lo lados de esa secuencia. Se cree que son una especie
LOS ALIMENTOS. TÉCNICAS de sistema inmunitario bacteriano de forma que cuando entra
material genético no deseado en una bacteria las enzimas de
BASADAS EN LA restricción reconocen el material extraño y lo degradan.
6. ¿Se degrada el ADN cuando las células mueren?
HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS En comparación con el ARN, que se degrada muy rápidamente
cuando las células mueren, el ADN tarda un tiempo mucho más
NUCLEICOS. RIBOTIPADO. largo en degradarse. Se han encontrado restos de ADN en
restos de 1 millón de años. La zona donde más persiste el ADN
MICROARRAYS. es enlos dientes.
7. ¿Cuántos tipos de ARN existen?
Las técnicas genéticas de identificación y tipificación son las más Existen ARNm (donde se codifican los codones que se agrupan
complejas de entender. Se basan en detectar regiones específicas de 3 en 3 para codificar los aa), ARNr (parte de ribosomas),
de ácidos nucleicos y permiten tipificar microorganismos: tipificar ARNt (encargado de llevar el aa que diga el ARNm). Nos
quiere decir identificar al microorganismo más allá del nivel de interesa el ARNr.
especie. Esto es importante porque hay especies dentro de las Visto esto en este tema veremos los métodos genéticos basados en
cuales hay cepas patógenas y no patógenas como ocurre en E. coli la hibridación de ácidos nucleicos.
(comensal o patógeno) por tanto, quedarnos al nivel de especie a A. Sistema GeneQuence
veces no es suficiente. B. Sistema VIT
→ Esto va a ser clave en: C. Microarrays, micromatrices de ADN, chips genómicos o
• Brotes de toxiinfecciones alimentarias donde es biochips
importante conocer el alimento causal y la fuente de D. Ribotipado
contaminación (¿cómo ha llegado el patógeno?).
• En vigilancia epidemiológica:: patógenos emergentes,
reservorios, etc. Se trata de un punto de vista preventivo. MÉTODOS BASADOS EN LA
→ Los métodos tradicionales de tipificación se basan en rasgos
fenotípicos pero no son tan fiables y seguros como los métodos HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS
genéticos que veremos: el fenotipo realmente es la suma del
genotipo y ambiente esto quiere decir que podemos
NUCLEICOS
determinar dos microorganismos con un genotipo muy similar FUNDAMENTO: Hemos dicho que el ADN tiene una estructura
pero que se comportan de forma muy distinta en distintos formada por dos cadenas antiparalelas donde los nucleótidos se
ambientes. Depende de las del ambiente para que se unen entre sí por puentes de hidrógeno según su capacidad. Esta
manifiesten los rasgos. técnica se basa precisamente en la capacidad de las moléculas de
• Los métodos tradicionales tienen grandes limitaciones: ácidos nucleicos para formar cadenas dobles en las que los
variabilidad fenotípica, necesidad de múltiples reactivos, nucleótidos de cadenas complementarias están unidas por puentes
aplicabilidad… de hidrógeno.
• No son aplicables a todos los microorganismos. COMPONENTES DE LA REACCIÓN
→ Mientras que con las técnicas genéticas: 1. Ácido nucleico diana que será lo que queremos detectar.
• El 100% de los microorganismos son tipificables 2. Sonda génica: fragmento de nucleótidos marcado que permite
genéticamente porque todos tienen ácidos nucleicos. la detección específica de su secuencia complementaria.
• No afecta la variación fenotípica: independientemente Normalmente son oligonucleótidos (cadena corta de 30-40). Es
del ambiente en el que se encuentre el alimento o imprescindible que la sonda esté marcada para que luego el
persona (en caso de tratarse de un brote), los ácidos sistema de detección detecte que la reacción de encuentro ha
nucleicos son invariables. ocurrido. El marcado puede ser de múltiples formas:
• Son técnicas rápidas y relativamente sencillas que a. Marcado isotópico (por radiación): consiste en la unión
pueden aplicarse en laboratorios comunes de de un isótopo radiactivo al fragmento de nucleótidos.
microbiología y además son aplicables a Una reacción positiva se detecta porque la sonda
microorganismos difíciles de cultivar. impresiona una película fotográfica (se vería una señal).
1
Irene Gómez Romero
b. Fluorescencia. En su caso será necesario un equipo de 3. Hibridación y captura ARNr diana La muestra lisada se añade
detección de fluorescencia. en los pocillos de la placa junto con una sonda de captura.
c. Con enzimas (fosfatasa alcalina, peroxidasa rábano) al • El pocillo está tapizado químicamente con un
añadir el sustrato correspondiente forman un producto polinucleótido de timina (poli dT).
coloreado que se cuantifica con un espectrofotómetro. • La sonda de captura tiene una parte específica para el
A continuación veremos algunos métodos comerciales basados en ARNr que se quiere detectar (sonda de captura) y tiene
la hibridación de ácidos nucleicos: una cola de poli dA (común a todas las sondas) que
permiten que la sonda entera quede adherida al pocillo
1. SISTEMA GENEQUENCE por puentes de hidrógeno con su complementaria (poli
El Sistema GeneQuence se define como un sistema diagnóstico dT).
completo para la detección rápida y específica de bacterias en De este modo, si la muestra presenta el ARNr diana se unirá a
alimentos mediante hibridación de ácidos nucleicos. la sonda de captura y la sonda de captura lo anclará al pocillo
→ Se dirige a detectar algunas especies de bacterias y está gracias la interacción poli dA – poli dT.
disponible para Salmonella spp., Escherichia coli, Listeria spp., 4. Se realiza un lavado para eliminar todo lo que no se haya unido
Staphylococcus aureus, Campylobacter spp., Yersinia específicamente en lo que se refiere a la muestra porque la
enterocolitica. sonda de captura sí que se une al pocillo por su cola de poli A.
→ Utiliza sondas dirigidas frente a fracciones del ARNr. El ARNr 5. Adición de segunda sonda (sonda de detección): se incorpora
forma parte de los ribosomas y concretamente se intenta una sonda de detección unida a una enzima (peroxidasa de
analizar la fracción ribosómica 16S. rábano) de modo que sólo quedará retenida indirectamente al
• Se considera una buena diana de las técnicas genéticas pocillo si la sonda de captura ha encontrado al ácido nucleico
porque está presente en todos los organismos salvo virus que se buscaba en el ARNr.
que carecen de ARNr porque utilizan el de la célula Si la sonda de captura no ha podido detectar el ácido nucleico
maquinaria a la que infectan. la sonda detección no tiene donde unirse.
6. Se realiza un lavado y si la sonda de detección ha encontrado
• Se estima que pueden haber hasta 10.000 de copias de
el ARNr para unirse se elimina con el lavado.
ARNr por célula por tanto esto facilita mucho su
7. Detección: se adiciona el sustrato de la enzima y si la sonda de
detección: si en lugar de detectar una secuencia del ARNr
captura no encuentra su ácido nucleico diana la sonda de
fuéramos a detectar una secuencia del ADN,
detección se arrastra con el lavado y por tanto no hay enzima
normalmente en el ADN esa secuencia está presente una
que se una al sustrato pero si el ARNr está presente la enzima
vez o varias veces.
también lo estará y se forma un producto azul.
• La secuencia del ARNr tiene zonas conservadas y zonas
variables, estas últimas nos van a permitir detectar una
cepa.
2. SISTEMA VIT
El Sistema VIT (Vermicon) es un sistema de hibridación para la
• Las bases de datos de secuencias de ARNr permiten:
detección de levaduras en bebidas (alcohólicas, no alcohólicas,
Obtener la identificación de la cepa
carbonatadas…).
El uso de secuencias libremente disponibles para
diseñar sondas que nos permitan detectar PROCEDIMIENTO Fig 24.2
específicamente la especie que queremos. Se trata de un método opaco respecto a la forma de funcionamiento
→ Solo se requiere un lector de absorbancia para detectar color. y no se explica muy en profundidad su principio (bajo patente).
1. Se añade a un porta la muestra enriquecida y a continuación
PROCEDIMIENTO Fig 24.1 una gota de solución-VIT que cuenta con una sonda capaz de
1. Enriquecimiento para aumentar penetrar en la célula y generar fluorescencia cuando encuentra
selectivamente el la secuencia complementaria.
microorganismo diana. Se realiza 2. La muestra se incuba.
en un medio selectivo para 3. Se analiza con un microscopio de fluorescencia.
favorecer su crecimiento e
inhibir el crecimiento de otros.
2. Lisis celular para externalizar el
ácido nucleico.
Figura 24.1 Sistema GeneQuence
2
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5. Visualización de la reacción en un microscopio o escáner de
fluorescencia. El equipo conoce las sondas inmovilizadas en
cada posición por lo que cuando observa una señal de
fluorescencia en un punto determinado puede llevar a cabo su
identificación (a nivel de especie).
Figura 24.2 Sistema VIT 4. RIBOTIPADO
Comercialmente el sistema RiboPrinter es el más conocido. Se
VENTAJAS
caracteriza por ser un sistema totalmente automatizado cuya
• Resultados en 3 horas tras el enriquecimiento.
utilidad principal es la tipificación.
• Permite el uso de varias sondas para detectar distintas cepas Los anteriores eran sistemas de detección, pero en este caso
(fig 24.2). tipificamos, vamos más allá de la especie y podemos saber de qué
INCONVENIENTES: Solo detecta células vivas porque las sondas se cepa se trata.
dirigen al ARNr y como comentábamos el ARN tiene una vida corta Es algo compleja y cara pero es útil.
(el ARNr es sinónimo de viabilidad). PROCEDIMIENTO
3. MICROARRAYS, MICROMATRICES DE
0. Al tratarse de un ensayo muy específico y caro previamente
habrá que haber realizado ensayos con resultados a nivel de
ADN, CHIPS GENÓMICOS O BIOCHIPS especie y normalmente se parte de colonias aisladas.
Se trata de sistemas miniaturizados que 1. Aislamiento del ADN de la muestra.
permiten analizar la hibridación de los 2. Digestión con enzimas de restricción.
ácidos nucleicos de una muestra con Recordemos que eran enzimas que reconocían
numerosas sondas en un único secuencias específicas de 4-8 pB y cortaban en
experimento. (Resultados de una posición definida con respecto a la
presencia/ausencia) secuencia de reconocimiento.
Antes este método era inviable (utilizan múltiples sondas en un Las enzimas de restricción están disponibles
mismo experimento) porque las sondas reaccionaban entre ellas comercialmente.
había mucho ruido. Tras este paso se habrán generado más o menos fragmentos
en función del número de sitios que haya encontrado la
Aunque se ha aprobado y comprobado el funcionamiento de
enzima.
distintos chips para detectar patógenos no hay ninguno
3. La muestra ya digerida y que hasta ahora se encontraba en una
comercializado para su aplicación en microbiología de alimentos. En
disolución se carga en pocillos con gel de agarosa (el gel de
microbiología están aprobados a nivel experimental pero no se
agarosa se incorpora caliente en los pocillos junto a la muestra
comercializan. Puede ser que en un futuro se aprueben porque la
y solidifica).
ventaja de detectar muchos microrganismos en un solo ensayo es
4. Electroforesis del ADN digerido: se
enorme.
aplica un campo eléctrico y como el
PROCEDIMIENTO ADN presenta carga negativa (por los
0. Impresión de sondas en el biochip: las grupos fosfato) comienza a
sondas están inmovilizadas en un desplazarse a través del gel de
soporte sólido (placa de vidrio, gel de agarosa. En un intervalo de tiempo las
sílice…). Al tratarse de un sistema bandas de ADN migrarán más a
miniaturizado es un robot el que se menor tamaño de cadena
encarga de imprimir las sondas y consiguiendo separar los distintos
depositarlas con mucha precisión en fragmentos de ADN que la muestra
un espacio muy muy reducido. pudiera tener (como que los conseguimos aislar).
Cada sonda representa una especie 5. Transferencia de bandas a membrana de
diferente. nylon. Es necesario porque la hibridación
Con esto ya tendríamos los biochips no se puede realizar sobre el soporte de
preparados para el ensayo. agarosa (sería algo así como coger cada
1. Extracción de ácidos nucleicos de la muestra: la muestra banda e inocularla sobre la membrana de
enriquecida no puede añadirse tal cual porque el biochip tiene nylon).
una tecnología muy delicada. 6. Hibridación con sonda dirigida al ADNr
2. Adición de ácidos nucleicos extraídos marcados con (del cual existen múltiples copias)
fluorescencia: todas las cadenas de ADN extraído se marcan marcada con fluorescencia: esta sonda
con fluorescencia. detecta los genes del ADN que codifican
3. Hibridación: se da un tiempo el ARNr (el ARNr tiene que sintetizarse
para que ocurran las por el ADN).
posibles reacciones de • Resulta que el ADN tiene múltiples
hibridación. En caso de que copias de genes que codifican por el ARNr (unas 30-40
el ADN del microorganismo copias) por lo que la sonda hibridará con los fragmentos
complementario a la sonda que contengan trozos de genes que codifican para el
esté presente se quedará ARNr.
unido y marcado con
fluorescencia.
4. Lavado: para eliminar todo aquello que no se haya unido
específicamente.
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• En función del genoma microbiano algunos trozos serán
más grandes que otros según donde haya reconocido la
enzima y haya cortado.
7. Sistema de detección de la
hibridación: en aquellos sitios
donde la sonda haya encontrado un
fragmento de gen para el que está
diseñada emitirá luminiscencia.
8. Sistema de análisis de señal: cámara
+ software: a raíz de la
luminiscencia que se genere en la
muestra se elabora un patrón de bandas específico para cada
microorganismo tanto
en el número como
posición e intensidad
de las bandas.
APLICACIÓN DEL RIBOTIPADO EN LA IA
Dentro de la IA el ribotipado permite la detección de la fuente de
toxiinfecciones alimentarias.
Resulta imprescindible estar completamente seguros del origen
alimentaria implicado en el brote porque tiene implicaciones legales
y responsabilidades para la empresa productora
EJ: Detección de la fuente de una toxiinfección alimentaria causada
por Listeria monocytogenes: una aproximación posible sería utilizar
un ribotipado de los alimentos sospechosos y compararlos con los
de la personas enfermas.
Para ello:
1. Se tipifica por el método inmunoquímico el serotipo x de
Listeria monocytogenes en personas afectadas.
2. Se apuntan los alimentos sospechosos a los frecuentemente
vinculados con la bacteria: queso fresco, salmón ahumando o
producto cárnico. Se encontró la presencia de Listeria en los
tres alimentos y se ribotipifican para saber exactamente cuál
era el implicado que tenía el mismo serotipo:
→ En el caso del salmón hay dos ribotipos (dos bandas
comunes) y el resto de las bandas no coinciden. Es
normal que coincidan dos bandas porque al fin y al cabo
se trata de la misma especie: Listeria monocytogenes
pero no tienen el mismo serotipo por tanto se descarta.
→ En la carne ocurre igual que en el salmón, encontramos
bandas comunes que indican que pertenecen al mismo
género y especie pero el aislado no es el mismo. Se
descarta.
→ El ribotipado del aislado en el queso fresco coincide
completamente con el de la persona enferma lo que
indica que el alimento es el vinculado al brote en
cuestión.
También sirve para determinar el origen de contaminaciones dentro
de una empresa.
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