Introducción al análisis

espectrofotométrico
¿Qué es la luz?
 ¿Qué es la luz?

• longitud de onda (λ)

•frecuencia (ν)
•velocidad de propagación (c)

c=λ.ν
¿Qué es la luz?
• Desde el punto de vista energético, es más conveniente considerar la
luz como formada por partículas llamadas fotones.
 Espectro electromagnético
• Abarca un intervalo muy amplio de
longitudes de onda o energías.

• Según su λ recibe diferentes

nombres.

• La luz visible, que es la única

perceptible por el ojo humano,
representa solamente una
pequeña parte del espectro, desde
350-380 a 750-780 nm.
 Métodos instrumentales de análisis

Están basados en la medida de propiedades químicas y físicas de los analitos con fines
cualitativos y cuantitativos. La medida se realiza en un instrumento apropiado.

Propiedad medida Método Instrumental Método Instrumental

Absorción de radiación Espectrofotometría de absorción Óptico

Emisión de radiación Espectroscopía de emisión Óptico

Potencial eléctrico Potenciometría Electroanalítico

Corriente eléctrica Voltamperometría Electroanalítico

Resistencia eléctrica Conductimetría Electroanalítico

Interacciones con transferencia de energía

• Absorción: la absorción de un fotón lleva a un átomo o molécula a un

nivel de energía superior (excitado), y cuando vuelve al estado
fundamental se produce una emisión de energía, ya sea en forma de
calor, luz, etc.
• Emisión: la absorción de energía por parte de un átomo, lo lleva a un
nivel energético superior y, volviendo a su estado de menor energía o
fundamental, emite un fotón cuya energía y longitud de onda
dependen de las transiciones energéticas en cuestión.
 Mediciones espectroscópicas

Procesos de emisión o de quimioluminiscencia.

Mediciones espectroscópicas

Métodos de absorción.
 ¿Qué significa que el analito absorbe luz?

Energía absorbida por átomos = E de transiciones electrónicas

Energía absorbida por moléculas = E de transiciones rotacionales,

vibracionales y electrónicas.
Proceso de absorción
 Absorción de radiación electromagnética

Para que la radiación electromagnética sea absorbida por la materia deben

cumplirse dos condiciones generales:
1) debe haber una interacción entre el campo eléctrico de la radiación y alguna carga
eléctrica de la sustancia
2) La energía de la radiación incidente debe ser exactamente igual a la energía
cuantizada que requiere la sustancia.
Transmitancia (T) y Absorbancia (A)
¿CÓMO SE RELACIONA LA MEDIDA DE ABSORBANCIA CON LA
CONCENTRACIÓN DEL ANALITO?
 ¿CÓMO SE RELACIONA LA MEDIDA DE ABSORBANCIA CON LA
CONCENTRACIÓN DEL ANALITO?

1. El número de materiales de absorción en su trayectoria

(concentración).

2. Las distancias que la luz debe atravesar a través de las muestra.

Denominamos a este fenómeno, distancia del camino óptico.

3. Las probabilidades que hay de que el fotón de esa longitud

particular de onda pueda absorberse por el material. Esto es la
constante de proporcionalidad.
¿CÓMO SE RELACIONA LA MEDIDA DE ABSORBANCIA CON LA
CONCENTRACIÓN DEL ANALITO?
¿CÓMO SE RELACIONA LA MEDIDA DE ABSORBANCIA CON LA
CONCENTRACIÓN DEL ANALITO?

La ley de Lambert Beer es una ley límite, sólo

se cumple en determinadas condiciones: luz
monocromática y soluciones diluidas.
Representación gráfica de la Ley de Lambert y Beer.
Desviaciones de la ley de Lambert Beer (¿por qué se pierde la
linealidad entre A y c?)

1- Si la solución del analito es concentrada

2- Desviaciones químicas:
- asociación o disociación del analito en solución
- reacciones del analito con el solvente
- presencia de otros componentes en la muestra que
también absorben luz incidente.

3- Desviaciones instrumentales
Desviaciones de la ley de Lambert Beer (¿por qué se pierde la
linealidad entre A y c?)
COMPONENTES DEL ESPECTROFOTÓMETRO
UV-VIS
1- Fuente de luz policromática (para el visible lámpara de Tungsteno y para UV
lámpara de deuterio).

2- Sistema óptico necesario para seleccionar una determinada longitud de

onda (colimador, monocromador, selector de longitud de onda).

3- Cubeta (recipiente donde se coloca la muestra a medir, para el visible debe

ser de vidrio o de plástico; para UV de cuarzo). Muchas veces al camino óptico
(b) se lo denomina ancho de la cubeta.

4- Detector (Fototubo).

5- Procesador y lector de la señal.

 Fotodetector, que mide
Instrumentación típica de un cuantitativamente la
radiación que pasa por la
espectrofotómetro
Monocromador que separa la
muestra

banda de longitud de onda

deseada
COMPONENTES DEL ESPECTROFOTÓMETRO
UV-VIS
Fuente de energía radiante
Características

Continua. Estable. Intensa

Lámpara de
intensidad lumínica
Lámpara de Para λ en
Tungsteno o Wolframio
Deuterio el Visible

300 500 700 900 1100

Para λ en el
longitud de onda (nm)
Ultravioleta 24
COMPONENTES DEL ESPECTROFOTÓMETRO
UV-VIS

• Fuentes continuas: emiten radiación que solo cambia de intensidad

lentamente en función de la longitud de onda

• Fuentes lineales: emiten un número limitado de líneas espectrales,

cada una de las cuales abarca un intervalo de longitud de onda muy
estrecho.

• También pueden clasificarse como :

- fuentes continuas: emiten radiación de manera continua con el
tiempo
-fuentes pulsadas, las cuales emiten radiación en ráfagas 25
COMPONENTES DEL ESPECTROFOTÓMETRO UV-VIS

Selector de λ
Características

•longitud de onda de máxima transmisión

•ancho de banda efectivo

Filtros de corte Monocromadores de prisma

Filtros de absorción Monocromadores de red
Filtros de interferencia

Fotómetros Espectrofotómetros 26
COMPONENTES DEL ESPECTROFOTÓMETRO UV-VIS

Cubetas

Características

Absorción mínima a la longitud de onda de trabajo

Colocar con caras transparentes perpendiculares a la dirección del haz incidente

Sílice Vidrio o plástico

Ultravioleta Visible

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COMPONENTES DEL ESPECTROFOTÓMETRO UV-VIS

Detectores

Su función es convertir la respuesta del instrumento en una señal medible.

Características

•deben responder a un amplio rango de longitudes de onda

•deben dar respuesta rápida
•deben ser sensibles a bajos niveles de radiación
•deben producir señal eléctrica fácilmente amplificable
•la señal debe ser proporcional a la potencia radiante

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Fototubos Fotomultiplicadores Fotodiodoarray
¿CÓMO PUEDO DETERMINAR LA CONCENTRACIÓN DE UN ANALITO
UTILIZANDO LA ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN MOLECULAR
UV-VIS?

• Utilizando la ley de Lambert y Beer

• Utilizando el procedimiento de la curva de calibración

Metodología cuantitativa. Detalles del procedimiento experimental

Calibración con patrones de concentración conocida

•Pocas veces es posible suponer el cumplimiento de la ley de Beer y utilizar un único

patrón para determinar la absortividad molar.
•Comprobar la ley de Beer realizando un calibrado a la λ del máximo de absorción.
•Se miden las absorbancias de patrones y muestras y se obtiene la ecuación de la recta
de calibrado generalmente aplicando el método de mínimos cuadrados:
• A = mc + b
•Los estándares o patrones de calibración se deben aproximar tanto como sea posible a
la composición final de las muestras reales y deben abarcar un intervalo razonable de
concentraciones del analito.
•La concentración de la muestra se calcula a partir de la ecuación de la recta de
calibrado sustituyendo su valor de A y despejando la c correspondiente 31
Metodología cuantitativa. Detalles del procedimiento experimental

Método de las adiciones estándar

Cuando se analizan muestras complejas, como alimentos ó cenizas vegetales, suele ser imposible o muy
difícil preparar estándares que se asemejen a las muestras.
En este caso, el método de las adiciones estándar es útil para contrarrestar los efectos de matriz.

Método de las adiciones estándar. El método de un solo punto

•Se toman dos porciones de la muestra

•Una porción se mide como de costumbre
•A la segunda porción se le agrega una cantidad conocida de la disolución estándar de analito
•Ambas respuestas se utilizan entonces para calcular la concentración desconocida,
suponiendo una relación lineal entre la respuesta y la concentración del analito

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 Método de las adiciones estándar . El método de las adiciones múltiples

A0 A1 A2 A3

A = mc+b 0 = mc muestra + b Cmuestra = b/m

Concentración añadida del estándar

Concentración de c1 c2 c3
la muestra
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Metodología cuantitativa. Detalles del procedimiento experimental

Toma y tratamiento de la muestra

•Realizar un espectro de absorción de la muestra
Selección de la •Para obtener máxima sensibilidad, realizar las medidas de A
longitud de onda a una λ que corresponda a un máximo de absorción λmax, ya
que el cambio en la absorbancia por unidad de concentración
es mayor en este punto.

•la naturaleza del disolvente

Control de las variables •el pH de la disolución
que influyen en la absorbancia •la temperatura
•las concentraciones altas del electrolito
•la presencia de sustancias interferentes
Elegir las condiciones para el análisis
 Determinación de •Calibración con patrones de concentración conocida
la relación entre •Método de las adiciones estándar
la absorbancia A a) El método de un solo punto
y la concentración c b) El método de las adiciones múltiples
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 Aplicaciones analíticas

Análisis cualitativo: los espectros de la muestra se comparan con los de los

correspondientes estándares, con el fin de identificar las bandas de absorción
coincidentes. Este tipo de análisis es más frecuente en UV e IR para identificar
compuestos orgánicos y más rara vez se utiliza en Vis.

Análisis cuantitativo: está basado en la ley de Lambert-Beer en el intervalo de

concentraciones de cumplimiento de la ley.
•Se establece la curva de calibrado usando estándares y la absorbancia de la muestra de
concentración desconocida se remite a la curva (a veces basta con un solo estándar).
•En espectrofotometría Vis, el analito se suele incorporar a una especie compleja que
presente bandas de absorción intensas.
•Siempre que sea posible se debe medir la absorbancia a λmax
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Características de los métodos espectrofotométricos

 Amplia aplicabilidad: Análisis orgánico e inorgánico

 Elevada sensibilidad: los límites detección de 10-4 a 10-5 M.
 Selectividad de moderada a alta.
 Buena exactitud: errores de concentración 1-5% o incluso menores.
 Facilidad y comodidad en las medidas espectrofotométricas.
 Se prestan a una fácil automatización.

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 Campo de aplicación
 Especies absorbentes: compuestos orgánicos que contengan grupos cromóforos y especies
inorgánicas como son los metales de transición.
 Especies no absorbentes: los analitos reaccionan con un reactivo para producir un
compuesto absorbente.